Die vorliegende Studie zielt darauf ab, den Zusammenhang zwischen der miR-146a-rs2910164-Polymorphie und der Anfälligkeit für allergische Rhinitis (AR) zu klären. Niedrigere Plasmaspiegel von miR-146a sowie das rs2910164-GG-Genotyp sind mit einem erhöhten AR-Risiko, verstärkten entzündlichen Reaktionen und schwereren klinischen Manifestationen bei AR-Patienten verknüpft.
Forschungsartikel
Assoziationsstudie von Mir-146a Rs2910164 mit der Anfälligkeit für allergische Rhinitis
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Allergische Rhinitis (AR) stellt keine Bedrohung für das Leben der Patienten dar, beeinträchtigt jedoch erheblich ihre Lebensqualität. Micro-RNA-146a (miR-146a) spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunregulation und entzündlichen Reaktionen; der Zusammenhang zwischen der miR-146a-rs2910164-Polymorphie und der Anfälligkeit für AR ist jedoch noch nicht vollständig verstanden. Diese Fall-Kontroll-Studie wurde durchgeführt, um den Einfluss der miR-146a-rs2910164-Polymorphie auf die Anfälligkeit für AR zu untersuchen. In die Studie wurden insgesamt 180 Probanden ohne AR und 211 AR-Patienten eingeschlossen. Die Expression von miR-146a im Plasma wurde mittels RT-qPCR gemessen; das rs2910164-Genotyp wurde mit der TaqMan-qPCR-Methode bestimmt. Mit ELISA wurden die Konzentrationen von serumgebundenem IgE, IL-4, IL-6 und IL-10 ermittelt. Mithilfe der Pearson-Korrelationsanalyse wurden lineare Zusammenhänge zwischen der Expression von miR-146a und dem TNSS-Score, dem RQLQ-Score sowie den Konzentrationen der serumgebundenen Faktoren analysiert. Die Risikofaktoren für AR wurden mittels logistischer Regression identifiziert. Das GG-Genotyp und das G-Allel der miR-146a-rs2910164-Polymorphie traten bei AR-Patienten signifikant häufiger auf als bei gesunden Kontrollpersonen. Die Konzentration von miR-146a im Plasma war bei AR-Patienten vermindert. Die miR-146a-Konzentration im Plasma war bei AR-Patienten mit dem GG-Genotyp niedriger, was auf aktivere allergische und entzündliche Reaktionen hindeutet. Die Expression von miR-146a stand in engem Zusammenhang mit allergischen Symptomen und der Schwere der klinischen Manifestationen. Die logistische Regression ergab, dass die Konzentrationen von serumgebundenem IgE und IL-4 unabhängige Risikofaktoren für AR darstellen, während IL-10 und die miR-146a-Expression unabhängige Schutzfaktoren waren. Niedrige Plasmaspiegel von miR-146a treten bei AR-Patienten auf, und das GG-Genotyp der miR-146a-rs2910164-Polymorphie erhöht die Anfälligkeit für AR.
Einleitung
Allergische Rhinitis (AR) ist eine allergenvermittelte, nichtinfektiöse Entzündung der Nasenschleimhaut. Zu den typischen klinischen Symptomen der AR gehören Juckreiz in der Nase, Nasenverstopfung, klarer Nasenausfluss und häufiges Niesen1. Bei schwereren Fällen können Patienten außerdem eine verminderte Geruchswahrnehmung aufweisen und sogar die Schlafqualität beeinträchtigt sein. Epidemiologische Daten zeigen, dass die globale Prävalenzrate der AR von Jahr zu Jahr steigt und mittlerweile 10 % bis 25 % erreicht2. Obwohl die AR das Leben der Patienten nicht unmittelbar bedroht, stört sie Schlaf, Lernen und Arbeit erheblich, verringert die Lebensqualität signifikant und verursacht eine hohe ökonomische Belastung für Individuen und die Gesellschaft3. Studien haben bestätigt, dass AR ein Risikofaktor für Asthma bronchiale ist, und im Verlauf der Erkrankung entwickeln Patienten häufiger eine Sinusitis oder Nasenpolypen, wodurch die Krankheitslast weiter zunimmt4,5. Daher wird die Prävention und Kontrolle der AR zu einer zentralen Aufgabe im Bereich der Atemwegserkrankungen. Die Pathogenese der AR ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Eine eingehende Erforschung der pathophysiologischen Mechanismen der AR sowie die Entwicklung gezielter Therapiestrategien besitzen daher eine entscheidende Bedeutung und stellen gegenwärtig dringend zu lösende wissenschaftliche Fragestellungen dar.
Der Ausbruch von AR hängt mit Umwelt- und genetischen Faktoren zusammen6. Aktuelle Forschungsergebnisse gehen allgemein davon aus, dass der synergistische Effekt individueller genetischer Anfälligkeit und der Exposition gegenüber Allergenen die zentrale treibende Kraft für das Auftreten von AR darstellt. Das Brozek-Team bestätigte zudem, dass das Wechselspiel zwischen genetischer Anfälligkeit des Körpers und Umweltexpositionen die grundlegende Ursache von AR ist2. Im Bereich der Forschung zu genetischen Mechanismen von AR hat die genetische Polymorphie zunehmend die Aufmerksamkeit der Wissenschaftler auf sich gezogen. Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), als vorherrschende Form der genetischen Polymorphie, sind die Hauptursache für Variationen genetischer Informationen in Organismen7. Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass das TT-Genotyp bei IL-33 rs7044343 ein potenzielles Ziel für die Prävention und Behandlung von AR darstellen könnte8. Außerdem wirkt das TT-Genotyp an der CD14-Promotor-Stelle C-159T als prädiktiver Marker für das AR-Risiko9. Dies zeigt, dass Schlüssel-Gen-SNPs wichtige molekulare Zielstrukturen zur Risikobewertung von AR, zur Früherkennung sowie zur präzisen Prävention und Therapie darstellen können. Dies liefert entscheidende Hinweise für ein tieferes Verständnis des genetischen Anfälligkeitmechanismus von AR.
