Ein kombiniertes Serum-Biomarker-Panel zur diagnostischen und prognostischen Bewertung beim Ösophagusplattenepithelkarzinom

Zusammenfassung

Diese Studie stellt einen zwei Zentren umfassenden ambispektiven Workflow zur Messung des serumgebundenen karzinoembryonalen Antigens, des Plattenepithelkarzinom-Antigens und des Kohlenhydrat-Antigens 125 sowie zur Validierung ihres kombinierten diagnostischen und prognostischen Werts beim ösophagealen Plattenepithelkarzinom vor.

Zusammenfassung

​Das ösophageale Plattenepithelkarzinom ist weiterhin schwierig, frühzeitig zu diagnostizieren und vor der Behandlung präzise einzustufen. Die konventionelle Tumor-Node-Metastase-Stadieneinteilung liefert wesentliche anatomische Informationen, spiegelt jedoch die zirkulierende biologische Heterogenität nicht vollständig wider. Diese zweizentrische, ambispektive Beobachtungsstudie entwickelte und validierte extern ein kombiniertes Serum-Biomarker-Panels, das das karzinoembryonale Antigen, das Plattenepithelkarzinom-Antigen und das Kohlenhydrat-Antigen 125 zur diagnostischen Differenzierung und prognostischen Risikobewertung beim ösophagealen Plattenepithelkarzinom umfasst. Insgesamt wurden 277 Probanden aus einem Tertiary Hospital und einem kommunalen Gesundheitszentrum rekrutiert, darunter 167 Patienten mit ösophagealem Plattenepithelkarzinom, 55 Patienten mit benignen ösophagealen Erkrankungen und 55 gesunde Kontrollpersonen. Die Kohorte des Tertiary Hospitals diente der Modellentwicklung und internen Validierung, während die Kohorte des kommunalen Zentrums zur externen Validierung herangezogen wurde. Vor der Behandlung wurden die Serum-Biomarker vor der initialen Therapie gemessen, logarithmisch transformiert, anhand der Parameter der Trainingskohorte standardisiert und in diagnostische logistische Regressionsmodelle sowie prognostische Cox-Regressionsmodelle mit proportionalen Hazards eingegeben. Das kombinierte Panel zeigte eine höhere diagnostische Trennschärfe als jeder einzelne Marker, mit einer Fläche unter der ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic) von 0,869 in der Trainingskohorte und 0,842 in der externen Validierungskohorte. Ein höherer kombinierter Biomarker-Burden war assoziiert mit einer Tumorlänge von mindestens 5 cm, einem pT3–4-Befund, Lymphknotenmetastasen und einer Tumor-Node-Metastase-Stadieneinteilung im Stadium III–IV. In der Überlebensanalyse prognostizierte ein hoher kombinierter Biomarker-Burden unabhängig von den wichtigsten klinisch-pathologischen Faktoren ein schlechteres Gesamtüberleben und progressionsfreies Überleben. Das integrierte prognostische Modell, das den Biomarker-Burden mit klinisch-pathologischen Variablen kombiniert, schnitt besser ab als die Tumor-Node-Metastase-Stadieneinteilung allein, mit einem C-Index von 0,792 in der Trainingskohorte und 0,761 in der externen Validierung. Diese Ergebnisse untermauern die Verwendung des Serum-Panels aus karzinoembryonalem Antigen, Plattenepithelkarzinom-Antigen und Kohlenhydrat-Antigen 125 als praktische, nichtinvasive Ergänzung zur Beurteilung vor der Behandlung und zur individualisierten Risikostratifizierung beim ösophagealen Plattenepithelkarzinom.

Einleitung

Das ösophageale Plattenepithelkarzinom ist ein bedeutender histologischer Subtyp des Ösophaguskarzinoms und stellt insbesondere in China in Ostasien weiterhin eine erhebliche klinische Belastung dar¹. Obwohl die endoskopische Diagnose, die bildgebende Beurteilung, die Chirurgie, die Radiochemotherapie und die systemische Therapie das klinische Management verbessert haben, bleibt die Prognose für viele Patienten unbefriedigend². Ein wichtiger Grund hierfür ist, dass die Erkrankung häufig erst nach lokaler Invasion oder lymphogener Streuung diagnostiziert wird³. Ein weiterer Grund liegt darin, dass Patienten mit dem gleichen Tumor-Node-Metastasen-Stadium dennoch in der Therapieantwort, dem Rezidivrisiko und dem Überlebensverlauf variieren können⁴. Diese Unterschiede zeigen, dass die alleinige anatomische Stadieneinteilung die biologische Variabilität des ösophagealen Plattenepithelkarzinoms nicht vollständig beschreiben kann.

