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Acupotomie bei zervikaler Spondylose bei Ratten: Ein visualisiertes Protokoll zur Modelletablierung und Intervention

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DOI:

10.3791/72132

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3. September 2026

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1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Dermatology, Beijing Tsinghua Changgung Hospital, School of Clinical Medicine, Tsinghua Medicine, Tsinghua University, 3Acupuncture and Moxibustion Clinic, Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt ausführlich eine Modellierungsmethode für zervikale Spondylose bei Ratten und eine Akupotomie-Interventionsstrategie und liefert einen visualisierten Operationsprotokoll für entsprechende Forschungsarbeiten.

Zusammenfassung

Zervikale Spondylose (ZS) ist eine chronische degenerative Erkrankung. Degenerative Veränderungen in den Bandscheiben der Halswirbelsäule sowie nachfolgende pathologische Umbauprozesse beeinträchtigen umgebende Gewebe und Strukturen und führen zu klinischen Manifestationen wie Nackenschmerzen, Steifheit, eingeschränkter Beweglichkeit sowie gelegentlich Taubheitsgefühlen und ausstrahlenden Symptomen in die oberen Extremitäten. Unter diesen ist die Nervenwurzelkompression am häufigsten. Daher wurde in dieser Studie ein Rattenmodell der ZS, hervorgerufen durch Kompression der Halsnervenwurzeln, etabliert. Die Akupotomie-Therapie hat sich in der klinischen Behandlung der ZS als vielversprechend erwiesen, indem sie lokale Weichteiladhäsionen löst und die Nervenkompression lindert. Bisher fehlen jedoch visuell dokumentierte Verfahrensprotokolle für Tierversuche. Die vorliegende Studie beschreibt detailliert eine zuverlässige Methode zur Erzeugung eines Rattenmodells der ZS sowie das entsprechende Interventionsprotokoll mittels Akupotomie. Dabei werden der Prozess der Modellinduktion, die einzelnen Schritte der Akupotomie-Manipulation, die therapeutische Lokalisation, Techniken zur Fixierung der Ratte sowie wesentliche Vorsichtsmaßnahmen erläutert. Zusätzlich wurde mittels Elektromyographie (EMG) der erfolgreiche Aufbau des ZS-Modells bestätigt und die Intervention durch mechanische Reizschwellen, Ganganalyse sowie histopathologische Untersuchung der Nervenwurzeln evaluiert. Diese Arbeit liefert nicht nur eine Referenz für die Erstellung des ZS-Rattenmodells und die Durchführung der Akupotomie-Intervention, sondern bietet auch einen systematischen und praktikablen experimentellen Rahmen für zukünftige Untersuchungen der Wirkmechanismen.

Einleitung

Die zervikale Spondylose (CS) ist eine häufige degenerative Erkrankung der Wirbelsäule. Ihr zentraler pathologischer Prozess beginnt mit der Degeneration der Bandscheiben, die wiederum eine Reihe sekundärer pathologischer Veränderungen auslöst, einschließlich einer Verengung des Zwischenwirbelraums, der Bildung von Osteophyten und einer Hypertrophie der Bänder1,2. Diese pathologischen Veränderungen führen zu einer Vielzahl klinischer Symptome wie Schmerzen und Steifheit im Nacken- und Schulterbereich sowie ausstrahlender Taubheit in den oberen Extremitäten. In schweren Fällen können neurologische Ausfälle auftreten, darunter motorische Dysfunktionen und sogar Tetraplegie2,3. Bemerkenswerterweise hat sich die Inzidenz der zervikalen Spondylose in den letzten Jahren kontinuierlich erhöht, wobei das Erkrankungsalter zunehmend jünger wird und somit eine erhebliche sozioökonomische Belastung verursacht4. Die Degeneration der zervikalen Bandscheiben und die proliferierende Osteophytenbildung können benachbarte knöcherne und weichteilige Strukturen beteiligen und so zu einer Verengung des zervikalen Wirbelkanals oder der Zwischenwirbelforamina führen, wodurch angrenzende Strukturen wie zervikale Nervenwurzeln, das Rückenmark und die Arteria vertebralis komprimiert werden1,2,3,4. Unter diesen ist die Kompression der zervikalen Nervenwurzeln am häufigsten und macht etwa 60–70 % aller CS-Fälle aus5,6,7. Obwohl in der klinischen Praxis mehrere therapeutische Ansätze zur Verfügung stehen, darunter Physiotherapie, pharmakologische Behandlung und Chirurgie, haben sich konservative Therapien aufgrund der hohen Kosten, erheblichen Belastung und ungewissen postoperativen Ergebnisse chirurgischer Eingriffe als bevorzugte Behandlungsform für die meisten Patienten etabliert4. In der modernen medizinischen Praxis werden häufig nichtsteroidale Antiphlogistika und neurotrope Wirkstoffe eingesetzt. Obwohl diese Medikamente Schmerzen lindern und den Krankheitsverlauf bis zu einem gewissen Grad verlangsamen können, gehen sie mit Nebenwirkungen wie Schädigungen des Verdauungssystems und Nierenschäden einher8,9.

Die Akupotomie-Therapie ist eine charakteristische Behandlungsform, die auf den traditionellen chinesischen Akupunkturtheorien in Kombination mit modernen minimalinvasiven chirurgischen Techniken basiert. Sie wirkt durch das Durchtrennen und Freilegen von Weichteiladhäsionen, die Regulierung lokaler entzündlicher Faktoren und die Verbesserung der regionalen Mikrozirkulation10,11,12. In den letzten Jahren wurde die klinische Wirksamkeit der Akupotomie bei der zervikalen Spondylose weithin anerkannt und zeigt vielversprechendes Potenzial bei der Linderung von Nervenkompression, Schmerzlinderung und Verbesserung der zervikalen Motorik13,14. Dennoch ergeben sich bei der Anwendung in Tierversuchen Herausforderungen wie ungenaue Lokalisation und Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Eindringtiefe. Gleichzeitig ist die Schaffung stabiler und reproduzierbarer Tiermodelle eine wesentliche Voraussetzung, um diese klinischen Beobachtungen in fundierte, evidenzbasierte Schlussfolgerungen zu überführen. Die Methode der intravertebralen Nylonnaht erzeugt eine direkte mechanische Kompression durch Einbringen von Nylonfäden in das Zwischenwirbelloch und ahmt dadurch präzise den pathophysiologischen Prozess der klinischen Nervenwurzelkompression nach15. Dieser Modellierungsansatz bietet zudem Vorteile wie einen kurzen Modellierungszyklus und kontrollierbare Kompressionssegmente15. Allerdings stützt sich das chirurgische Vorgehen weitgehend auf persönliche Erfahrung, und detaillierte, visualisierte Operationsbeschreibungen fehlen derzeit.

