Methodenartikel

Protokoll zur RNA-Isolierung aus verschiedenen Bärtierchenarten

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DOI:

10.3791/72120

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1. September 2026

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1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur RNA-Isolierung aus verschiedenen Bärtierchenarten unter Verwendung eines säulenbasierten RNA-Isolierungs-Kits, das zur Gewinnung von RNA aus geringen Gewebemengen entwickelt wurde und ausreichende Mengen hochwertiger RNA für nachgeschaltete Anwendungen wie die RNA-Sequenzierung und die Synthese von komplementärer DNA liefert.

Zusammenfassung

Tardigraden sind mikroskopisch kleine Tiere, die für ihre außergewöhnliche Toleranz gegenüber Umweltstress bekannt sind. Diese Tiere können Austrocknung, extremen Druck, niedrige Temperaturen und hohe Dosen ionisierender Strahlung überstehen. Die molekularen Mechanismen, die diesen Extremtoleranzen zugrunde liegen, sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Die molekularbiologischen Methoden, die zur Untersuchung dieser Mechanismen eingesetzt werden – darunter die RNA-Sequenzierung, die RNA-Interferenz (RNAi) sowie die heterologe Expression von Tardigraden-Genen in Systemen wie Bakterien – erfordern die Isolierung von hochwertiger Boten-RNA (mRNA) aus begrenztem biologischem Material. In dieser Studie beschreiben wir ein reproduzierbares Protokoll zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Tardigraden, das (1) bei mehreren Arten anwendbar ist, einschließlich einer Heterotardigraden-Art, (2) lediglich 25–200 Tiere benötigt, abhängig von der Körpergröße, und (3) RNA in ausreichender Menge und Qualität für nachfolgende Anwendungen liefert. Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht eine effiziente RNA-Gewinnung aus einer praktikablen Anzahl von Tardigraden und unterstützt molekularbiologische Untersuchungen zur Stressresistenz bei verschiedenen Tardigraden-Arten.

Einleitung

Tardigraden sind bekannt für ihre Fähigkeit, extremen Belastungen zu widerstehen, die anderen Tieren zum Verhängnis würden, einschließlich Austrocknung, extremen Drucks, extremen Temperaturen und DNA-schädigenden Substanzen wie zytostatischen Wirkstoffen und ionisierender Strahlung1,2,3,4,5,6,7,8. In den letzten Jahren haben Wissenschaftler die Mechanismen untersucht, die der außergewöhnlichen Widerstandsfähigkeit der Tardigraden zugrunde liegen, und dabei molekulare Methoden wie die RNA-Sequenzierung, RNA-Interferenz (RNAi) und die heterologe Expression von Tardigraden-Genen in anderen Systemen eingesetzt, darunter humane Zellen und Bakterien8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Diese Ansätze haben sich als leistungsfähiges Werkzeug erwiesen, um Einblicke in die genauen Mechanismen zu gewinnen, durch die Tardigraden eine derart extreme Stressresistenz erreichen8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Alle diese molekularen Ansätze zur Erforschung der Stressresistenz von Tardigraden setzen jedoch voraus, dass es gelingt, aus diesen winzigen Tieren RNA in ausreichender Menge und angemessener Qualität zu isolieren, um sie in nachfolgenden Verfahren verwenden zu können.

Eine frühere Methode zur RNA-Isolierung aus Tardigraden erwies sich als erfolgreich für Forscher, die mit Hypsibius exemplaris23 arbeiteten. Bei dem Versuch, dieses Protokoll mit H. exemplaris zu replizieren, stellten wir jedoch fest, dass es unzuverlässig hinsichtlich der resultierenden RNA-Konzentration und -Qualität war (unveröffentlichte Daten). Eine alternative, auf Phenol basierende Methode zur RNA-Isolierung hat sich als wirksam für H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus und eine Heterotardigraden-Art erwiesen13,21,22,24,25,26. Dieses Protokoll liefert RNA in ausreichender Qualität und Menge für nachgeschaltete Verfahren, sowohl aus einzelnen Tieren als auch aus Tierpools (~50). Allerdings erfordert dieses Protokoll, dass der Anwender Reagenzien handhabt, die Phenol enthalten. Phenol ist eine gefährliche Chemikalie, die sorgfältige Handhabung erfordert, und eine unsachgemäße Durchführung dieses Protokolls kann zu einer Mitübertragung von Phenol führen, was die RNA-Reinheit und nachgeschaltete Anwendungen beeinträchtigt. Ein weiteres bereits veröffentlichtes Protokoll zur RNA-Isolierung aus Tardigraden konzentriert sich auf die Fähigkeit, RNA aus einzelnen Tieren zu isolieren27. Obwohl dies ein wertvolles Protokoll für Anwendungen wie die quantitative PCR (qPCR)27 darstellt, eignet es sich weniger für nachgeschaltete Anwendungen wie die RNA-Sequenzierung, bei denen das Ziel darin besteht, einen ganzheitlicheren Einblick in die Reaktion der Tiere auf einen bestimmten Stressfaktor oder eine bestimmte Bedingung zu erhalten.

