Stabilisierende Protein- und Protein-RNA-Kondensate in niedrigschmelzenden Agarose-Hydrogelen für quantitative biophysikalische Messungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine robuste Methode, um flüssig-flüssige, phasengetrennte Kondensate innerhalb einer porösen, niedrigschmelzenden Agarose-Hydrogelmatrix physisch zu immobilisieren, ohne deren interne Flüssigkeitsdynamik zu stören. Der Ansatz minimiert Tröpfchensedimentation, Koaleszenz und oberflächenbenetzende Artefakte und ermöglicht so reproduzierbare Bildgebung und quantitative biophysikalische Analyse über Stunden hinweg.

Zusammenfassung

Biomolekulare Kondensate, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung gebildet werden, werden zunehmend als grundlegende organisatorische Einheiten der Zelle anerkannt, mit Aufgaben von RNA-Verarbeitung bis hin zur Assemblierung von Stressgranulaten. Die In-vitro-Rekonstitution solcher Kondensate mit gereinigten Proteinen und RNA liefert Modellsysteme, doch flüssige Tröpfchen verdichten, sedimentieren und breiten sich im Laufe der Zeit auf Oberflächen aus, wodurch erhebliche Variabilität in quantitativen Messungen über experimentelle Zeiträume hinweg eingeführt wird. Das Einbetten dieser Kondensate in ein spärliches, optisch transparentes und chemisch inertes Hydrogel – hier hergestellt aus niedrigschmelzendem Agarose (LMA) bei 0,3–1,0 % W/v – stabilisiert Tröpfchen in drei Dimensionen und ermöglicht so den Einsatz von Methoden mit längeren Messzeiten oder experimentellen Aufbauten mit wiederholten Messungen. Dieses Papier präsentiert ein detailliertes, schrittweises Protokoll zur LMA-Lagerpräparation, Tröpfchenbildung und Einbettung und liefert Beispiele für spezifische nachgelagerte biophysikalische Messungen. Wir zeigen außerdem, dass spezifische Tropfeneigenschaften, wie die molekulare Diffusion, nach der LMA-Einbettung in die getesteten repräsentativen Systeme erhalten bleiben. Da die Methode mit konfokaler, Weitfeld- oder Superauflösungsmikroskopie, Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleaching oder Kernspinresonanzspektroskopie kompatibel ist, kann sie die quantitative Charakterisierung biomolekularer Kondensate unterstützen, die für Gesundheit und Krankheit relevant sind.

Einleitung

Die Flüssigkeit-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) treibt die Bildung membranloser Organellen und biomolekularer Kondensate in Zellen vor, darunter Stressgranulate, P-Körper und den Nukleolus 1,2,3,4,5. Diese Kondensate konzentrieren spezifische Proteine und Nukleinsäuren, während sie einen schnellen Austausch mit dem umgebenden Zytoplasma oder Nukleoplasma aufrechterhalten – ein Kennzeichen für flüssiges^{Verhalten 1,2,3,4,5}. Die Dysregulation von LLPS wurde mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, wie neurodegenerativen Erkrankungen ^3,6,7, und ist auch mit der Replikation mehrerer Viren wie SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12 verbunden.

Die In-vitro-Rekonstitution von Kondensaten mit gereinigten Proteinen und RNA unter definierten Pufferbedingungen ist zu einem grundlegenden Ansatz zur Untersuchung von LLPS-Mechanismen ^{geworden 3,4}. Tröpfchen in einem Reagenzglas oder auf einer Glasoberfläche sind jedoch anfällig für drei Hauptartefakte: (i) Gravitationssedimentation, die Tropfen am Boden ansammeln lässt; (ii) Koaleszenz, bei der Tröpfchen im Laufe der Zeit zu wenigeren, größeren Strukturen verschmolzen; und (iii) Oberflächenbefeuchtung, bei der Tropfen sich ausbreiten und teilweise auf die Deckung absorbieren. Diese Phänomene verringern die Reproduzierbarkeit quantitativer Messungen und erschweren es, einzelne Tröpfchen in ihren physiologisch relevanten Dimensionen^{zu verfolgen 13}. Diese Phänomene schränken den Einsatz von Methoden weiter ein, die verlängerte Messzeiten von Minuten bis Stunden erfordern (z. B. Kernresonanzspektroskopie [NMR]- oder Superauflösungsmikroskopietechniken wie STORM) und verhindern wiederholte Messungen über längere Zeiträume.