Diese Studie stellt einen vollständigen, detaillierten und visualisierten experimentellen Protokollablauf vor, der die Erstellung eines Rattenmodells der zervikalen Spondylose sowie den gesamten Ablauf einer Akupotomie-Intervention umfasst. Da anästhetische Substanzen die Messung der mechanischen Withdrawal-Schwelle beeinflussen und somit die experimentellen Ergebnisse stören könnten16,17,18,19, wurde in dieser Studie eine spezielle Fixiervorrichtung für Ratten verwendet. Dieser Artikel bietet eine ausführliche Beschreibung des Induktionsprozesses des Rattenmodells, der schrittweisen Durchführung der Akupotomie, der präzisen Lokalisation der Behandlungsstellen, der Methoden zur Fixierung und Immobilisierung der Ratten sowie weiterer wichtiger experimenteller Vorsichtsmaßnahmen. Es kamen mehrere Evaluationsdimensionen zum Einsatz, darunter die Messung der mechanischen Withdrawal-Schwelle, elektrophysiologische Ableitungen, Ganganalyse und histopathologische Untersuchung der Nervenwurzeln. Ziel dieser Studie ist es, ein visualisiertes Protokoll für die Modellinduktion und die Akupotomie-Intervention beim Rattenmodell der zervikalen Spondylose bereitzustellen und dadurch methodische Unterstützung für mechanistische Untersuchungen sowie die Wirksamkeitsbewertung der Akupotomie-Therapie bei der Behandlung der zervikalen Spondylose (CS) zu liefern.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Ausschuss für Tierversuche des Unternehmens Beijing MDKN Biotech Company überprüft, genehmigt und streng überwacht (Genehmigungs-ID: MDKN-2025-096). Alle Protokolle wurden strikt gemäß den Richtlinien für die Zucht, Pflege und Verwendung von Laborversuchstieren durchgeführt, die von den National Institutes of Health (NIH) herausgegeben wurden. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

1. Experimentelle Tiere und Gruppen

  1. Wählen Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley-(SD)-Ratten mit einem Gewicht von 230,0 g ± 20 g zur Aufnahme in das Experiment.
  2. Unterbringen Sie die Tiere in einer dedizierten Versuchstieranlage.
  3. Halten Sie die Umgebungstemperatur bei 24 °C ± 2 °C und relative Luftfeuchtigkeit bei 50–60 % unter einem 12-Stunden-Licht-/Dunkelwechsel. Bereitstellen ad libitum Zugang zu Standardfutter und Wasser während der gesamten Studie.
  4. Nach einer 7-tägigen Eingewöhnungsphase werden 24 Ratten zufällig in vier Gruppen eingeteilt (n = 6 pro Gruppe): die normale Kontrollgruppe (Control), die Schein-operationgruppe (Sham), die CS-Modellgruppe (Model) und die Akupotomiegruppe. Der zeitliche Ablauf des experimentellen Designs ist in Abbildung 1.

2. Aufbau des CS-Modells

HINWEIS: Alle Ratten 12 h vor der Modellierung Nahrung und Wasser entziehen. Körpergewicht wiegen und dokumentieren. Alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren mit Hochdruckdampf sterilisieren (Abbildung 2A).

  1. Bereiten Sie den Nylongarn einen Tag vor der Operation vor, indem Sie ihn in Segmente mit einem Durchmesser von 0,5 mm und einer Länge von etwa 1 cm schneiden. Tauchen Sie die Filamente 4 h in 75 %igen Ethanol ein, trocknen Sie sie unter sterilen Bedingungen und legen Sie sie anschließend 8 h in eine 0,1%ige Poly-L-Lysin-Lösung, um die Gewebeadhäsivität zu verbessern.
  2. Stellen Sie die Ratte in eine Induktionskammer. Induzieren Sie die Anästhesie mit 4 % Isofluran und führen Sie die Anästhesie anschließend mit 1,5–2,0 % Isofluran fort. über eine Gesichtsmaske. Das Tier in Bauchlage fixieren (gemäß institutionell genehmigter Protokolle).
  3. Rasieren Sie den dorsalen zervikalen Bereich, um das Operationsfeld vollständig freizulegen. Desinfizieren Sie den Operationsbereich dreimal mit Povidon-Iod von innen nach außen und wiederholen Sie den Desinfektionsvorgang mit 75 %igem Ethanol.
  4. Palpieren und markieren Sie den höchsten Dornfortsatz (T2) am Rücken der Ratte. Führen Sie einen medianen dorsalen Hautschnitt von etwa 3 cm Länge durch, der kranial vom Gipfel des T2-Dornfortsatzes ausgeht. Lösen Sie das subkutane Gewebe und die hintere Halsmuskulatur stumpf.Abbildung 2B).
  5. Den linken Wirbelbogen von C5 bis T1 vollständig freilegen und das überlagernde Muskel- und Bindegewebe sorgfältig abkratzen (Abbildung 2C).
  6. Lösen Sie das Ligamentum flavum und die Bindegewebsstrukturen an den Zwischenwirbelräumen C6–C7 und C7–T1 vorsichtig mit Mikrozangen. Öffnen Sie den linken Wirbelbogen von C7 mit einer feinen Pinzette, um das Rückenmark freizulegen.
  7. Ziehen Sie das Rückenmark vorsichtig mit einem okulären Nervendissektor nach rechts. Führen Sie den sterilisierten Nylonfaden mit mikrochirurgischer Pinzette unter den Nervenwurzeln C6–C7 und C7–T1 entlang der Längsachse des Rückenmarks ein; vermeiden Sie übermäßigen Druck, um Verletzungen der Wirbelvenen zu verhindern.
    HINWEIS: Exponieren Sie das Rückenmark in der Schein-Gruppe an der identischen anatomischen Stelle, ohne den Nylonfaden einzubringen.
  8. Schließen und nähen Sie den Einschnitt schichtweise nach Abschluss des Verfahrens.
  9. Überführen Sie die Ratten auf eine thermostatisch geregelte Heizplatte, die auf 37 °Cund überwachen Sie die Vitalzeichen, bis die volle Bewusstseinswiederherstellung erfolgt ist.
  10. Verabreichen Sie eine intramuskuläre Injektion von 50.000 Einheiten Natriumpenicillin-Lösung in die Hinterextremität zur postoperativen Infektionsprophylaxe. Bringen Sie die Tiere zur postoperativen Erholung in ihre Heimkäfige zurück.