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass eine abnormale Expression von microRNAs (miRNAs) einer der zentralen treibenden Faktoren für das Auftreten und die Entwicklung einer Vielzahl von Erkrankungen ist10. miRNAs zeichnen sich durch eine stabile Existenz in Körperflüssigkeiten aus und stellen damit hochsensible molekulare Marker für die Krankheitsdiagnose dar. miR-146a ist eine Art nicht-kodierendes RNA-Molekül mit umfassenden biologischen Funktionen11. Die rs2910164-Polymorphie befindet sich im Stamm-Schleifen-Bereich der Vorläufer-miR-146a-Sequenz. Eine Variation an dieser Stelle kann die Verarbeitung und Reifungseffizienz von prä-miR-146a beeinflussen, wodurch die Expressionsebene der reifen miR-146a verändert und die downstream gerichteten Immun- und Entzündungsreaktionen beeinflusst werden. Frühere Studien haben bestätigt, dass eine Überexpression von miR-146a die bronchiale Hyperreagibilität in Asthma-Mausmodellen signifikant verringern und die Aktivierung sensibilisierter Lymphozyten hemmen kann12. Durch gezielte Hemmung der Aktivität des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) kann miR-146a die entzündlichen Schäden bei Sinusitis wirksam lindern13. Darüber hinaus kann eine Überexpression von miR-146a auch die pathologischen Symptome des AR-Mausmodells durch Blockade des Toll-like-Rezeptor-4-(TLR4-)Signalwegs abschwächen14. Diese Beobachtungen unterstreichen die entscheidende Rolle von miR-146a bei der Modulation von Erkrankungen des Atmungssystems.
Bestehende Hinweise aus Gen-Polymorphismus-Studien deuten darauf hin, dass die Frequenz des G-Allels an der miR-146a rs2910164-Lokalisation eng mit einer Hyperreagibilität der Atemwege assoziiert ist15. Dieser SNP gilt außerdem als potenzieller Biomarker für das Asthmarisiko in der koreanischen Bevölkerung15. Darüber hinaus zeigte das Team von Jimenez-Morales, dass das CC-Genotyp an der miR-146a rs2910164-Lokalisation einen schützenden Effekt gegen Asthma verleiht16. Es liegen jedoch keine entsprechenden Studien vor, die einen Zusammenhang zwischen dem miR-146a rs2910164-Polymorphismus und der Anfälligkeit für allergische Rhinitis (AR) berichten. Daher zielt diese Studie darauf ab, den Einfluss des Polymorphismus von miR-146a rs2910164 auf AR zu überprüfen und liefert damit eine neue theoretische Grundlage für die Pathogenese, die klinische Diagnose und die Behandlung von AR.
Protokoll
Ethische Erklärung:
Alle Teilnehmer wurden umfassend über den Zweck unseres Experiments informiert und unterzeichneten das Einwilligungsformular. Diese Studie wurde von dem Ethikkomitee des Ersten Angegliederten Krankenhauses Longyan der Medizinischen Universität Fujian genehmigt (Genehmigungsnummer. LYREC2023-k007-01). Alle Verfahren wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und der Deklaration von Helsinki durchgeführt.
Teilnehmerrekrutierung, Ein- und Ausschlusskriterien sowie Probenentnahme
Insgesamt 211 Personen mit Diagnose einer allergischen Rhinitis (AR) und 180 gesunde Teilnehmer (ohne AR) wurden von der HNO-Ambulanz des Ersten Angegliederten Krankenhauses Longyan der Medizinischen Universität Fujian zwischen Januar 2023 und Mai 2025 rekrutiert. Die Diagnosekriterien für AR orientierten sich an den Leitlinien der Chinesischen Gesellschaft für Allergologie zur Diagnose und Behandlung der allergischen Rhinitis17. Die Patienten mussten mindestens zwei klinische Symptome der AR aufweisen, darunter Juckreiz in der Nase, Niesreiz, verstopfte Nase oder laufende Nase. Zusätzlich musste die nasale Schleimhautuntersuchung Blässe und Ödeme zeigen, und entweder das Ergebnis des Pricktests (Skin Prick Test, SPT) oder der serumgebundene IgE-Test musste positiv sein. Der Pricktest wurde durch geschultes Personal im allergologischen Testraum der Ambulanz durchgeführt, um Genauigkeit und konsistente Ergebnisse sicherzustellen. Alle AR-Patienten absolvierten den Rhinoconjunctivitis Quality of Life Questionnaire (RQLQ) sowie die Bewertung des Total Nasal Symptom Score (TNSS) mit Unterstützung des medizinischen Personals, und die erzielten Werte wurden für die anschließende Analyse dokumentiert.
Gesunde Freiwillige, die sich im Krankenhaus einer routinemäßigen körperlichen Untersuchung unterzogen, wurden als Nicht-AR-Gruppe rekrutiert. Teilnahmeberechtigt waren Personen ohne persönliche oder familiäre Vorgeschichte von AR, ohne Asthma- oder andere allergische Erkrankungen, ohne chronische Sinusitis oder andere entzündliche Erkrankungen der Nasenhöhle sowie ohne Infektion der Atemwege im letzten Monat. Zusätzlich wurden Personen mit Vorerkrankung schwerer Herzerkrankungen, Leber-, Lungen- oder Nierenerkrankungen oder bösartigen Tumoren von der Studie ausgeschlossen.
Es wurden periphere venöse Blutproben von zwei Gruppen von Freiwilligen gesammelt. Ein Teil des antikoagulierten venösen Blutes wurde zur DNA-Extraktion und zur Extraktion von Plasma-RNA verwendet. Ein weiterer Teil des venösen Blutes wurde separiert, um Serum zu gewinnen, das für den Nachweis serumbezogener Faktoren (Immunglobulin E (IgE), Interleukin-4 (IL-4), IL-6 und IL-10) verwendet wurde.