Die aktuelle klinische Beurteilung stützt sich hauptsächlich auf Endoskopie mit Biopsie, radiologische Stadieneinteilung und die pathologische Beurteilung nach der Operation. Diese Methoden sind unverzichtbar, weisen jedoch Grenzen auf, wenn sie für wiederholte Überwachungen, die Abschätzung des Therapierisikos vor Behandlungsbeginn oder umfassende Screenings eingesetzt werden. Die Endoskopie ist invasiv und weniger geeignet für häufige Nachuntersuchungen, während die Computertomographie und die endosonographische Untersuchung subtile Invasionen oder kleine metastatische Läsionen übersehen können⁵. Bildbasierte und molekulare prognostische Modelle haben die Risikovorhersage beim Plattenepithelkarzinom des Ösophagus verbessert, doch viele erfordern spezialisierte Plattformen, die Nachbearbeitung von Bildern, die Sequenzierung von Gewebeproben oder rechnergestützte Analysen, die nicht in allen klinischen Laboren routinemäßig verfügbar sind^6,7. Ein kostengünstiger und wiederholbarer, auf Blutproben basierender Ansatz könnte daher nützliche zusätzliche Informationen liefern, insbesondere wenn Ärzte vor der definitiven Therapie eine Risikostratifizierung vor der Behandlung benötigen.

Serumtumormarker sind in diesem Kontext attraktiv, da sie routinemäßig verfügbar, minimalinvasiv und leicht wiederholbar sind. Das karzinoembryonale Antigen spiegelt die Tumormasse und eine abnorme zelluläre Differenzierung wider, während das Plattenepithelkarzinom-Antigen enger mit der malignen Transformation des Plattenepithels assoziiert ist⁸. Das Kohlenhydrat-Antigen 125 wurde mit systemischer entzündlicher Aktivität, Beteiligung des Serums und Krankheitsprogression bei mehreren Malignitäten in Verbindung gebracht⁹. Diese Marker repräsentieren nicht dasselbe biologische Signal. Stattdessen erfassen sie möglicherweise sich überlappende, aber unterschiedliche Dimensionen der Tumormasse, des Plattenepithel-Phänotyps, der systemischen Antwort und der Wechselwirkung zwischen Wirt und Tumor. Aus diesem Grund kann ein kombiniertes Markerpanel besser abschneiden als ein einzelner Marker, wenn das Ziel darin besteht, ein ösophagales Plattenepithelkarzinom zu identifizieren und das klinische Risiko abzuschätzen¹⁰.

Frühere Studien haben Serum-Tumormarker, entzündliche Indikatoren, bildgebende Merkmale, molekulare Profile und zusammengesetzte prognostische Modelle beim ösophagealen Plattenepithelkarzinom und verwandten gastrointestinalen Krebserkrankungen evaluiert^11,12. Viele veröffentlichte Modelle konzentrieren sich jedoch entweder auf die Diagnose oder die Prognose, verwenden Einzelzentren-Kohorten, weisen keine unabhängige externe Validierung auf oder liefern nur begrenzte Angaben zu Marker-Transformation, Cut-off-Auswahl, Kalibrierung und Reproduzierbarkeit des Modells. Die Neuheit der vorliegenden Studie liegt in der Entwicklung eines praktischen Serum-Panel mit drei Markern, das routinemäßig gemessene Parameter – carcinoembryonales Antigen, Plattenepithelkarzinom-Antigen und Kohlenhydrat-Antigen 125 – nutzt, um sowohl die diagnostische Differenzierung als auch die prognostische Risikostratifizierung innerhalb eines einzigen zweizentrischen Workflows zu unterstützen. Das Modell wurde an einer Kohorte eines tertiären Krankenhauses entwickelt und anschließend ohne erneute Optimierung an einer unabhängigen Kohorte eines Versorgungszentrums getestet, wodurch die Stabilität in unterschiedlichen klinischen Settings bewertet werden konnte.