3. Fixierungsverfahren

  1. Fixieren Sie die Ratte in einer schwarzen Fixierungsnetzhülle.
  2. Befestigen Sie zwei Nylonkabelbinder an einem Kunststoffrahmen. Befestigen Sie den oberen Kabelbinder im axillären Bereich und den unteren Kabelbinder im Beckenbereich (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Kunststoffplatte mit den Maßen 200 mm × 300 mm × 5 mm, die entlang der langen Seiten mit 20 mm × 4 mm großen Schlitzen versehen ist, die in Abständen von 10 mm und entlang der kurzen Seiten in Abständen von 3 mm angeordnet sind, und die mit fünf Stützfüßen in der Mitte sowie an den vier Ecken ausgestattet ist (Abbildung 3A).
  3. Wiederholen Sie nach der Modellinduktion das oben beschriebene Fixierungsverfahren für jede Ratte in allen Gruppen drei aufeinanderfolgende Tage lang, um eine ausreichende Gewöhnung sicherzustellen. Jede Fixierungssitzung sollte mindestens 5 Minuten pro Tag dauern.

4. Akupotomie-Behandlung

  1. Beginnen Sie die Akupotomie-Intervention am 4.th Tag nach der Modellerstellung.
  2. Bereiten Sie sterile Einweg-Acupunktur-Nadeln vor (Durchmesser: 0,40 mm; Länge: 40 mm).
  3. Entfernen Sie das Fell im zervikalen Bereich, um das Operationsfeld vollständig freizulegen.
  4. Tasten Sie die Weichteile beidseits der Halswirbel-Dornfortsätze ab, um verhärtete Knoten oder strangförmige Strukturen zu erkennen. Bestimmen Sie einen Punkt am Dornfortsatz von C6 oder C7 und lokalisieren Sie anschließend zwei weitere Punkte, die jeweils etwa 0,5 cm seitlich zu beiden Seiten dieses Dornfortsatzes liegen.
  5. Bezeichnen Sie diese drei Stellen als Einstichpunkte für die Akupotomie und markieren Sie sie (Abbildung 3C).
  6. Desinfizieren Sie die markierten Einstichstellen mit medizinischem PVP-Jod, gefolgt von 75%igem medizinischem Ethanol.
  7. Richten Sie die Schneidkante des Akupotoms parallel zur hinteren Mittellinie aus und halten Sie den Nadelstiel während der Einführung senkrecht zur hinteren zervikalen Koronalebene.
  8. Üben Sie mit dem linken Daumen sanften Druck auf die Einstichstelle aus, während Sie das Akupotom mit Daumen und Zeigefinger der rechten Hand festhalten. Durchdringen Sie rasch senkrecht das subkutane Gewebe und führen Sie die Nadel dann langsam weiter, bis zur knöchernen Oberfläche.
  9. Führen Sie innerhalb des Läsionsgebiets dreimal einen lokalisierten longitudinalen Schnitt und zweimal eine transversale Weichteilfreilegung durch, wobei der Operationsbereich auf 1 mm begrenzt bleibt. Ziehen Sie die Nadel nach Abschluss der Manipulation zurück.Abbildung 3D).
  10. Üben Sie 3 Minuten lang festen Druck auf die Einstichstelle aus, um die Hämostase zu erreichen. Führen Sie die Akupotomie-Intervention alle 5 Tage einmal durch, insgesamt drei Sitzungen.
    HINWEIS: Mit Ausnahme der Akupotomie-Gruppe erhalten die anderen drei Gruppen keine therapeutische Intervention. Die Tiere dieser Gruppen werden jedoch in gleicher Weise und für die gleiche Dauer immobilisiert wie die Tiere der Akupotomie-Gruppe.

5. Test zur mechanischen Entzugsschwelle (MWT)

HINWEIS: Führen Sie die Messung am Tag vor der Operation zur Modellerstellung sowie am 3.rd Tag und der 14th Tag nach der Operation unter Verwendung eines pflanzlichen mechanischen Schmerzreizgeräts für Ratten und Mäuse.

