Methodenartikel

Gezielte Cas9-Applikation zur Durchführung von Rescue-Experimenten in stabil transduzierten Knockout-HEK293-Zellen

93 Ansichten

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DOI:

10.3791/72172

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28. August 2026

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1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beseitigt das Cas9-Protein nach der Genomeditierung, um robuste Rescue-Experimente in stabil transduzierten Knockout-Zelllinien zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Die CRISPR-Cas9-Genbearbeitungstechnologie hat die Molekularbiologie revolutioniert. Häufig wird diese Technologie eingesetzt, um ein Gen zu löschen, das ein Protein von Interesse kodiert. Das resultierende Phänotyp liefert wertvolle Erkenntnisse über die Funktion des Proteins. Die funktionelle Bedeutung des Zielproteins kann bestätigt werden, indem das Protein erneut eingeführt wird, um die verlorene Funktion wiederherzustellen (Rettung). Dies wird typischerweise erreicht, indem die protein-kodierende cDNA in trans mittels eines Expressionsvektors eingeführt wird. In Knockout-Zelllinien jedoch, die das CRISPR-Cas9-System stabil exprimieren, könnte auch das neu eingeführte Expressionsplasmid durch Cas9 gespalten werden. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine Strategie, um dieses potenzielle Hindernis für Rettungsexperimente zu umgehen. Dieser Ansatz wird anhand von HEK293-Zellen demonstriert, in denen das Gen, das das E3-Ubiquitin-Ligase-Grundgerüstprotein CUL4B kodiert, mittels CRISPR-Cas9 unterbrochen wurde. Die Transduktion dieser Zellen mit einer guide-RNA (gRNA), die das integrierte Cas9-Transgen gezielt ansteuert, führte zum Verlust nachweisbaren Cas9-Proteins. Die Abschaltung von Cas9 ermöglichte die Wiederherstellung der CUL4B-Expression und -Funktion nach Einführung eines CUL4B-Expressionsplasmids. Diese Ergebnisse liefern einen Beweis des Konzepts für einen breit anwendbaren Ansatz, um die Proteinfunktion durch Rettungsexperimente zu untersuchen.

Einleitung

CRISPR-Cas9 ist ein leistungsstarkes Genom-Editierungs-Tool, das von einem natürlichen, adaptiven Immunsystem abstammt, das von Prokaryoten zur Abwehr von Bakteriophagen-Infektionen genutzt wird. Aufgrund seiner geringen Kosten, hohen Erfolgsrate und einfachen Handhabung hat die CRISPR-Cas9-Technologie andere Genom-Editierungs-Methoden wie Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) und transkriptionsaktivierende Faktor-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs) bei der präzisen genetischen Modifikation, insbesondere in Zellkulturen, übertroffen. Das zweikomponentige System besteht aus einer Cas9-Nuklease und einer Leit-RNA (gRNA). Durch Watson-Crick-Basenpaarung lenkt die gRNA Cas9 zu einer genomischen Zielstelle, die unmittelbar neben einem Protospacer-angrenzenden Motiv (PAM) liegt. Die PAM-Sequenz fungiert als entscheidende Erkennungsstelle, die die Nukleaseaktivität ermöglicht. An dieser Stelle erzeugt Cas9 einen Doppelstrangbruch (DSB). In Abwesenheit einer homologen Reparaturvorlage repariert die Zelle den DSB über die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ). Dieser Reparaturmechanismus kann Insertionen oder Deletionen (Indels) einführen, was zu Leserasterverschiebungen und einem funktionellen Knockout des Zielgens führt. Die Unterbrechung des Zielgens wird daher erreicht, indem Cas9 zusammen mit einer konstruierten gRNA eingeführt wird. Die 20 Nukleotide lange gRNA-Sequenz ist komplementär zu einer genomischen Stelle, die unmittelbar neben dem PAM liegt. Der resultierende funktionelle Verlust des Zielgens offenbart die spezifischen Rollen dieses Gens in zellulären Prozessen1.

Ein Rettungsexperiment oder Komplementationsassay beinhaltet die Wiederherstellung des fehlenden Proteins, um die Umkehrung des beobachteten Phänotyps nachzuweisen. Dieser Ansatz dient als strenges Kontrollverfahren, um unerwünschte experimentelle Effekte auszuschließen, wie sie beispielsweise durch „Off-Target“-CRISPR-Cas9-Löschungen entstehen können. Die gebräuchlichste Methode zur erneuten Einführung eines Proteins der Untersuchung ist die Transfektion oder Transduktion eines exogenen Expressionsvektors. Dieser eingeführte DNA-Abschnitt ist jedoch derselben CRISPR-Cas9-Zielgerichtetheit ausgesetzt wie das endogene Genom. Dieses Risiko ist besonders hoch in stabil transduzierten Zelllinien, bei denen eine konstitutive Cas9-Expression mit einer Antibiotikaselektion gekoppelt ist, um eine homogene und konsistente Knockout-Population sicherzustellen; eine Strategie, die häufig bei Zelllinien erforderlich ist, die schwer zu transfectieren oder zu transduzieren sind, wie beispielsweise solche, die aus immunen, hämatopoetischen oder neuronalen Linien stammen.

Eine Methode, um eine Vektorzielgerichtetheit zu umgehen, besteht darin, exogenes mRNA-Molekül einzuführen, das das Protein der gewünschten Interaktion codiert, wodurch eine Cas9-vermittelte Spaltung sowie die Notwendigkeit einer nukleären Transkription umgangen werden. Im Vergleich zu Plasmid-DNA ist synthetische mRNA jedoch teurer in der Herstellung, von Natur aus weniger stabil und führt zu einer stark flüchtigen Expression. Zudem erfordert sie spezifische chemische Modifikationen, um die Auslösung zytosolischer angeborener Immunantworten zu vermeiden2.