Diese Einschränkungen bestehender Protokolle zur RNA-Isolierung führten zur Untersuchung alternativer Methoden zur Gewinnung von RNA aus Tardigraden. Das in diesem Protokoll verwendete säulenbasierte RNA-Isolierungs-Kit ist für die Isolierung von RNA aus geringen Gewebemengen konzipiert. Es wurde bereits früher erfolgreich zur Isolierung von RNA aus Insekten-Gewebe für anschließende RNA-Sequenzierungsanalysen eingesetzt, was darauf hindeutet, dass es auch für die Isolierung von RNA aus anderen kleinen, cuticulatragenden Organismen wie Tardigraden geeignet sein könnte.28. Diese Studie beschreibt detailliert die schrittweise Anwendung eines säulenbasierten RNA-Isolationskits an Tardigraden, einschließlich Erläuterungen zu spezifischen Vorsichtsmaßnahmen, die bei der Durchführung dieses Protokolls mit Tardigraden zu beachten sind. Dieser Artikel berichtet über den Erfolg dieses Protokolls bei sechs Tardigraden-Arten (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadaboutiund die Heterotardigrade Viridiscus celatus). Die Studie hat bestätigt, dass RNA von beträchtlicher Qualität und Menge bereits aus lediglich 25 Tieren gewonnen werden kann. Beispiele für die erzielten RNA-Konzentrationen und Qualitätsdaten werden ebenfalls angegeben und sind für nachfolgende Anwendungen wie die RNA-Sequenzierung (mit minimaler Verzerrung, exponentieller Bibliotheksverstärkung) sowie die Synthese komplementärer DNA (cDNA) geeignet. Diese RNA-Isolationsmethode hat sich bereits als nützlich erwiesen, um Mechanismen der Strahlenresistenz aufzuklären in H. exemplaris8. Der Erfolg dieses Protokolls bei verschiedenen Tardigraden-Arten legt nahe, dass es breiter zur Untersuchung von Stressresistenzmechanismen, Entwicklungsmechanismen und evolutionären Prozessen anwendbar wäre.

Protokoll

Für das folgende Protokoll ist keine institutionelle Tierversuchsethikgenehmigung erforderlich, da wirbellose Tiere von dieser Anforderung ausgenommen sind. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

1. Vorbereitung der Ausrüstung und des Bereichs für die RNA-Isolierung

  1. Schalten Sie einen Heizblock oder Wasserbad auf 42 °C ein, um die RNA-Extraktion vorzubereiten.
  2. Bereiten Sie einen Mikrozentrifugenröhrchenständer, Pipetten (2 µL, 20 µL, 200 µL und 1000 µL) sowie passende gefilterte Pipettenspitzen geeigneter Größe vor.
  3. Reinigen Sie die Arbeitsfläche, den Röhrchenständer, die Pipetten und die Spitzenkästen mit RNase Away, verdünnter Bleichlösung (10 %) oder 70 %igem Ethanol, um jegliche verbleibende RNase zu denaturieren.
    ANMERKUNG: Eine übermäßige Menge an RNase auf den Geräten oder in der Umgebung, in der die RNA isoliert wird, kann zu einer unzureichenden RNA-Qualität nach der Isolierung aufgrund von Degradation führen. Verringern Sie dieses Risiko, indem Sie ausreichend Zeit für die Wirkung der RNase-denaturierenden Chemikalien einplanen und sicherstellen, dass die Fläche und die Geräte vollständig getrocknet sind, bevor Sie fortfahren.
  4. Tragen Sie bei allen Schritten dieses Protokolls Handschuhe und behandeln Sie die Handschuhe während des Protokolls regelmäßig mit einer RNase-denaturierenden Lösung, um eine RNase-vermittelte RNA-Degradation zu verhindern.

2. Sammeln von Tieren zur RNA-Isolierung

  1. Unter Verwendung eines Pipettenbalgs, der an eine Aspiratorröhre mit Glaskapillare angeschlossen ist (Abbildung 1A), einer Irwin-Schleife oder einer Mikropipette werden 25–200 Tiere (je nach Artengröße) aus ihren Kulturschalen in eine Schale mit sauberem Quellwasser überführt, um die Menge an nicht-tardigraden Material (Algen oder andere Nahrungsquellen wie Nematoden oder Rädertiere, je nach Art) zu verringern.
  2. Verschaffen Sie sich einen RNase-freien 1,5-mL-Röhrchen und ein Stößel.
  3. Unter Verwendung eines Pipettenbalgs, der an eine Aspiratorröhre mit Glaskapillare oder einer Irwin-Schleife angeschlossen ist, werden die Tiere in das untere Ende des RNase-freien 1,5-mL-Röhrchens überführt, wobei besonders darauf geachtet werden muss, so wenig Wasser wie möglich mit den Tieren zu übertragen.
  4. Zentrifugieren Sie 3 Minuten bei 4.500 g, um die Tardigraden am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu pelletieren.
  5. Während das Röhrchen mit den pelletierten Tardigraden unter dem Stereomikroskop beobachtet wird, wird mit einer 20-µL-Pipette oder einem an eine Aspiratorröhre mit Glaskapillare angeschlossenen Pipettenbalg, dessen Öffnung kleiner ist als die Tardigraden, aus denen die RNA isoliert wird, vorsichtig so viel Wasser wie möglich entfernt, ohne das Pellet der Tardigraden zu stören. Siehe Abbildung 1B für eine Darstellung der akzeptablen Menge an verbleibendem Wasser.
    ANMERKUNG: Achten Sie darauf, hier einen dünnen Wasserfilm zurückzulassen, damit die Tiere in der kurzen Zeit zwischen dem Entfernen des Wassers und dem Hinzufügen des Extraktionspuffers (XB) nicht austrocknen. Sollten die Tiere austrocknen, kann dies zu einer schlechten RNA-Qualität nach der Isolierung führen.
  6. Geben Sie 100 µL Extraktionspuffer (XB) in das Röhrchen mit den Tardigraden.

