Methodenartikel

Bildgebung des Liquor-Cerebrospinalis-Transports mittels kontrastverstärkter Magnetresonanztomographie via intraventrikuläre Infusion bei Nagetieren

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DOI:

10.3791/72175

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28. August 2026

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1Department of Electrical, Computer, and Systems Engineering, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Radiology, Case Western Reserve University, 4Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur intraventrikulären Kanülierung und Tracer-Infusion vor, das speziell für dynamische kontrastverstärkte MRT-Studien (DCE-MRI) an Nagetieren entwickelt wurde. Das Protokoll ermöglicht eine kontinuierliche Tracer-Zufuhr während der Bildaufnahme und erlaubt so die Ganzhirn-Darstellung des Tracer-Transports und dessen Clearance aus dem Gehirn innerhalb einer einzigen, ununterbrochenen Untersuchungssitzung.

Zusammenfassung

Die intraventrikuläre (ICV) Kanülierung ermöglicht die direkte Applikation exogener Tracer oder therapeutischer Substanzen in das Seitenventrikel, den Ursprung der Liquorzirkulationsbahn. Die infundierten Moleküle werden durch die Flüssigkeitsströmung des Liquors (CSF) durch die Ventrikelräume in den Subarachnoidalraum transportiert und gelangen anschließend über den perivaskulären Raum in das Hirnparenchym. Herkömmliche ICV-Kanülierungsmethoden verwenden jedoch typischerweise ferromagnetische Kanülen, die mit MRT-Untersuchungen unverträglich sind und daher eine Infusion außerhalb des Scanners sowie die Entfernung der Kanüle vor der Bildgebung erforderlich machen. Die für den Tiertransport und die Bildgebungseinrichtung benötigte Zeit führt häufig zum Verlust der initialen, und möglicherweise kritischsten, Phase des Tracertransports. Hier beschreiben wir ein MRT-kompatibles ICV-Kanülierungs- und Infusionsprotokoll für Nagetiere, das eine kontinuierliche, während der dynamischen MRT-Aufnahme erfolgende Tracerapplikation im Scanner ermöglicht. Die Infusionsleitung besteht vollständig aus nichtmagnetischen Materialien, wodurch eine unterbrechungsfreie Bildaufnahme innerhalb einer einzigen Sitzung möglich ist. Dieser Ansatz eignet sich besonders gut für dynamische kontrastverstärkte MRT-Studien zur Untersuchung der Liquordynamik, des glymphatischen Transports, des Abtransports gelöster Substanzen sowie der intrathekalen Arzneimittelabgabe.

Einleitung

Das Gehirn ist eines der metabolisch aktivsten und dynamischsten Organe des Körpers und erzeugt kontinuierlich Abfallprodukte, die effizient entfernt werden müssen, um eine normale neuronale Funktion aufrechtzuerhalten1. Die Anreicherung metabolischer Abfallstoffe ist ein Kennzeichen der Neurodegeneration und des altersbedingten Gehirnabbaus2. Das glymphatische System spielt eine zentrale Rolle bei diesem Clearance-Prozess, indem es die Beseitigung metabolischer Nebenprodukte und toxischer Abfälle durch massenhafte Liquor-Zerebrospinalis-(CSF-)Strömung sowie den Austausch von CSF mit interstitieller Flüssigkeit (ISF) ermöglicht3,4,5, ein Vorgang, der durch die auf den astrozytären Endfüßchen lokalisierten Aquaporin-4-(AQP4-)Wasserkanäle unterstützt wird6. Ein erhebliches Verständnis der CSF-Dynamik wurde durch die Untersuchung des Transports verschiedener CSF-Tracer gewonnen. Die dynamisch kontrastverstärkte MRT (DCE-MRT) mit gadoliniumbasierten Kontrastmitteln (GBCAs) eignet sich besonders gut zur ganzheitlichen Beurteilung des Tracertransports im Gehirn7,8. Die klinische Relevanz dieses Ansatzes wurde durch translationsmedizinische Studien am Menschen belegt. Die intrathekale Gabe von GBCAs, gefolgt von seriellen MRT-Untersuchungen, wurde verwendet, um die CSF-Dynamik im menschlichen Gehirn zu bewerten9. Spätere Arbeiten zeigten einen gehirnweiten Tracertransport, dem eine nächtliche Clearance folgte10. Dieser Ansatz wurde kürzlich angewandt, um einen beeinträchtigten periarteriellen Tracertransport bei Probanden mit reduzierter intrakranieller Druck-Volumen-Reservekapazität sowie bei Patienten mit idiopathischem Normaldruck-Hydrozephalus aufzuzeigen11. Diese Studien etablieren die DCE-MRT des CSF-Tracertransports als klinisch übertragbaren Ansatz und motivieren die Entwicklung strenger, reproduzierbarer präklinischer Methoden zur mechanistischen Erforschung der Regulation der CSF-Dynamik und der Abfallbeseitigung.