Die physikalische Immobilisierung innerhalb eines Hydrogel-Netzwerks behandelt alle drei Artefakte gleichzeitig. Agarose bildet bei Temperaturen unter 34–38 °C ein physikalisch vernetztes Gel. Bei Konzentrationen von 0,3–1,0 % w/v ist die Netzgröße der Agarose groß genug, um intakte Mikrometertröpfchen einzuschließen, während sie ausreichend porös bleibt, um die intra-tropfen-molekulare Dynamik¹³ nicht zu behindern. Zusätzlich ermöglicht die Porosität der Agarosematrix die Diffusion von Makromolekülen und kleinen Molekülen in und aus den eingebetteten Tröpfchen. Für besonders temperaturempfindliche Systeme, die Proteine mit gefalteten Domänen betreffen oder einer oberen/unteren kritischen Lösungstemperatur (UCST/LCST)-Phasentrennung folgen, kann stattdessen niedrigschmelzende Agarose (LMA) mit einem Gellingpunkt von 26–30 °C verwendet werden. Alternative Anti-Benetzungsmethoden, wie die Oberflächenpassivierung, können die Kondensathaftung und damit das Benetzen reduzieren, erfordern jedoch oft eine spezielle Vorbereitung und verhindern weder Tröpfchensedimentation noch Koaleszenz. Im Gegensatz dazu bietet die Agarose-Einbettung eine einfache und breit zugängliche Methode zur räumlich immobilisierenden Kondensate. Wichtig ist, dass Agarose nachweislich den konformationellen Zustand des im Sarkom verschmolzenen Proteins (FUS) und anderer RNA-bindender Proteine bei Tröpfchenbildung bis zu Agarosekonzentrationen von 1,0 % w/v¹³ nicht stört. Dieses Protokoll standardisiert den Agarose-Einbettungsansatz für den allgemeinen Gebrauch mit vielen fasentrennenden Protein- oder Protein-RNA-Systemen von Interesse und bietet Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Reagenzienpräparation und Probenpräparation.

Protokoll

1. Herstellung von Agarose-Fond

WICHTIG: Bereiten Sie den Agarosebestand im selben Puffer vor, der zur Herstellung der phasengetrennten Proben (im Folgenden "Tropfenpuffer" bezeichnet) verwendet wird, um Puffer-Mismatch¹⁴ zu vermeiden. Beispiel: Die Nukleokapsidprobe wird in Puffer A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2) vorbereitet, der auch zur Herstellung des Agarosebestands verwendet werden soll.
HINWEIS: Die endgültigen experimentellen Bedingungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Pufferzusammensetzung, die Proteinkonzentration, die Verwendung von Zusatzstoffen und das Endprobenvolumen, hängen stark vom untersuchten biologischen System und der spezifischen nachgelagerten Anwendung ab. Ebenso hängen Erfassungsparameter, Instrumentenaufbau und Datenanalyse stark von der Probe und dem spezifischen Experiment ab. Beispielsweise wird die Herstellung des SARS-CoV-2-Nukleokapsids mit Poly(A) in Abbildung 1A (konfokale Fluoreszenzmikroskopie) beschrieben.

1. Wiegen Sie die passende Menge LMA oder normaler Agarose in ein 1,5-mL-Rohr mit Tröpfchenpuffer. Beispiel: Für eine 2 % W/V-Aktie lösen Sie 20 mg Agarose in 1 ml Puffer A auf.
   HINWEIS: Die Endkonzentration des Agarosebestands sollte je nach gewünschter Endkonzentration in der Probe 1–2 % w/v betragen. Es wird nicht empfohlen, mehr als 2 % W/V zu überschreiten, da das Pipetten zunehmend schwierig wird. Schneiden Sie das schmale Ende der Pipettenspitze ab, um das Pipettieren zu erleichtern, besonders bei hohen Agaroseanteilen. Konsultieren Sie den Diskussionsabschnitt, um festzustellen, ob LMA oder reguläre Agarose für die Proben erforderlich ist.
2. Erhitze den Agarose-Fond auf 80–90 °C in einem Heizblock oder Wasserbad und löse den Agarose vollständig durch Vortex auf (dauert ca. 10 Minuten).
   VORSICHT: Geschmolzene Agarose ist heiß. Vorsichtig damit umgehen.
3. Den Agarosebestand auf 37 °C (LMA) oder 55 °C (reguläre Agarose) im Heizblock oder Wasserbad auszugleichen. Überprüfen Sie, ob die Lösung bei dieser Temperatur klar und flüssig bleibt. Überprüfen Sie bei Bedarf die Temperatur des Agarose-Fonds mit einem Thermometer.
   PAUSENPUNKT: Geschmolzene Agarosebestände können 30–60 Minuten warm gehalten werden.
   Das Erhitzen der Agarose in einem Wasserbad wird dringend empfohlen, um eine homogenere Erhitzung zu gewährleisten und die Zieltemperatur mit ausreichender Präzision zu halten. Dies ist besonders wichtig bei der Arbeit mit LMA, da kleine Temperaturabweichungen zu einer vorzeitigen Gelation führen können.
4. Nach der Probenvorbereitung (Abschnitt 2) werden die übrig gebliebenen Agarosebrühe bei +4 °C gelagert. Befolgen Sie die oben genannten Schritte 1.2 und 1.3, um den Agarose-Bestand vor der Anwendung wieder einzuschmelzen und auszugleichen.
   HINWEIS: Wir empfehlen, den Agarosebestand maximal 2 Wochen bei +4 °C aufzubewahren und ihn nicht mehr als 2–3 Verhärtungs-/Schmelzzyklen zu unterziehen. Verwenden Sie gute Herstellungspraktiken, um Verunreinigungen zu verhindern. Entsorgen Sie Bestände früher, wenn sie nicht wieder einschmelzen oder wieder festigen oder sichtbare Kontaminationen auftreten.