3. Mechanische Zerstörung von Tardigraden und RNA-Extraktion

  1. Zerstören Sie die Tardigraden mit dem RNase-freien Stößel, indem Sie diesen etwa 30 Sekunden lang vorsichtig, aber kräftig auf den Boden des Röhrchens drücken. Insgesamt sollten 20–30 Mahlvorgänge ausreichen, um die Tardigraden zu zerstören.
  2. Nehmen Sie den Stößel vorsichtig aus dem Röhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass möglichst viel Flüssigkeit am Boden des Röhrchens verbleibt.
  3. Überprüfen Sie den Inhalt des Mikrozentrifugenröhrchens unter dem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass keine sichtbaren intakten Tiere mehr vorhanden sind.
  4. Incubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 42 °C auf einem schüttelnden Heizblock mit sanftem Schütteln (300 U/min).
    ANMERKUNG: Der Extraktionspuffer (XB) stabilisiert die RNA, um eine Degradation bei dieser Temperatur zu verhindern.

4. Die Reinigungssäule für die RNA-Isolierung vorbereiten

  1. In den letzten 10 Minuten der Extraktionsinkubation die Säule zur RNA-Gewinnung und -Reinigung zusammenbauen. Eine Reinigungssäule in ein Sammelröhrchen stellen und die Säule entsprechend beschriften.
  2. 250 µL Konditionierungspuffer (CB) direkt auf die Säule geben.
  3. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. 5 min bei 16.000 × g zentrifugieren und den Durchlauf entsorgen. Die Säule ist nun bereit, das RNA-Überstand aus dem nächsten Schritt aufzunehmen.
  5. Den 10x DNase I-Reaktionspuffer und Nukleasefreies Wasser aus dem Gefrierschrank nehmen, um sie rechtzeitig zum vollständigen Auftauen für Schritt 6 unten bereitzuhaben.

5. Binden von RNA an die Säule

  1. Nach der Extraktionsinkubation die Röhrchen mit den mechanisch disruptierten Tardigraden und Extraktionspuffer (XB) 2 min bei 3.000 × g zentrifugieren.
  2. Ein neues RNase-freies Röhrchen entnehmen und entsprechend beschriften.
  3. Mit einer 200-µL-Pipette und einer Filterpipettenspitze vorsichtig den Überstand von den pelletierten Tardigradenhüllen abpipettieren. Dabei darauf achten, das Pellet der Hüllen nicht aufzuwirbeln, und nur den Überstand entfernen.
    HINWEIS: Der Übergang von Hülle in nachfolgende Schritte führt aufgrund einer physikalischen Verstopfung der Säule zu einer geringeren Effizienz der RNA-Ausbeute an der Säule. Um diesen möglichen Fehler zu vermeiden, kann die Pipettenspitze mit dem Überstand unter dem Mikroskop überprüft werden, um das Fehlen von Hülle zu bestätigen. Falls Hülle sichtbar ist, den Überstand zurück in das Röhrchen geben und den Zentrifugationsschritt wiederholen.
  4. Den Überstand in das neu beschriftete, RNase-freie Röhrchen überführen.
  5. 100 µL 70 % Ethanol in das Röhrchen mit der RNA pipettieren und mehrfaches Auf- und Abpipettieren, um gründlich zu mischen. Bei diesem Schritt sollten sich nach Zugabe des Ethanol klare, viskose Fäden zeigen. Dies ist ein gutes Zeichen dafür, dass RNA im Überstand vorhanden ist.
  6. Die gesamte Mischung (200 µL) auf die vorbereitete Säule aus Schritt 4 pipettieren.
    HINWEIS: Beim Pipettieren von Lösungen auf die Säule in diesem und den folgenden Schritten darauf achten, die Flüssigkeit in die Mitte der Säule abzugeben und die Säule mit der Pipettenspitze nicht mechanisch zu berühren. Eine mechanische Beschädigung der Säule führt zu Problemen in nachfolgenden Schritten bezüglich der RNA-Qualität und -menge.
  7. Um die RNA an die Säule zu binden, 2 min bei 100 × g zentrifugieren, gefolgt von einer Zentrifugation bei 16.000 × g für 30 s, um den Durchlauf zu entfernen.

6. Herstellung der DNase-I-Lösung

  1. Lassen Sie den 10x DNase-I-Reaktionspuffer und nukleasefreies Wasser vollständig auftauen, bevor Sie die Lösung herstellen.
  2. Stellen Sie für jede RNA-Isolierung eine 40 µL große Lösung in einem separaten 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen her, die aus 32 µL nukleasefreiem Wasser, 4 µL 10x DNase-I-Reaktionspuffer und 4 µL DNase-I-Enzym besteht. Bewahren Sie die Lösung bis zum Einsatz in Schritt 7,3 auf Eis auf.

7. Waschen der RNA und Behandlung mit DNase I

  1. Pipettieren Sie 100 µL Waschpuffer 1 (W1) direkt auf die Reinigungssäule, die die gebundene RNA enthält (aus Schritt 5.7).
  2. Zentrifugieren Sie 1 min bei 8,000 × g und entfernen Sie den Durchlauf.
  3. Pipettieren Sie 40 µL DNase I-Lösung aus Schritt 6 direkt auf die Reinigungssäule und inkubieren Sie 15 min bei Raumtemperatur, um DNA-Kontamination zu entfernen.
  4. Pipettieren Sie 40 µL Waschpuffer 1 (W1) auf die Reinigungssäule und zentrifugieren Sie 30 s bei 8,000 × g.
  5. Pipettieren Sie 100 µL Waschpuffer 2 (W2) auf die Reinigungssäule und zentrifugieren Sie 1 min bei 8,000 × g.
  6. Pipettieren Sie weitere 100 µL Waschpuffer 2 (W2) auf die Reinigungssäule und zentrifugieren Sie 2 min bei 16,000 × g. Entsorgen Sie den Durchlauf.
  7. Zentrifugieren Sie die Säule 1 min bei 16,000 × g, um die Säule zu trocknen.

