Arzneimittel-Wechselwirkung zwischen Eugenol und Repaglinid bei Typ-2-Diabetes mellitus und sein möglicher Mechanismus

Zusammenfassung

Diese Studie hatte zum Ziel, potenzielle Wirkstoffwechselwirkungen zwischen Eugenol (EUG) und Repaglitid (RPG) bei Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) zu untersuchen.

Zusammenfassung

Diese Studie untersuchte die potenzielle Wirkstoffwechselwirkung (DDI) zwischen Eugenol (EUG) und Repaglinid (RPG) bei Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM). Ein T2DM-Rattenmodell wurde unter Verwendung einer fettreichen Ernährung und Streptozotocin (STZ) entwickelt. Die Einzeldosis-Gruppe erhielt 0,4 mg/kg RPG, und die Ko-Dosierungsgruppen wurden sieben Tage lang mit EUG (50, 100, 150 mg/kg) vorbehandelt, bevor sie eine Einzeldosis RPG (0,4 mg/kg) erhielten. Die Blutzucker- und Pharmakokinetikparameter von RPG wurden in den Plasmaproben von Ratten bewertet. Der Einfluss von EUG auf die metabolische Stabilität von RPG und die Aktivität von Cytochrom P3A (CYP3A) wurde in Rattenlebermikrosomen (RLM) untersucht. Bei T2DM-Ratten zeigte die RPG-Behandlung einen hypoglykämischen Effekt, der durch EUG-Ko-Gabe in dosisabhängiger Weise weiter gefördert wurde (S. < 0,001). Die EUG-Parallelverabreichung beeinflusste die Pharmakokinetik von RPG, indem sie die Fläche unter der Kurve erhöhte (AUC, erhöhte um 88,64 %, 164,59 % und 244,72 % gegenüber einzelner RPG, p < 0,001), die Plasmamaximalkonzentration (C_max, erhöht um 18,61 %, 53,58 % und 77,63 % gegenüber einzelner RPG, p < 0,01), die maximale Konzentration (T_max, 1,0 Stunden bei EUG-Co-Gabe vs 0,5 Stunden bei einzelner RPG), Halbwertszeit (t_1/2, verlängert 33,86 %, 49,61 % und 88,19 % vs. Einzel-RPG, p < 0,01), mittlere Retentionszeit (MRT, verlängert 17,62%, 26,42%, 44,04% vs. einzelne RPG, p < 0,001) sowie eine verringerte Abklärungsrate (Clz/F, sank um 48,92%, 63,31% und 74,10% vs. einzelne RPG, p < 0,001) dosisabhängig. In vitro Die RLM-Studie verbesserte EUG die metabolische Stabilität von RPG, indem es die Halbwertszeit (44,09 ± 3,25 min) verlängerte und die intrinsische Clearance reduzierte (30,55 ± 3,69 μL/min/mg). EUG hemmte außerdem die Aktivität von CYP3A mit einem IC₅₀ von 7,90 ± 1,79 μM. Die gemeinsame Verabreichung von EUG förderte den hypoglykämischen Effekt von RPG durch eine Steigerung der systemischen RPG-Exposition bei T2DM-Ratten, möglicherweise durch Verbesserung der RPG-Stoffwechselstabilität und Hemmung der CYP3A-Aktivität.