Um eine Zielgerichtetheit des Cas9/gRNA-Komplexes auf Expressionsplasmide zu vermeiden, kann eine Wobble-Basen-Engineering der kodierenden Sequenz eingesetzt werden. Durch die Nutzung der Entartung des genetischen Codes können synonyme Mutationen eingeführt werden, um die erforderliche PAM-Sequenz zu eliminieren und/oder die Komplementarität zur gRNA zu stören, ohne die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins zu verändern. Die Anwendung synonymer Mutationen ist jedoch nicht risikofrei. Solche Veränderungen können eine suboptimale Codonnutzung verursachen, was die Translationskinetik stören und zu Proteinfehlfaltung, verminderte mRNA-Stabilität oder schädliche Veränderungen der RNA-Sekundärstruktur führen kann3,4. Seltener können weitere mögliche Folgen die Einführung versteckter Polyadenylierungssignale, die Störung posttranskriptioneller regulatorischer Motive und eine erhöhte CpG-Dichte umfassen5,6. Darüber hinaus könnten technisch veränderte Sequenzen unbeabsichtigt zelluläre Stressreaktionen auslösen, wenn die resultierende mRNA-Struktur die Fortbewegung der Ribosomen beeinträchtigt7,8.

Neben den Herausforderungen, die mit der Verwendung synthetischer mRNA oder der Wobble-Basen-Engineering verbunden sind, führt die konstitutive Expression von Cas9 nach der Genomeditierung zu mehreren störenden Variablen in nachfolgenden Assays. Da die Spezifität von Cas9 unvollkommen sein kann, erhöht ein anhaltender Ausdruck die Wahrscheinlichkeit von Off-Target-Schnitten und damit die akkumulative Aufnahme unbeabsichtigter Mutationen im Laufe der Zeit9,10,11. Darüber hinaus kann eine chronische genomische Überwachung und wiederholte Doppelstrangbrüche eine anhaltende DNA-Schadensantwort auslösen, die letztlich zu Zellzyklusarrest, Zellalterung oder Apoptose führt12,13. Diese konstitutive Produktion verursacht zudem eine metabolische Belastung, wodurch ein klonaler Drift begünstigt wird, bei dem Zellen mit geringer Expression Zellen mit hoher Expression überflügeln, was zu inkonsistenten Transgenleveln über aufeinanderfolgende Passagen hinweg führt. Schließlich kann Cas9 als großes prokaryotisches Protein Stress über angeborene Immunsignale auslösen oder die Proteostase-Maschinerie des Wirts überlasten und dadurch die Unfolded-Protein-Response induzieren14,15,16.

Um diese Komplikationen zu verringern, wurden mehrere Strategien zur vorübergehenden Hemmung von Cas9 entwickelt, darunter phagenstammige Anti-CRISPR-Proteine (Acrs)17,18, Hemmstoffe auf Small-Molecule-Basis oder Degron-gekoppelte Systeme wie PROTACs19,20 sowie optogenetische Kontrollmechanismen19,21. Diese Ansätze bringen jedoch praktische Hürden mit sich, die ihre Anwendbarkeit für Rescue-Assays einschränken. Acrs wirken über molekulare Mimikry und erfordern daher eine stöchiometrische Optimierung, um Präzision zu gewährleisten. Außerdem können Acrs dieselben proteostatischen und immunogenen Belastungen verstärken, die mit einer Überexpression von Cas9 assoziiert sind. Chemische Modulation führt zu pharmakokinetischen Komplexitäten, potenzieller Zytotoxizität und den mit PROTACs verbundenen „Hook-Effekten“, bei denen übermäßige Ligandenkonzentrationen paradoxerweise die Bildung produktiver ternärer Komplexe verhindern22. Optogenetische Plattformen sind durch zelluläre Phototoxizität und die Notwendigkeit spezieller Hardware zur Aufrechterhaltung einer konstanten Lichtzufuhr begrenzt19,21. Wichtig ist, dass diese Methoden aufgrund ihrer nur temporären oder reversiblen Hemmung häufig unzureichend für Anwendungen sind, bei denen Cas9 konstitutiv exprimiert wird.

Im Gegensatz dazu bieten selbstinaktivierende CRISPR-Systeme eine dauerhafte Lösung, indem sie das Cas9-Transgen unmittelbar nach erfolgreicher Bearbeitung des Zielgens autonom und permanent stören. Durch die Beseitigung restlicher Nukleaseaktivität schützt dieser Ansatz nachfolgende Rettungsvektoren dauerhaft vor Spaltung und verringert gleichzeitig den langfristigen proteostatischen Stress sowie genomische Off-Target-Drift. Obwohl selbstgerichtete gRNAs über vorübergehende Ribonukleoprotein- oder lipidbasierte Transfektionen geliefert werden können23,24, unterliegen diese Methoden Verdünnung und stochastischer Variation, was zu einer „mosaikartigen“ Population führt, in der einige Zellen der Inaktivierung entgehen25,26,27.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, nutzt das hier beschriebene Protokoll ein lentivirales Transportsystem zur Selbstinaktivierung von Cas9, das klare praktische Vorteile für die stabile Modifikation von Zelllinien bietet. Die lentivirale Abgabe gewährleistet die gekoppelte Vererbung des Cas9-Transgens und seines selbstgerichteten Regulators und verhindert damit effektiv das für schnell teilende Populationen typische „Verdünnungs-Entkommen“. Darüber hinaus ermöglicht die erweiterte Ladekapazität lentiviraler Vektoren die Koreexpression von Selektionsmarkern, um eine homogene, Cas9-deletierte Population sicherzustellen, während ihre breite Tropismusfähigkeit, vermittelt durch VSV-G-Pseudotypisierung, eine effiziente Abgabe in schwer transduzierbare Zelltypen erleichtert25,28,29.

Als Machbarkeitsnachweis dieser Methode beschreibt dieses Protokoll die Selbstinaktivierung von Cas9, um die phänotypische Wiederherstellung des E3-Ubiquitin-Ligase-Adapterproteins CUL4B in CUL4B-Knockout-HEK293-Zellen zu ermöglichen30.

Protokoll

Diese Studie verwendete etablierte immortale humane Zelllinien (HEK293 und HEK293FT) und umfasste keine menschlichen Probanden, primären menschlichen Gewebe oder Tierversuche. Daher war eine institutionelle Genehmigung durch eine Ethikkommission nicht erforderlich.

1. Erzeugung eines Cas9-spezifischen gRNA-Lentiviralvektors

  1. Fügen Sie die Cas9-spezifische gRNA-Sequenz (Tabelle 1) in den pLentiGuide-Puro-Lentiviralvektor ein.
  2. Ersetzen Sie das Antibiotikaresistenzgen durch ein Gen, das sich von dem Resistenzmarker unterscheidet, der zur Selektion der stabil transduzierten CRISPR-Cas9-Zelllinie verwendet wurde.
  3. Überprüfen Sie die erfolgreiche Insertion und Sequenztreue sowohl der Cas9-spezifischen gRNA als auch des ersetzten Antibiotikaresistenzgens durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung vektorspezifischer Primer.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurde das Puromycin-Resistenzgen (PuroR) durch das Hygromycin-B-Resistenzgen (HygroR) ersetzt, um den Vektor Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro zu erzeugen. Alternative Antibiotikaresistenzgene sind Blasticidin S (BlastR), G418/Geneticin (NeoR) und Zeocin (ZeoR).