  1. Stellen Sie jede Ratte in eine transparente Testkammer, die auf einem Metallgitterboden in einer ruhigen Umgebung bei 24 °C ± 2 °C steht.
  2. Lassen Sie die Ratte mindestens 5 min im Inneren der Kammer akklimatisieren, oder bis Erkundungs- und Pflegeverhalten weitgehend abgeklungen sind.
  3. Positionieren Sie die Spitze des von-Frey-Filaments senkrecht zur plantaren Fläche der linken Vorderpfote, zwischen dem dritten und vierten Mittelhandknochen. Führen Sie den Reiz von unten durch das Metallgitter hindurch durch, bis eine schnelle Rückzugsreaktion der Pfote, ein Lecken oder Schütteln erfolgt.
  4. Notieren Sie den angezeigten Wert zum Zeitpunkt des Rückzugs als mechanische Schmerzschwelle.
  5. Nach jedem Test der Ratten reinigen Sie den Metallgitterboden und die inneren Wände der Kammer gründlich mit 75%igem medizinischem Alkohol und trocknen Sie diese anschließend mit sauberer Gazetupfer, um verbleibende Gerüche zu entfernen, die nachfolgende Verhaltensuntersuchungen beeinflussen könnten. Führen Sie die nächste Ratte erst ein, nachdem das Gerät vollständig getrocknet ist.
    ​HINWEIS: Testen Sie alle Ratten nacheinander in einer rotierenden Reihenfolge über drei Durchgänge. Halten Sie zwischen zwei aufeinanderfolgenden MWT-Messungen an derselben Ratte ein Intervall von mindestens 10 min ein. Verwenden Sie den Mittelwert der drei Messungen als endgültigen MWT-Wert für jede Ratte.

6. Elektromyographie (EMG) Aufzeichnung

HINWEIS: Führen Sie die Ruhezustands-EMG am 3. Tag nach der Modellerstellung mithilfe eines Systems zur Erfassung und Analyse biologischer Signale durch.

  1. Betäuben Sie die Ratte durch Isofluran-Inhalation (Induktionskonzentration 3–4 %, Erhaltungskonzentration 1,5–2,0 %). Sichern Sie das Tier in Bauchlage auf der Versuchsplattform und legen Sie den linken Vorderlauf vollständig frei.
  2. Verbinden Sie die Leitungsdrähte der Ableitelektroden mit den vorgesehenen Erfassungskanälen. Starten Sie die Erfassungssoftware, wählen Sie den EMG-Signalmode aus und stellen Sie die Abtastrate auf 20 kHz mit einem Bandpassfilterbereich von 15 Hz–5 kHz ein.
  3. Desinfizieren Sie die Muskeln des linken Vorderlaufs (Musculus flexor carpi radialis, Musculus flexor carpi ulnaris, Musculus biceps brachii und Musculus triceps brachii) mit entfetteten Wattebäuschen, die in 75 %igem medizinischem Ethanol getränkt sind.
  4. Führen Sie die nadelförmige Ableitelektrode senkrecht in den Muskelbauch ein, wobei sie orthogonal zur Ausrichtung der Muskelfasern positioniert sein soll. Führen Sie eine zweite Nadelelektrode 3–5 mm entfernt als Bezugselektrode ein und platzieren Sie die Erdungselektrode am Schwanzansatz.
  5. Beobachten Sie unmittelbar nach der Nadeleinführung die Einstichaktivität. Sobald die Einstichpotentiale verschwunden sind und der Muskel vollständig entspannt ist, nehmen Sie das Ruhe-EMG-Signal 1 Minute lang für jede Ratte auf.
    ANMERKUNG: Halten Sie während der Aufnahme eine ruhige Umgebung aufrecht und minimieren Sie elektromagnetische Störungen von außen. Häufige Störungen umfassen Netzfrequenzstörungen durch Wechselstrom sowie hochfrequente Störgeräusche von anderer Labortechnik, die sich als regelmäßige Sinuswellen auf den Elektromyogrammen überlagern. Solche Störungen können durch Erdung, geeignete Filtereinstellungen und Umgebungsmanagement reduziert werden.
  6. Ziehen Sie alle Nadelelektroden vorsichtig zurück und bringen Sie die Ratte in ihren Heimkäfig zurück, damit sie sich spontan von der Narkose erholen kann.
  7. Reinigen Sie nach Abschluss der EMG-Aufnahme bei jeder Ratte die Nadelelektroden mit 75 %igem medizinischem Ethanol unter Verwendung entfetteter Wattebäusche und trocknen Sie sie gründlich mit steriler Mullbinde ab, um eine Kreuzkontamination zu verhindern.

7. Ganganalyse bei Ratten

HINWEIS: Führen Sie die Ganganalyse am ersten Tag nach Abschluss der Akupotomie-Behandlung (postoperativer Tag 15 nach Modell-Operation) durch. Das Ganganalysesystem besteht aus einem Laufband mit einem transparenten Band, einer Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera unterhalb des Bandes und einer Computerarbeitsstation.

  1. Stellen Sie die Ratte auf die Lauffläche und lassen Sie sie sich 3 Minuten lang frei akklimatisieren.
  2. Schalten Sie das Laufband ein und erhöhen Sie die Geschwindigkeit schrittweise von 5,0 cm/s, bis die Ratte einen stabilen Gang ohne erkundendes Verhalten zeigt.​
  3. Aufnahme eines 10-s-Ventrovideos (Unteransicht) des Gehens der Ratte mit der Hochgeschwindigkeitskamera.
  4. Nach Abschluss der Tests an jeder Ratte reinigen Sie das Laufband und die Testkammer gründlich mit 75 %igem Ethanol, um restliche Gerüche zu entfernen, die nachfolgende Verhaltensbewertungen beeinflussen könnten. Lassen Sie das Band vollständig trocknen, bevor Sie die nächste Ratte einsetzen.
  5. Importieren Sie die aufgezeichneten Videos in die Analyse-Software. Nutzen Sie die Software, um die Absetzposition der Pfoten jedes Gliedmaßes zu identifizieren und eine Reihe von Gangparametern zu extrahieren.
  6. Nach Abschluss der automatisierten Analyse exportieren Sie die Daten der Gangparameter für die anschließende statistische Auswertung.
  7. Verwenden Sie in der vorliegenden Studie folgende Gangparameter: durchschnittliche Abdruckfläche der linken Vorderpfote (der Mittelwert der Fußabdruckgröße über die gesamte Standphase), maximale Standfläche der linken Vorderpfote (die maximale Größe des Fußabdrucks über die gesamte Standphase) und Standdruck der linken Vorderpfote (der die relative Intensität des Pfotendrucks während der Standphase widerspiegelt, wie vom Ganganalyse-System erfasst).
    ​HINWEIS: Erfassen Sie drei gültige Gangsequenzen pro Ratte und verwenden Sie den Mittelwert der drei Messungen für die Analyse.