8. RNA-Elution

  1. Bereiten Sie für jede RNA-Isolierung ein 0,5-mL-Röhrchen (im Kit enthalten) vor und beschriften Sie es entsprechend. In diesem Röhrchen wird die isolierte RNA enthalten sein.
  2. Übertragen Sie die Säule mit der gebundenen und gewaschenen RNA in das beschriftete 0,5-mL-Röhrchen. Die Säule sollte fest in dieses Röhrchen einrasten.
  3. Positionieren Sie die Pipettenspitze bei seitlicher Betrachtung direkt über die Säulenmembran, geben Sie 11 µL Elutionspuffer (EB) auf die Säule und inkubieren Sie 1 Minute bei Raumtemperatur.
    ANMERKUNG: Wenn der Elutionspuffer (EB) nicht direkt auf die Säule aufgetragen wird, führt dies zu geringeren RNA-Mengen. Werden Flüssigkeitstropfen am Rand der Säule beobachtet, deutet dies auf eine unzureichende Verteilung des Elutionspuffers (EB) auf der Säule hin. In diesem Fall wird empfohlen, diesen Schritt mit dem Durchlauf aus Schritt 8.5 zu wiederholen und sicherzustellen, dass der Elutionspuffer (EB) direkt in die Mitte der Säule gegeben wird.
  4. Setzen Sie das 0,5-mL-Röhrchen mit der Säule in das mitgelieferte Sammelröhrchen, um eine korrekte Passform während der Zentrifugation zu gewährleisten (Abbildung 2).
  5. Zentrifugieren Sie die Säule 1 Minute bei 1.000 × g, um den Elutionspuffer (EB) zu verteilen, und anschließend 1 Minute bei 16.000 × g, um die RNA zu eluieren.
  6. Stellen Sie das 0,5-mL-Röhrchen mit der RNA unmittelbar auf Eis.

9. Überprüfung der RNA-Menge und -Qualität mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer

HINWEIS: Es können andere Methoden zur Beurteilung der RNA-Menge und -Qualität verwendet werden. Hier wird eine Methode mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer angewandt. Ein Fluorometer oder ein mikrofluidisches Gelelektrophoresegerät kann ebenfalls verwendet werden29.

  1. Wischen Sie die Säule des Mikrovolumen-Spektrophotometers mit einem fusselfreien Tuch ab, um sicherzustellen, dass keine anderen Flüssigkeiten vorhanden sind.
  2. Wählen Sie die Einstellung RNA am Spektrophotometer für die Analyse aus.
  3. Kalibrieren Sie das Spektrophotometer mit 1 µL Puffer zur Elution (EB), der im Schritt 8.3 verwendet wurde.
  4. Wischen Sie nach der Kalibrierung den Puffer zur Elution (EB) mit einem fusselfreien Tuch von der Säule ab.
  5. Während das 0,5-mL-Gefäß mit RNA auf Eis bleibt, pipettieren Sie 1 µL RNA auf die Säule des Spektrophotometers. Senken Sie den Arm des Spektrophotometers ab, um die Absorption der Probe zu messen, um Menge und Qualität der isolierten RNA zu bestimmen.
    HINWEIS: Weitere Einzelheiten zu akzeptablen Qualität und Quantität für nachgeschaltete Anwendungen finden Sie im folgenden Abschnitt „Ergebnisse“.

Ergebnisse

Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll, wie oben erwähnt, ist das Entfernen einer geeigneten Menge Wasser von den gesammelten Tardigraden, bevor der Extraktionspuffer (XB) für die RNA-Extraktion zugegeben wird. Zu viel verbleibendes Wasser führt zu einer Verdünnung des Extraktionspuffers (XB) und zu einer minderwertigen RNA-Extraktion aus den Tieren (d. h. RIN < 7, 260/280-Verhältnis <1,8, 260/230-Verhältnis <1,8 und/oder Konzentration <5 ng/µL), was nach der Elution zu einer verminderten RNA-Konzentration und -qualität führt. Das Entfernen zu viel Wassers kann die Tiere schnell austrocknen, was möglicherweise zur Letalität führt und die RNA-Qualität verringert, da nach dem Absterben die RNase-Aktivität zunehmen kann. Eine visuelle Darstellung zeigt die geeignete Menge Wasser an, die vor dem Hinzufügen des Extraktionspuffers (XB) mit den Tardigraden im Reaktionsgefäß verbleiben sollte (Abbildung 1B), um die erfolgreiche Durchführung dieses Protokolls zu unterstützen.