2. Herstellung von Lentivirus, das eine Cas9-spezifische gRNA kodiert

  1. Seeden Sie 2,5 × 106  HEK293FT-Zellen in eine 10 cm große, zellkulturgeeignete Petrischale.
    HINWEIS: Kultivieren Sie die Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; hoher Glucosespiegel), das mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) ergänzt ist (im Folgenden als cDMEM bezeichnet), und inkubieren Sie sie bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. HEK293FT-Zellen werden verwendet, da sie höhere lentivirale Titer erzeugen als andere von HEK293 abgeleitete Zelllinien31.
  2. Inkubieren Sie die Zellen 12 h lang, bis sie mindestens 60 % Konfluenz erreicht haben, bevor Sie die Transfektion durchführen.
    ACHTUNG: Führen Sie alle Arbeiten mit Lentiviren der dritten Generation unter Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) und zugelassener Dekontaminationsverfahren (z. B. Sicherheitswerkbank der Klasse II, sekundäre Eindämmung und 70 % Ethanol) durch, wie von Pauwels et al.32 beschrieben.
  3. Bereiten Sie eine Standard-Calciumphosphat-(CaPhos-)Transfektionsmischung vor. Verdünnen Sie 20 µg gesamte Plasmid-DNA in steriler, molekularbiologischer Qualität in Wasser auf ein Endvolumen von 450 µL. Geben Sie 50 µL 2,5 M CaCl2 hinzu, gefolgt von 500 µL 2× HEPES-pufferter Salzlösung (HBS; pH 7,05), um in einem 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen ein Endvolumen von 1 mL zu erhalten.
    HINWEIS: Verwenden Sie sequenzverifizierte, überwiegend supercoiled Plasmid-DNA, die folgende Qualitätskriterien erfüllt: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 = 2,0–2,2 und Endotoxin <0,1 EU/µg. Bereiten Sie die Transfektionsmischung mit einem annähernd äquimolaren Verhältnis vor, bestehend aus 5 µg Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5,6 µg pLP1 (Gag/Pol), 3,8 µg pLP2 (Rev) und 5,6 µg pLP/VSVG (vesikuläre Stomatitis-Virus-Glykoprotein).
  4. Mischen Sie die CaPhos-Transfektionslösung gründlich durch vorsichtiges Pipettieren.
  5. Geben Sie 1 mL der CaPhos-Transfektionsmischung tropfenweise zur HEK293FT-Zellkultur hinzu.
  6. Schwenken Sie die Kulturschale vorsichtig, um die Transfektionskomplexe gleichmäßig zu verteilen.
  7. Inkubieren Sie die Zellen 12 h lang.
    HINWEIS: Die Calciumphosphat-Transfektion wird im Allgemeinen nicht durch Standarderhaltungsantibiotika beeinflusst33. Für empfindlichere Transfektionsmethoden wie die Lipofektion wird jedoch ein antibiotikafreies Medium empfohlen, da polyanionische Antibiotika die Bildung von DNA-Lipid-Komplexen stören können34.
  8. Aspirieren und entsorgen Sie das Kulturmedium.
  9. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL steriler, 1× Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur.
  10. Aspirieren und entsorgen Sie die PBS.
  11. Geben Sie 10 mL frisches, bei Raumtemperatur gehaltenes cDMEM hinzu.
  12. Stellen Sie die Zellen zurück in den Inkubator und lassen Sie lentivirale Partikel 36 h lang im Kulturmedium anreichern.
    HINWEIS: Unter diesen Bedingungen wird geschätzt, dass das unbehandelte lentivirale Überstand nach 48 h etwa 1,0 × 106 transduzierende Einheiten (TU)/mL ergibt, obwohl der tatsächliche Titer experimentell bestimmt werden sollte, wie von Kutner et al.35 oder Barde et al.36 beschrieben. Lagern Sie den lentiviralen Überstand bis zu 2 Jahre bei −80 °C. Vermeiden Sie wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen, da diese den viralen Titer um etwa 55 % reduzieren können37,38,39,40.