Die Kanülierung der Zisterna magna (ICM) wird häufig in glymphatischen Studien zur Tracerapplikation verwendet.12. Allerdings werden nur etwa 20 % der applizierten GBCA über diese Route werden in das Hirnparenchym transportiert, wobei der Großteil direkt in das Rückenmark oder die Lymphbahnen abfließt8Dieser Ansatz birgt zudem das Risiko einer Schädigung des Kleinhirns oder des Hirnstamms, und die Fixierung der Kanüle für Langzeitstudien bleibt technisch anspruchsvoll. Die intraventrikuläre (ICV) Kanülierung hat sich als robuste Alternative etabliert.13,14,15Eine aktuelle Studie zeigte ihre Reproduzierbarkeit und wesentliche Vorteile bei der Applikation fluoreszierender Tracer, einschließlich einer stabilen Kanülenfixierung, die eine freie Bewegung der Tiere ermöglicht und wiederholte Tracer-Injektionen in Längsschnittstudien unterstützt.13.

Trotz dieser Vorteile sind bestehende Protokolle zur intrazerebroventrikulären Kanülierung nicht direkt mit MRT-Studien kompatibel16. Da die intrazerebroventrikuläre Kanülierung eine Durchdringung des Gehirnparenchyms erfordert, werden üblicherweise ferromagnetische Kanülen verwendet, die starke Suszeptibilitätsartefakte in MRT-Bildern verursachen. Folglich muss die Tracer-Infusion außerhalb des Scanners erfolgen, wobei die Kanüle vor der Übertragung des Tieres zur Bildgebung entfernt wird. Ein typischer Arbeitsablauf beinhaltet die Aufnahme einer Basislinienaufnahme, das Entfernen des Tieres zur Kanülierung und Tracer-Infusion sowie anschließendes erneutes Positionieren des Tieres für nachfolgende dynamische Aufnahmen. Dieser unterbrochene Arbeitsablauf schließt eine kontinuierliche, auf die Basislinie bezogene Datenaufnahme aus und führt zu Fehlausrichtungen durch das erneute Positionieren, die eine vokselbasierte kinetische Analyse verfälschen können. Noch wichtiger ist, dass aufgrund der Tatsache, dass die frühe Aufnahmephase typischerweise der dynamischste, aber zugleich flüchtigste Abschnitt der Tracer-Kinetik ist, der Tiertransfer und die Scanner-Vorbereitung während dieses Zeitfensters zum Verlust der informativsten Daten führen.

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das diese Einschränkungen überwindet, indem eine MRT-kompatible ICV-Infusionsleitung mit einer Kontrastmittelapplikationsmöglichkeit im Scanner integriert wird, wodurch eine kontinuierliche, dynamische MRT-Aufnahme bei Nagetieren ermöglicht wird. Dieser Ansatz erlaubt eine quantitative, ganzhirnweite Abbildung des Transportverhaltens von CSF-Tracern innerhalb einer einzigen, ununterbrochenen Bildgebungssitzung. Dieses Protokoll eignet sich besonders gut zur Untersuchung der ganzhirnweiten CSF-Dynamik, des glymphatischen Transports und der Kinetik der Löslichkeitsbeseitigung. Obwohl es hier für erwachsene Ratten beschrieben ist, kann das Protokoll mit entsprechenden Anpassungen der Kanülierungskoordinaten und Infusionsparameter auch für Mäuse verwendet werden15.

Protokoll

Das unten beschriebene Protokoll wurde von dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Case Western Reserve University (A-3145-01-2023-0015) genehmigt, gemäß dem Guide for the Care and Use of Laboratory Animals und der Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgelistet.