DNA-Extraktion:
200 µL peripherer venöser Blutproben wurden zur DNA-Gewinnung unter Verwendung eines Kits zur genomischen DNA-Extraktion aus Vollblut verwendet (siehe Tabelle der Materialien). Die Blutproben wurden in Röhrchen mit Lithiumheparin als Antikoagulans gesammelt, anschließend aliquotiert und bei -20 °C eingefroren. Die spezifischen Arbeitsabläufe sind streng gemäß den Anweisungen des Kits durchzuführen. Abschließend wurden 100 µL Elutionspuffer verwendet, um die DNA zu eluieren. Die Reinheit der extrahierten DNA-Probe wurde mittels Nukleinsäure-/Proteinanalyzer (Spektrophotometer) bestimmt (das Verhältnis OD₂₆₀/OD₂₈₀ lag zwischen 1,8 und 2,0). Die DNA-Proben wurden nach der Analyse bei -20 °C für spätere Genotypisierungsexperimente aufbewahrt.
Genotypdetektion
Ein TaqMan SNP-Genotypisierungs-Kit stand zur Bestimmung der Verteilung der miR-146a rs2910164-Genotypen zur Verfügung. Die Kit-Informationen wurden in die Verbrauchsmittelliste eingetragen. Das Gesamtvolumen der PCR-Reaktion betrug 10 µL und enthielt 5 µL Master Mix, 0,5 µL Sondenprimer-Mix, 10 ng Vorlagen-DNA und RNase-freies Wasser. Die DNA-Amplifikation wurde mit dem Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Gerät Roche LightCycler 480 II durchgeführt. Reaktionsbedingungen: Prädenaturierung bei 95 °C für 10 min; 40 Zyklen (95 °C für 15 Sekunden, 60 °C für 1 min), wobei die FAM/VIC-Fluoreszenz bei 60 °C erfasst wurde. Nach Abschluss der Amplifikation wurden die erfassten FAM/VIC-Doppel-Fluoreszenzsignale mit der LightCycler 480-Software analysiert und die Genotypdaten statistisch ausgewertet. Ein einzelnes FAM-Signal repräsentiert einen homozygoten Genotyp, ein einzelnes VIC-Signal einen anderen homozygoten Genotyp, und das Vorhandensein beider Signale weist auf einen heterozygoten Genotyp hin. Proben mit abnormalen Signalen oder inkonsistenten Ergebnissen bei Wiederholung werden erneut getestet. Jedes Experiment wurde jeweils mit einer kontrollierten Probe ohne Vorlage-DNA und einer positiven Kontrolle zur Qualitätskontrolle durchgeführt. Alle Proben wurden in dreifacher technischer Wiederholung analysiert.
Echtzeit-PCR (RT-qPCR)
Die Gesamt-RNA aus Plasma wurde aus 100 µL Plasma mithilfe eines speziellen miRNA-Extraktionskits isoliert. Die Kit-Informationen wurden in die Liste der Verbrauchsmaterialien eingetragen. Die RNA-Konzentration wurde mittels Spektrophotometer bestimmt. Das OD₂₆₀/OD₂₈₀-Verhältnis der qualifizierten extrahierten miRNA-Proben lag zwischen 1,8 und 2,0. Für die reverse Transkription zur Synthese von cDNA wurden 200 ng RNA verwendet, und das Reaktionsverfahren erfolgte gemäß den Standardanweisungen des Kits. Die reverse Transkription wurde in einem Gesamtvolumen von 20 µL durchgeführt, einschließlich einer Inkubation bei 42 °C für 60 min und einer Inaktivierung bei 85 °C für 5 min. Die qPCR-Reaktion wurde gemäß dem etablierten Protokoll mit einem Gesamtvolumen von 20 µL vorbereitet. Die Reaktionsmischung setzte sich wie folgt zusammen: 10 µL qPCR-Vormischung, 0,4 µL Vorwärtsprimer, 0,4 µL Rückwärtsprimer, 1 µL cDNA-Vorlage und 8,2 µL RNase-freies Wasser. Es wurden spezifische Primer für miR-146a und das interne Referenzgen U6 verwendet. Die Amplifikation wurde mit dem Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Gerät Roche LightCycler 480 II durchgeführt. Die thermischen Zyklenbedingungen für die qPCR waren: 95 °C für 30 s zur Vor-Denaturierung, gefolgt von 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 5 s sowie Annealing und Extension bei 60 °C für 30 s. Alle Proben wurden in dreifacher technischer Wiederholung analysiert. Die experimentellen Daten wurden mit der LightCycler 480-Software ausgewertet. Unter Verwendung von U6 als interne Referenz zur Korrektur von interprobenbedingten Variationen wurde zunächst ΔCt (Ct-Wert von miR-146a minus Ct-Wert von U6) berechnet, anschließend ΔΔCt (ΔCt der Versuchsgruppe minus ΔCt der Kontrollgruppe) und schließlich die relative Expressionsmenge von miR-146a über 2⁻ΔΔCt ermittelt.
ELISA
Die Serumspiegel von IgE, IL-4, IL-6 und IL-10 wurden mithilfe von ELISA-Tests bestimmt. Die experimentellen Verfahren orientierten sich an der Bedienungsanleitung. Die spezifischen Schritte waren wie folgt: Zunächst wurde die konzentrierte Waschlösung verdünnt und die Standards stufenweise verdünnt, um Arbeitslösungen für die Standardkurve herzustellen. Anschließend wurden je 50 µL Verdünnungspuffer, Standardlösung und zu testende Probe in die Wells gegeben und 60 min bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Wells dreimal mit Waschpuffer gespült. Danach wurden je 50 µL der Arbeitslösung der enzymkonjugierten Antikörper zugegeben und die Platten 30 min bei 37 °C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurde die Flüssigkeit entfernt, die Wells erneut gespült und anschließend die chromogene Lösung hinzugefügt. Die Platten wurden 15 min bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Nach Zugabe der Stopplösung wurde die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Die Probenkonzentrationen wurden anhand der Standardkurve berechnet. Jede Probe wurde dreifach getestet. Daten mit einem Variationskoeffizienten unter 10 % galten als gültig. Zur Qualitätskontrolle wurden während des Experiments Leer- und Kontrollwells eingerichtet. Der Nachweisbereich und die Empfindlichkeit des Kits entsprachen den Vorgaben des Herstellerhandbuchs.