2. Probenvorbereitung

1. Erwärmen Sie alle Materialien, die direkt mit der Agarose in Kontakt kommen (z. B. Pipettenspitzen, Röhrchen, Mikroskopieobjekte), auf etwa 37 °C, indem Sie sie für 2–3 Minuten auf den Heizblock oder in einen Inkubator legen.
2. Bereiten Sie den Agarose-Bestand gemäß Abschnitt 1 vor.
3. Bereiten Sie Tröpfchenpuffer, die phasentrennenden Komponenten (z. B. Protein- oder RNA-Bestände) und alle anderen Zusatzstoffe (z. B. Übungsmittel, Farbstoffe) gemäß dem Standardprotokoll für die Proben vor. Gleichgewicht auf Raumtemperatur (RT) an. Beispiel: Puffer A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), Nukleokapsid-Proteinstock (60 μM, in Puffer A), Poly(A)-Bestand (30 μM, im Puffer A).
   HINWEIS: Für die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleaching (FRAP), konfokaler Fluoreszenzmikroskopie oder stochastischer optischer Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) sollte ein kleiner Anteil fluoreszenzmarkierter Proteine oder RNA zu den Protein- bzw. RNA-Lagern hinzugefügt werden (empfohlen: <5 % markierter Anteil).
4. Berechnen Sie die Mengen des Tröpfchenpuffers, des Agarose-Bestands, der phasentrennenden Komponenten (z. B. Protein oder RNA von Interesse) und etwaiger ergänzender Zusatzstoffe (z. B. Füllmittel) für die Probe. Beispiel: 6 μL Puffer A, 5 μL 2% Agarose-Bestand (endgültig 0,5 %), 5 μL Nukleokapsidprotein (finales 15 μM), 4 μL Poly(A) (finales 6 μM). Endvolumen 20 μL.
   HINWEIS: Obwohl stark von der Schüssel, dem Rohr, der Platte oder dem anderen für das Experiment verwendeten Behälter abhängt, sind die häufig verwendeten Volumina 150 μL für ein 3-mm-NMR-Rohr, 20 μL für Mikroskopie- oder FRAP-Experimente in einem 6-Kanal-Objektträger und 20–30 μL für STORM-Experimente in 18-Bohrloch-Objektträgern (siehe Materialtabelle).
   1. Als Anfangswerte verwenden Sie die finalen 0,3–0,5 % mit Agarose für standardisierte biophysikalische Tests und 0,8–1,0 % w/v für die Langzeitstabilisierung (z. B. Alterungsexperimente).
      HINWEIS: Für die langfristige Stabilisierung und Lagerung von Proben sollten Maßnahmen ergriffen werden, um eine Enttrocknung der Proben zu verhindern (z. B. das Abschließen des Probenbehälters, die Lagerung in einer befeuchteten Kammer und das Hinzufügen einer Verdunstungsbarriere) und um sicherzustellen, dass die Pufferzusammensetzung und der pH-Wert während längerer Inkubationen stabil bleiben.
   2. Für NMR-Proben fügen Sie die endgültige 5 % v/v D2O zur Probe hinzu, um zu sperren.
      HINWEIS: Die Konzentration aller anderen Komponenten und das gesamte Probenvolumen hängen stark von der spezifischen Anwendung und dem experimentellen Aufbau ab.
5. Fügen Sie die entsprechenden Mengen an Puffer, phasentrennenden Komponenten, Agarose-Bestand und Zusätzen in ein vorgewärmtes 1,5-mL-Rohr ein.
   HINWEIS: Wir empfehlen, zuerst den Puffer und Agarose hinzuzufügen, gefolgt von weiteren Zusatzstoffen. Wir empfehlen außerdem, die phasentrennenden Komponenten zuletzt hinzuzufügen, um die Kondensatbildung auszulösen. Die optimale Mischreihenfolge hängt jedoch vom System ab und sollte im Voraus bestimmt werden. Dies ist besonders relevant für Systeme, in denen Stöchiometrie und die Reihenfolge der Addition die Tropfengröße oder Kompartimentierung stark beeinflussen können. Beispiel: Die Mischreihenfolge für die Nukleokapsidprobe ist zuerst Puffer A, zweiter Agarose-Stock, drittes Nukleokapsidprotein und zuletzt Poly(A), basierend auf den in Schritt 2.4 angegebenen Volumen. In dieser Probe wird LLPS durch die Hinzufügung von Poly(A) ausgelöst. Für Systeme, in denen LLPS sichtbare Trübung erzeugt, kann Trübung als qualitativer Qualitätsindikator dienen; Allerdings sind Anfangszeit und Sichtbarkeit systemabhängig, und das Fehlen unmittelbarer Trübung bedeutet an sich kein Protokollversagen.
   1. Lassen Sie den Schlauch im Heizblock oder Wasserbad auf, während Sie ein paar Mal auf und ab pipetten. Vermeiden Sie es, Luftblasen einzuführen.