1. Vorbereitung der Infusionsleitung

  1. Schneiden Sie ein 30-mm-Stück einer Kupferkanüle und ein 2-m-Stück Polyethylen-(PE-)Schlauch mit einer Zahnscschere ab.
  2. Weiten Sie unter dem Mikroskop vorsichtig ein Ende des PE-Schlauchs mit einer 30-G-Nadel und führen Sie die Kupferkanüle in das erweiterte Ende ein. Sichern Sie die Verbindung mit Cyanacrylat-Kleber. Verbinden Sie das gegenüberliegende Ende des PE-Schlauchs mit einer 30-G-Nadel.
    HINWEIS: Kupfer ist sehr duktil; achten Sie darauf, den Lumen beim Schneiden nicht einzuknicken. Vermeiden Sie beim Zusammenbau eine Verformung der Kanüle oder ein Durchstechen des Schlauchs. Die Länge des PE-Schlauchs sollte es ermöglichen, die Spritzenpumpe außerhalb des Streufeldes des Scanners zu platzieren.
  3. Füllen Sie die Kanüle-Schlauch-Anordnung mit entgaster Tracerlösung und verbinden Sie sie mit einer 50-µL-Hamilton-Spritze. Wickeln Sie die Spritzenspitze mit Polytetrafluorethylen-(PTFE-)Gewindedichtband um, um Leckagen zu verhindern. Gehen Sie vorsichtig vor, um beim Befüllen keine Luftblasen einzuschließen.
  4. Befestigen Sie die Hamilton-Spritze an der Spritzenpumpe und ziehen Sie weitere 30 µL Tracerlösung in die Spritze auf.

2. Kanülierungsverfahren

  1. Wiegen Sie die Ratte und betäuben Sie sie mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (90 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Überprüfen Sie die ausreichende Narkosetiefe anhand der Zehenquetschreflex. Bei Bedarf eine Drittel der Initialdosis ergänzen und vor Fortfahren erneut überprüfen.
  2. Rasieren Sie den Kopf und den Hals, entfernen Sie loses Haar und desinfizieren Sie die freigelegte Haut mit 70 % Ethanol-Tupfern.
  3. Sichern Sie die Ratte im stereotaktischen Rahmen und legen Sie eine Heizplatte, die mit saugfähigem Papier bedeckt ist, unter das Tier. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um eine Hornhauttrockenheit zu verhindern.
  4. Stellen Sie die Nasenklemme so ein, dass der Schädel ausgerichtet ist. Führen Sie einen medianen Schnitt durch und ziehen Sie die Haut mit vier Hämorrhagieklemmen zurück, um Bregma und Lambda freizulegen. Tragen Sie 3 % Wasserstoffperoxid auf den Schädel auf, um verbliebenes Periost zu entfernen und die Sichtbarkeit der Orientierungspunkte zu verbessern.
    ANMERKUNG: Eine genaue Ausrichtung des Schädels ist entscheidend für eine reproduzierbare Kanülenplatzierung. Als praktische Qualitätskontrolle vergleichen Sie die mediolateralen (ML) und dorsoventralen (DV) Koordinaten an Bregma und Lambda: Wenn der Schädel korrekt ausgerichtet ist, sollte der Unterschied zwischen den beiden Orientierungspunkten in keiner der Achsen ML oder DV 0,2 mm überschreiten.
  5. Befestigen Sie den elektrischen Bohrer mit einem feinen Bohrer im stereotaktischen Arm und stellen Sie sicher, dass der Arm fest verriegelt ist.
  6. Positionieren Sie den Bohrer an Bregma, bewegen Sie ihn dann 0,7 mm nach posterior und 1,4 mm nach lateral rechts. Senken Sie den Bohrer ab, bis er die Schädeloberfläche berührt, und notieren Sie die DV-Koordinate.
  7. Unter mikroskopischer Beobachtung führen Sie den Bohrer in 0,1-mm-Schritten voran. Stoppen Sie unverzüglich beim Durchbruch des Schädels (die typische Schädeldicke bei erwachsenen Ratten beträgt 0,3–0,4 mm).
  8. Ersetzen Sie den Bohrer durch die vorbeladene Kanüle am stereotaktischen Arm. Fördern Sie die Infusionspumpe kurzzeitig, bis Flüssigkeit gerade aus der Kanülenspitze austritt, um einen ungehinderten Flüssigkeitsweg zu bestätigen.
  9. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle senkrecht zur Schädeloberfläche montiert ist, und richten Sie sie über das Bohrloch aus. Führen Sie die Kanüle mit 0,1 mm/s auf eine endgültige Zieltiefe von 3,5 mm unterhalb der Dura-Oberfläche.
  10. Geben Sie einen Tropfen Gewebekleber an die Schnittstelle zwischen Kanüle und Schädel. Nach dem Aushärten schließen Sie den Hautschnitt mit Nähten und biegen Sie die Kupferkanüle vorsichtig parallel zur Schädeloberfläche, um Kontakt mit der MRT-Spule zu vermeiden.