8. HE-Färbung der Nervenwurzelgewebe

HINWEIS: Nach den Verhaltensuntersuchungen am 15. Tag nach der Operation sammeln Sie Gewebeproben der Nervenwurzel für die HE-Färbung.

  1. Betäuben Sie Ratten durch intraperitoneale Injektion von 2 % Natriumpentobarbital (0,3 mL/100 g) und führen Sie eine transkardiale Perfusion mit Paraformaldehyd durch.
  2. Präparieren Sie die C6–T1-Rückenmarksnervenwurzeln und tauchen Sie das Gewebe zur Nachfixierung 48 h lang in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C ein.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist reizend; daher stets in gut belüfteter Umgebung oder unter chemischer Abzugshaube damit umgehen.
  3. Spülen Sie das fixierte Nervenwurzelgewebe 1 h lang unter fließendem Leitungswasser, um restliche Fixiermittel zu entfernen.
  4. Führen Sie eine gestufte Dehydrierung des Gewebes mit Ethanol durch, klären Sie nacheinander in Xylol (I) und Xylol (II), infiltrieren Sie mit Paraffin und schneiden Sie in einer Dicke von 3–5 µm. Trocknen Sie die Schnitte bei 65 °C.
  5. Entfetten Sie die Schnitte nacheinander in Xylol (I) und Xylol (II), jeweils 8 min. Rehydrieren Sie die Schnitte durch eine gestufte Ethanolreihe (100 % für 15 min, 95 % für 5 min, 80 % für 5 min, 70 % für 3 min) und tauchen Sie sie anschließend 2 min in destilliertes Wasser.
  6. Färben Sie die Schnitte 5 s lang mit Hämalun-Lösung und spülen Sie sie danach 2 min unter fließendem Wasser, um überschüssige Färbung zu entfernen.
  7. Differenzieren Sie die Schnitte 30 s lang in destilliertem Wasser. Tauchen Sie die Schnitte 10 s in 70 %iges Ethanol, gefolgt von 10 s in 80 %igem Ethanol.
  8. Färben Sie die Schnitte 4 min lang mit Eosin-Lösung und spülen Sie sie anschließend unter fließendem Wasser, um oberflächliche Färbung zu entfernen. Dehydrieren Sie die Schnitte durch eine gestufte Ethanolreihe (70 % für 10 s, 80 % für 10 s, 95 % für 10 s, 100 % für 160 s) und klären Sie sie 4 min in Xylol.
  9. Decken Sie die Objektträger mit neutralem Harz ab.
  10. Untersuchen Sie die pathologischen und morphologischen Veränderungen des Rückenmarksnervenwurzelgewebes unter dem Lichtmikroskop bei 400× Vergrößerung und fertigen Sie Mikroskopiebilder aus repräsentativen Zielbereichen an.

9. Statistische Analyse

  1. Führen Sie die statistische Analyse mit der SPSS-Software durch. Geben Sie kontinuierliche Variablen, die einer Normalverteilung folgen, als Mittelwert ± Standardabweichung an.
  2. Unter der Annahme von Normalverteilung und Varianzhomogenität analysieren Sie die mechanischen Withdrawal-Schwellen mittels Varianzanalyse mit wiederholten Messungen und die Gangparameter mittels einfaktorieller ANOVA. Führen Sie anschließend paarweise post-hoc-Vergleiche zwischen den Gruppen mit dem Least-Significant-Difference-Test (LSD-Test) durch.
  3. Wenden Sie nichtparametrische Tests an, falls die Annahmen der Normalverteilung oder der Varianzhomogenität nicht erfüllt sind.
  4. Signifikante Unterschiede werden bei einem p-Wert < 0,05 angenommen.

Ergebnisse

Die Bewertungen der mechanischen Entzugsschwelle (MWT) zeigten vor der Modellinduktion vergleichbare Basiswerte in allen Gruppen. Am 3. Tag nach Modellierung und Scheinoperation wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Scheingruppe und der Kontrollgruppe beobachtet (p > 0,05). Im Gegensatz dazu wiesen sowohl die Modell- als auch die Akupotomiegruppe eine deutliche Verringerung der MWT im Vergleich zur Scheingruppe auf (p < 0,01, Abbildung 4). Nach Abschluss der Behandlung zeigte die Akupotomiegruppe im Vergleich zur Modellgruppe eine signifikante Erhöhung der MWT (p < 0,05, Abbildung 4).

Elektromyographie (EMG)-Aufzeichnungen zeigten, dass am 3.rd Tag nach Modellierung und Scheinoperation waren abnorme spontane Aktivitäten wie Fibrillationspotentiale und positive spitze Wellen im Ruhezustand in der Nadelelektromyographie sowohl in der Modell- als auch in der Akupotomiegruppe nachweisbar. Im Gegensatz dazu wurden in den Ruhe-Nadelelektromyographie-Ableitungen der Kontroll- oder Scheingruppen keine abnormen spontanen Entladungen beobachtet.Abbildung 5). Wenn keine abnormalen spontanen Potentiale auf der betroffenen Seite nachweisbar sind, deutet dies darauf hin, dass das Modell möglicherweise die Zielnervenwurzel nicht erfolgreich geschädigt hat, und das chirurgische Vorgehen muss erneut überprüft werden.