Bisher wurde dieses Protokoll an sechs verschiedenen Bärtierchenarten getestet, einschließlich eines Heterotardigraden (V. celatus). Diese Isolierungen ergaben RNA-Konzentrationen zwischen 11 ng/µL und 106,6 ng/µL (bestätigt mittels Mikrovolumen-Spektrophotometer, Tabelle 1) sowie zwischen 9 ng/µL und 113 ng/µL (bestätigt durch mikrofluidische Gelelektrophorese, Tabelle 2). Die Anzahl der Tiere, die für die RNA-Isolierung benötigt wird, hängt von der Größe der jeweiligen Art ab. Größere Bärtierchen, wie Arten der Gattung Paramacrobiotus und Milnesium sp., liefern bereits mit nur 25 Tieren ausreichende RNA-Konzentrationen (Tabelle 1). Bei kleineren Arten wie H. exemplaris und V. celatus ist die Isolierung dagegen erfolgreicher mit 100 oder mehr Tieren (Tabelle 1). Die meisten Isolate weisen ein 260/280-Verhältnis um 2 auf, was auf saubere RNA hinweist30. Bei Isolierungen einiger Arten (V. celatus und H. exemplaris, sowie der Paramacrobiotus-Art) tritt gelegentlich ein niedriges 260/230-Verhältnis auf, was auf eine Kontamination mit Reagenzien hindeutet30. Dies trat häufiger bei Verwendung einer geringeren Anzahl von Tieren auf (100 bei V. celatus und H. exemplaris sowie 25 bei Paramacrobiotus-Arten), was darauf hindeutet, dass zu wenige Tiere das Risiko einer Reagenzienkontamination in der endgültig eluierten RNA erhöhen können. Durch die Beurteilung der RNA-Qualität via mikrofluidische Gelelektrophorese kann eine RNA-Integritätszahl (RIN) berechnet werden. Ein RIN-Wert zwischen 9 und 10 deutet auf hochwertige RNA mit geringer Degradation hin31, und es wird allgemein empfohlen, bei einem RIN unter 7 keine nachgeschalteten Verfahren wie die RNA-Sequenzierung durchzuführen. Einige Beispielergebnisse der mikrofluidischen Gelelektrophorese sind dargestellt (Abbildung 3) für Proben mit hohem sowie niedrigem bzw. nicht nachweisbarem RIN. Einige dieser Proben wurden von weiteren Analysen ausgeschlossen (Tabelle 2, Abbildung 3A,D). Dennoch wurden einige Proben mit niedrigem bzw. nicht nachweisbarem RIN für die Bibliotheksherstellung zur RNA-Sequenzierung verwendet und führten dennoch zu qualitativ hochwertigen Sequenzierergebnissen (Tabelle 2, Abbildung 3B,F, unveröffentlichte Daten, siehe „Diskussion“ für weitere Informationen).

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Abbildung 1: Aufbau zur RNA-Isolierung. Bilder zeigen eine Pipettenbirne, die an eine Aspirationsröhre angeschlossen ist, die mit einer Glaskapillare ausgestattet ist, um Tiere zu bewegen und Wasser abzusaugen (A) sowie eine Darstellung der akzeptablen Restmenge an Wasser vor der Zugabe des Extraktionspuffers (XB) zu Paramacrobiotus-Tardigraden (B). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Aufbau des Elutionsrohrs für die finale Elution. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der Mikrofluidik-Gel-Elektrophorese für H. exemplaris und P. gadabouti. (A) RNA-Gel von H. exemplaris, das ionisierender Strahlung ausgesetzt wurde. (B) RNA-Gel von P. gadabouti und H. exemplaris unter Kontrollbedingungen. (C–F) Repräsentative Peakprofile von einer hochwertigen H. exemplaris-RNA-Probe (C), von einer H. exemplaris-Probe fragwürdiger Qualität (D), von einer gut qualitativen P. gadabouti-Probe (E) und von einer H. exemplaris-Probe mit sichtbarer Degradation (Peak bei 147 bp) (F). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Repräsentative RNA-Konzentrationen und Qualitätsangaben verschiedener Tardigraden-Arten, ermittelt mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer. *Konzentrationen unter 20 ng/µL, wie mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer ermittelt, können zu ungenauen Absorptionsverhältnissen führen. **Niedriges 260/230-Verhältnis, verursacht durch falsche Zentrifugationsgeschwindigkeit in Schritt 5.7. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Repräsentative RNA-Konzentrationen und Qualitätsinformationen von zwei Tardigradenarten, die mit einem Mikrofluidik-Gelelektrophorese-System gesammelt wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Isolierung von RNA aus Tardigraden zu erleichtern, die in ausreichender Menge und Qualität vorliegt, um für nachfolgende Anwendungen geeignet zu sein, die Untersuchungen zur Stressresistenz von Tardigraden ermöglichen. In diesem Protokoll wurden Bereiche hervorgehoben, in denen Anwender auf Probleme stoßen können, darunter das vollständige Entfernen des Wassers vor dem Hinzufügen des Extraktionspuffers (XB) (Schritt 2.5), die Zerstörung der Tardigradenkörper (Schritt 3.1–3.3), das Überführen des Überstandes auf die Säule zur Reinigung (Schritt 5.3) und die Elution der RNA (Schritt 8.3). Fehler in einem dieser Schritte können zu einer verminderten Konzentration oder Qualität der gewonnenen RNA führen. Falls die resultierende RNA-Konzentration unter 5 ng/µL liegt (gemessen mittels Mikrovolumen-Spektrophotometer), sollte der Anwender erwägen, die RNA-Isolierung erneut durchzuführen – entweder (1) mit mehr Ausgangsmaterial an Tieren (>100 bei kleinen Arten oder >50 bei größeren Arten) oder (2) durch Wiederholung des Protokolls unter besonderer Beachtung der Schritte zum Entfernen des Wassers, zur Zerstörung der Tardigraden und zur Elution.