3. MRT-Setup und dynamische Aufnahme

  1. Platzieren Sie die Volumen-Sendespule im Isocentrum des Scanners.
  2. Überführen Sie das Tier in Rückenlage in eine MRT-kompatible Halterung. Schließen Sie das System zur physiologischen Überwachung an, einschließlich Atemsensor und rektalem Temperaturfühler. Schalten Sie das zirkulierende Warmwasserbad ein, um die Körpertemperatur bei ~37 °C.
  3. Während der gesamten Scansitzung eine angemessene Anästhesie durch Zusatz von Isofluran aufrechterhalten über Schnauzenkappe. Stellen Sie die Isoflurankonzentration zwischen 0,25 % und 1,0 % ein, um eine Atemfrequenz von 50–70 Atemzügen/min aufrechtzuerhalten.
    HINWEIS: Eine vor der Kanülierung verabreichte Ketamin-Xylazin-Anästhesie bewirkt während der ersten Übertragung in die MRT-Halterung eine anhaltende Sedierung. Führen Sie Isofluran schrittweise ein und überwachen Sie kontinuierlich die Atemfrequenz während der Untersuchung.
    ACHTUNG: Isofluran ist ein flüchtiges Agens, das eine Inhalationsgefahr darstellt; verwenden Sie eine aktive Absaugung und minimieren Sie die Exposition des Personals.
  4. Platzieren Sie die Infusionspumpe außerhalb des Streufeldes des Magneten und stellen Sie die Infusionsrate ein auf 1 µL/min und die Infusionsdauer auf 20 min, was einem Gesamtinfusionsvolumen von entspricht 20 µLOrdnen Sie die Infusionsleitung sorgfältig entlang der Halterung an und sichern Sie sie, um Zugbelastung und Verschiebung zu vermeiden.
    ACHTUNG: Ferromagnetische Gegenstände können in der Nähe eines MRT-Scanners zu gefährlichen Projektilen werden. Alle MRT-inkompatiblen Geräte außerhalb des Streufeldes aufbewahren.
  5. Bringen Sie die Oberflächenarrayspule direkt über dem dorsalen Schädel auf, zentriert zum Gehirn. Legen Sie ein kleines Stück saugfähiges Papier zwischen die Spule und die Schnittstelle, um Wundsekret aufzunehmen.
  6. Schieben Sie die Liege in den Magneten, bis sich das Gehirn im Isocenter befindet. Stellen Sie sicher, dass die Infusionsleitung und die Anschlüsse der physiologischen Überwachung weiterhin ungehindert verlaufen.
  7. Führen Sie die anfängliche Scanner-Einrichtung durch und nehmen Sie anatomische Bilder auf, um die erfolgreiche Kanülenplatzierung zu bestätigen.
  8. Nach Erhalt der Basislinienbilder die Infusionspumpe und die dynamische Aufnahme gleichzeitig starten und die Aufnahme insgesamt 3 h lang fortsetzen (siehe Tabelle 1 für Aufnahmedetails).

Ergebnisse

Die chirurgische Arbeitsstation ist so konfiguriert, dass die Bohrung präzise positioniert werden kann, um das Seitenventrikel anzusteuern (0,7 mm posterior und 1,4 mm lateral zum Bregma; Abbildung 1A,D). Die Infusionsleitung besteht aus einer 30-mm-Kupferkanüle, einem 2-m-Stück PE-Schlauch und einer 30-G-Nadel, die mit einer Hamilton-Spritze verbunden ist (Abbildung 1B). Die verlängerte Schlauchlänge ermöglicht es, die Spritzenpumpe außerhalb des Streufeldes des Scanners zu platzieren. Nach dem Bohren des Trepanationslochs wird die vorgefüllte Infusionsleitung am stereotaktischen Arm befestigt, und die Kanüle wird bis zu einer Tiefe von 3,5 mm unterhalb der Duraoberfläche in das Seitenventrikel vorgeschoben (Abbildung 1C). Sobald die Kanüle fixiert ist, wird sie parallel zur Schädeloberfläche gebogen, um Kontakt mit der MRT-Spule zu vermeiden (Abbildung 1E).

Eine erfolgreiche ICV-Kanülierung kann anhand anatomischer Bilder bestätigt werden, die das Ventrikelsystem und die Kanülenbahn deutlich darstellen und eine direkte Visualisierung der Kanülenspitze innerhalb des Ventrikellichts sowohl in sagittaler (Abbildung 2A) als auch in axialer (Abbildung 2B) Ansicht ermöglichen. Diese Bilder erlauben zudem, Tiere mit fehlplazierter Kanüle von den DCE-MRT-Scans auszuschließen, beispielsweise bei zu geringer Einführung, wenn die Spitze im Corpus callosum endet, oder bei übermäßiger Einführung, wenn die Spitze in den Thalamus hineinragt. Die räumliche und zeitliche Verteilung des Tracers in den DCE-MRT-Scans kann eine zusätzliche Bestätigung einer korrekten Kanülenplatzierung liefern, da fehlplazierte Kanülen den Tracer in das Hirnparenchym abgeben und dadurch Kinetiken erzeugen, die nicht mit der Ausbreitung des Tracers im Ventrikelsystem übereinstimmen.