      HINWEIS: Solange die Agarose noch flüssig ist, können Tröpfchen verschmelzen. Daher kann das Variieren der Vor-Inkubationszeit am Heizblock oder in einem Wasserbad vor Beginn der Gelation ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung von Tröpfchen unterschiedlicher Größe sein. Die Charakterisierung der Tropfenwachstumskinetik in Abwesenheit von Agarose vor der Auswahl des Pre-Inkubationszeitintervalls ermöglicht es Forschern, einen bestimmten Tropfengrößenbereich reproduzierbar anzuvisieren.
6. Für Mikroskopie-/FRAP-Proben:
   1. Verwenden Sie eine normale Pipette, um die Probe schnell auf den bevorzugten Mikroskopieträger zu übertragen (z. B. Kanalmikroskopie-Objektträger mit Deckdeckungsboden).
   2. Lass die Gelation bei RT für 5–10 Minuten (siehe Anmerkung im Diskussionsabschnitt) zu.
      HINWEIS: Bewegen Sie den Objektträger während dieser Zeit nicht. Schützen Sie Leuchtstoffproben vor Licht.
   3. Missen Sie die Probe nach dem Standardprotokoll. Beispiel: rotierendes Scheibenkonfokalmikroskop, 100x 1,45 Plan apo Ölobjektiv, Anregungswellenlänge 561 nm für Cy3-Farbstoff, Aufnahme 100 ms bei 30 % Laserleistung (Cy3) und 50 ms bei 6 % Lichtintensität (Hellfeld). Für FRAP: Bleichbereich 1/10^El des Tröpfchendurchmessers in der Mitte des Tröpfchens platziert, 25 Vorbleichrahmen (Aufnahme ohne Verzögerung), 60 Nachbleichbilder (aufgenommen im Abstand von 1 Sekunde), Laserpuls zum Bleichen 15 ms bei 70 % Laserleistung. Analyse der FRAP-Wiederherstellung durch vollständige Normalisierung in Open-Access-Software; Berichte nur kinetische Anpassungsparameter, wenn eine Anpassung durchgeführt wird.
7. Für STORM-Beispiele:
   1. Verwenden Sie eine normale Pipette, um die Probe schnell in den bevorzugten STORM-Schlitten zu übertragen (z. B. 18-Bohrkammer-Schlitten mit Deckungsboden). Gib die Probe als Tropfen ab.
   2. Lass die Gelation bei RT für 5–10 Minuten (siehe Anmerkung im Diskussionsabschnitt) zu.
      HINWEIS: Bewegen Sie den Objektträger während dieser Zeit nicht. Schützen Sie Leuchtstoffproben vor Licht.
   3. Fülle den gesamten Brunnen mit STORM-Puffer. Versiegeln Sie den Brunnen gemäß dem Standardprotokoll.
   4. Die Probe vor der Messung mindestens 1–2 Stunden ausgleichen, damit der STORM-Puffer in das Agarose-Hydrogel diffundieren kann.
      HINWEIS: Eine erfolgreiche Diffusion des STORM-Puffers in die Probe kann leicht überprüft werden, wenn die fluoreszierenden Farbstoffe während der STORM-Aufnahme blinken. Je nach Musterspezifikation können längere Gleichgewichtszeiten erforderlich sein.
   5. Missen Sie die Probe gemäß dem verwendeten Standardprotokoll. Beispiel: Ti2-Invertiertes Mikroskop, SR-Apochromat TIRF 100x 1,49 Ölobjektiv, stark geneigte dünne Beleuchtung. Aufnahme von 20.000 Bildern pro Probe, Sichtfeld 64 x 64 Pixel, Belichtungszeit 10 ms mit einem 125 mW 647 nm Laser für Cy5-Farbstoff und Verwendung eines 20 mW 405 nm Lasers zur Unterstützung des Übergangs vom langlebigen Dunkelzustand in den Grundzustand. Die Bilder wurden mittels Maximum-Likelihood-Schätzung mit Multi-Emitter-Fitting verarbeitet. Eine Driftkorrektur wurde angewendet, und in der endgültigen Visualisierung wurden nur Datenpunkte mit einer Lokalisierungsgenauigkeit von 25 nm oder besser einbezogen. Endgültige Bilder werden mit der Methode der durchschnittlich verschobenen Histogramme bei 20-facher Vergrößerung (1 Pixel = 8 nm im Endbild) erzeugt.
8. Für NMR-Proben:
   1. Verwenden Sie eine lange, dünne Glaspipette (vorgewärmt), um die Probe schnell in das NMR-Röhrchen zu übertragen. Gib die Probe am Boden des Röhrchens ab.
   2. Lass die Gelation bei RT für 5–10 Minuten (siehe Anmerkung im Diskussionsabschnitt) zu.
      HINWEIS: Schütteln Sie während dieser Zeit nicht die NMR-Röhre.
   3. Missen Sie die Probe gemäß dem verwendeten Standardprotokoll. Beispiel: Feldstärke von NMR 750 MHz mit PATXI-Raumtemperatur-Sonde, 3-mm-Röhre, Aufnahme bei 25 °C, Standard-Pulssequenz (stebpgp1s19) für Diffusions-(DOSY)-Experimente, Parameter: 4.096 Punkte mit 32 Scans, Gradientenstärke 2–95 %, Diffusionszeit 0,08 s, Gradientenpuls 12 ms, Relaxationsverzögerung (d1) 5 s.