Einleitung

Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) ist eine chronische Stoffwechselstörung, die durch Insulinresistenz oder verminderte Insulineffizienz gekennzeichnet ist und weltweit Millionen von Menschen betrifft. Komplexe Wechselwirkungen mit genetischer Anfälligkeit und Lebensstilfaktoren sind an T2DM beteiligt, was zu einer beeinträchtigten Glukoseaufnahme, übermäßiger hepatischer Glukoneogenese und chronischer, niedriggradiger Entzündung² führt. T2DM kann bei unsachgemäßer Behandlung zu schwerwiegenden Komplikationen führen, darunter Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Nierenerkrankungen, Retinopathie und Neuropathie, was die Lebensqualität der Patienten erheblich beeinträchtigt und die Sterblichkeit erhöht². Zu den aktuellen Behandlungen von T2DM gehören Metformin, Sulfonylharnstoffe, GLP-1-Rezeptoragonisten und DPP-4-Inhibitoren usw.^3. Repaglinid (RPG) ist eine Art von kurz wirkendem Meglitinid, das durch die Stimulation der Insulinsekretion wirkt und die Eigenschaft der Dosisflexibilität⁴ besitzt. Im Vergleich zu Sulfonylharnstoffe bieten Glinide eine bessere Kontrolle der postprandialen Hyperglykämie, verringern das Risiko bestimmter Nebenwirkungen wie Hypoglykämie und bieten ein günstigeres Sicherheitsprofil, insbesondere bei Patienten mit Nierenversagen ^5,6. RPG wird nach der oralen Verabreichung schnell aufgenommen und erreicht typischerweise innerhalb von 30–60 Minuten die Plasmakonzentrationen, und seine kurze Halbwertszeit führt zu einer kurzen Stimulation der Insulinfreisetzung. Klinisch wird RPG entweder als Monotherapie oder in Kombination mit anderen oralen antihyperglykämischen Mitteln eingesetzt, um die glykämische Kontrolle^zu optimieren. Seine klinische Anwendung ist jedoch durch geringe orale Bioverfügbarkeit (etwa 56%), schnellen Leberstoffwechsel und ein mögliches Risiko für Hypoglykämie 8,9,10,11,12,13,14 begrenzt. Diese Nachteile unterstreichen die Notwendigkeit einer umfassenden Behandlungsstrategie.

Eugenol (EUG), chemisch bekannt als 4-allyl-2-methoxyphenol, ist eine organische Verbindung mit der chemischen Formel C₁₀H₁₂O₂¹⁵. EUG ist eine farblose bis blassgelbe Flüssigkeit und eine aktive phenolische Verbindung, die hauptsächlich in Nelken (Eugenia caryophyllata Thunb.) und anderen aromatischen^Pflanzen vorkommt. EUG hat aufgrund seiner verschiedenen pharmakologischen Eigenschaften, darunter antioxidative, entzündungshemmende, antibakterielle, schmerzlindernde und antitumorhemmende Wirkungen, viel Aufmerksamkeit auf EUG erregt 17,18,19. Jüngste Studien haben gezeigt, dass EUG den potenziellen Wert als Zusatztherapie für T2DM gezeigt hat, da sowohl in vitro als auch in vivo experimentelle Belege darauf hindeuten, dass EUG die Insulinsensitivität verbessert, die Glukoseaufnahme in peripheren Geweben fördert, die hepatische Glukoneogenese hemmt und die Funktion der β-Zellen der Pankreas-Zyklüre schützt^20,21. Diese vielschichtigen Maßnahmen, kombiniert mit relativ niedriger Toxizität²², positionieren EUG als sehr vielversprechenden Naturarzneimittelkandidaten, der die Schwächen traditioneller klinischer Medikamente ergänzen und T2DM-bedingte Komplikationen durch einen synergistischen Mechanismus lindern kann.