Bei DCE-MRT-Scans wird die intrazerebrale Infusion von Kontrastmitteln nach der Erfassung der Basisliniendaten initiiert, und die dynamische Bildaufnahme kann bis zu 3 Stunden oder länger dauern (Abbildung 2C). Abbildung 2D zeigt repräsentative 3D-T1-gewichtete Bilder, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Kontrastmittelinfusion aufgenommen wurden. Am Ende der 20-minütigen Infusion ist eine Kontrastmittelanreicherung bereits im infundierten (ipsilateralen) Seitenventrikel, im dritten und vierten Ventrikel sowie in der Zisterna magna erkennbar, was auf eine schnelle Ausbreitung des Tracers entlang des ventrikulär-subarachnoidalen Weges durch Massenfluss hinweist. Eine Signalanreicherung ist zudem im Parenchym um den ipsilateralen Seitenventrikel herum zu beobachten, was auf einen Transport des Tracers in das periventrikuläre Gewebe über die Ependymmembran hindeutet.

Eine genauere quantitative Beurteilung des Transports von Kontrastmitteln kann mithilfe parametrischer Kartierungstechniken erzielt werden, wie beispielsweise der T1- und T2-Kartierung mittels Magnetic Resonance Fingerprinting (MRF; Abbildung 3). In den intrathekalen Kompartimenten nimmt T1 während der Infusion rasch ab, wobei sich die Veränderung vom ipsilateralen Seitenventrikel über den dritten und vierten Ventrikel bis zum Zisterna-magna-Bereich fortpflanzt, wobei letzterer einen leichten Verzug im Einsetzen der T1-Verkürzung aufweist. Intrazerebroventrikulär verabreichte Kontrastmittel zeigen zudem ein ausgedehntes Eindringen in das Hirnparenchym, wobei periventrikuläre Regionen (nahegelegen) früher und stärker ausgeprägte T1-Reduktionen aufweisen, während weiter entfernte Regionen verzögerte und geringere T1-Reduktionen zeigen. Mit einem dreistündigen Untersuchungsprotokoll kann auch die Clearance des Kontrastmittels aus dem Hirnparenchym anhand der Kinetik der T1-Erholung bewertet werden. Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll eine dynamische Überwachung der wesentlichen Phasen des Liquor-Tracer-Transports, einschließlich schneller ventrikulärer Verteilung, intrathekaler Fortpflanzung, parenchymatöser Aufnahme und anschließender Clearance, innerhalb einer einzigen kontinuierlichen MRT-Untersuchung.

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Abbildung 1: Chirurgische Einrichtung und Infusionsleitung für eine MRT-kompatible ICV-Kanülierung. (A) Chirurgischer Arbeitsplatz. Ein elektrisches Bohrgerät ist über dem Operationsfeld positioniert, um eine Bohröffnung anzulegen. (B) Montierte Infusionsleitung, bestehend aus einer 30-G-Nadel (roter Pfeil), einem 2-m-Polyethylen-Schlauchstück (grüner Pfeil) und einer 30-mm-Kupferkanüle (blauer Pfeil). (C) Vorgeladene Infusionsleitung, montiert am stereotaktischen Arm zur Kanülenimplantation. (D) Koordinaten für die Kanülenimplantation. (E) Erscheinungsbild vor der Wundverschluss; die Kupferkanüle ist parallel zur Schädelloberfläche gebogen, um Kontakt mit der MRT-Spule zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Kanülenplatzierung und dynamische Überwachung des Kontrastmitteltransports nach intrazerebroventrikulärer Infusion. (A,B) Darstellung der Kanülenplatzierung (rote Pfeile) in anatomischen Bildern in sagittaler bzw. axialer Ansicht. (C) Schematische Darstellung des Bildgebungsprotokolls. (D) Repräsentative 3D T1-gewichtete Bilder zu ausgewählten Zeitpunkten in sagittaler (oben), axialer (Mitte) und koronarer (unten) Ansicht. Maßstabsbalken: 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Quantitative Bewertung des Tracertransports mittels magnetresonanzspektroskopischer Fingerabdrucktechnik (MRF). (A) Aus 3D-MRF-Daten rekonstruierte T1 (oben) und T2 (unten) Karten zu ausgewählten Zeitpunkten nach intrazerebroventrikulärer (ICV) Infusion. Maßstab, 5 mm. (B) Mittlere T1-Verläufe in intrathekalen Kompartimenten, einschließlich des kontralateralen Seitenventrikels (LV), des dritten Ventrikels (V3), des vierten Ventrikels (V4) und der Zisterna magna (CM). Der grau schattierte Bereich zeigt die 20-minütige Infusionsphase an. (C) Mittlere T1-Verläufe in parenchymalen Geweben nahe und fern von V4 sowie des kontralateralen LV. Die Positionen der Auswertebereiche (ROIs) für die Zeitverläufe sind in (A) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Schematische Darstellung des Transportes von CSF-Tracern nach intrazerebroventrikulärer Infusion. (A) Sagittale Ansicht, die die Tracer-Infusion zeigt über ICV-Kanüle und ihre anschließende Bulk-Flow-Verteilung durch das Ventrikelsystem in den subarachnoidalen Raum (rote Pfeile) sowie ihr Transport über die Ependymmembran in das angrenzende Hirnparenchym (blaue Pfeile). LV: Seitenventrikel; V3: Dritter Ventrikel; V3v: ventraler Dritter Ventrikel; V4: Vierter Ventrikel; CM: Zisterna magna.B) Vergrößerte schematische Darstellung des markierten Bereichs in (A) die den Austauschweg zwischen ZNS-Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) und Interstitialflüssigkeit (ISF) darstellen. Die CSF tritt entlang des paraarteriellen Raums in das Parenchym ein, gefördert durch auf den Endfüßchen der Astrozyten exprimierte Aquaporin-4-Wasserkanäle (AQP4), bewegt sich konvektiv durch den interstitiellen Raum und tritt aus über den paravenösen Raum in die abführende Vene Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