Diese Studie entwickelte und validierte ein kombiniertes Serum-Biomarker-Panel, das auf dem carcinoembryonalen Antigen, dem Antigen des Plattenepithelkarzinoms und dem Kohlenhydrat-Antigen 125 basiert. Die Analyse verfolgte zwei miteinander verknüpfte Zielsetzungen. Erstens sollte geprüft werden, ob das kombinierte Panel die diagnostische Unterscheidung zwischen ösophagealem Plattenepithelkarzinom und nicht-malignen Kontrollen im Vergleich zu einzelnen Serummarkern verbesserte. Zweitens sollte ermittelt werden, ob die vor der Behandlung bestehende Belastung mit kombinierten Biomarkern zusätzliche prognostische Informationen jenseits herkömmlicher klinisch-pathologischer Variablen und des Tumor-Node-Metastasen-Stadiums lieferte. Durch diese Struktur konnte die Studie beurteilen, ob ein routinemäßig verfügbares Serum-Biomarker-Panel als nichtinvasive Ergänzung zur pathologischen Diagnose, bildgebenden Beurteilung und anatomischen Stadieneinteilung bei der prätherapeutischen klinischen Evaluation dienen kann.

Protokoll

Diese Studie an menschlichen Probanden, klinischen Aufzeichnungen und Serumperlen wurde gemäß der Deklaration von Helsinki und den institutionellen Anforderungen für die Forschung am Menschen durchgeführt¹³. Das Studienprotokoll wurde von der Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine unter der Genehmigungsnummer CJ28J12-45 geprüft und genehmigt. Für retrospektiv erhobene anonymisierte klinische Daten und Restserumproben wurde die Anforderung einer zusätzlichen schriftlichen informierten Einwilligung gemäß den ethischen Richtlinien der Institution aufgehoben. Für prospektiv gesammelte Proben wurde vor der Einbindung eine schriftliche informierte Einwilligung eingeholt. Alle Teilnehmerinformationen und Serumproben wurden vor der Analyse anonymisiert. Studienkennungen dienten der Datenverknüpfung, und keine personenbezogenen Identifikationsmerkmale waren im Analyse-Datensatz enthalten.

Studiendesign und Kohortenzuordnung

Diese zweizentrische ambispektive Beobachtungsstudie untersuchte den diagnostischen und prognostischen Wert eines kombinierten Serum-Biomarker-Panels, das das karzinoembryonale Antigen (CEA), das Plattenepithelkarzinom-Antigen (SCC-Ag) und das Kohlenhydrat-Antigen 125 (CA125) für das ösophageale Plattenepithelkarzinom (ESCC) umfasst. Retrospektive Daten wurden aus geeigneten klinischen Befunden und verbliebenen Serumproben vor der Behandlung gewonnen, und eine prospektive Rekrutierung diente der Sammlung zusätzlicher Serumproben vor der Behandlung sowie der Durchführung der Nachbeobachtung im selben Studienrahmen. Die Teilnehmer wurden von einem tertiären Krankenhaus und einem kommunalen Gesundheitszentrum zwischen Januar 2021 und Dezember 2024 rekrutiert, wobei die Nachbeobachtung bis zum 31. Dezember 2025 fortgesetzt wurde. Zentrum A war das tertiäre Krankenhaus und diente als Trainingskohorte für die Modellentwicklung, Schätzung der Koeffizienten, Auswahl der Cutoff-Werte und interne Validierung. Zentrum B war das kommunale Gesundheitszentrum und fungierte als externe Validierungskohorte. Die Studie wurde gemäß den Richtlinien für die transparente Berichterstattung über multivariable Vorhersagemodelle für individuelle Prognose oder Diagnose (TRIPOD) berichtet¹⁴.