3. Gewinnung von Lentivirus mit kodierender gRNA für Cas9 und Transduktion von Zielzellen

  1. Seeden Sie 1,0 × 106 adhärente Zielzellen in eine 10 cm große, zellkulturgeeignete Petrischale.
  2. Inkubieren Sie die Zielzellen 12 Stunden vor der lentiviralen Transduktion.
    ANMERKUNG: Die Zielzellen sind HEK293-Zellen, die stabil Streptococcus pyogenes Cas9, eine gegen CUL4B gerichtete gRNA (Tabelle 1) und ein Puromycin-Resistenzgen (PuroR) exprimieren. Kultivieren Sie die Zellen in cDMEM, das 10 µg/mL Puromycin enthält, und überprüfen Sie die Unterbrechung von CUL4B mittels Western-Blot-Analyse vor der Selbstinaktivierung von Cas9. Führen Sie alle nachfolgenden Experimente mit HEK293ΔCUL4B-Zellen in frühen Passagen durch.
  3. Gewinnen Sie das lentivirusenthaltende Medium, indem Sie das Überstandmedium vorsichtig von den HEK293FT-Produktionszellen in ein steriles 15-mL-Konischglas überführen, wobei Sie darauf achten, die Zellmonoschicht nicht zu stören.
    ANMERKUNG: Entsorgen Sie die HEK293FT-Produktionszellen gemäß den etablierten Biosicherheitsrichtlinien32.
  4. Zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand 10 Minuten bei 1.000 × g bei Raumtemperatur (RT), um eventuell verbliebene HEK293FT-Produktionszellen zu pelletieren.
  5. Aspirieren und verwerfen Sie das Kulturmedium der zuvor angesiedelten HEK293ΔCUL4B-Zellen.
  6. Geben Sie 7 mL des geklärten lentiviralen Überstandmediums in die 10 cm große Schale mit den HEK293ΔCUL4B-Zellen. Vermeiden Sie es, das Pellet am Boden des Zentrifugenröhrchens aufzurühren, und lassen Sie mindestens 1 mL Restüberstand zurück, um eine Mitübertragung von Produktionszellen zu minimieren.
    ANMERKUNG: Falls gewünscht, filtrieren Sie das Überstandmedium durch einen 0,45 µm-Filter, um verbliebene Produktionszellen weiter zu entfernen. Entsorgen Sie den verbleibenden Überstand gemäß den Biosicherheitsrichtlinien32. Bei einer geschätzten Titerkonzentration von 1,0 × 106 TU/mL wird ein Inokulum von 7 mL voraussichtlich eine Infektionsmultiplizität (MOI) zwischen 3,5 und 5,5 ergeben41.
  7. Inkubieren Sie die transduzierten HEK293ΔCUL4B-Zellen 24 Stunden lang, um eine vollständige lentivirale Transduktion und Integration zu ermöglichen.
  8. Aspirieren und verwerfen Sie das virale Überstandmedium.
  9. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL sterilem, 1× PBS bei Raumtemperatur.
  10. Aspirieren und verwerfen Sie das PBS.
  11. Geben Sie 10 mL frisches, bei Raumtemperatur vorgewärmtes cDMEM hinzu.
  12. Stellen Sie die Zellen zurück in den Inkubator und kultivieren Sie sie vier Tage lang, um die Expression des Transgens und die Inaktivierung von Cas9 zu ermöglichen.
    ANMERKUNG: Falls der lentivirale Cas9-gRNA-Vektor keinen fluoreszierenden Reporter enthält, transduzieren Sie parallel eine Kontrollkultur mit einem ähnlich hergestellten lentiviralen Vektor, der einen fluoreszierenden Reporter exprimiert. Nutzen Sie die Kontrollkultur, um die Transduktionseffizienz sowie den Zeitpunkt des Abbaus des Zielgens mittels qualitativer Fluoreszenzmikroskopie oder quantitativer Durchflusszytometrie abzuschätzen. In dieser Studie war die GFP-Expression vier Tage nach der Transduktion mittels Fluoreszenzmikroskopie deutlich nachweisbar.

4. Antibiotische Selektion von Cas9-spezifischen gRNA-Transduzenten

HINWEIS: Vier Tage nach der Transduktion sollten die Zielzellen konfluent oder nahezu konfluent sein und müssen in ein größeres Kulturgefäß überführt werden. Führen Sie die Zellübertragung gleichzeitig mit der Einleitung der Antibiotikaselektion durch.

  1. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den HEK293ΔCUL4B -Zellen durch Absaugen und entsorgen Sie es.
  2. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL sterilem, auf Raumtemperatur erwärmtem 1× Phosphat-gepuffertem Salzlösung (PBS).
  3. Entfernen Sie das PBS durch Absaugen und entsorgen Sie es.
  4. Geben Sie 2 mL sterile, auf Raumtemperatur erwärmte Trypsin-EDTA-Lösung in die Kulturschale.
  5. Inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang, um die Ablösung zu fördern.
  6. Geben Sie 8 mL auf Raumtemperatur erwärmtes cDMEM zu, um das Trypsin zu neutralisieren.
  7. Überführen Sie die Zellsuspension in ein steriles kegelförmiges 15-mL-Röhrchen.
  8. Pipettieren Sie die Zellsuspension 15–20 Mal auf und ab, um zelluläre Aggregate vollständig aufzulösen.
  9. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 200 × g und Raumtemperatur.
  10. Während die Zellen zentrifugiert werden, bereiten Sie einen T150-Zellkulturflasken mit 20 mL cDMEM vor, der mit 250 µg/mL Hygromycin B ergänzt ist.
    HINWEIS: Die zur Selektion erforderliche Hygromycin-B-Konzentration kann je nach Zelltyp variieren. Führen Sie eine Kill-Kurve mit 50–500 µg/mL Hygromycin B durch, um die minimale Konzentration zu bestimmen, die erforderlich ist, um alle nicht-transduzierten Zellen innerhalb von 7–10 Tagen abzutöten. Falls ein alternatives Antibiotikaresistenz-Marker im Cas9-gRNA-Vektor verwendet wird, führen Sie eine Kill-Kurve mit 2–10 µg/mL Blasticidin S, 400–800 µg/mL G418/Geneticin oder 50–400 µg/mL Zeocin durch.
  11. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen, ohne das Zellpellet zu stören.
  12. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL cDMEM, ergänzt mit 250 µg/mL Hygromycin B.
  13. Überführen Sie die 10 mL Zellsuspension in den vorbereiteten T150-Flasken, der 20 mL Selektionsmedium enthält.
  14. Schwenken Sie den Flasken vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
  15. Inkubieren Sie die Zellen drei Tage lang unter Selektionsbedingungen.
  16. Am Tag 3 der Selektion saugen Sie das Selektionsmedium ab und ersetzen Sie es durch 30 mL frisches cDMEM, ergänzt mit 250 µg/mL Hygromycin B.
    HINWEIS: Der Austausch des Selektionsmediums entfernt nicht-angewachsene tote Zellen, ergänzt die Nährstoffe und erhält die antibiotische Wirkung aufrecht.
  17. Setzen Sie die Inkubation fort, bis die überlebende Zellmonoschicht etwa 90 % Konfluenz erreicht hat, was typischerweise nach weiteren vier Tagen der Fall ist.

5. Validierung des Cas9-Abbaus und der in trans CUL4B-Rettung

HINWEIS: Sobald die Zellen eine Konfluenz von etwa 90 % erreichen, bestätigen Sie in den Anfangsexperimenten die Cas9-Ablation und kryokonservieren Sie unverzüglich die verbleibende Zellpopulation42. Dieser Ansatz minimiert die Entwicklung sekundärer kompensatorischer Mechanismen.