ParameterDCE-MRT (3D FLASH)3D MRF
SequenztypT1-gewichtete 3D FLASH3D MRF (Stack-of-Spirals)
TR / TE (ms)20,0 / 2,710,0 / 2,0
Kippwinkel10°Variabel (variable Kippwinkel-Serie)
MagnetisierungsvorbereitungKeineInversion oder T2-Vorbereitung (6 von 8 Segmenten)
Bildfeld36 × 24 × 24 mm³60 × 60 mm² (in Ebene); 15 mm (durch Ebene)
Matrixgröße144 × 96 × 96300 × 300 (in Ebene); 30 (durch Ebene)
Räumliche Auflösung0,25 mm isotrop0,2 × 0,2 mm² (in Ebene); 0,5 mm (durch Ebene)
Zeitliche Auflösung3 min/Bild7 min/Bild
k-Raum-TrajektorieCartesianStack-of-Spirals-Trajektorien; 48 Interleaves für vollständige Abtastung
BeschleunigungKeine (einzelner Durchlauf)48-fach (24× in Ebene, 2× durch Ebene)
HinweisAlle Bildgebungsversuche wurden an einem 9,4-T-Bruker-BioSpin-System durchgeführt, das auf der ParaVision-360-v3.4-Plattform läuft. Als Sendeantenne diente eine 86-mm-Quadratur-Volumenspule, als Empfänger eine 4-Kanal-Oberflächen-Arrayspule. 

Tabelle 1: MRT-Aufnahmeparameter.

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll kombiniert eine intrazerebroventrikuläre Kanülierung mit einer Infusion während der Bildaufnahme und der dynamischen MRT-Aufnahme, wodurch eine quantitative Ganzhirnbewertung des Transportverhaltens von Kontrastmitteln im Liquor innerhalb einer einzigen Untersuchungssitzung ermöglicht wird. Die Vorzüge sowie Einschränkungen der intrazerebroventrikulären (ICV) Infusion lassen sich am besten im Vergleich zur Infusion in den Zisterna-magna-Raum (ICM) beurteilen. Die ICM-Infusion umgeht eine transparenchymale Kanülierung und ist daher weniger invasiv. Da die Zisterna magna jedoch mittig im Liquorzirkulationsweg liegt, kann die ICM-Infusion – insbesondere bei höheren Infusionsraten – eine vorübergehende Umkehrung des Druckgradienten verursachen, der die Liquorzirkulation antreibt17. Noch wichtiger ist, dass über die ICM verabreichte Tracer rasch in den downstream gelegenen subarachnoidalen Raum und anschließend in den perivaskulären Raum verteilt werden. Obwohl AQP4-Kanäle an den Endfüßchen der Astrozyten den Austausch zwischen Liquor und Interstitialflüssigkeit (ISF) fördern, sind diese Kanäle aufgrund der großen Molekülgröße nicht für gadoliniumbasierte Kontrastmittel (GBCAs) durchlässig. Infolgedessen zeigen über die ICM verabreichte Tracer im Parenchym eine deutlich geringere Kontrastverstärkung im Vergleich zur ICV-Infusion15, wodurch die ICM-Infusion weniger geeignet ist, um die Clearance von gelösten Substanzen aus dem Gehirn zu untersuchen. Die ICV-Infusion behebt diese Einschränkungen, indem sie Tracer nahe den endogenen Produktionsstellen des Liquors abgibt13,14. Darüber hinaus begünstigen die Druck- und Konzentrationsgradienten während der ICV-Infusion den direkten Transport der Tracer durch die Ependymschicht13,14,15, wodurch diese Tracer als Marker für die Abfallbeseitigung genutzt werden können (Abbildung 4).