Insgesamt wurden 277 Teilnehmer eingeschlossen, darunter 194 aus Zentrum A und 83 aus Zentrum B. Der Trainingskohorte gehörten 114 Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC), 40 Kontrollen mit benignen ösophagealen Erkrankungen und 40 gesunde Kontrollen an. Die externe Validierungskohorte umfasste 53 Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC), 15 Kontrollen mit benignen ösophagealen Erkrankungen und 15 gesunde Kontrollen. Zur Minimierung von Informationslecks und zur Prüfung der Modellstabilität in einem unabhängigen klinischen Umfeld erfolgte die zentrumsbasierte Zuordnung anstelle einer zufälligen Aufteilung. In der diagnostischen Analyse wurden die Serumspiegel von CEA, SCC-Ag und CA125 bei Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC), bei Patienten mit benignen ösophagealen Erkrankungen sowie bei gesunden Kontrollen verglichen. Die prognostische Analyse beschränkte sich auf Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC) und untersuchte, ob die kombinierte Belastung durch Biomarker die Risikostratifizierung für das Gesamtüberleben (OS) und das progressionsfreie Überleben (PFS) verbesserte. Das Studiendesign, die Teilnehmerrekrutierung, die Kohortenzuordnung, der Workflow zur Analyse der serumbasierten Biomarker, die Entwicklung des diagnostischen Modells, die externe Validierung sowie der Vergleich der prognostischen Modelle sind in Abbildung 1 zusammengefasst.

Der Teilnehmerfluss umfasste die Einschreibung, Ausschlüsse, die diagnostische Gruppierung und die zentrumsbasierte Zuordnung. Insgesamt wurden 326 Personen untersucht. 49 Personen wurden ausgeschlossen, darunter 12 mit einer antitumoralen Therapie vor der Blutentnahme, 8 mit einem weiteren primären Malignom, 9 mit schwerer Infektion, Autoimmunerkrankung oder unkontrollierten Komorbiditäten, die wahrscheinlich die serumgebundenen Tumormarker beeinflusst hätten, 11 mit Hämolyse, Lipämie, ikterischer Interferenz, unzureichendem Serumvolumen oder verlängertem Verarbeitungsintervall sowie 9 mit fehlenden wichtigen klinischen, pathologischen oder Nachsorge-Daten. Die endgültige analytische Studienpopulation umfasste 277 Teilnehmer: 167 ESCC-Patienten, 55 Kontrollpersonen mit benignen Speiseröhrenerkrankungen und 55 gesunde Kontrollpersonen.

Begründung zur Stichprobengröße

Die Stichprobengröße wurde anhand der konsekutiven Verfügbarkeit geeigneter Teilnehmer, Vorbehandlungs-Serumproben und Nachverfolgungsinformationen während des vorgegebenen Studienzeitraums bestimmt. Das diagnostische Modell verwendete drei kontinuierliche Serum-Biomarker als Kandidaten-Prädiktoren. In der Trainingskohorte standen 114 ESCC-Fälle und 80 Nicht-ESCC-Kontrollen zur Verfügung, was 38,0 ESCC-Fällen und 26,7 Nicht-ESCC-Kontrollen pro Kandidaten-Biomarker-Prädiktor entspricht. Dies unterstützte eine logistische Regression mit geringer Dimensionalität und verringerte das Überanpassungsrisiko. Die externe Validierungskohorte umfasste 53 ESCC-Fälle und 30 Nicht-ESCC-Kontrollen und wurde ausschließlich zur Validierung verwendet, ohne dass die Koeffizienten neu geschätzt wurden. Die Begründung der Stichprobengröße orientierte sich an aktuellen Grundsätzen für Vorhersagemodelle, die auf der Häufigkeit des Endpunkts, der Anzahl der Kandidaten-Prädiktorparameter, der erwarteten Modellleistung und einer unabhängigen Validierung basieren, anstatt auf zufälliger Datenaufteilung¹⁵.