Dieser Artikel liefert Beispiele für Bewertungen der RNA-Qualität (RIN, 260/280-Verhältnis, 260/230-Verhältnis), die als geeignet oder ungeeignet für die RNA-Sequenzierung erachtet wurden (Tab. 1, Tab. 2, Abb. 3). Gelegentlich werden bei einigen RNA-Isolierungen mit diesem Protokoll niedrige (<1,0) 260/230-Verhältnisse beobachtet (Tab. 1), was auf das Vorhandensein von Restmengen organischer Verbindungen hindeutet. Dies war meist mit einer geringen Anzahl von Tieren verbunden. Falls eine Erhöhung der Tieranzahl nicht möglich ist oder falls Anwender*innen regelmäßig auf niedrige 260/230-Verhältnisse stoßen, wird empfohlen, einen zusätzlichen Waschschritt mit Wash Buffer 2 (W2) einzufügen (Wiederholung von Schritt 7,6) und/oder die Trocken-Spin-Zentrifugationszeit in Schritt 7,7 zu verlängern, um eine vollständige Entfernung dieser Kontaminationen sicherzustellen. Außerdem ist anzumerken, dass die eine repräsentative H. exemplaris-Isolierung mit niedrigem 260/230-Verhältnis (Tab. 1) von einer Studierenden durchgeführt wurde, die zum ersten Mal das Protokoll anwandte und im Nachhinein erkannte, dass Schritt 5,7 (Zentrifugation zur Entfernung von Ethanol nach der Bindung der RNA an die Säule) mit einer falschen Zentrifugationsgeschwindigkeit (zu langsam) durchgeführt wurde. Dies führte vermutlich dazu, dass Ethanol an der Säule verblieb und sich durch das gesamte Protokoll fortpflanzte, was letztlich das schlechte 260/230-Verhältnis verursachte. Nachfolgende Isolierungen durch dieselbe Person ergaben 260/230-Werte im akzeptablen Bereich (nicht niedriger als 1,5). Daher sollten alle Anwender*innen, insbesondere Erstanwender*innen, besonders genau auf die Zentrifugationsgeschwindigkeiten achten, um solche Probleme zu vermeiden. Trotz gelegentlich niedriger 260/230-Verhältnisse oder niedriger RIN-Werte bei H. exemplaris konnte RNA mit ähnlichen Qualitätskennzahlen dennoch erfolgreich für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung verwendet werden, um differentielle Genexpression nach Exposition gegenüber ionisierender Strahlung oder anderen Stressfaktoren zu untersuchen8 (Tab. 1, Tab. 2 und unveröffentlichte Daten). Ebenso führte die mit diesem Protokoll isolierte RNA aus P. gadabouti zu hoher RNA-Konzentration und -qualität (bestätigt durch RIN, Tab. 2, Abb. 3) und ergab aussagekräftige RNA-Sequenzierungsdaten (unveröffentlichte Daten). Anekdotisch wurde in dieser Studie erfolgreich RNA aus H. exemplaris mit niedrigen Konzentrationen (5–9 ng/µL) verwendet, um cDNA für die erfolgreiche nachgeschaltete Klonierung von H. exemplaris-Genen herzustellen8. Wenn die RNA aus H. exemplaris zu niedrigen bzw. nicht nachweisbaren Konzentrationen und RIN-Werten führte (gemessen mittels Mikrofluidik-Gel-Elektrophorese), wurde die RNA erneut isoliert, bevor mit der Bibliotheksvorbereitung für die RNA-Sequenzierung fortgefahren wurde (Tab. 2, Abb. 3A,D). Die Entscheidung, die RNA-Isolierung für diese Probe erneut durchzuführen (Abb. 3A,D), anstatt wie bei anderen Proben von H. exemplaris mit nicht nachweisbarem RIN direkt zur Sequenzierung überzugehen (Abb. 3B,F), basierte auf dem Fehlen klarer Banden im Mikrofluidik-Gel, was auf einen Fehler beim Beladen, auf abgebaute RNA oder auf unzureichende RNA-Konzentration hindeuten kann. Im Gegensatz dazu ergab RNA aus H. exemplaris, die eine relativ niedrige Konzentration, einen nicht nachweisbaren RIN und Anzeichen für teilweisen RNA-Abbau (erkennbar an erhöhten Mengen an kurzkettiger RNA) aufwies, nach der Bibliotheksvorbereitung dennoch verwendbare Sequenzierungsdaten (unveröffentlichte Daten, Tab. 2, Abb. 3B,F). Daher sollte, obwohl hier einige Richtlinien zur Beurteilung der Eignung von RNA-Proben für nachgeschaltete Anwendungen gegeben werden, die endgültige Entscheidung im Ermessen des/der Anwenders liegen, wobei die spezifische nachgeschaltete Anwendung bei der Bewertung der ausreichenden Qualität und Menge der RNA berücksichtigt werden sollte.