Mehrere technische Details sind entscheidend für reproduzierbare Ergebnisse. Eine genaue Nivellierung des Schädels ist unerlässlich, um den Seitenventrikel konsistent anzusteuern, da die Toleranz bei der Kanülenplatzierung aufgrund der geringen Größe des Ventrikels sehr klein ist. Ebenso wichtig ist der Aufbau einer verstopfungs- und leckagefreien Infusionsleitung. Luftblasen oder teilweise Verstopfungen können das Infusionsprofil verändern und die Interpretation der Kinetik in der frühen Phase beeinträchtigen; im schlimmsten Fall kann eine große Blase die Leitung vollständig blockieren und so zum Scheitern des Experiments führen. Zu den häufigen Problemen während der MRT-Installation gehören Leckagen an der Verbindung zwischen Spritze und Nadel, die durch PTFE-Gewindedichtband vermieden werden können, sowie Zugbelastung der Infusionsleitung beim Einsetzen der Halterung, die durch Befestigung der Schläuche an der Halterung verhindert werden kann, um Ziehen oder Knicken zu vermeiden.

Die hier angegebenen Zielkoordinaten und Einfügetiefen wurden für 12 Wochen alte Wistar-Ratten optimiert und erfordern möglicherweise Anpassungen bei anderen Altersstufen und Stämmen. Die intrazerebroventrikuläre Infusion kann an Mäusen durchgeführt werden, wobei entsprechende Modifikationen aufgrund des geringeren Körpergewichts und der kleineren Ventrikelgröße erforderlich sind15. Die Infusionsgeschwindigkeit und das Gesamtvolumen können entsprechend den physikochemischen Eigenschaften des Tracers angepasst werden, einschließlich der Molekülgröße und der Relaxivität; aufgrund des geringen Volumens der Ventrikelräume sollten jedoch höhere Infusionsraten mit Vorsicht eingesetzt werden, da sie den Ventrikeldruck erheblich erhöhen können. Zusätzlich bietet die in der vorliegenden Studie verwendete Kupferkanüle die notwendige Spaltfestigkeit, um die Dura zu durchdringen und das Parenchym in einem einzigen, geraden Durchgang zu passieren. Ihre duktilen Eigenschaften ermöglichen zudem eine einfache Biegung, was bei platzbeschränkten Spulenanordnungen vorteilhaft ist18. Die durch Hochfrequenz induzierte Erwärmung ist aufgrund der kurzen eingebetteten Länge der Kanüle minimal. Allerdings kann eine übermäßige Degradation von Kupfer freie Kupferionen freisetzen, die zu Neurotoxizität führen; daher ist eine Kupferkanüle vermutlich für eine chronische Implantation ungeeignet. Bei Spulenanordnungen, die eine hervorstehende Kanüle zulassen, bieten Silica- oder PEEK-Katheter ausreichende mechanische Festigkeit für die Insertion und vermeiden gleichzeitig diese Toxizitätsprobleme14,19,20.

Das hier verwendete Kontrastmittel (Gd-DOTA) hat ein Molekulargewicht von 558,65 Da, was um ein Vielfaches höher liegt als das endogener metabolischer Lösungsmittel wie Lactat (90 Da) und Glukose (180 Da), jedoch deutlich niedriger als das größere, proteinbasierte Aggregate, die bei Neurodegeneration von Interesse sind, wie Amyloid-β-Monomere (~4,5 kDa) oder Tau (~45–65 kDa). Dies macht Gd-haltige Kontrastmittel zu geeigneten Stellvertretern für die Clearance-Kinetik kleiner Moleküle, jedoch sollten die Ergebnisse nicht direkt auf die Clearance größerer makromolekularer Lösungsmittel übertragen werden. Außerdem können die Ergebnisse aufgrund der Tatsache, dass AQP4-Wasserkanäle für Gd-haltige Kontrastmittel undurchlässig sind, nicht direkt auf den durch AQP4 vermittelten Austausch zwischen Zerebrospinalflüssigkeit und Interstitieller Flüssigkeit übertragen werden.