Die Cytochrom-P450-Enzyme (P450s) spielen eine entscheidende Rolle im Prozess des Arzneimittelstoffwechsels und vermitteln Arzneimittelwechselwirkungen (DDIs), indem sie bestimmte Subtypen induzieren oder hemmen, was für eine sichere und wirksame^{Behandlung von} entscheidender Bedeutung ist. Bemerkenswert ist, dass RPG hauptsächlich in der Leber von CYP2C8 und CYP3A4^24,25 metabolisiert wird. Bei gleicher Verabreichung mit Quercetin (QCT) verbessert QCT die Bioverfügbarkeit von RPG in vivo, indem es den Leber-First-Pass und den systemischen Stoffwechsel mittels CYP450s²⁶ hemmt. Es wurde außerdem berichtet, dass EUG die Aktivität von CYP450s, einschließlich 1A2, 2C9, 2D6 und 3A4, konzentrationsabhängig unterdrückt, was auf mögliche Wechselwirkungen hinweist, wenn EUG zusammen mit Medikamenten verabreicht wird, die von diesen^{Enzymen 27} metabolisiert werden. Trotz des vielversprechenden Potenzials von EUG als Zusatztherapie für T2DM und der bekannten Anfälligkeit von RPG für CYP-vermittelte DDIs bleibt unklar, ob EUG die systemische Exposition, die metabolische Stabilität oder den CYP3A-vermittelten Stoffwechsel von RPG verändert. Da sowohl EUG als auch RPG wahrscheinlich gemeinsam in der klinischen Praxis oder in Nahrungsergänzungsumfeldungen verabreicht werden, birgt das Fehlen von DDI-Daten zwischen ihnen ein potenzielles Risiko unbeabsichtigter Veränderungen der RPG-Plasmakonzentrationen. Solche Veränderungen könnten entweder zu einer verminderten therapeutischen Wirksamkeit oder einem erhöhten Risiko für Hypoglykämie führen. Daher stellt diese Evidenzlücke ein erhebliches Hindernis für die rationale und sichere Kombination von Naturprodukten mit herkömmlichen Antidiabetika dar. Daher ist es unerlässlich, die Wirkung von EUG auf die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von RPG systematisch zu bewerten und den zugrunde liegenden Stoffwechselmechanismus aufzuklären, mit besonderem Fokus auf die Aktivität von CYP3A. Angesichts der oben genannten Belege könnte spekuliert werden, dass EUG den RPG-Stoffwechsel beeinflussen könnte, indem es die Aktivität von CYP450 verändert. Dies ist die erste Studie, die die EUG–RPG-Interaktion in einem T2DM-Setting untersucht. Die Ergebnisse sollen eine kritische Wissenslücke schließen und eine mechanistische Grundlage für die Optimierung der sicheren gemeinsamen Verwaltung von EUG und RPG im T2DM-Management bieten. Wenn eine gemeinsame Verabreichung in Betracht gezogen wird, sollte das Potenzial für eine erhöhte RPG-Exposition berücksichtigt werden, und Anzeichen einer Hypoglykämie sollten überwacht werden, insbesondere wenn EUG in hohen Dosen oder als konzentriertes Präparat eingenommen wird. Darüber hinaus exprimieren Ratten zwar CYP3A-Isoformen, die funktional dem menschlichen CYP3A4 ähneln, aber die direkte Übertragung quantitativer Ergebnisse auf den Menschen erfordert Vorsicht aufgrund von Artunterschieden in der Enzymexpression und katalytischer Aktivität.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Ethikkomitee der Jilin-Akademie der Chinesischen Medizinischen Wissenschaften (Datum: 2024.11.21/Nr.2024112) in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien²⁸ genehmigt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tierhaltung

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (200–250 g) wurden in einem Labortierzimmer unter folgenden Bedingungen untergebracht: Temperatur: 22 °C ± 2 °C, relative Luftfeuchtigkeit: 40–60 % und ein 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus, mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser, um eine Woche Akklimatisierung^{zu ermöglichen.}

2. Tiermodellierung, Behandlung und Probenverarbeitung

Die Stichprobengröße wurde anhand einer Leistungsanalyse mit dem F-Test (G*Power 3.1.9.7) bestimmt. Eine A-priori-Potenzanalyse wurde mit einer Effektgröße von 0,6, einem α-Niveau von 0,05 und einer gewünschten Potenz von 0,8 durchgeführt, was eine Gesamtstichprobengröße von 55 ergab. Diese Berechnung zeigte, dass mindestens 9 Ratten pro Gruppe benötigt wurden. Daher wurden pro Gruppe zehn Ratten eingesetzt, was eine tatsächliche Leistung von 0,86 erreichte.

Bevor das T2DM-Modell eingeführt wurde, wurden alle Ratten 12 Stunden lang gefastet. Anschließend wurden sie zufällig in zwei Gruppen eingeteilt: die Kontrollgruppe (n = 10) und die T2DM-Gruppe (n = 50). Die Einführung des T2DM-Rattenmodells erfolgte nach der zuvor berichteten^{Methode 31}. Kurz gesagt, Ratten der T2DM-Gruppe wurden vier Wochen lang mit einer fettreichen Ernährung (mit einem Fettgehalt von 60 %) gefüttert und erhielten anschließend eine einzelne intraperitoneale Injektion von 30 mg/kg STZ, gelöst im sterilen Citratpuffer (pH 4,4). Drei Tage nach der STZ-Injektion wurde der Blutzucker der Schwanzvene der Ratten mit einem Blutzuckermessgerät gemessen, und Ratten mit einer Blutzuckerkonzentration von über 16,7 mmol/L galten als erfolgreich etabliert von T2DM. In der Kontrollgruppe erhielten die Ratten eine normale Ernährung und intraperitoneale Injektionen von 0,9 % normaler Kochsalzlösung im gleichen Zeitraum wie die T2DM-Gruppe.