Wissenschaftler, die RNA aus Tardigraden isolieren möchten, müssen mehrere Aspekte berücksichtigen, um das am besten geeignete Protokoll für ihren Zweck auszuwählen. Alle bisher beschriebenen Methoden zur RNA-Isolierung (einschließlich des hier beschriebenen Verfahrens) haben RNA in ausreichender Menge und Qualität geliefert, um nachgeschaltete Anwendungen wie RNA-Sequenzierung, cDNA-Synthese und qPCR8,12,13,17,21,22,25,27 zu ermöglichen. Kosten sind oft ein entscheidender Faktor, insbesondere für Forschungslabore mit begrenztem Budget oder Lehrlabore. Das hier beschriebene Protokoll ist pro Isolationsreaktion teurer als zuvor beschriebene Protokolle. Wir argumentieren jedoch, dass der erhöhte Kostenaufwand mit Vorteilen im Vergleich zu früheren Protokollen einhergeht. Im Vergleich zu anderen spaltenbasierten RNA-Isolierungsverfahren23 kann das hier beschriebene Protokoll aus einer geringeren Menge an Ausgangsmaterial (weniger Tiere) ausreichend RNA von hoher Qualität gewinnen. Außerdem erwies sich das zuvor beschriebene spaltenbasierte Protokoll in unseren Händen als inkonsistent und führte häufig zu extrem niedrigen RNA-Ausbeuten, die für nachgeschaltete Schritte unzureichend waren (unveröffentlichte Daten). Das hier beschriebene Protokoll ist außerdem deutlich sicherer als ein phenolbasiertes Verfahren, da es nicht erforderlich macht, dass Anwender gefährliche Chemikalien handhaben, die einen Abzug erfordern. Ein häufiges Problem bei phenolbasierten RNA-Extraktionsprotokollen ist zudem die Mitübertragung von Phenol, was die RNA-Reinheit beeinträchtigt und nachgeschaltete Anwendungen stören kann. Diese Nachteile machen phenolbasierte RNA-Extraktionsverfahren für Studierende (sowohl in Forschungslaboren als auch im Unterricht) weniger zugänglich. Das phenolbasierte Verfahren ist jedoch am kostengünstigsten. Das hier beschriebene Protokoll eignet sich nicht zur Isolierung von RNA aus einem einzelnen Tier, um transkriptomische Reaktionen einzelner Organismen zu untersuchen (wie von Kirk et al veröffentlicht), sondern ist stattdessen nützlich, um gemeinsame Veränderungen zwischen Individuen als Reaktion auf einen Stressfaktor zu untersuchen und so einen ganzheitlicheren Einblick in Stressreaktionen zu gewinnen. Daher sollten Anwender die Bedeutung von Kosten, Tierverfügbarkeit und Benutzerfreundlichkeit der vorhandenen Protokolle gegeneinander abwägen, um das am besten geeignete Verfahren auszuwählen.

Dieser Bericht bestätigte, dass dieses Protokoll RNA in ausreichender Menge und Qualität aus sechs verschiedenen Bärtierchen-Arten gewinnt, einschließlich einer repräsentativen Art aus der Klasse Heterotardigrada. Darüber hinaus liefert diese RNA-Isolationsmethode ausreichend RNA aus einer realistischen Anzahl Tiere (25–200, abhängig von der Artengröße). Die Validierung dieses RNA-Isolationsprotokolls an mehreren Arten eröffnet den Zugang zum Verständnis faszinierender Aspekte der Bärtierchen-Biologie. Dies beschränkt sich nicht nur auf die Untersuchung der Stressresistenz, sondern erstreckt sich auch auf das Verständnis der Evolution dieser Tiere, einschließlich der Evolution von Resistenzmechanismen und ihrer Entwicklung. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für Nicht-Modell- und im Feld gesammelte Bärtierchen-Arten, bei denen die Biomasse begrenzt ist und standardisierte Methoden zur RNA-Isolierung fehlen. Schließlich ist dieses Protokoll für Forschende zugänglich und kann reproduzierbar von Studierenden durchgeführt werden, was es zu einer wertvollen Ressource in Lehr- oder Forschungslaboren an Institutionen mit Schwerpunkt auf der Ausbildung von Studierenden macht.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Startgelder der UNC Asheville (an CCH) und durch eine NSF-Förderung 2225683 an Jason Pienaar (postdoktoraler Betreuer von PK) unterstützt. Wir danken der UNC High Throughput Sequencing Facility für technische Unterstützung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5-mL-MikrofugegefäßeUSA Scientific1615-5500Seal-Rite 1,5 mL-Mikrozentrifugenröhrchen, abgestuft, naturfarben, aus Polypropylen, 500 Stück/Beutel
70 % EthanolVWR71001-654Zur Reinigung von Arbeitsflächen/Geräten
Arcturis PicoPure RNA-Isolierungs-KitFisherKIT0204Kit mit Komponenten für das in dieser Arbeit beschriebene Isolierungsprotokoll
ZentrifugeEppendorf5405000441Zentrifuge 5425, mit Drehreglern, nicht gekühlt, mit Rotor FA-24x2, 120 V/50–60 Hz (USA)
Deer Park Spring WaterJeder LebensmittelladenN/VDieses Medium dient zur Kultivierung von Tardigraden und zum Spülen der Tardigraden vor der RNA-Isolierung
DissektionsmikroskopZeissN/VZeiss Stemi 305, Zoombereich 5:1 und Gesamtmagnifikation 8x–40x, mit Transilluminationsmodul M LED
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, RNase-frei (1 U/µL)
Gefilterte Pipettenspitzen, 10 µLVWR76322-528Jede gefilterte Pipettenspitze ist geeignet
Gefilterte Pipettenspitzen, 1000 µLVWR76322-154Jede gefilterte Pipettenspitze ist geeignet
Gefilterte Pipettenspitzen, 20 µLVWR76322-134Jede gefilterte Pipettenspitze ist geeignet
Gefilterte Pipettenspitzen, 200 µLVWR76322-150Jede gefilterte Pipettenspitze ist geeignet
Glas-KapillarenFisher50-821-811World Precision Instrument Standard Glass Capillaries – 1B120-6 (6 Zoll, Außendurchmesser 1,2 mm, ohne Filament). Diese werden über einer Flamme zu zwei Kapillaren mit verengten Enden gezogen und anschließend auf den geeigneten Durchmesser gebrochen, um die gewünschte Tardigradenart mit der Mundpipette aufzusaugen.
HeizblockEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, Grundgerät ohne Thermoblock, 100–130 V/50–60 Hz (USA/JP/Südamerika/TW)
High Sensitivity RNA Screen Tape-LadderAgilent5067-5581Ladder für die hochsensible Analyse von Gesamt-RNA an TapeStation-Systemen
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Für die hochsensible Analyse von Gesamt-RNA an TapeStation-Systemen
High Sensitivity RNA ScreenTape-ProbenpufferAgilent5067-5580Puffer für die hochsensible Analyse von Gesamt-RNA an TapeStation-Systemen
Mikrofluidische GelelektrophoreseAgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation System
Mikrovolumen-SpektrophotometerFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, Detektortyp: 2048-Element CMOS-Linearsensor, Display: 10-Zoll-Farbdisplay mit hoher Auflösung, Sprachen: Chinesisch, Englisch, Französisch, Japanisch, Deutsch, Lichtquelle: Xenon-Blitzlampe, Spektralbandbreite: ≤ 1,8 nm (FWHM bei Hg 254 nm), Spannung: 12 VDC
MundpipetteMillipore SigmaA5177Aspirator-Rohrverbände für kalibrierte Mikrokapillar-Pipetten
Nukleasefreies WasserFisherFERR0581Thermo Scientific Wasser, nukleasefrei
Pipetten (2,5 µL, 20 µL, 200 µL und 1000 µL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, 4er-Pack
RNase AwayFisher21-402-178Thermo Scientific RNase AWAY Oberflächendesinfektionsmittel
RNase-freie Röhrchen und PistillenFisher12-141-368RNase-freie Röhrchen und Pistillen für die RNA-Isolierung