Rekrutierung der Teilnehmer, Eignungskriterien und Datenerhebung

Die Teilnehmer wurden kontinuierlich während des Studienzeitraums rekrutiert. In Zentrum A wurden ESCC-Patienten aus den Abteilungen Thoraxchirurgie, Gastroenterologie und Onkologie rekrutiert. In Zentrum B wurden ESCC-Patienten über screeningsbasierte Programme in der Gemeinschaft, Nachsorgeakten oder Überweisungswegen identifiziert und nur dann eingeschlossen, wenn eine histopathologische Bestätigung und vorbehandlungsbedingte Serumproben vorlagen. Kontrollpersonen mit benignen Speiseröhrenerkrankungen wurden aus Personen rekrutiert, die eine Gastroskopie wegen Dysphagie, Refluxsymptomen oder Verdacht auf Speiseröhrenveränderungen durchlaufen hatten und nicht-maligne pathologische Befunde aufwiesen. Gesunde Kontrollpersonen wurden aus Routine-Gesundheitsuntersuchungen im gleichen Zeitraum ausgewählt und wiesen keine Vorgeschichte von Malignitäten, aktiven Infektionen, schweren Leber- oder Nierenfunktionsstörungen oder bildgebenden/endoskopischen Hinweisen auf raumfordernde Läsionen der Speiseröhre auf.

ESCC-Patienten waren berechtigt, wenn bei ihnen ein primäres Ösophaguskarzinom durch eine gastroskopische Biopsie oder postoperative Pathologie bestätigt wurde, sie vor der Blutentnahme keine antitumorale Therapie erhalten hatten und vollständige klinische Basisdaten, pathologische Befunde sowie vorbehandlungsbezogene Serumproben vorlagen. Teilnehmer wurden ausgeschlossen, wenn sie ein anderes primäres Malignom aufwiesen, zuvor eine antitumorale Therapie vor der Blutentnahme erhalten hatten, eine schwere akute Infektion, eine aktive Autoimmunerkrankung, nicht kontrollierte Komorbiditäten mit wahrscheinlichem Einfluss auf die Serumtumormarkerwerte, sichtbare Hämolyse, Lipämie, ikterische Interferenz, unzureichendes Serumvolumen, fehlende wichtige klinische Variablen oder keine verfügbaren Nachsagedaten hatten. Die prognostische Analyse beschränkte sich auf ESCC-Patienten mit verfügbarer Tumor-Node-Metastase-(TNM-)Stadieneinteilung und messbaren Überlebens- oder Progressionsendpunkten. Patienten mit einer Nachsorge von weniger als 6 Monaten wurden einbezogen, wenn innerhalb dieses Zeitraums ein Tod oder ein Progress auftrat.

Zu den Basisvariablen gehörten Alter, Geschlecht, Rauchgeschichte, Alkoholkonsumgeschichte, Body-Mass-Index, Studienzentrum, Diagnosegruppe, Läsionstyp sowie die Serumspiegel von CEA, SCC-Ag und CA125. Bei Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC) wurden zusätzliche Variablen erfasst, darunter Tumorlokalisation, Tumorlänge, histologische Differenzierung, Invasions Tiefe, Lymphknotenstatus, TNM-Stadium, lymphovaskuläre Invasion, initiale Behandlungsmodalität, Rezidiv, Progression, Überlebensstatus und Datum der letzten Nachuntersuchung. Die Rauchgeschichte wurde definiert als gegenwärtiges Rauchen oder früheres regelmäßiges Rauchen von mindestens 100 Zigaretten im Laufe des Lebens. Die Alkoholkonsumgeschichte wurde definiert als Alkoholkonsum von mindestens einmal pro Woche über einen Zeitraum von mehr als sechs Monaten. Die TNM-Klassifikation erfolgte gemäß der achten Auflage des Stadiensystems des American Joint Committee on Cancer/Union for International Cancer Control für Ösophaguskarzinom¹⁶. Pathologische Präparate von Fällen mit Ösophaguskarzinom (ESCC) und benignen Läsionen wurden unabhängig voneinander von zwei erfahrenen Pathologen überprüft, wobei bei Uneinigkeiten ein dritter Pathologe zur Konsensfindung hinzugezogen wurde.