  1. Saat von HEK293-Zellen in früher PassageΔCUL4B Zellen, die stabil eine Cas9-zielgerichtete gRNA exprimieren (im Folgenden als HEK293 bezeichnet)ΔCUL4BΔcas9) in vier Vertiefungen einer 6-Loch-Zellkulturplatte mit einer Dichte von 2,5 × 105 Zellen pro Vertiefung
  2. HEK293-Zellen ansetzenΔCUL4B Zellen in vier Vertiefungen einer separaten 6-Loch-Platte aussäen. Elterliche HEK293-Zellen in mindestens einer zusätzlichen Vertiefung aussäen, die als Kontrolle dient.
    HINWEIS: Verwenden Sie die HEK293ΔCUL4B und elterliche HEK293-Kulturen als Kontrollen für die Expression von Cas9 bzw. CUL4B.
  3. Inkubieren Sie alle Kulturen 12 h lang, um eine vollständige Zelladhäsion und aktive Proliferation zu ermöglichen.
  4. Stellen Sie Calciumphosphat- (CaPhos-)Transfektionsgemische mit 0, 0,5, 1,0 oder 2.0 µg von pCMV-FLAG-CUL4B. Puffern Sie jede Mischung auf ein konstantes Gesamtvolumen 10 µg Plasmid-DNA durch Zugabe eines leeren pCMV-Vektors.
  5. Verdünnen Sie jede DNA-Mischung in sterilem, molekularbiologischer Qualität entsprechendem Wasser auf ein Endvolumen von 180 µL, hinzufügen 20 µL von 2,5 M CaCl₂2und dann hinzufügen 200 µL von 2× HEPES-puffertes Salz (HBS; pH 7,05), um ein Endvolumen von zu erhalten 400 µL in einem 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Bei Verwendung von Expressionsplasmiden, die von starken Promotoren (z. B. CMV) angetrieben werden, sollte eine DNA-Titration durchgeführt werden, um Proteinausprägungslevel zu erreichen, die mit der endogenen Expression vergleichbar sind. Verwenden Sie sequenzverifizierte, überwiegend supercoilierte Plasmid-DNA mit A260/A280-Werten von 1,8–2,0, A260/A230-Werten von 2,0–2,2 und einem Endotoxin-Gehalt von <0,1 EU/µg.
  6. Jede CaPhos-Transfektionslösung gründlich durch vorsichtiges Pipettieren mischen.
  7. Hinzufügen 200 µL jeweils tropfenweise zu der zugewiesenen Vertiefung mit HEK293ΔCUL4BΔcas9 Zellen. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Proben, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
  8. Fügen Sie den verbleibenden 200 µL jeweils tropfenweise zu der entsprechenden Transfektionsmischung in die vorgesehene Vertiefung mit HEK293ΔCUL4B Zellen
  9. Inkubieren Sie die transfizierten Kulturen 12 h lang.
  10. Entfernen Sie das Kulturmedium aus jedem Well.
  11. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL sterilem, auf Raumtemperatur gebrachtem 1× PBS
  12. Pipettieren Sie das PBS ab und entsorgen Sie es.
  13. Geben Sie 2 mL frisches cDMEM bei Raumtemperatur in jede Vertiefung.
  14. Kultivieren Sie die Zellen weitere 24 Stunden, um die Expression von CUL4B und nachgeschaltete funktionelle Reaktionen zu ermöglichen.
  15. Die Zellen mittels Standard-Trypsinisierungsverfahren gewinnen.
  16. Überführen Sie jede Zellsuspension in ein einzelnes 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.
  17. Washen Sie jede Zellsuspension einmal mit 1× PBS
  18. Kurzfristig die Proben auf 14.000 × g bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
  19. Pipettieren und verwerfen Sie den PBS-Überschuss.
    ACHTUNG: β-2-Mercaptoethanol ist ein flüchtiger Haut- und Atemwegsreizstoff mit starkem Geruch. Umgang mit Stammlösungen nur in einer zertifizierten chemischen Abzugshaube und unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich chemikalienbeständiger Handschuhe, eines Laborkittels und von Schutzbrille. Kontaminierte Pipettenspitzen, Röhrchen und Abfälle gemäß den institutionellen Richtlinien für gefährliche Abfälle entsorgen.
  20. Lyse das Zellpellet direkt in 200 µL Laemmli-Probenpuffer, ergänzt mit 5 % (v/v) β- Mercaptoethanol
  21. Denaturieren Sie die Proteine, indem Sie die Proben erhitzen bei 95 °C für 15 min.
  22. Auflösen 20–40 µg pro Gesamtprotein pro Lane mittels standardmäßiger Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).
  23. Übertragen Sie die aufgetrennten Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid- (PVDF-)Membran.
  24. Blockieren Sie die Membran für 30 min bei Raumtemperatur mit Blockierpuffer.
    HINWEIS: Bereiten Sie den Blockierpuffer entweder mit 5 % (w/v) fettfreier Trockenmilch oder 5 % (w/v) Rinder-Serumalbumin (BSA) vor, die in Standardwaschpuffer (0,1 % Tween 20 in entweder 1× Tris-gepufferte Kochsalzlösung oder 1× PBS
  25. Spülen Sie die Membran dreimal für jeweils 10 Minuten mit Standardwaschpuffer.
  26. Inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörpern gegen CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6 oder α-TUBULIN für 12 h bei 4 °C unter leichtem Schwenken
    HINWEIS: Verdünnen Sie die Primärantikörper 1:1.000 im Standardwaschpuffer.
  27. Entfernen Sie die Primärantikörperlösung und waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 10 Minuten mit Standardwaschpuffer.
  28. Inkubieren Sie die Membran mit dem geeigneten mit der alkalischen Phosphatase (AP)-konjugierten sekundären Antikörper gegen Maus- oder Kaninchen-IgG für 12 h bei 4 °C unter leichtem Schwenken
    HINWEIS: Verdünnen Sie die sekundären Antikörper 1:3.000 im Blockierpuffer.
  29. Entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung und waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 10 Minuten mit Standardwaschpuffer.
  30. Tragen Sie das verbesserte chemilumineszente (ECL) Substrat gleichmäßig auf die Membran auf und inkubieren Sie es für 1 min.
  31. Chemilumineszente Signale mit einem digitalen Bildgebungssystem erfassen.
    HINWEIS: Falls gewünscht, bestätigen Sie die erfolgreiche Genstörung durch Sanger-Sequenzierung der gezielten genomischen Region nach PCR-Amplifikation der isolierten genomischen DNA.43.

Ergebnisse

Um Cas9-ablatierte Knockout-Linien für experimentelle Rekonstitution zu erzeugen, wurde in HEK293FT-Zellen ein Lentivirus hergestellt, das eine Cas9-zielgerichtete gRNA codiert (Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro), unter Verwendung standardmäßiger Verpackungsplasmide (pLP1, pLP2 und pLP/VSVG). Der resultierende virale Überstand wurde gewonnen und zur Transduktion der Zielzellen verwendet. Das Überleben während der Hygromycin-B-Selektion bestätigte eine erfolgreiche lentivirale Transduktion, und anschließende Western-Blot-Analysen verifizierten die Cas9-Ablation (Abbildung 1).