Referenzen

  1. Møbjerg N, Neves RC. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2021;254:110890.
  2. Møbjerg N, Halberg KA, Jørgensen A, Persson D, Bjørn M, Ramløv H, et al. Survival in extreme environments—on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiol (Oxf). 2011;202(3):409-420.
  3. Hibshman JD, Clegg JS, Goldstein B. Mechanisms of desiccation tolerance: themes and variations in brine shrimp, roundworms, and tardigrades. Front Physiol. 2020;11:592016.
  4. Hengherr S, Schill RO. Environmental adaptations: cryobiosis. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 295-310.
  5. Schill RO, Hengherr S. Environmental adaptations: desiccation tolerance. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 273-293.
  6. Guidetti R, Rizzo AM, Altiero T, Rebecchi L. What can we learn from the toughest animals of the Earth? Water bears (tardigrades) as multicellular model organisms in order to perform scientific preparations for lunar exploration. Planet Space Sci. 2012;74(1):97-102.
  7. Jönsson KI. Radiation tolerance in tardigrades: current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 2019;11(9):1333.
  8. Clark-Hachtel CM, Hibshman JD, De Buysscher T, Stair ER, Hicks LM, Goldstein B. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 2024;34(9):1819-1830.e6.
  9. Hashimoto T, Kunieda T. DNA protection protein, a novel mechanism of radiation tolerance: lessons from tardigrades. Life (Basel). 2017;7(2):26.
  10. Chavez C, Cruz-Becerra G, Fei J, Kassavetis GA, Kadonaga JT. The tardigrade damage suppressor protein binds to nucleosomes and protects DNA from hydroxyl radicals. Elife. 2019;8:e47682.
  11. Kamilari M, Jørgensen A, Schiøtt M, Møbjerg N. Comparative transcriptomics suggest unique molecular adaptations within tardigrade lineages. BMC Genomics. 2019;20(1):607.
  12. Boothby TC, Tapia H, Brozena AH, Piszkiewicz S, Smith AE, Giovannini I, et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 2017;65(6):975-984.e5.
  13. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 2022;23(1):405.
  14. Anoud M, et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade-specific DNA-binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 2024;13:RP92621.
  15. Förster F, Liang C, Shkumatov AV, et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 2012;6:69-96.
  16. Horikawa DD, Sakashita T, Katagiri C, et al. Analysis of DNA repair and protection in the tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 2013;8(6):e64793.
  17. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  18. Li L, et al. Multi-omics landscape and molecular basis of radiation tolerance in a tardigrade. Science. 2024;386(6720):eadl0799.
  19. Hibshman JD, Clark-Hachtel CM, Bloom KS, Goldstein B. A bacterial expression cloning screen reveals single-stranded DNA-binding proteins as potent desicco-protectants. Cell Rep. 2024;43(11):114956.
  20. Hashimoto T, Horikawa DD, Saito Y, et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nat Commun. 2016;7:12808.
  21. Yoshida Y, Hirayama A, Arakawa K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2024;100(7):414-28.
  22. Murai Y, et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests the possibility of convergent evolution of abundant heat-soluble proteins in Tardigrada. BMC Genomics. 2021;22(1):813.
  23. Boothby TC. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(11):prot102376.
  24. Arakawa K, Yoshida Y, Tomita M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 2016;3:160063.
  25. Yoshida Y, Sugiura K, Tomita M, Matsumoto M, Arakawa K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 2019;19(1):20.
  26. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  27. Kirk MJ, Xu C, Paules J, Rothman JH. Single-animal, single-tube RNA extraction for comparison of relative transcript levels via qRT-PCR in the tardigrade Hypsibius exemplaris. J Vis Exp. 2025;(215):e66935. doi:10.3791/66935.  
  28. Linz DM, Hara Y, Deem KD, Kuraku S, Hayashi S, Tomoyasu Y. Transcriptomic exploration of the coleopteran wings reveals insight into the evolution of novel structures associated with the beetle elytron. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2023;340(2):197-213.
  29. Agilent Technologies Inc. RNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems. Part No. G2991-90121 Rev. D. Santa Clara (CA): Agilent Technologies; 2018.
  30. Manchester KL. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996;20(6):968-70.
  31. Imbeaud S, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005;33(6):e56.

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