Ergebnisse

Das Protokoll wurde auf Kondensate angewendet, die vom FUS-N-terminalen Domäne (FUS NTD) oder vom SARS-CoV-2 Nukleokapsid (N)-Protein mit Poly(A)- oder s2m-RNA als repräsentative Beispiele sowohl für rein-Protein- als auch Protein-RNA-Tröpfchen gebildet wurden. Um zu beurteilen, ob Agarose unter den getesteten Bedingungen nachweisbar die Kondensatbildung beeinflusst, bildeten wir Tröpfchen mit N-Protein und Poly(A) bei Anwesenheit und Abwesenheit von 0,5 % w/v LMA. Da LMA nach etwa 5 Minuten bei RT erstarrt, haben wir zu diesem Zeitpunkt Fluoreszenzmikroskopiebilder aufgenommen und festgestellt, dass die Tröpfchen in beiden Fällen ungefähr gleich groß waren (Abbildung 1A,B). Um die präventive Wirkung von Agarose auf Tröpfchenbefeuchtung und -fusion zu demonstrieren, nahmen wir 60 Minuten nach der Probenvorbereitung eine weitere Bildserie auf. Während die in Agarose eingebetteten Tröpfchen ihre Größe nicht veränderten, zeigten Kondensate ohne LMA eine drastische Zunahme aufgrund von Fusion und Oberflächenbenetzung (Abbildung 1A,B). Während wir die Tröpfchen relativ früh nach der Keimbildung eingebettet haben, können Tröpfchen unterschiedlicher Größe durch Variation der Vor-Einbettungszeit eingebettet werden. Trotz der Einbettung der Tröpfchen in Agarose-Hydrogel wurden die gemessenen Kondensatdynamiken nicht nachweisbar verändert. FRAP-Rückgewinnung und damit die scheinbare Tröpfchendiffusion waren mit und ohne LMA in der Probe sehr ähnlich (Abbildung 1C). Darüber hinaus haben frühere Diffusions-geordnete NMR-Spektroskopie-(DOSY)-Experimente mit FUS-NTD-Kondensaten gezeigt, dass Diffusionsraten nicht nachweisbar von der Agarosekonzentration beeinflusst wurden, zumindest nicht im Bereich von 0,25–1 % w/v (Abbildung 1D) (adaptiert von Emmanouilidis et ^al.13). Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Agarose-Hydrogel geeignet ist, phasengetrennte Kondensate in Raum und Zeit einzufangen und so wiederholte Messungen über längere Zeiträume zu ermöglichen.

Während sowohl Mikroskopie- als auch FRAP-Messungen relativ schnell zu erfassen sind (Sekunden bis Minuten), benötigen einige Experimente mehrere Minuten (z. B. STORM, 1D ¹H NMR) oder sogar Stunden (z. B. 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR) zum Erfassen. Für solche Experimente ist es entscheidend, dass Tröpfchen während der gesamten Aufnahme stationär bleiben und sich im Laufe der Zeit nicht absetzen. Hier zeigen wir, dass wir N-Protein- + s2m-RNA-Tröpfchen in LMA lange genug stabilisiert haben, um STORM-Bilder zu erhalten (Abbildung 1E). Darüber hinaus hatten NMR-Spektren von FUS-NTD-Tröpfchen in Anwesenheit und Abwesenheit von Agarose vergleichbare Linienbreiten, was auf keine nachweisbare Interaktion zwischen Agarose-Hydrogelen und dem Protein unter diesen Bedingungen hindeutet (Abbildung 1F) (adaptiert von Emmanouilidis et ^al.13). Im Gegensatz dazu zeigten die Spektren der in Agarose eingebetteten Kondensate eine höhere Signalintensität, wahrscheinlich weil sich während der Aufnahme nicht stabilisierte Tröpfchen im NMR-Rohr absetzten und daher nicht mehr für die Messung verfügbar waren (Abbildung 1F) (adaptiert von Emmanouilidis et ^al.13). Zusammenfassend ermöglicht die Stabilisierung von Kondensaten in Agarose-Hydrogelen nicht nur zeitliche Experimente, sondern auch die Anwendung von Methoden mit verlängerten Aufnahmezeiten, während die gemessenen Tröpfcheneigenschaften in den getesteten repräsentativen Systemen erhalten bleiben.