Das CUL4B-Protein wurde in den ursprünglichen HEK293-Zellen leicht nachgewiesen, fehlte jedoch in HEK293-Zellen, die mit dem leeren Vektor transfiziert worden waren.ΔCUL4B und HEK293ΔCUL4BΔcas9 Zellen. In Übereinstimmung mit dem Verlust von CUL4B zeigten WDR5 und CDC6 die erwarteten Zunahme bzw. Abnahme in der stationären Expression, was die Störung der CUL4B-Funktion bestätigt. Das Cas9-Protein wurde in HEK293-Zellen nachgewiesen.ΔCUL4B Zellen, war jedoch in den ursprünglichen HEK293- und HEK293-Zellen nicht nachweisbarΔCUL4BΔcas9 Zellen, was eine erfolgreiche Cas9-Ablation bestätigt. Wie erwartet führte die Transfektion des CUL4B-Expressionsplasmids in HEK293ΔCUL4B Zellen führte nur zu einer minimalen Wiederherstellung der CUL4B-Proteinexpression. Im Gegensatz dazu wurde nach Transfektion von HEK293-Zellen eine starke CUL4B-Expression beobachtet.ΔCUL4BΔcas9 Zellen, begleitet von der Wiederherstellung der downstream Proteinexpression, wie durch verringerte WDR5- und erhöhte CDC6-Spiegel belegt. Insgesamt zeigen diese Befunde, dass die Ablation von Cas9 eine effiziente Wiederherstellung der CUL4B-Expression und -Funktion ermöglicht, indem sie den Cas9-vermittelten Schnitt des Rescue-Plasmids verhindert (Abbildung 2).

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Abbildung 1: Experimenteller Arbeitsablauf zur gezielten Ablation von Cas9 und Validierung der CUL4B-Rettung. Dieser Arbeitsablauf beschreibt die Erzeugung von Cas9-ablatierten CRISPR-Knockout-Zellen durch Cotransfektion von HEK293FT-Produkterzellen mit pLP1, pLP2, pLP/VSVG und einem Cas9-gRNA1_pLentiGuide-Hygro-Konstrukt mittels Kalziumphosphat-Transfektion. Das resultierende lentivirale Überstandmedium wird gesammelt, durch Zentrifugation von verbliebenen Produkterzellen befreit und zur Transduktion von Zielzellen verwendet. Nach der Selektion wird die erfolgreiche Ablation von Cas9 mittels Western-Blot-Analyse bestätigt, um eine reine Knockout-Zelllinie zu etablieren, die für die experimentelle Rekonstitution von CUL4B bereitsteht. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Wiederherstellung der CUL4B-Expression und -Funktion in mit CRISPR-Cas9 bearbeiteten HEK293-Zellen. (A) Experimentelles Schema des Transfektionsablaufs. HEK293ΔCUL4B  - und HEK293ΔCUL4BΔcas9-Zellen wurden entweder mit einem leeren Vektor oder mit zunehmenden Mengen an pCMV-FLAG-CUL4B transfiziert. Die Zellen wurden 36 h nach der Transfektion geerntet, und die Proteine der Lysate wurden mittels SDS-PAGE getrennt. (B) Western-Blot-Analyse der Wiederherstellungs-Effizienz und nachgeschalteter funktioneller Kontrollen. Die angegebenen Proteine wurden mittels Western-Blot detektiert. WDR5 und CDC6 dienten als Kontrollen für die CUL4B-Funktion. α-TUBULIN diente als Ladekontrolle. Elterliche HEK293-Zellen dienten als Kontrolle für die Basal-Expression. Die Blots sind repräsentativ für unabhängige Experimente (n = 2). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

ZielgengRNA-Sequenz (5′→3′)PAM (5′→3′)ZielpositionZielbeschreibung
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 Exon 3N-terminale Region des menschlichen CUL4B-ORF für einen durch Leserasterwechsel verursachten Knockout
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)konservierte interne Region des cas9-Transgens zur Auslösung von selbstinaktivierenden Indels

Tabelle 1: CRISPR-Cas9-Leit-RNA-Sequenzen und genomische Zielvorgaben.

Diskussion

Dieses Protokoll ermöglichte eine robuste Wiederherstellung der Zielproteinexpression und -funktion in mittels CRISPR-Cas9 editierten Knockout-Zelllinien, bei denen Cas9 nach der Editierung abgeschaltet wurde. Eine bemerkenswerte Beobachtung dieser Arbeit ist das erhebliche Ausmaß, in dem eine konstitutive Cas9-Expression die plasmidgesteuerte Transgenexpression unterdrückt. Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Fähigkeit, sowohl das verlorene Protein als auch das damit assoziierte Phänotyp wiederherzustellen. Diese Methode schafft zudem einen Rahmen für die phänotypische Untersuchung einer breiten Palette von Proteinveränderungen. Beispielsweise kann die Einführung einer Phosphomimetikum-Variante (z. B. Serin zu Asparaginsäure) wertvolle Einblicke in die Rolle dieser posttranslationalen Modifikation liefern, ohne durch das Hintergrundsignal des nativen Proteins beeinträchtigt zu werden.

Daher ist dieses Protokoll weitgehend auf standardmäßige adhärente (z. B. HeLa, A549) und Suspension (z. B. Jurkat, THP-1) Zelllinien anwendbar. Allerdings könnte dieses sequenzielle Selektionskonzept für primäre oder nicht teilende Zellen (z. B. primäre Neuronen oder Makrophagen) unpraktisch sein. In diesen empfindlichen Systemen führt die schnelle Eliminierung nicht transduzierter Begleitzellen zur Freisetzung zytotoxischer Trümmer und pro-apoptotischer Stresssignale in das gemeinsame Mikromilieu, wodurch indirekte Toxizität ausgelöst wird46,47. Ebenso könnte es bei hochanpassungsfähigen, aneuploiden Krebszelllinien (z. B. U87 Glioblastom oder A375 Melanom) versagen, die dazu neigen, CRISPR-vermittelte Phänotypen durch schnelle chromosomale Umstrukturierungen oder die rasche Selektion bereits vorhandener resistenter Klone zu umgehen48,49. Letztlich hängt die Eignung von der Fähigkeit einer Zelllinie ab, die metabolische Belastung einer Doppelvektor-Expression zu tolerieren, diesen indirekten Selektionsdruck auszuhalten und über den mehrwöchigen Protokollverlauf stabile Wachstumskinetik aufrechtzuerhalten.