Die Ganganalyse zeigte, dass nach Abschluss der Behandlung die durchschnittliche Abdruckfläche, die maximale Standfläche und der Standdruck in der Scheinbehandlungsgruppe nicht signifikant von denen der Kontrollgruppe abwichen (p > 0,05). Im Gegensatz dazu waren alle Gangparameter in der Modellgruppe im Vergleich zur Scheinbehandlungsgruppe deutlich vermindert (p < 0,001). Bezogen auf die Modellgruppe wiesen die Akupotomie-Gruppe signifikante Erhöhungen bei jedem dieser Gangindizes auf (p < 0,05, Abbildung 6). Die durchschnittliche Abdruckfläche ist der Mittelwert der Größe des Fußabdrucks über die gesamte Standphase. Die maximale Standfläche ist die größte Größe des Fußabdrucks über die gesamte Standphase. Der Standdruck spiegelt die relative Intensität des Pfotendrucks während der Standphase wider, wie sie vom Ganganalyse-System erfasst wurde.

Die HE-Färbung von zervikalem Nervenwurzelgewebe zeigte, dass die Morphologie des Nervenwurzelgewebes in den Kontroll- und Scheinbehandlungsgruppen im Wesentlichen normal erschien. Nervenfasern und neuronale Zellkörper waren relativ geordnet und dicht angeordnet, wiesen klar definierte strukturelle Grenzen auf und zeigten kein erkennbares interstitielles Ödem. Im Gegensatz zur Scheinbehandlungsgruppe wies die Modellgruppe ausgeprägte pathologische Veränderungen auf, die auf eine Nervenwurzelschädigung hindeuteten und sich durch ungeordnete, lockere Anordnung der Nervenfasern und Zellkörper, Ruptur und Deformation einer Teilmenge neuronaler Zellen, partielle Fragmentierung der Fasern sowie starkes interstitielles Ödem auszeichneten. Im Vergleich zur Modellgruppe verbesserte die Akupotomie-Behandlung diese pathologischen Läsionen deutlich, was sich in einer regelmäßigeren Ausrichtung der Nervenfasern und Zellkörper, einer Abschwächung des interstitiellen Ödems und einer teilweisen Wiederherstellung der strukturellen Integrität des Nervengewebes zeigte (Abbildung 7).

Zeitstrahldiagramm des Akupotomie-Behandlungsverlaufs mit MWT-Tests, EMG-Aufzeichnung und Gangbildanalyse.
Abbildung 1: Zeitstrahldiagramm des experimentellen Designs. Nach einer 7-tägigen adaptiven Fütterungsphase wurden CS-Modelle sowohl in der Modellgruppe als auch in der Akupotomiegruppe von Ratten etabliert. Die Scheinoperationgruppe wurde derselben Rückenmarksregion wie die Modellgruppe ausgesetzt, jedoch ohne Einlegen der Fadenverankerung. Die Akupotomie-Intervention begann am 4.ten Tag nach erfolgreicher Modellierung in der Akupotomiegruppe. Die mechanischen Schmerzschwellen der Ratten wurden am Tag vor der Modellierung, am 3. postoperativen Tag sowie am Ende der Intervention am 14. postoperativen Tag gemessen. Die Elektromyographie-Beurteilung erfolgte am 3. postoperativen Tag zur Evaluierung einer Nervenwurzelkompression. Die Gangbildanalyse wurde am 15. postoperativen Tag nach der Intervention durchgeführt, um die motorische Koordinationsfunktion der Ratten zu bewerten. Die Probennahme erfolgte nach den Verhaltenstests am 15. postoperativen Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Aufbau der chirurgischen Instrumente, Sektionsverfahren an Nagetieren, markiertes Diagramm zur Darstellung der Wirbelsäulenexposition für anatomische Untersuchungen
Abbildung 2: Erstellung des CS-Rattenmodells. (A) Chirurgische Instrumente, die zur Induktion des Modells verwendet werden. (B) Dorsale zervikale Inzision und Gewebesektion. (C) Linke C5–T1 zervikale Wirbelbögen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Vorbereitung der Tierversuche, einschließlich Diagramm zur Rattenfixierung, für die Einrichtung eines medizinischen Eingriffs.
Abbildung 3: Verfahren der Akupotomie-Behandlung. (A) Kunststoffplatte zur Fixierung der Ratte. (B) Schematische Darstellung der Rattenfixierung. (C) Anatomische Oberflächenmerkmale, die den Dornfortsätzen C6 und C7 bei Ratten entsprechen. (D) Schematische Darstellung der Akupotomie-Behandlung bei Ratten. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Balkendiagramm, das die mechanische Withdrawal-Schwelle zwischen den Gruppen zeigt: Kontrolle, Sham, Modell, Akupotomie.
Abbildung 4: Vergleich der mechanischen Withdrawal-Schwelle zwischen den vier experimentellen Rattengruppen (n = 6 pro Gruppe). **p < 0,01 im Vergleich zur Sham-Operationsgruppe; #p < 0,05 im Vergleich zur Modellgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Vergleich der Wellenamplituden; A, B zeigen hohes Rauschen; C, D zeigen geringes Rauschen; Diagramm zur Audio-Signalanalyse.
Abbildung 5: Elektromyogramme der Vordergliedmaßen im Ruhezustand in den vier experimentellen Gruppen nach der Induktion des Modells. (A) Elektromyogramm der Vordergliedmaße in der Modellgruppe. (B) Elektromyogramm der Vordergliedmaße in der Akupotomiegruppe. (C) Elektromyogramm der Vordergliedmaße in der Kontrollgruppe. (D) Elektromyogramm der Vordergliedmaße in der Scheingruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Balkendiagramm zum Vergleich der durchschnittlichen Abdruckfläche, der maximalen Standfläche und des Standdrucks zwischen vier Gruppen.
Abbildung 6: Vergleich der Gangparameter zwischen den vier experimentellen Rattengruppen (n = 6 pro Gruppe). (A) Vergleich der durchschnittlichen Abdruckfläche. (B) Vergleich der maximalen Standfläche. (C) Vergleich des Standdrucks. ***p < 0,001 im Vergleich zur Sham-Operationsgruppe; #p < 0,05 im Vergleich zur Modellgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Histologischer Gewebevergleich, vier Objektträger, Mikroskopieaufnahme, 100 µm-Skala zur zellulären Analyse.
Abbildung 7: HE-Färbung von Nervenwurzelgewebe aus den vier experimentellen Rattengruppen bei 400-facher Vergrößerung. (A) HE-Färbung der Kontrollgruppe. (B) HE-Färbung der Sham-Gruppe. (C) HE-Färbung der Modelgruppe. (D) HE-Färbung der Akupotomiegruppe. Maßstabsbalken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Die Auswahl eines geeigneten Tiermodells ist eine Voraussetzung, um die Pathogenese der zervikalen Spondylose (CS) aufzuklären und therapeutische Maßnahmen streng zu evaluieren. Derzeit wird die intravertebrale Nylonnaht-Methode aufgrund ihrer relativen Einfachheit, des kurzen Modellierungszyklus sowie der hohen Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit weithin angewandt15,20. Bei dieser Methode wird ein komprimierendes Material in den Spinalkanal der Ratte implantiert, um eine kontinuierliche Kompression der zervikalen Spinalnervenwurzeln auszuüben und damit die pathologische Situation einer Nervenwurzelkompression nachzuahmen, wie sie klinisch durch eine Bandscheibenprotrusion oder osteophytische Hyperplasie verursacht wird. Unter den sekundären Verletzungen, die mit der zervikalen Spondylose assoziiert sind, ist die Kompression der Nervenwurzeln am häufigsten und stellt die Hauptursache für ausgeprägte klinische Symptome dar, die typischerweise als Schmerzen im Nackenbereich, Steifheit und ausstrahlende Beschwerden in die oberen Extremitäten auftreten5,7,21. Daher wurde in dieser Studie die intravertebrale Nylonnaht-Methode verwendet, um ein Rattenmodell der CS zu etablieren, und es wurde ein visuell dargestelltes operatives Protokoll zur Herstellung des Modells sowie zur Akupotomie-Behandlung bei Ratten mit CS bereitgestellt.