Abbildung 1: Kondensatstabilisierung durch Agarose-Einbettung ohne nachweisbare Störung der gemessenen Tröpfcheneigenschaften. (A) Fluoreszenzmikroskopie eines 15 μM Nukleokapsidproteins mit 6 μM Cy3-poly(A) (5 % markiert) im Puffer A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2) in Anwesenheit (+ Agarose) oder Abwesenheit (ohne Agarose) von 0,5 % w/v LMA. Die Bilder wurden 5 oder 60 Minuten nach dem Mischen / Agarose-Einbetten aufgenommen. Die Bilder sind repräsentativ für 7 Bilder, die in n = 2 unabhängigen Experimenten aufgenommen wurden. Skalenbar = 5 μm. (B) Quantifizierung der Tröpfchenradien der in (A) gezeigten Kondensate. Die Daten werden als Boxplots dargestellt (Box = Interquartilbereich, Mittellinie = Median, Schnurrhaare = Bereich der verbleibenden Daten, Punkt = Ausreißer). Der durchschnittliche Radius ± Standardabweichung (sd) und die Anzahl der analysierten Tröpfchen in jeder Bedingung werden direkt im Diagramm dargestellt. Die Daten folgen einer Normalverteilung. Einzelne Tröpfchen wurden nicht als unabhängige biologische Replikate für statistische Inferenzen behandelt. Es wurde kein statistischer Test durchgeführt; Verteilungen werden beschreibend dargestellt. (C) FRAP der in (A) gezeigten Tröpfchen zum Zeitpunkt 5 Minuten. Das Photobleaching erfolgte mit dem 561-nm-Laser (Cy3). Daten zeigen die normierte Intensität (Mittelwert ± sd von n = 3 unabhängige Replikationen pro Bedingung), die durch Normalisierung des gebleichten Signals auf die Vor-Bleichwerte, eine ungebleichte Fläche derselben Probe und die Hintergrundfluoreszenz erhalten wird. (D) Ungestörtes DOSY-Signal des 200 μM FUS NTD-Proteins im Puffer B (30 mM HEPES, 200 mM KCl, 600 mM Harnstoff, pH 7,3) in Gegenwart von 0,25, 0,5 oder 1,0 % mit regulärer Agarose. N = 1. (E) Konfokale Fluoreszenzmikroskopie und STORM-Bilder von 15 μM Cy5-Nukleokapsidproteinen (5 % markiert) mit 6 μM viraler s2m-RNA in Puffer A mit 0,5 % w/v LMA. Repräsentativ für n = 3 unabhängige Experimente. Skalenleiste = 1 μm in beiden Bildern. (F) 1D ¹H NMR-Spektren (links) und 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR-Spektren (rechts) von 200 μM FUS NTD im Puffer B bei Anwesenheit oder Abwesenheit von 0,5 % mit regulärer Agarose. N = 1. Die Panels (D) und (F) stammen aus Emmanouilidis et ^al.13 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Der Erfolg der Agarose-Einbettung biomolekularer Kondensate hängt von mehreren Faktoren ab. Erstens muss Agarose bei Temperaturen gehalten werden, die hoch genug sind, um eine vorzeitige Gelierung zu verhindern, und gleichzeitig niedrig genug, um biomolekulare Strukturen oder Wechselwirkungen nicht zu beeinträchtigen. Niedrigschmelzende Agarose hat einen Gellingpunkt von 26–30 °C und einen Schmelzpunkt von 60–65 °C, während reguläre Agarose einen Gelingpunkt von 34–38 °C und einen Schmelzpunkt von 90–95 °C hat. Zweitens sind das schnelle Mischen und der Transfer in das Endreaktionsgefäß (z. B. NMR-Röhre) entscheidend, da kleine Abweichungen im Zeit- oder Temperaturbereich zu ungleichmäßiger Einbettung und damit zu einer beeinträchtigten Reproduzierbarkeit führen können.

Trotz dieser kritischen Punkte lässt sich die Methode leicht an verschiedene experimentelle Bedürfnisse anpassen. Für phasentrennende Systeme mit intrinsisch ungeordneten Proteinen oder Systemen, die nicht anfällig für Wärmedenaturierung sind, kann reguläres Agarose anstelle von LMA verwendet werden, um Kosten zu sparen. Bei der Herstellung von Proben, die Proteine mit gefalteten Domänen enthalten, oder andere temperaturempfindliche (Bio-)Molekül, die zu Wärmedenaturierung neigen, sollte LMA verwendet werden, um Denaturierung zu verhindern. Eine Kontrollprobe mit reiner Wärme/ohne Agarose kann vorbereitet werden, um die Auswirkungen der Agarose-Einbettung von den Effekten der vorübergehenden Probenerwärmung zu trennen. Um das Risiko dieser temperaturabhängigen Denaturierungseffekte zu verringern, ist niedrigschmelzende Agarose besonders für temperaturempfindliche Proben geeignet, während die Agarosekonzentration angepasst werden kann, um die Netzgröße und den Grad der mechanischen Einschließung zu modulieren. Für hochempfindliche Diffusionsmessungen, wie die kürzlich entwickelte NMR-Methode namens LLPS REDIFINE ^15,16, ist die niedrigste Agarosekonzentration, die Sedimentation verhindert, in der Regel vorzuziehen, typischerweise 0,3–0,5 % w/v. Für Reifungsexperimente, die Wochen bis Monate Stabilität erfordern, ist 0,8–1 % W/V vorzuziehen. Diese Parameter sollten optimiert werden, um eine effektive Stabilisierung sicherzustellen, ohne die Kondensatmorphologie oder -dynamik nachweisbar zu verändern, und stets an das spezifische System angepasst werden. Diese Validierung erfordert den Vergleich von Proben mit und ohne Agarose-Einbettung (und ansonsten identischen Bedingungen) oder den Vergleich verschiedener Agarosekonzentrationen (um konzentrationsabhängige Netzeffekte auszuschließen), zum Beispiel mit Mikroskopie zur Beurteilung der Tröpfchenmorphologie, FRAP zur Diffusionsbeurteilung oder einer anderen geeigneten Methode zur Beurteilung der für den Forscher wichtigen Tröpfcheneigenschaften.