Datenstatistik
Die experimentellen Daten wurden mit den Softwareprogrammen SPSS und GraphPad Prism 9 analysiert. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) dargestellt. Der Shapiro-Wilk-Test wurde zur Beurteilung der Normalverteilung stetiger Variablen verwendet, und der Levene-Test wurde zur Bewertung der Varianzhomogenität angewandt. Der Vergleich stetiger Variablen zwischen den beiden Gruppen wurde mittels des t-Tests für unabhängige Stichproben analysiert. Für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA mit anschließendem Tukey-Post-hoc-Test durchgeführt, und eine zweifaktorielle ANOVA wurde verwendet, um die Haupteffekte von zwei unabhängigen Faktoren sowie deren Wechselwirkungseffekt zu bewerten. Ausreißer wurden basierend auf der 3-Standardabweichungs-Regel identifiziert und ausgeschlossen. In dieser Studie wurden keine fehlenden Daten festgestellt. Die Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurve wurde zur Analyse der diagnostischen Wirksamkeit von miR-146a für AR verwendet. Relevante ROC-Parameter und 95-%-Konfidenzintervalle wurden mithilfe integrierter statistischer Algorithmen berechnet. Die Pearson-Korrelationsanalyse wurde verwendet, um die lineare Korrelation zwischen der Expression von miR-146a und den Konzentrationen serumbezogener Faktoren zu ermitteln. Univariate und multivariate logistische Regressionsanalysen wurden durchgeführt, um Risikofaktoren für AR zu identifizieren. Variablen mit p < 0,05 in der univariaten Analyse wurden in das multivariate logistische Regressionsmodell einbezogen. Ein p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnisse
Teilnehmermerkmale und Genotypverteilung
Die klinischen Basisdaten der beiden Probandengruppen wurden statistisch analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Serumspiegel von IgE, IL-4, IL-6 und IL-10 signifikante Unterschiede aufwiesen. Im Vergleich zur Nicht-AR-Freiwilligengruppe waren die Konzentrationen von Serum-IgE, IL-4 und IL-6 in der AR-Patientengruppe erhöht, während der IL-10-Spiegel vermindert war (Tabelle 1). Die Genotypverteilung von miR-146a rs2910164 wurde mittels der TaqMan-qPCR-Methode bestimmt. Die Analyseergebnisse zeigten, dass der GG-Genotyp (χ2=7,018, OR (95% CI) = 0,471 (0,269–0,825), p=0,008) und das G-Allel (χ2=7,474, OR (95% CI) = 0,637 (0,506–0,894), p=0,006) bei der AR-Patientengruppe häufiger vorkamen als in der Nicht-AR-Gruppe. Die Genotypverteilung am rs2910164-Lokus entsprach dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (pHWE = 0,191) (Tabelle 2).
Analyse der Expression von Plasma-miR-146a
Die Expression von miR-146a im Plasma wurde in beiden Studienkohorten gemessen. In der Gruppe der AR-Patienten wurde eine deutliche Verringerung des miR-146a-Spiegels beobachtet (Abbildung 1A). Die ROC-Kurvenanalyse zeigte, dass miR-146a eine gute diagnostische Wirksamkeit für AR aufweist (Abbildung 1B). Die AUC betrug 0,891. Bei einem optimalen Cutoff-Wert von 0,785 ergaben sich eine Sensitivität von 83,89 %, eine Spezifität von 79,44 % und ein Youden-Index von 0,633. Basierend auf dem Genotyp des miR-146a rs2910164 wurden die beiden Probandengruppen jeweils in drei Untergruppen unterteilt: GG, GC und CC. Die Unterschiede in der miR-146a-Expression in jeder Untergruppe wurden verglichen. Die statistischen Ergebnisse zeigten, dass in der Nicht-AR-Gruppe keine signifikanten Unterschiede in der miR-146a-Expression zwischen den verschiedenen Genotyp-Untergruppen bestanden (Abbildung 1C); in der AR-Gruppe war der Expressionsspiegel von Plasma-miR-146a in der GG-Genotyp-Untergruppe signifikant niedriger als in den GC- und CC-Genotyp-Untergruppen (Abbildung 1D). Die oben genannten Daten deuten darauf hin, dass die Expression von Plasma-miR-146a bei AR-Patienten, die den GG-Genotyp von rs2910164 tragen, vermindert ist.
Serumanalyse von Zytokinen und Korrelation mit der miR-146a-Expression
Anschließend wurden die Serumspiegel von IgE, IL-4, IL-6 und IL-10 in den verschiedenen Genotyp-Subgruppen der Probanden statistisch ausgewertet. Die statistischen Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede in den Serumspiegeln von IgE, IL-4, IL-6 und IL-10 zwischen den verschiedenen Genotyp-Subgruppen (Abbildung 2A–D); in der AR-Gruppe waren die Spiegel von serumgebundenem IgE, IL-4 und IL-6 bei Patienten mit dem GG-Genotyp signifikant höher als bei Patienten mit den GC- und CC-Genotypen, während der Spiegel von serumgebundenem IL-10 niedriger war (Abbildung 2A–D). Mithilfe einer Pearson-Korrelationsanalyse wurden lineare Zusammenhänge zwischen der Expression von miR-146a im Plasma und der TNSS-Skala, der RQLQ-Skala sowie den Serumspiegeln von IgE, IL-4, IL-6 und IL-10 untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von miR-146a signifikant negativ mit der TNSS-Skala, der RQLQ-Skala und den Serumspiegeln von IgE, IL-4 und IL-6 korrelierte, während eine positive Korrelation mit dem Serumspiegel von IL-10 bestand (Tabelle 3). Diese Befunde legen nahe, dass die Expressionshöhe von miR-146a eng mit der Schwere der AR sowie mit den Ausmaßen allergischer Reaktionen und Entzündungen verknüpft ist.