T2DM-Ratten wurden weiter in vier Gruppen mit jeweils 10 Ratten unterteilt: die T2DM + RPG Gruppe (einzelne RPG), die T2DM + RPG + EUG (50 mg/kg) Gruppe (Co-RPG+EUG 50 mg/kg), die T2DM + RPG + EUG (100 mg/kg) Gruppe (co-RPG+EUG 100 mg/kg) und die T2DM + RPG + EUG (150 mg/kg) Gruppe (co-RPG+EUG 150 mg/kg). Nach 12 Stunden Fasten wurden die Ratten in der Einzel-RPG-Gruppe oral 0,4 mg/kg RPG (in normaler Kochsalzlösung suspendiert) mit einer Gavage-Nadel²⁶ verabreicht. Ratten in den co-RPG+EUG-Gruppen erhielten oral 50, 100 und 150 mg/kg EUG, einmal täglich für sieben aufeinanderfolgende Tage, und am achten Tag, nach einer weiteren 12-stündigen Fastenphase, erhielt die Co-Administrationsgruppe zusätzlich 0,4 mg/kg RPG mittels intragastrischer Wand. Anschließend wurden Blutzuckerwerte anhand von Blutproben aus der Schwanzvene bewertet.

Für die pharmakokinetische Analyse wurde die Blutprobe (0,2 ml) aus dem venösen plexus des hinteren orbitalen Plexus der Ratten in die heparinisierten Mikrozentrifugenröhren zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen (0,25 Stunden, 0,5 Stunden, 1 Stunden, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden und 8 Stunden nach der Dosis). Nach der Entnahme wurden die Proben zentrifugiert (1500 × g, 10 min, 4 °C), um das Plasma (blassgelb, klar) zu trennen, das bis zur Analyse bei -80 °C gelagert wurde. Die Plasmaproben wurden anschließend auf RPG-Konzentration mit der in Schritt 4 beschriebenen HPLC-Methode analysiert.

3. Stoffwechselstudie in den zusammengepoolten Rattenlebermikrosomen

Um den Mechanismus der pharmakokinetischen Veränderungen in vivo zu untersuchen, wurde der Einfluss von EUG auf die metabolische Stabilität des RPG und die CYP3A-Aktivität im RLM untersucht. RPG (3 μM) wurde mit oder ohne EUG in einem PBS-Puffer bei 37 °C mit einem Gesamtvolumen von 200 μL inkubiert, einschließlich RLM (0,5 mg/mL mikrosomales Protein) und eines NADPH-Regenerationssystems (1,3 mM NADP, 3,54 mM Glukose-6-phosphat, 0,4 U/mL Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase und 3,3 mM MgCl₂). Nach einer 5-minütigen Vorinkubation bei 37 °C ohne NADPH wurde die Reaktion durch das Hinzufügen des NADPH-Regenerationssystems eingeleitet. Die Mischung wurde anschließend bei 37 °C in einem Schüttelwasserbad inkubiert. Zu unterschiedlichen Inkubationszeiten (0 Min, 5 Min, 15 Min, 30 Min, 45 Min, 60 Min) wurden 30 μL Proben entnommen und in ein Mikrozentrifugenrohr mit eiskaltem Acetonitril überführt, um die Reaktion zu beenden. Die Proben wurden zentrifugiert (12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C), um das Überstandsmittel (klar) zu erhalten. Die resultierenden Supernatanten wurden anschließend auf RPG-Konzentration mit derselben HPLC-Methode analysiert, wie in Schritt 4 beschrieben.