Obwohl dieser Ansatz als vielseitiges Machbarkeitskonzept für die meisten Zelllinien dient, erfordert seine Anwendung ein sorgfältiges Gleichgewicht zwischen Transfektionseffizienz und genomischer Integrität. Wie beschrieben gewährleistet die lentivirale Abgabe einer auf „Selbst“ gerichteten gRNA eine homogene Cas9-abgeschaltete Population, insbesondere in schwer zu transduzierenden Zellen. Das Risiko einer insertionalen Mutagenese aufgrund semi-zufälliger Integration bleibt jedoch bestehen. Diese Risiken lassen sich durch die Optimierung der MOI kontrollieren. In permissiven Linien wie HEK293 führt eine MOI von 1–5 zu einer hohen Sättigung, während gleichzeitig die integrationsbedingte Mutagenese und Zytotoxizität minimiert wird41. Im Gegensatz dazu benötigen resistentere Immun- oder Neuronzellen typischerweise MOIs von 10–50, wobei oft Enhancer wie Polybrene und/oder Spinokulation erforderlich sind, um vergleichbare Effizienzen zu erzielen50,51,52,53,54,55.

Dieser technische Kompromiss betrifft auch die Wahl zwischen polyklonalen und monoklonal ausgewählten Populationen. Die hier erzeugten HEK293ΔCUL4BΔcas9 -Zellen sind polyklonal, eine Entscheidung, die die experimentellen Zeitpläne beschleunigt, da der wochenlange Aufwand für die Expansion einzelner Zellen bei der Einzelzell-Subklonierung entfällt. Zudem erfasst ein polyklonaler Pool das durchschnittliche Phänotyp der Kultur und wirkt so effektiv als Puffer gegen klonale Artefakte oder integrationsstellebezogene Probleme. Obwohl monoklonale Linien aufgrund ihrer genetischen Homogenität eher konsistente Ergebnisse liefern, legen die hier vorgestellten Ergebnisse nahe, dass die polyklonale Auswahl eine gangbare und oft bessere Alternative darstellt, wenn Geschwindigkeit und repräsentative Population im Vordergrund stehen.

Die zeitliche Stabilität des resultierenden Phänotyps kann ebenfalls eine entscheidende Variable sein. In dem hier vorgestellten System nahm der regulatorische Einfluss von CUL4B auf WDR5 und CDC6 über aufeinanderfolgende Passagen der Knockout-Zelllinien ab, was mit einer kompensatorischen Hochregulation des Paralogs CUL4A korrelierte (Daten nicht gezeigt). Dies spiegelt die Befunde von Nakagawa et al. wider, die zeigten, dass CUL4A die Funktion von CUL4B in CUL4B-verarmten Zellen teilweise wiederherstellen kann44. Solche homöostatischen Kompensationseffekte sind in der Zellbiologie häufig, insbesondere wenn ein Protein mit hoher struktureller Homologie und funktioneller Redundanz gegenüber anderen zellulären Proteinen gezielt beeinflusst wird.

Um diese sekundären kompensatorischen Mechanismen zu umgehen, können zwei unterschiedliche strategische Ansätze verfolgt werden, abhängig von den experimentellen Zielen und der verwendeten Zelllinie. Für Forscher, die Effizienz priorisieren oder mit stark anpassungsfähigen Zelllinien arbeiten, ist ein verkürzter experimenteller Zeitplan unerlässlich. Diese Strategie beinhaltet die unmittelbare Validierung des Verlusts des Zielproteins, idealerweise sobald die Kultur nach der Selektion 90 % Konfluenz erreicht hat, gefolgt von der gezielten Anwendung von selbstinaktivierendem Cas9 und funktionellen Assays. Durch die Anwendung dieses beschleunigten Arbeitsablaufs lassen sich die primären biologischen Konsequenzen des Knockouts wahrscheinlicher erfassen, bevor die zelluläre homöostatische Maschinerie ausreichend Zeit hat, redundante Paralogen hochzuregulieren oder den resultierenden Phänotyp anderweitig zu beeinflussen.

Alternativ bietet für Studien, die eine langfristige Stabilität oder hochpräzise Rettungsexperimente erfordern, insbesondere in transfektionsresistenten Modellen wie Immun- und Nervenzellen, ein tetracyclin-kontrolliertes (Tet-On/Off)-System eine gangbare Lösung56,57. Obwohl die Implementierung dieses induzierbaren Systems zusätzliche Runden lentiviraler Transduktion und den Einsatz unterschiedlicher Antibiotikaresistenzmarker erfordert, ermöglicht es eine dauerhafte Wiederherstellung des Zielproteins, um die zelluläre Umgebung zu stabilisieren, bevor vorübergehende, durch Doxycyclin vermittelte „Verlust- und Rettungs“-Ereignisse ausgelöst werden57.