Zwei geschulte Forscher extrahierten unabhängig voneinander klinische Informationen aus elektronischen Patientenakten, pathologischen Befunden, Labordaten, Behandlungsunterlagen, Nachsorgeakten und Sterberegistern mithilfe eines vorab festgelegten Datenwörterbuchs. Unstimmigkeiten wurden durch Überprüfung der Originaldokumente geklärt, wobei ein dritter Forscher bei Bedarf die endgültige Entscheidung traf. Die Tumoralokalisation wurde in obere, mittlere oder untere Speiseröhre unterteilt. Die histologische Differenzierung wurde als gut, mäßig oder schlecht differenziert klassifiziert. Die Einheiten für kontinuierliche Variablen wurden vor der Analyse in beiden teilnehmenden Zentren standardisiert.

Blutentnahme, Serumverarbeitung und Biomarkerbestimmung

Alle Blutproben wurden vor der initialen Behandlung, innerhalb von 7 Tagen nach der pathologischen Bestätigung und mindestens 3 Tage vor Therapiebeginn entnommen. Zwischen 7:00 Uhr und 9:00 Uhr morgens wurden periphere venöse Blutproben von 5–8 mL nach einer nächtlichen Fastenphase unter Verwendung von Röhrchen mit Serumtrenngel entnommen. Die Probenentnahme wurde verschoben, wenn der Teilnehmer innerhalb von 72 Stunden vor der Entnahme eine Bluttransfusion, eine Albumininfusion mit großem Volumen oder ein invasives Verfahren erhalten hatte. Die Proben durften 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen und wurden anschließend 10 Minuten lang bei 1.500 × g zentrifugiert. Das Serum wurde abgetrennt und in 3–5 mit Barcode beschriftete Röhrchen portioniert, wobei jede Portion 300–500 µL enthielt. Die Aliquote wurden bis zur Analyse bei −80 °C gelagert, wobei kein Aliquot mehr als einem Einfrier- und Auftauzyklus unterzogen wurde. Proben mit sichtbarer Hämolyse, Lipämie, ikterischer Störung, unzureichendem Volumen oder einer Zeitspanne zwischen Probenentnahme und Einfrieren von mehr als 2 Stunden wurden ausgeschlossen.

Serum-CEA, SCC-Ag und CA125 wurden mithilfe automatisierter chemilumineszenter Immunassay-Systeme gemäß den Herstelleranweisungen bestimmt. Serumproben wurden vor der Analyse bei 4 °C aufgetaut, vorsichtig gemischt und nach Möglichkeit in einem einzigen Durchgang analysiert. Falls eine Batch-Analyse erforderlich war, wurde die Reihenfolge der Proben so organisiert, dass keine systematische Gruppierung nach Erkrankungsstatus, Zentrum, pathologischem Stadium oder Follow-up-Ergebnis vorlag. Proben, deren Werte über dem analytischen Messbereich lagen, wurden gemäß den Reagenzianweisungen verdünnt und erneut getestet. Das Laborpersonal war unkenntlich gegenüber der Zugehörigkeit der Teilnehmergruppe, dem pathologischen Stadium, dem Behandlungsstatus und dem Follow-up-Ergebnis.

Die klinischen Schwellenwerte betrugen 5,0 ng/mL für CEA, 1,5 ng/mL für SCC-Ag und 35 U/mL für CA125, basierend auf lokalen Laborstandards und den Referenzintervallen der Hersteller. Diese Schwellenwerte wurden verwendet, um die Markererhöhung und eine hohe kombinierte Biomarkerlast für assoziationsanalytische Untersuchungen bezüglich klinisch-pathologischer Parameter sowie für die Überlebensstratifizierung zu definieren. Für die diagnostische Klassifizierung wurden datenbasierte Cutoffs ausschließlich im Trainingskollektiv anhand des Youden-Index ausgewählt und anschließend unverändert auf die externe Validierungskohorte angewandt. Vor der Durchführung der Tests erfolgten die Kalibrierung des Instruments und die interne Qualitätskontrolle. Hoch- und niedrigkonzentrierte Kontrollen wurden an jedem Testtag mitgeprüft, und die Tests wurden nur durchgeführt, wenn die Ergebnisse der Qualitätskontrolle innerhalb des akzeptierten Bereichs lagen.