Nach der Kompression der Nervenwurzel können lokale Ischämie, entzündliche Reaktionen und mechanische Reizung sowohl eine periphere als auch eine zentrale Sensibilisierung hervorrufen, die letztlich zu Hyperalgesie führt22,23,24,25,26. Die vorliegenden Ergebnisse zeigten eine deutliche Verringerung der mechanischen Schmerzschwelle der kontralateralen Vorderpfote bei Ratten nach der Induktion des Modells, was darauf hinweist, dass das Verfahren erfolgreich mechanische Hyperalgesie ausgelöst hat. Bei Ratten, die eine Akupotomie-Behandlung erhielten, wurde die mechanische Rückzugschwelle signifikant wiederhergestellt, was darauf schließen lässt, dass die durch Akupotomie bewirkte Freisetzung den Zustand der Schmerzsensibilisierung wirksam abschwächt. Schmerz beeinflusst nicht nur die sensorischen Schwellen, sondern verändert auch die spontanen Bewegungsmuster der Tiere. Ganganalysesysteme ermöglichen durch die Erfassung raumzeitlicher Parameter der Pfotenabdrücke während der Fortbewegung eine objektive Quantifizierung schmerzbedingter kompensatorischer Gangveränderungen und überwinden damit die ausgeprägte Subjektivität herkömmlicher Verhaltensbewertungsmethoden27. In dieser Studie zeigten Ratten der Modellgruppe eine verminderte durchschnittliche Abdruckfläche, ein reduziertes maximales Standfläche und einen niedrigeren Standdruck der ipsilateralen Vorderpfote, was auf ein Lastvermeidungsverhalten und schmerzbedingte schützende Gangveränderungen hinweist. Im Gegensatz dazu zeigten Ratten, die einer Akupotomie-Behandlung unterzogen wurden, eine Tendenz zur Normalisierung dieser Gangparameter, was darauf hindeutet, dass die Akupotomie-Behandlung neben der Schmerzlinderung auch die motorische Koordination verbessert. Histomorphologische Beobachtungen zeigten zudem zwischen den Gruppen Unterschiede in der Anordnung und Morphologie der Nervenfasern und neuronalen Zellkörper innerhalb der Nervenwurzel sowie im Ausmaß des interstitiellen Ödems. Diese Befunde legen nahe, dass die Akupotomie-Therapie möglicherweise die pathologischen Veränderungen der Nervenwurzel abschwächen kann.

Die Kompression der Nervenwurzel führt nicht nur zu Störungen der sensorischen Leitung, sondern kann auch eine Denervierung oder eine fehlerhafte Hypererreglichkeit der innervierten Muskulatur verursachen. Die Elektromyographie (EMG) im Ruhezustand, bei der durch Aufzeichnung der spontanen elektrischen Aktivität (wie Fibrillationspotentiale und positive spitze Wellen) in einem vollständig entspannten Muskel eine empfindliche Indikation für eine abnorme Sarkolemm-Erreglichkeit als sekundäre Folge einer neurogenen Verletzung bereitgestellt wird, stellt eine entscheidende elektrophysiologische Methode zur Beurteilung von Radikulopathien sowohl in der klinischen als auch in der experimentellen Forschung dar28,29,30. Unter physiologischen Bedingungen zeigt ein vollständig entspannter Muskel elektrische Stille, das heißt, es treten keine spontanen Entladungen auf. In dieser Studie wurden ausgeprägte spontane Entladungen in den ruhenden Muskeln der kontralateralen Vordergliedmaße bei Ratten nach der Induktion des Modells nachgewiesen. Eine solche abnorme ruhende EMG-Aktivität ist ein charakteristisches Merkmal einer neurogenen Schädigung und deutet darauf hin, dass die zervikalen Nervenwurzeln dieser Tiere einer anhaltenden Kompression ausgesetzt sein könnten31. Die abnormen EMG-Befunde in der Modell- und der Akupotomie-Gruppe nach der Modellierung bestätigten darüber hinaus die erfolgreiche Erstellung des CS-Rattenmodells aus elektrophysiologischer Sicht.