Analyse der Risikofaktoren für allergische Rhinitis
Mithilfe einer univariaten logistischen Regression wurden die Risikofaktoren für AR analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass IgE (OR = 1,719, 95 % CI = 1,151–2,568, p = 0,008), IL-4 (OR = 1,602, 95 % CI = 1,073–2,392, p = 0,021), IL-6 (OR = 1,566, 95 % CI = 1,048–2,341, p = 0,029), IL-10 (OR = 0,649, 95 % CI = 0,435–0,968, p = 0,034) und die Expression von miR-146a (OR = 0,149, 95 % CI = 0,096–0,233, p < 0,001) einen Einfluss auf das Auftreten von AR hatten. Nach Berücksichtigung von Störfaktoren mittels multivariater logistischer Regressionsanalyse ergab sich statistisch signifikant, dass IgE (OR = 1,724, 95 % CI = 1,092–2,722, p = 0,019), IL-4 (OR = 1,943, 95 % CI = 1,206–3,131, p = 0,006), IL-10 (OR = 0,479, 95 % CI = 0,296–0,773, p = 0,003) und die Expression von miR-146a (OR = 0,148, 95 % CI = 0,093–0,235, p < 0,001) unabhängige Risikofaktoren für AR darstellten (Tabelle 4).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2. Expression von miR-146a im Plasma und diagnostische Leistung bei AR.
(A) Relative Expression von miR-146a im Plasma bei gesunden Probanden ohne AR und Patienten mit AR. (B) ROC-Kurve zur Bewertung der diagnostischen Leistung von miR-146a im Plasma für AR. (C) Expression von miR-146a im Plasma in den Genotyp-Untergruppen GG, GC und CC in der Gruppe ohne AR. (D) Expression von miR-146a im Plasma in den Genotyp-Untergruppen GG, GC und CC in der AR-Gruppe. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. ***p < 0.001. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3. Serumspiegel von Zytokinen bei Probanden mit unterschiedlichen Genotypen von miR-146a rs2910164 in den Gruppen ohne AR und mit AR.
Serumspiegel von (A) IgE, (B) IL-4, (C) IL-6 und (D) IL-10 in den Subgruppen mit GG-, GC- und CC-Genotypen der Gruppen ohne AR und mit AR. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ns, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
| Information | Nicht-AR | AR | p-Wert |
| Alter (Jahre) | 42,37±12,43 | 41,81±11,86 | 0,316 |
| BMI (kg/m2) | 23,72±2,36 | 23,58±2,71 | 0,302 |
| Geschlecht (männlich, n) | 87 | 97 | 0,641 |
| Raucher | 81 | 94 | 0,929 |
| IgE (IU/ml) | 36,17±10,44 | 116,52±24,38 | <0,001 |
| IL-4 (ng/L) | 1,76±0,61 | 18,74±4,62 | <0,001 |
| IL-6 (ng/L) | 1,29±0,57 | 9,63±3,79 | <0,001 |
| IL-10 (ng/L) | 3,26±0,68 | 1,74±0,73 | <0,001 |
| TNSS | / | 5,92±1,82 | |
| RQLQ | / | 2,43±1,16 | |
| Abkürzungen: AR, allergische Rhinitis; BMI, Body-Mass-Index; IgE, Immunglobulin E; IL, Interleukin; TNSS, Gesamtwert der nasalen Symptome; RQLQ, Fragebogen zur Lebensqualität bei Rhinokonjunktivitis; p<0,05 zeigt statistische Signifikanz an. | |||
Tabelle 1: Klinische Merkmale der Studienteilnehmer.
Vergleich der demografischen Merkmale, der Spiegel von Serumzytokinen und der klinischen Bewertungsscores zwischen den Gruppen ohne AR und mit AR. Die Abkürzungen sind im Tabellenfußnote erläutert.
| rs2910164 | Nicht-AR (n=180) (%) | AR (n=211) (%) | Χ2 | p-Wert | OR (95% KI) |
| Kodominaler Modell | |||||
| GG | 31 (17,22 %) | 57 (27,01 %) | 1 | ||
| GC | 82 (45,56 %) | 96 (45,50 %) | 2,832 | 0,092 | 0,637 (0,376–1,079) |
| CC | 67 (37,22 %) | 58 (27,49 %) | 7,018 | 0,008 | 0,471 (0,269–0,825) |
| Dominanter Modell | |||||
| GG + GC | 113 (62,78 %) | 153 (72,51 %) | 1 | ||
| CC | 67 (38,22 %) | 58 (27,49 %) | 4,232 | 0,04 | 0,639 (0,417–0,980) |
| Rezessiver Modell | |||||
| GG | 31 (17,22 %) | 57 (27,01 %) | 1 | ||
| GC + CC | 149 (82,78 %) | 154 (72,99 %) | 5,34 | 0,021 | 0,562 (0,344–0,919) |
| Allele | |||||
| G | 144 (40,00 %) | 210 (49,76 %) | 1 | ||
| C | 216 (60,00 %) | 212 (50,24 %) | 7,474 | 0,006 | 0,637 (0,506–0,894) |
| pHWE | 0,494 | 0,191 | |||
| Abkürzung: AR, allergische Rhinitis. OR, Odds Ratio; pHWE>0,05 deutet darauf hin, dass die Gruppe im Einklang mit dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht ist. p < 0,05 zeigt statistische Signifikanz an. Hinweis: Das GG-Genotyp wurde als Referenzgruppe (OR = 1,000) für alle genetischen Modelle festgelegt. | |||||
Tabelle 2: Assoziation zwischen der miR-146a-rs2910164-Polymorphie und allergischer Rhinitis.