In der vorliegenden Studie folgte unmittelbar nach dem Kanülierungsverfahren eine Bildgebungssitzung, um die Durchführbarkeit zu demonstrieren. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Implantation einer Kanüle eine entzündliche Reaktion hervorrufen kann, welche die Glymphatikfunktion unterdrücken kann13, und dass eine Wartezeit von 24 Stunden erforderlich wäre, um die Wiederherstellung der Glymphatikfunktion auf Basisniveau zu ermöglichen21. Forschende sollten diesen Faktor berücksichtigen, wenn sie Studien entwerfen, die darauf abzielen, die Glymphatikfunktion zu untersuchen. Darüber hinaus wurde in einer früheren Studie berichtet, dass der Zufluss von Zerebrospinalflüssigkeit unter Ketamin/Xylazin-Anästhesie höher ist als unter Isofluran-Anästhesie18. Demzufolge verwendet das vorliegende Protokoll Ketamin/Xylazin zur initialen Einleitung. Eine einzelne Dosis von Ketamin/Xylazin reicht jedoch nicht aus, um über die gesamte Dauer des kombinierten Kanülierungs- und Bildgebungsprotokolls eine stabile Anästhesie aufrechtzuerhalten. Das hier verwendete Anästhesieregime wurde aus einer früheren Studie übernommen, in der Dexmedetomidin in Kombination mit niedrig dosiertem Isofluran eingesetzt wurde22. Es stellt einen Kompromiss dar zwischen der Aufrechterhaltung physiologischer Stabilität über ein längeres Protokoll hinweg und der Minimierung anästhesiebedingter Hemmung der Glymphatikfunktion.

Trotz der Vorteile hat die intrazerebroventrikuläre (ICV) Infusion einige Einschränkungen. Aufgrund des geringen Volumens der Liquorzerebrospinalis im Schädel (~300 µL)23 kann nur ein begrenztes Volumen an Tracern infundiert werden. Außerdem entspricht die Infusionsrate (1 µL/min) in etwa der Liquorproduktionsrate (~1,6 µL/min)23,24; daher ist während der Infusion mit einem vorübergehenden Anstieg des ventrikulären Drucks zu rechnen. Eine Verringerung des Infusionsvolumens oder der Infusionsrate könnte dieses Problem teilweise abschwächen; ein geringeres Tracervolumen könnte jedoch die Nachweisempfindlichkeit beeinträchtigen, während eine langsamere Infusionsrate die gesamte Infusionsdauer verlängert, ohne den Druckanstieg vollständig zu reduzieren. Daher ist bei der Interpretation der Tracertransportdynamik während der Infusionsphase Vorsicht geboten, auch wenn diese Einschränkung eine zuverlässige Charakterisierung der anschließenden Verteilungs- und Clearance-Phasen nicht ausschließt. Insgesamt bietet dieses MRT-kompatible ICV-Infusionsprotokoll eine praktische und anpassungsfähige Plattform, um den gesamten Zeitverlauf des Liquor-Tracertransports in vivo zu erfassen und eröffnet neue Ansätze zur Untersuchung der Liquordynamik, des Löslichkeitsabbaus und deren Störungen bei Erkrankungen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health unter den Fördernummern R01NS124206 und RF1AG094791 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht zwangsläufig die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Abbildung 4 wurde mit BioRender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
30 G × 1 in. Einweg-Hypodermikanadel mit KunststoffhubExel26439
50 µL, gastight Spritze, Luer-Spitze (LT)Hamilton80901
Anatomische schmale PinzetteFine Science Tools11003-12
Künstliches CSFTOCRIS3525
Attane Isofluran 1000 mg/gScanVet55226
Kupfer-Kapillarrohr, 0,32 mm Außendurchmesser × 0,16 mm InnendurchmesserNippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd.C1220-11-109
Kupfer-ClipIEUYOFEBA 1801
WattestäbchenPuritan868-WCS
Dotarem (Gadoterat-Meglumin) Injektionslösung, 0,5 mmol/mLGuerbetNDC 67684-2001-1
BohrmaschineForedomModel SR
BohrerFine Science Tools19007-05
BohrerhalterStoelting51630
Dumont-medizinische PinzetteFine Science Tools11252-00, 11253-20
AugensalbeRugbyNDC 0536
E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic SystemE-Z SystemsEZ-7000
Graefe-PinzetteFine Science Tools11052-10,11152-10
HeizplatteBraintree Scientific5381
Kit für Hochtemperatur-KauterFine Science Tools18010-00
Ketaminol Vet 100 mg/mL (Ketamin)Intervet International BV511519
KWIK-SIL Silikonkleber, geringe Toxizität, KitWorld Precision InstrumentsKWIK-SIL
Nadel 5/8 in., Einweg, steril, 26 GBD305115
Polyethylen-Schlauch, 0,61 mm Außendurchmesser × 0,28 mm InnendurchmesserScandidactSKU252
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Referenzen

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