Offenlegungen

Die Autoren verwendeten Google Gemini, um die technische Terminologie zu präzisieren und den Manuskripttext zu überarbeiten. Die KI diente lediglich als Hilfsmittel zur sprachlichen Verbesserung und leistete keinen Beitrag zur ursprünglichen Datensynthese, zur Konzeption der Studie oder zum primären Verfassen des Textes. Die Autoren überprüften und bearbeiteten die Ausgabe und übernehmen die volle Verantwortung für den Inhalt des endgültigen Manuskripts. Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Startkapitalmittel des Le Moyne College, des Forschungs- und Entwicklungs-Komitees des Le Moyne College, des Studierenden-Forschungskomitees des Le Moyne College, des Walter L. '66 und MaryAnne Poland Jesuit-Zentrums für Forschung und Lehrinnovation sowie der Abteilung für Biologische und Umweltwissenschaften des Le Moyne College unterstützt. Die Autoren danken BioRender.com für die Erstellung der grafischen Abbildungen. Abbildung 1 wurde in BioRender erstellt (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3), und das obere Feld von Abbildung 2 wurde in BioRender erstellt (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
anti-Cas9-AntikörperCell Signaling65832Dieser mausmonoklonale Antikörper ermöglicht den spezifischen Nachweis von S. pyogenes Cas9 in humanen Lysaten und eignet sich daher ideal zur Überprüfung der selbstgerichteten, durch gRNA vermittelten Cas9-Entfernung.
anti-CDC6-AntikörperCell Signaling3387Dieser kaninchenmonoklonale Antikörper ermöglicht den spezifischen Nachweis von humanem CDC6 und eignet sich daher ideal zur Überwachung der funktionellen Downstream-Effekte von CUL4B.
anti-CUL4B-AntikörperSigma-AldrichC9995Dieser affinitätsgereinigte, polyklonale Kaninchenantikörper ermöglicht den spezifischen Nachweis von humanem CUL4B, ohne mit dem eng verwandten Paralog CUL4A zu kreuzreagieren.
anti-maus IgG, HRP-gekoppelter sekundärer AntikörperCell Signaling7076Dieser gegen maus-IgG gerichtete Antikörper aus Pferd ist mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert und für den chemilumineszenten Nachweis mausmonoklonaler primärer Antikörper optimiert.
anti-kanin IgG, HRP-gekoppelter sekundärer AntikörperCell Signaling7074Dieser gegen kaninchen-IgG gerichtete Antikörper aus Ziege ist mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert und für den chemilumineszenten Nachweis polyklonaler und monoklonaler primärer Kaninchenantikörper optimiert.
anti-WDR5-AntikörperCell Signaling13105Dieser kaninchenmonoklonale Antikörper ermöglicht den spezifischen Nachweis von humanem WDR5 und eignet sich daher ideal zur Überwachung der funktionellen Downstream-Effekte von CUL4B.
anti-α-TUBULIN-AntikörperCell Signaling3873Dieser mausmonoklonale Antikörper erkennt humanes Alpha-Tubulin und eignet sich ideal als einheitliche Ladekontrolle zur Normalisierung in der Western-Blot-Analyse.
Calciumphosphat-TransfektionskitThermoFisher ScientificK278001Dieses Kit bietet effiziente Reagenzien für die vorübergehende Transfektion, die für die skalierbare und kostengünstige Produktion von lentiviralen Vektoren in adhärenten HEK293FT-Produktionszellen optimiert sind.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation custom synthesiscas9 gRNA-Sequenz: CGTGATCACCGACGAGTACA, PAM-Sequenz: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation custom synthesiscas9 gRNA-Sequenz: CGTGATCACCGACGAGTACA, PAM-Sequenz: AGG
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium GibcoD5796Dieses Medium mit hohem Glucosespiegel, ergänzt mit L-Glutamin und Natriumpyruvat, ist für das Wachstum, die Vitalität und die metabolische Stabilität schnell proliferierender Säugerzelllinien (z. B. HEK293FT) optimiert.
Fötales Rinderserum, Premium (hitzeinaktiviert)Corning35-016-CVDieses hochwertige, hitzeinaktivierte Serum liefert essentielle Wachstumsfaktoren und Hormone und minimiert gleichzeitig die komplementvermittelte Zytotoxizität bei Säugerzelllinien.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573Diese gut charakterisierte humane embryonale Nierenzelllinie ist hochgradig transfectierbar und dient als robustes Standardmodell zur Untersuchung von Gen-Knockout-Phänotypen und Protein-Rettungsansätzen.
HEK293FT-Zellen ThermoFisher ScientificR70007Dieses schnell wachsende, hochgradig transfectierbare Derivat der humanen embryonalen Nierenzelllinie exprimiert stabil das große SV40-T-Antigen und ist daher für die Maximierung der Virustiter bei der Produktion von lentiviralen Vektoren optimiert.
Hygromycin BsigmaaldrichH7772Dieses Aminonukleosid-Antibiotikum wird als Selektionsmittel in der Kultur von Säugerzellen verwendet, um stabile Transdukte, die den Hygromycin-Resistenzmarker exprimieren, zu isolieren.
pCLIP-All-hCMV-Puro-Plasmid (CUL4B gRNA)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bCUL4B gRNA-Sequenz: ATCAAACCCTACAAACTCCA, PAM-Sequenz: AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/ADieses Säugerexpressionsplasmid nutzt einen Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor, um die konstitutive Expression eines FLAG-markierten Cullin-4B-Proteins (CUL4B) zu steuern, und wurde von Jianping Jin zur Verfügung gestellt.
pCMV-M1 SäugerexpressionsvektorAddgene23007Leerer Expressionsvektor als Kontrolle (ein Geschenk von Linda Wordeman)
pLentiGuide-PuroAddgene52963Dieser lentivirale Transfervektor ermöglicht die Expression einer anpassbaren gRNA unter Kontrolle des humanen U6-Promotors sowie eines Puromycin-Resistenzmarkers unter Kontrolle des EF-alpha-Promotors für CRISPR-Targeting in Cas9-exprimierenden Zellen und wurde von Feng Zhang zur Verfügung gestellt.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 Lentiviraler Vektor zur Expression von GFP zum Nachweis der Transduktionseffizienz (ein Geschenk von Kevin Janes)
PuromycinSigma-AldrichP8833Dieses Aminonukleosid-Antibiotikum wird als Selektionsmittel in der Kultur von Säugerzellen verwendet, um stabile Transdukte, die den Puromycin-Resistenzmarker exprimieren, zu isolieren.
Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Corning21-040-CVDiese standardisierte isotonische Salzlösung wird zum Waschen von Zellmonolagen verwendet, um Spuren von Kulturmedien, Serumproteinen oder Enzymen effektiv zu entfernen, ohne den osmotischen Druck oder die Zellvitalität zu beeinträchtigen.
Trypsin-EDTA 1XCorning25-051-CIDiese standardmäßige enzymatische Dissoziationslösung wird verwendet, um adhärente Säugerzellen von Kulturgefäßen abzulösen, indem Peptidbindungen gespalten werden, während EDTA zweiwertige Kationen chelatiert, um die interzelluläre Adhäsion zu stören.
ViraPower Lentiviraler VerpackungsmixThermoFisher ScientificK497500Dieses optimierte Gemisch aus Verpackungsplasmiden (pLP1, pLP2 und pLP/VSVG) wird zur Cotransfektion in Produktionszellen verwendet, um die Produktion von lentiviralen Expressionsvektoren mit hohem Titer und replikationsinkompetentem Phänotyp zu ermöglichen.

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