Verteilung der rs2910164-Genotypen und -Allele in den Nicht-AR- und AR-Gruppen, analysiert mithilfe kodominanter, dominanter, rezessiver und allelischer genetischer Modelle.
| Einzelteile | miR-146a | TNSS | RQLQ | IgE | IL-4 | IL-6 | IL-10 |
| Pearson-Korrelation | 1 | -0,742 | -0,736 | -0,806 | -0,756 | -0,727 | 0,757 |
| p-Wert | / | <0,001 | <0,001 | <0,001 | <0,001 | <0,001 | <0,001 |
| Abkürzung: TNSS, Gesamtwert der nasalen Symptome (Total Nasal Symptom Score); RQLQ, Fragebogen zur Lebensqualität bei Rhinokonjunktivitis (Rhinoconjunctivitis Quality of Life Questionnaire); IgE, Immunglobulin E; IL, Interleukin; p<0,05 weist auf statistische Signifikanz hin. | |||||||
Tabelle 3: Korrelation der Expression von miR-146a im Plasma mit klinischen und entzündlichen Parametern.
Pearson-Korrelationsanalyse der Expression von miR-146a im Plasma mit TNSS-Score, RQLQ-Score, Serum-IgE-Spiegel und Zytokinspiegeln bei den Studienteilnehmern.
| Elemente | Univariate Regressionsanalyse | Multivariate Regressionsanalyse | ||||
| OR | 95% CI | p-Wert | OR | 95% CI | p-Wert | |
| Alter | 0.984 | 0,661–1,465 | 0,937 | |||
| BMI | 1,301 | 0,799–2,119 | 0,29 | |||
| Geschlecht | 1,099 | 0,738–1,638 | 0,641 | |||
| Raucher | 1,018 | 0,683–1,519 | 0,929 | |||
| IgE | 1,719 | 1,151–2,568 | 0,008 | 1,724 | 1,092–2,722 | 0,019 |
| IL-4 | 1,602 | 1,073–2,392 | 0,021 | 1,943 | 1,206–3,131 | 0,006 |
| IL-6 | 1,566 | 1,048–2,341 | 0,029 | 1,489 | 0,924–2,353 | 0,088 |
| IL-10 | 0,649 | 0,435–0,968 | 0,034 | 0,479 | 0,296–0,773 | 0,003 |
| miR-146a-Expression | 0,149 | 0,096–0,233 | <0,001 | 0,148 | 0,093–0,235 | <0,001 |
| Abkürzungen: AR, allergische Rhinitis; BMI, Body-Mass-Index; IgE, Immunglobulin E; IL, Interleukin. | ||||||
Tabelle 4: Logistische Regressionsanalyse von Faktoren, die mit allergischer Rhinitis assoziiert sind.
Univariate und multivariate logistische Regressionsanalysen zur Bewertung von demografischen Variablen, serumgebundenen Zytokinen und der Expression von Plasma-miR-146a als Faktoren, die mit AR assoziiert sind.
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Diskussion
AR ist eine chronische allergische Entzündungserkrankung der Atemwege. Der zentrale Mechanismus von AR besteht darin, dass nach Exposition des Körpers gegenüber Allergenen entzündliche Läsionen der Nasenschleimhaut durch IgE vermittelt werden17,18. Zu den hauptsächlichen klinischen Symptomen zählen Juckreiz in der Nase, verstopfte Nase, Niesen und klarer Nasenausfluss, die die Lebensqualität der Patienten erheblich beeinträchtigen. Epidemiologische und genetische Studien haben bestätigt, dass eine genetische Anfälligkeit eine entscheidende und unverzichtbare Rolle beim Auftreten und Fortschreiten von AR spielt19. Diese Studie zeigte weiterhin, dass die Polymorphie miR-146a rs2910164 eng mit der Anfälligkeit für AR assoziiert ist und dass das GG-Genotyp des rs2910164 möglicherweise das pathogene Genotyp darstellt. Die erhöhte Serumkonzentration von IgE, IL-4 und IL-6 sowie die beobachtete Verringerung des IL-10-Spiegels bei Patienten mit AR weisen auf verstärkte allergische und entzündliche Reaktionen hin, die mit den immunopathologischen Merkmalen der Erkrankung übereinstimmen.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die miR-146a-SNP zur Pathogenese verschiedener allergischer Erkrankungen beiträgt, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis20, systemischer Lupus erythematodes21 und entzündliche Darmerkrankung22. Rasha et al. berichteten zudem, dass die Verteilung der GG-Genotypfrequenz und des G-Allels an der rs2910164-Lokus signifikant mit der Anfälligkeit für entzündliche Darmerkrankung korreliert22. Die Hai-Bo-Gruppe entdeckte, dass der CC-Genotyp an der rs2910164-Lokus ein schützender Genotyp für Psoriasis ist. Personen, die den GG-Genotyp tragen, weisen ein signifikant geringeres Risiko für die Entwicklung von Psoriasis auf23. Mehrere Studien berichteten, dass die rs2910164-Polymorphie eng mit der Asthmaanfälligkeit verbunden ist, und es wurde bestätigt, dass der GG-Genotyp das Risiko für die Entwicklung von Asthma signifikant erhöht15,16,24. Diese Studie zeigte weiterhin, dass die Verteilungshäufigkeit des miR-146a rs2910164 GG-Genotyps bei AR-Patienten höher war als in der gesunden Kontrollgruppe, was darauf hindeutet, dass der GG-Genotyp die Anfälligkeit für AR erhöhen könnte. Die beobachtete Anreicherung des GG-Genotyps und des G-Allels in der AR-Gruppe stützt weiterhin den möglichen Beitrag der genetischen Variation von miR-146a rs2910164 zur Krankheitsanfälligkeit. Bei AR-Patienten, die den rs2910164 GG-Genotyp tragen, waren die Konzentrationen von serumgebundenem IgE, IL-4, IL-6 und IL-10 erhöht. Das beobachtete veränderte Zytokinprofil bei Trägern des GG-Genotyps deutet auf eine stärkere entzündliche und allergische Reaktion hin, die zur erhöhten Krankheitsanfälligkeit beitragen könnte. Dieses Ergebnis legt nahe, dass der GG-Genotyp an der Pathogenese von AR beteiligt sein könnte, indem er die allergische und entzündliche Reaktion verstärkt.