Die Gelierungszeit ist ein weiterer wichtiger Aspekt. Die Zeit, die Agarose zum Erstarren benötigt, hängt von mehreren Faktoren ab, wie zum Beispiel dem Puffertyp, pH-Wert, der endgültigen Agarosekonzentration, der Anfangstemperatur und davon, ob niedrig schmelzendes oder normales Agarose verwendet wird. Typischerweise erstarrt die Agarose innerhalb von 5–10 Minuten. Die Gelation des Agarose-Stocks kann als Indikator für die Gelierung der Probe verwendet werden. Ebenso ermöglicht das Variieren der Vor-Inkubationszeiten vor der Agarose-Einbettung eine reproduzierbare Charakterisierung verschiedener Tropfengrößen. Die Wahl des Puffers ist ebenfalls entscheidend¹⁴. Es ist entscheidend, dass der Agarosebestand im selben Puffer vorbereitet wird, der zur Probenpräparation verwendet wird, um Pufferunstimmigkeiten zu vermeiden. Der Puffer sollte einer sein, in dem das System bekannt ist, dass es phasengetrennt ist.

Die Temperaturempfindlichkeit sollte für jedes System berücksichtigt werden. Viele phasentrennende Systeme zeigen thermoreversibles Phasenverhalten, bekannt als UCST/LCST-Typ LLPS. Daher sollte eine kurze Exposition gegenüber leicht erhöhten Temperaturen während des Agarosemischens validiert werden, um sicherzustellen, dass das Phasenverhalten oder die gemessenen Tröpfcheneigenschaften nicht gestört werden. Wenn Probleme auftreten, können diese typischerweise durch Verfeinerung der Temperaturbedingungen, Minimierung der Handhabungszeit oder Anpassung der Agarosekonzentration behoben werden. Beispielsweise bleiben LMA-Aktien zwar idealerweise auf 37 °C erhitzt, LMA-Aktien bleiben bei 33–35 °C dennoch liquid.

Die Fehlersuche ist wichtig, da je nach Probe und experimenteller Einrichtung unterschiedliche Fehlerarten auftreten können. Wenn Tröpfchen sich beim Mischen mit Agarose auflösen, kann dies durch zu warme LMA oder durch eine Puffer-Fehlanpassung verursacht werden. In diesem Fall sollte der LMA-Bestand genau auf oder wenige Grad unter der Zieltemperatur gehalten und in einem identischen Puffer wie das interessierende Protein/RNA vorbereitet werden. Wenn eine vorzeitige Gelation in der Pipettenspitze auftritt, kann dies daran liegen, dass die LMA zu kalt ist oder die Spitzen nicht vorgewärmt sind. Um dies zu vermeiden, sollten Spitzen und Schläuche auf 37 °C vorgewärmt werden, der Bediener schnell arbeiten und der Heizblock auf der Zieltemperatur gehalten werden. Wenn im Laufe der Zeit Benetzung, Koaleszenz oder Sedimentation auftritt, kann dies auf eine zu dünne Gelierung oder eine ungleichmäßige Gelierung zurückzuführen sein. In diesem Fall kann die LMA-Konzentration erhöht werden, und sogar eine Gelation bei Raumtemperatur sollte gewährleistet werden. Wenn die Agaroselösung sichtbare Partikel enthält, kann dies auf eine unvollständige Agarose-Auflösung zurückzuführen sein. In diesem Fall sollte die Agarose erhitzt werden, bis sie vollständig transparent ist, und vor der Verwendung gründlich vermischt werden (z. B. im Vortex). Wenn beim Mischen oder Pipettieren Luftblasen eingeführt werden, können diese die Bildgebung beeinträchtigen und zu einer ungleichmäßigen Kondensatverteilung führen. Um die Blasenbildung zu minimieren, sollten die Lösungen sanft durch langsames Pipettern auf und ab gemischt werden. Wenn eine heterogene Gelation oder eine ungleichmäßige Kondensatverteilung beobachtet wird, kann dies auf unzureichende Mischung oder lokale Temperaturgradienten während der Gelation zurückzuführen sein. In diesem Fall sollten die Proben auf dem Heizblock (oder Wasserbad) aufbewahrt werden, bis alle Komponenten hinzugefügt, sofort aber sanft gemischt und unter gleichmäßigen Temperaturbedingungen fest werden können. Starke Temperaturgradienten sollten vermieden werden; Eine Erstarrung bei Raumtemperatur wird empfohlen (und eine Erstarrung im Kühlschrank sollte vermieden werden). In Langzeitexperimenten kann die Verdunstung der Proben die Konzentrationen von gelösten Stoffen und die Eigenschaften des Kondensats verändern. Um die Verdunstung zu minimieren, sollten die Proben ordnungsgemäß versiegelt und wann immer möglich in einer feuchtigkeitskontrollierten Umgebung aufbewahrt werden.