Die Zwischenanalysen- und Zwischenzentren-Reproduzierbarkeit wurde vor der endgültigen Modellanalyse anhand verblindeter Überbrückungs-Serumaliquots und routinemäßiger Qualitätskontrollmaterialien beurteilt. Ein Überbrückungssatz aus 30 verblindeten Serumaliquots wurde in beiden Laborabläufen getestet. Die Zwischenzentren-Variationskoeffizienten betrugen 4,8 % für CEA, 5,6 % für SCC-Ag und 5,1 % für CA125. Die entsprechenden Intraklassen-Korrelationskoeffizienten lagen bei 0,94 für CEA, 0,92 für SCC-Ag und 0,93 für CA125. Es erfolgte keine zenterspezifische Nachkalibrierung der Assays, da keine systematischen Abweichungen den vorab definierten Bereich der laborinternen Qualitätskontrolle überschritten. Die endgültigen Biomarkerwerte wurden vor der Modellerstellung durch Einheitenstandardisierung und statistische Standardisierung basierend auf der Trainingskohorte harmonisiert.

Kombinierte Biomarker-Definition und Modellkonstruktion

Das kombinierte Panel aus Serum-Biomarkern bestand aus CEA, SCC-Ag und CA125. Für die Analyse der klinisch-pathologischen Assoziationen und die Kaplan-Meier-Überlebensstratifizierung wurde jeder Marker entsprechend der vordefinierten klinischen Schwelle als erhöht oder nicht erhöht klassifiziert. Ein hoher kombinierter Biomarker-Belastungswert wurde definiert als Erhöhung von mindestens zwei der drei Marker. Für die diagnostische und prognostische Modellierung wurden die drei Biomarker als kontinuierliche Variablen beibehalten, mittels des natürlichen Logarithmus transformiert und mit Hilfe des Mittelwerts und der Standardabweichung aus der Trainingskohorte standardisiert. Die gleichen Transformationsparameter wurden auf die externe Validierungskohorte angewandt.

Die standardisierten log-transformierten Biomarker wurden anhand der folgenden Parameter der Trainingskohorte berechnet:

zlnCEA = (lnCEA - 1,42)/0,71

zlnSCC - Ag = (lnSCC - Ag - 0,28)/0,57

zlnCA125 = (lnCA125 - 3,05)/0,62

Die kombinierte diagnostische Panel wurde mittels multivariater logistischer Regression in der Trainingskohorte erstellt. Der diagnostische lineare Prädiktor wurde wie folgt berechnet:

LPdiagnostic = -0,46 + 0,59 × zlnCEA + 1,05 × zlnSCC - Ag+0,42 × zlnCA125

Die individuelle vorhergesagte Wahrscheinlichkeit von ESCC wurde wie folgt berechnet:

PESCC = 1/1+exp(-LPdiagnostic)

Die optimale diagnostische Grenze für das kombinierte Panel betrug 0,57, ausgewählt in der Trainingskohorte anhand des Youden-Index und unverändert in der externen Validierung angewandt.

Die prognostische Biomarker-Score wurde mithilfe einer Cox-Proportionalitäts-Modellierung konstruiert. Als Vergleichsmodell für die anatomische Stadieneinteilung diente das alleinige TNM-Stadium-Modell. Das Biomarker-Modell verwendete die kombinierte Biomarker-Belastung. Das klinisch-pathologische Modell umfasste Alter, Tumorlänge, histologische Differenzierung, pT-Stadium, Lymphknotenstatus und initiale Behandlungsmodalität. Dem klinisch-pathologischen Modell wurde im integrierten Modell eine hohe kombinierte Biomarker-Belastung hinzugefügt. Für das OS wurde der integrierte prognostische lineare Prädiktor wie folgt berechnet:

LPOS = 0.33 × Alter ≥65 Jahre + 0,36 × Tumorlänge ≥5 cm + 0,25 × schlechte Differenzierung + 0,31 × pT3

- 4-Stadium + 0,66 × Lymphknotenmetastase

-0,58 × Radikaloperation - basierende Behandlung

+0,81 × highcombinedbiomarkerburden

Für PFS wurde der integrierte prognostische lineare Prädiktor wie folgt berechnet:

LPPFS = 0,27 × Alter ≥ 65 Jahre + 0,31 × Tumorlänge ≥ 5 cm  + 0,24 × schlechte Differenzierung + 0,25 × pT3

-4. Stadium + 0,55 × Lymphknotenmetastase

– 0,46 × Radikaloperation – basierende Behandlung

+0,71 × hohe kombinierte Biomarkerlast

Alle binären Variablen in den prognostischen Gleichungen wurden mit 1 kodiert, wenn vorhanden, und mit 0, wenn nicht vorhanden. Alle Koeffizienten, Standardisierungsparameter und Schwellenwerte wurden anhand der Trainingskohorte geschätzt und ohne erneute Optimierung direkt auf die externe Validierungskohorte angewandt.