Als zentraler Regulator der Entzündungsreaktion entfaltet miR-146a eine starke entzündungshemmende Wirkung. Die Überexpression von miR-146a reguliert downstream liegende Gene und lindert signifikant mehrere entzündungsbedingte Schäden25,26,27. Frühere Studien haben bestätigt, dass die Überexpression von miR-146a die Entzündungsreaktion bei allergischer Konjunktivitis wirksam unterdrücken kann, indem sie die Expression des Transkriptionsfaktors Forkhead-Box-Protein 3 (FOXP3) hochreguliert28. Weitere Tierversuche zeigten, dass die Herunterregulation von miR-146a bei mutierten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen ein höheres Risiko für die Entwicklung eines Emphysems birgt, was die schützende Rolle von miR-146a bei Atemwegserkrankungen weiter bestätigt29. Im Sinusitis-Modell hemmt miR-146a die Aktivierung von Mucin5AC (MUC5AC), wodurch die Schleimhautentzündung und eine übermäßige Schleimsekretion reduziert werden13. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass der Spiegel von miR-146a bei Patienten mit allergischer Rhinitis (AR) vermindert war und die plasmatische Expression von miR-146a bei Patienten mit dem rs2910164 GG-Genotyp noch niedriger war. Diese Befunde deuten darauf hin, dass der rs2910164 GG-Genotyp die Anfälligkeit für AR über seine Assoziation mit einer verminderten Expression von miR-146a und einer veränderten Immunregulation beeinflussen könnte. Der GG-Genotyp könnte die Expression von miR-146a verringern, wodurch seine entzündungshemmende Regulatorfunktion geschwächt und die Anfälligkeit für AR erhöht wird. Die Pearson-Korrelationsanalyse zeigte zudem einen Zusammenhang zwischen der Expression von miR-146a und der Schwere der AR sowie dem Entzündungszustand. Die Expression von miR-146a korrelierte linear negativ mit TNSS, RQLQ und den Serumspiegeln von IgE, IL-4 und IL-6 sowie linear positiv mit dem Spiegel von IL-10. Dies bedeutet, dass bei AR-Patienten mit niedrigerer miR-146a-Expression die klinischen Symptome schwerer ausgeprägt sind, die Lebensqualität stärker beeinträchtigt ist und allergische Reaktionen sowie entzündliche Reaktionen intensiver verlaufen.
Diese Studie war eine Fall-Kontroll-Studie. Die Analyse bestätigte eine signifikante Assoziation zwischen der miR-146a rs2910164-Polymorphie und der Anfälligkeit für AR. Die Forschung weist jedoch bestimmte Einschränkungen auf. Einerseits könnte die relativ geringe Stichprobengröße die Verallgemeinerbarkeit unserer Ergebnisse einschränken und die Verteilungsmerkmale des rs2910164-Genotyps in der Bevölkerung nicht genau charakterisieren. Andererseits zeigt diese Studie lediglich die Assoziation zwischen der miR-146a rs2910164-Polymorphie und der Anfälligkeit für AR auf, kann aber den kausalen Zusammenhang zwischen der miR-146a rs2910164-Polymorphie und AR nicht eindeutig belegen. Daher wird zukünftig eine prospektive Kohortenstudie durchgeführt, um mehr Patienten einzubeziehen, den Zusammenhang zwischen der miR-146a rs2910164-Polymorphie und dem Auftreten, Fortschreiten sowie der Prognose von AR zu klären und eine ausreichendere theoretische Grundlage für die Prävention und Behandlung von AR zu liefern.
Insgesamt war die Expression von miR-146a im Plasma bei Patienten mit AR verringert, und das rs2910164 GG-Genotyp war mit einer erhöhten Krankheitsanfälligkeit assoziiert. Diese Studie liefert einen potenziellen molekularen Marker zur Identifizierung von Personen mit erhöhtem AR-Risiko und schafft eine Grundlage für zukünftige Untersuchungen der genetischen Mechanismen, die der Krankheitsentstehung und -progression zugrunde liegen.
Offenlegungen
In dieser Arbeit gibt es keine Offenlegung.
Datenverfügbarkeit:
Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind als ergänzende Datei in diesem Artikel enthalten. Weitere Anfragen können an den korrespondierenden Autor gerichtet werden.
Beitrag der Autoren:
YMY leistete wesentliche Beiträge zur Konzeption und zum Design, zur Datenerhebung sowie zur Analyse und Interpretation der Daten und war an der Ausarbeitung des Manuskripts beteiligt. YYH unterstützte bei der Datenerhebung, Datenanalyse und statistischen Analyse. GML und JCW trugen zur Interpretation der Ergebnisse bei und überarbeiteten das Manuskript kritisch. Alle Autoren lasen und genehmigten das endgültige Manuskript.