Im Gegensatz zu Methoden wie der Paraformaldehydfixierung fixiert die Agarose-Einbettung die Proben nicht chemisch. Daher bleiben Kondensate dynamisch, was für funktionale Studien vorteilhaft ist, aber die Langzeitspeicherung einschränkt. Für längere experimentelle Zeiträume müssen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um Verdunstung und Pufferänderungen wie pH-Verschiebungen zu verhindern. Außerdem sollten zwar Agarose in diesen Tests meist wenig wechselwirken, aber potenzielle indirekte Auswirkungen auf die Diffusion oder die lokale Umgebung sollten berücksichtigt werden. Wenn Agarose–Biomolekül-Interaktionen vermutet werden, wie etwa eine nicht-spezifische Bindung des Proteins an Agarose, können alternative Hydrogelmatrizen wie photo-crosslinked polyethylene glycoldiacrylat (PEG-DA) mit entsprechender Maschengröße und Porosität in Betracht gezogen werden. Das Fehlen von Wechselwirkungen sollte durch Messung des FRAP in Anwesenheit und Abwesenheit der Matrix validiert werden.

Neben der chemischen Fixation werden Oberflächen-Passivierungsstrategien wie BSA-, PEG- oder tensidbeschichtete Oberflächen sowie unterstützte Lipiddoppelschichten häufig eingesetzt, um die Kondensatadhäsion und Benetzung zu reduzieren. Obwohl diese Ansätze die Oberflächenwechselwirkungen effektiv minimieren, verhindern sie nicht die Bewegung von Kondensat, Sedimentation oder Fusion. Die Agarose-Einbettung ergänzt diese Methoden somit durch physikalische Immobilisierung bei gleichzeitiger Erhaltung der Kondensatdynamik, was sie besonders nützlich für längere Experimente, dreidimensionale Bildgebung und quantitative Messungen macht, die eine stabile Probenpositionierung erfordern. Die Wahl der Methode sollte daher vom experimentellen Ziel geleitet werden.

Insgesamt bieten Agarose-Hydrogele ein einfaches, aber effektives Mittel, um Kondensate in drei Dimensionen zu stabilisieren. Dies verhindert Tröpfchenbefeuchtung und Fusion, ohne die gemessenen intrinsischen Eigenschaften der getesteten repräsentativen Systeme nachweisbar zu stören, was Zeitverlaufsexperimente und Techniken mit langen Aufnahmezeiten wie der NMR-Spektroskopie¹⁵ ermöglicht. Obwohl diese Methode aus verschiedenen Gründen möglicherweise nicht für alle phasentrennenden Systeme geeignet ist, ist die hier vorgestellte Methode auf die Untersuchung mehrerer biomolekularer Kondensate anwendbar und besonders nützlich für die Untersuchung von Reifungsprozessen, die für neurodegenerative Krankheitsmechanismen relevant sind¹⁷.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Röhrchen	jede Marke ist OK	N/A
18-Well Kammer-Slides	ibidi	81816	für STORM
Agarose, niedrige Geliertemperatur	Sigma-Aldrich	A9414	Molekulare Biologie Qualität
Agarose, ultra rein	Invitrogen	16500500
Kanal-Slides	ibidi	80606	für Mikroskopie
Konfokalmikroskop	Nikon	N/A
Cy5-Farbstoff, NHS-Chemie	Jena Biosciences	FP-201-CY5	zur Proteinmarkierung
D2O (Deuteriumoxid)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM Puffer	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD Protein	N/A	N/A	rekombinant in unserem Labor exprimiert, wie in Ref 13 beschrieben (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
Heizblock oder Wasserbad	jede Marke ist OK	N/A	jede Marke oder Modell ist ausreichend
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bildanalyse-Software	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NMR-Spektrometer	Bruker	N/A	750 MHz, PATXI Raumtemperatur-Probe, siehe Ref 13 für weitere Details (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
NMR-Röhrchen	Bruker	N/A	3 mm, Glas
P10, P20, P200 und P1000 Pipetten	jede Marke ist OK	N/A
pCp-Cy3-Farbstoff	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	zur Markierung von RNA
poly(A) RNA	N/A	N/A	im Labor in vitro transkribiert, Länge ca. 50 Nukleotide, wie in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024 beschrieben
s2m RNA	N/A	N/A	im Labor in vitro transkribiert, Länge 45 Nukleotide, Sequenz: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', wie in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024 beschrieben
SARS-CoV-2 Nucleokapsid-Protein	N/A	N/A	rekombinant im Labor exprimiert, wie in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024 beschrieben
Software für Plotting (z. B. R)	R-Project	Version 4.2.1	https://www.r-project.org/
STORM Mikroskop	Nikon N-STORM	N/A
ThunderSTORM Plugin	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
Pipettenspitzen für die verwendeten Pipetten	jede Marke ist OK	N/A
TopSpin	Bruker	Version 3.2 und 4.1
Harnstoff	Sigma-Aldrich	U5128