Um Verhaltensbewertungen nicht durch die kumulativen Effekte wiederholter Anästhesie zu verfälschen, wurde der Akupotomie-Eingriff in dieser Studie an wachen Tieren mithilfe einer Fixierungsvorrichtung durchgeführt32. Bisherige Berichte haben gezeigt, dass eine ausreichende Eingewöhnungstraining und wiederholte Exposition die durch Fixierung hervorgerufenen Stressreaktionen deutlich abschwächen können33,34,35,36. Dies legt nahe, dass das Eingewöhnungstraining vor dem Eingriff in diesem Protokoll die Störung der experimentellen Parameter durch akuten Fixierungsstress effektiv minimieren kann.

Diese Studie weist nicht wenigerere Einschränkungen auf. Erstens reproduziert die intravertebrale Nylonnahtmethode hauptsächlich eine akute oder subakute mechanische Kompression, während die menschliche CS in der Regel einem chronisch-degenerativen Verlauf folgt. Zweitens sollte, obwohl das vorliegende Fixierungsprotokoll so konzipiert wurde, den Stress zu minimieren, in zukünftigen Untersuchungen die Wirkung der Fixiervorrichtung umfassender durch die Bestimmung stressbezogener Biomarker wie Cortisol im Serum bewertet werden.

Zusammenfassend liefert diese Studie ein detailliertes operationelles Verfahren zur Erstellung eines Rattenmodells der CS und anschließender Behandlung mittels Akupotomie. Die Ergebnisse zeigen, dass die Akupotomie-Freigabe die mechanischen Schmerzschwellen signifikant erhöht, schmerzvermeidende Gangmuster verbessert und die pathologischen Veränderungen der Nervenwurzel abschwächt. Diese Arbeit stellt somit einen systematischen und praktischen experimentellen Rahmen bereit, um die Mechanismen der Akupotomie-Therapie bei der Behandlung der CS aufzuklären.

Offenlegungen

Alle Autoren haben erklärt, dass kein potenzieller Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch das Nationale Schlüssel-Forschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas (Förderkennzeichen Nr. 2023YFC3502703) und das Schlüsselprojekt des Gemeinsamen Fonds für Innovation und Entwicklung der Natürlichen Wissenschaftsstiftung der Provinz Hubei (Förderkennzeichen Nr. 2024AFD271).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 mL-SpritzeHebei Yunsheng Biotechnology Co., LtdSN-04442
1 mL-SpritzeShanghai Zhiyu Medical Equipment Co., LTDZSQ-1
4-0 Naht mit Nadel, einarmig (4×12)GLASSJZZSX193
75 % AlkoholShandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTD75-500ml
Akupotomie-NadelBeijing Huaxia Blue Chip Biotechnology Co., Ltd.HY0440
HaftobjektträgerCITOTEST188105
System zur Erfassung und Analyse biologischer SignaleTechmanBL-420N
System zur Erfassung und Analyse biologischer Signale (Software)TechmanBL-420N Version 3.0.0.237
DeckglasCitotest Labware Manufacturing Co.,Ltd10212432C
DehydriergerätDIAPATHDonatello
Elektronische WaageMettler-ToledoME203E/02
Elektrothermischer HeißlufttrocknungsofenLaboteryGEL-70
EinbettungsgerätWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Umweltfreundliche Entwässerungs- und DurchsichtigkeitsflüssigkeitServicebioG1128-1L
ESD-sichere schwarze Edelstahl-Pinzette (gebogene Spitze)solomenESD-15
ÄthanolSCRC100092683
Fettfreier WattebauschCaoxian Hualu Sanitary Material Co. LTDTZMQ-500
HE-Färbekit (Hämatoxylin-Eosin), konstante Färbung ServicebioG1076
HämstopzangesolomenB0557
IBM SPSS StatisticsIBM CorporationVersion 22.0
BildgebungssystemNikonNIKON DS-U3
JodophorShandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTDDF-500
IsofluranRWD life scienceR510-22-10
LatexhandschuheBeijing Ruijing Latex Products Co. LTDRJJC-S
mechanisches Testgerät zur PfotenstimulationKew basisKW-CT-1
medizinische PinzetteAIZANCHENGAZN00008
Moskito-HämstopzangeServicebioQX1310D
Neutraler KittSCRC10004160
Physiologische KochsalzlösungSHIMENSLYS-500ml
Augenchirurgische ScheresolomenB0754
ParaffinflüssigkeitMacklin8012-95-1
Paraformaldehyd-Fixiermittel (neutral)ServicebioG1101
PathologieschneiderShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
Penicillin-G-Natrium zur InjektionJilin Huamu Animal Health Product Co., Ltd.Veterinärarzneimittel-Zulassungsnummer 070011248
Poly-L-Lysin-LösungShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R23126-50ml
Tierpflege-Schermaschine für NagetieresolomenB1564
System zur Bildgebung und Analyse des Gangbildes bei NagetierenCleverTreadScan; BCamCapture
System zur Bildgebung und Analyse des Gangbildes bei Nagetieren (Software)CleverTreadScan Version 4.00; BCamCapture Version 3.00
SD-RattenBeijing Sibefei Biotechnology Co., LtdA102
Kleintier-Narkosegerät YuYAN ABM
Dampfsterilisator (Autoklav)YamatoSQ810C
Chirurgisches SkalpellsolomenB1177
Chirurgische MaskewinnerWJKZ-1
Chirurgische NadelhaltersolomenB0772
Chirurgische SchereGLASSJZZSX-ZC544R
GewebespreaderZhejiang Kehua Instrument Co., Ltd KD-P
System zur Polierung ultrareiner WasserAiken water ElAK-RO-C2
Allgemeines Gewebefixativ (neutral)ServicebioG1101-15ML
Aufrechter optischer MikroskopNikonNIKON ECLIPSE E100
XylolSCRC10023418

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