Danksagungen
Nicht zutreffend.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 15-mL-Zentrifugenröhrchen | Corning | 430791 | Für die Plasmaspaltung, Probenaufteilung und die Nukleinsäure-Extraktion |
| Applied Biosystems TaqMan Genotyping Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4371355 | 2× konzentrierte Master-Mix-Lösung, optimiert für SNP-Genotypisierung, enthaltend Hot-Start-Taq-Polymerase, dNTPs, Magnesiumionen, Reaktionspuffer und ROX-Referenzfarbstoff. Keine manuelle Systemvorbereitung erforderlich. Kompatibel mit dem oben genannten TaqMan-SNP-Genotypisierungs-Assay bietet sie ein stabiles enzymatisches Reaktionssystem für die SNP-Amplifikation und fluoreszenzbasierte Genotypisierung mit guter Reproduzierbarkeit und klaren Clusterergebnissen. |
| Applied Biosystems TaqMan SNP-Genotypisierungs-Assay (rs2910164, miR-146a) | Thermo Fisher Scientific | C__15946974_10 | Vorkonfektionierte Primer- und Sondenmischung zur SNP-Genotypisierung des humanen miR-146a rs2910164-Lokus. Enthält spezifische PCR-Primer und zwei MGB-Fluoreszenzsonden. VIC markiert das C-Allel und FAM markiert das G-Allel. Kann präzise die drei Genotypen (CC, CG, GG) in einem einzigen Reaktionsgefäß unterscheiden und eignet sich für die Endpunkt-Alleldiskriminierung an qPCR-Geräten. |
| BD Lithium-Heparin-Antikoagulans-Blutentnahmeröhrchen | BD Vacutainer | 367884 | Klinische Biochemie, Notfalltests und hämatologische Forschung |
| Graphpad | USA | / | Professionelle wissenschaftliche Grafikerstellung & Statistik-Software, Standard in Biologie/Medizin, keine Programmierkenntnisse erforderlich. Wichtige Stärken: t-Tests, ANOVA, Überlebensanalyse, nichtlineare Regression (z. B. Dosis-Wirkungs-Kurven); erzeugt publikationsreife Grafiken (Balken-, Streu-, Überlebenskurven) für qPCR, Western Blot, Zellassays. |
| Immunoglobulin E (IgE) ELISA-Kit | Jiancheng | H108-1-2 | Anwendung: Immunreaktion, Forschung zu allergischen Erkrankungen |
| Interleukin-10 (IL-10) ELISA-Kit | Jiancheng | H010-1-2 | Anwendung: Entzündung, Immunregulation, klinische Biomarker-Forschung |
| Interleukin-4 (IL-4) ELISA-Kit | Jiancheng | H005-1-2 | Forschungsbereich: Entzündung, Th2-Immunantwort, allergische Reaktion |
| Interleukin-6 (IL-6) ELISA-Kit | Jiancheng | H007-1-2 | Anwendung: Entzündung, Immunregulation, klinische Biomarker-Forschung |
| LightCycler 480 Software (v1.5 /v1.6) | Roche Diagnostics | / | Offizielle Roche-Software, die die qPCR-Datenakquise per Knopfdruck, quantitative Analyse, Schmelzkurvenanalyse sowie SNP-Genotypisierung (TaqMan-Endpunkt-Methode + HRM) ermöglicht. |
| miRcute Enhanced miRNA cDNA Erste-Strang-Synthese-Kit | TIANGEN | KR211-02 | Geeignet für die reverse Transkription aller reifen miRNAs |
| miRcute Serum/Plasma-miRNA-Extraktions- und Isolationskit | TIANGEN | DP503 | Geeignetes Probenmaterial: Humanes Serum, Plasma, Zellüberstand |
| Roche LightCycler 480 Instrument II (Echtzeit-PCR-System) | Roche Diagnostics | 05015278001 | qPCR-Quantifizierung + SNP-Genotypisierung (einschließlich TaqMan) + HRM-Analyse der Hochauflösenden Schmelzkurven |
| SPSS 27.0 | USA | / | Alles-in-einem-Software für Sozialwissenschaften/Medizinische Statistik, menügesteuert (kein Programmieren erforderlich), ideal für große Stichproben & komplexe Designs. Kernfunktionen: deskriptive Statistik, ANOVA, Regression, Chi-Quadrat-Test, Überlebensanalyse, Reliabilität, Berechnung der Stichprobengröße; unterstützt Datensäuberung & Import in mehreren Formaten (Excel/CSV) für klinische, Umfrage- und epidemiologische Daten. |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | TIANGEN | FP205-02 | Hochspezifische, verbesserte Master-Mix; optimierter Puffer mit H-Bindungs-Faktor minimiert Primer-Dimere & nichtspezifisch; Hot-Start-Taq + ROX für LightCycler 480 II; hohe Empfindlichkeit & Reproduzierbarkeit; ideal für Gene mit geringer Expression, komplexe Proben und Hochdurchsatz-Genotypisierung. |
| Thermo Scientific Multiskan FC Mikroplatten-Photometer | Thermo | 51119180 | Hochlesefähiger Multimode-Plattenreader; Absorption (einschließlich 450 nm) + Fluoreszenz + Lumineszenz; Linearität 0–4 Antikörper±2 %) bei 450 nm, Präzision SD&<0,001 Abs; kompatibel mit 96/384-Well-Platten, automatische Dynamikbereichsanpassung; ideal für ELISA, Zellviabilität, Immunoassays, molekulare Wechselwirkungen. |
| Thermo Scientific NanoDrop One UV-Vis-Spektrophotometer | Thermo | / | Goldstandard-Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer; 1–2 μL Probe, keine Küvette erforderlich; misst direkt Nukleinsäuren (260 nm), Proteine (280 nm), OD600 mit Konzentration & Reinheitsquotienten (A260/A280, A260/A230); Vollspektrum-Scan 190–850 nm, automatische Kalibrierung, Touchscreen; ideal für qPCR, NGS, Qualitätskontrolle der Proteinreinigung |
| Kit zur Extraktion genomischer DNA aus Vollblut | TIANGEN | DP304-03 | Anwendbares Probenmaterial: peripheres Vollblut, Blutzellen, Gewebeproben |
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