4. HPLC-Analyse

Die RPG-Konzentration im Plasma (ab Schritt 2) und in mikrosomalen Inkubationen (ab Schritt 3) wurde mit der von Kim et ^al.26 berichteten HPLC-Methode analysiert. Die spezifischen Operationsschritte sind wie folgt: Proben (120 μL) wurden mit 300 μL Acetonitril mit Ketoconazol (interner Standard, 100 ng/mL) gemischt, um eine Proteinpräzipitation zu erreichen. Anschließend wurde das Gemisch vortexiert und bei 15.000 g × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Supernatant wurde in ein Mikrosäulen-Zentrifugenrohr übertragen und bei 25 °C unter einer Stickstoffatmosphäre verdampft. Der Rückstand wurde nach dem Trocknen mit 50 μL mobiler Phase wieder gelöst, dann vortexiert und zentrifugiert. Anschließend wurden 40 μL des Supernatants in die HPLC-Säule injiziert (250 mm × 4,6 mm, Partikelgröße 5 μm). Die Säule wurde bei 25 °C im isokratischen Elutionsmodus mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) und Acetonitril (Volumenverhältnis 46,4: 53,6) mit einer Durchflussrate von 1 mL/min eluiert. Der Eluent wurde mit einem Fluoreszenzdetektor mit einer Anregungswellenlänge von 240 nm überwacht.

5. Statistische Analyse

Pharmakokinetische Analysesoftware wurde verwendet, um pharmakokinetische Parameter zu berechnen, darunter AUC, C_max, T_max, t_1/2, MRT und Clearance. Statistische Analyse- und Grafiksoftware wurden für die Figurengenerierung und Datenanalyse verwendet. Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit Einweg-ANOVA (für Blutzuckervergleiche) oder zweiseitiger ANOVA (für pharmakokinetische Parametervergleiche) analysiert, je nach Anwendung, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Die Wirkung von EUG auf die CYP3A-Aktivität wurde mittels nichtlinearer Regressionsanalyse bewertet. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Halbwertszeit von EUG bei der RPG-metabolischen Stabilität in RLM wurde berechnet durch:
t_1/2 (Min) = 0,693/ln(C_t/C₀ × 100).

Intrinsische Clearance-Rate (μL/min/mg Protein) = v × 0,693/t_1/2;
v (μL/mg) = Inkubationsvolumen/Proteinkonzentration.

Ergebnisse

EUG förderte den hypoglykämischen Effekt von RPG bei T2DM-Ratten
Der Blutzuckerspiegel der Ratten in der T2DM-Gruppe war im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht (p < 0,001, 95%-KI: -13,90~-11,32), was auf die erfolgreiche Durchführung des T2DM-Modells hinweist (Abbildung 1A). Die Verabreichung eines einzelnen RPG unterdrückte den Blutzuckerspiegel bei den T2DM-Ratten (p < 0,001, 95%-KI: 5,26~7,84). Die gemeinsame Verabrei...

Diskussion

T2DM ist eine chronische Stoffwechselerkrankung, die eine langfristige Behandlung erfordert, und Patienten müssen aufgrund von Grunderkrankungen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Nierenerkrankung^oft mehrere Medikamente einnehmen. Das Risiko von DDIs steigt bei gleichzeitiger Verabreichung erheblich, da sie die Aufnahme, den Stoffwechsel oder die Wirksamkeit von hypoglykämischen Medikamenten beeinträchtigen können, was zu akuten Risiken wie einem hypoglykämischen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acetonitril	Merck, Deutschland	34851	≥99,9%
chromatographische Säule	Phenomenex, USA	00G-4041-E0	250 mm × 4,6 mm, Partikelgröße 5 µm
DAS	Beijing Bozhiyin, China	-	3,0
EUG	MUST Bio-technology, China	A0074	Reinheit ≥99%
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	-	9.0.0
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie	Shimadzu Corporation, Japan	228-45147-42	RF-20A
Ketoconazol	Merck, Deutschland	K1003	Reinheit 99,0-101,0%
Männliche Sprague-Dawley-Ratten	Shanghai Animal Center, China	-	200–250 g
NADPH	Merck, Deutschland	10107824001	97% (Trockengewicht)
OneTouch Ultra2 Blutzuckermessgerät	Life Scan Inc., USA	https://shop.onetouch.com/onetouch-sup-reg-sup-ultra-sup-reg-sup-2-meter/product/OTSUS05_0019	-
PBS	Merck, Deutschland	P4474	pH 7,4
RLM	Merck, Deutschland	M9066	-
RPG	Merck, Deutschland	R9028	Reinheit ≥98%
STZ	Merck, Deutschland	S0130	≥98% (HPLC)
EUG, Eugenol; RPG, Repaglinid; RLM, Rattenlebermikrosomen; NADPH, β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat; STZ, Streptozotocin; PBS, phosphatgepuffertes Salz.