Diagnostische und prognostische Endpunkte

Die pathologische Diagnose wurde als diagnostischer Referenzstandard verwendet. Der primäre diagnostische Endpunkt war die Unterscheidung zwischen ESCC und Nicht-ESCC-Kontrollen, einschließlich benigner Speiseröhrenerkrankungen und gesunder Kontrollen. Zu den sekundären diagnostischen Endpunkten gehörten die Unterscheidung zwischen ESCC und benigner Speiseröhrenerkrankung, ESCC und gesunden Kontrollen sowie zwischen frühen ESCC-Stadien und nicht malignen Kontrollen. Frühe ESCC-Stadien wurden als TNM-Stadium I–II definiert. Die diagnostische Leistung wurde anhand von Receiver-Operating-Characteristic-Kurven, Fläche unter der Kurve, Sensitivität, Spezifität, positivem Vorhersagewert, negativem Vorhersagewert, Genauigkeit, F1-Score, Precision-Recall-Kurven, Kalibrationskurven, Brier-Scores, Kalibrationsintercepts, Kalibrierungssteigungen und der Entscheidungskurvenanalyse bewertet.

Die prognostische Analyse wurde ausschließlich bei Patienten mit Ösophagus-Plattenepithelkarzinom (ESCC) durchgeführt. Der primäre prognostische Endpunkt war das Gesamtüberleben (OS), definiert als der Zeitraum vom Datum der ersten definitiven antitumoralen Behandlung bis zum Tod aus beliebiger Ursache. Der sekundäre prognostische Endpunkt war das progressionsfreie Überleben (PFS), definiert als der Zeitraum von der Erstbehandlung bis zur dokumentierten Krankheitsprogression, Rezidiv oder dem Tod. Bei Patienten, die einer kurativen Operation unterzogen wurden, galt ein lokales Rezidiv, eine Fernmetastasierung oder ein tumorbedingter Tod als PFS-Ereignis, sofern nach der Operation kein Residualläsion vorhanden war. Bei Patienten, die eine definitive Radiochemotherapie oder eine palliative Behandlung erhielten, wurde die Progression anhand bildgebender Verfahren, endoskopischer Beurteilung und klinischer Evaluation festgestellt.

Nachsagedaten wurden durch ambulante Besuche, Krankenhausaufenthaltsakten, Gemeinschaftsnachsorgeakten, Überweisungsakten und telefonischen Kontakt erhoben. Die Patienten wurden in den ersten 2 Jahren nach der Behandlung alle 3 Monate, von Jahr 3 bis 5 alle 6 Monate und danach jährlich nachbetreut. Patienten ohne Tod, Rezidiv oder Progress zum Zeitpunkt des letzten Nachsagekontakts wurden zum Datum ihres letzten bestätigten Kontakts zensiert. Die Ergebnisereignisse wurden unabhängig voneinander von zwei Untersuchern überprüft. Wenn sich die Ereignisdaten zwischen den Quellen unterschieden, wurden Bildgebungsberichte, Entlassungsakten, endoskopische Berichte, Überweisungsdokumente und Sterberegisterakten geprüft, um das endgültige Ereignisdatum festzulegen. Das Nachsage-Stichtag war für beide teilnehmenden Zentren der 31. Dezember 2025.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit R 4.3.2 und SPSS 27.0 durchgeführt. Stetige Variablen wurden je nach Verteilung als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median (Interquartilbereich) zusammengefasst. Kategoriale Variablen wurden als Häufigkeiten und Prozentanteile dargestellt. Gruppenvergleiche wurden je nach Eignung mittels des t-Tests für unabhängige Stichproben, des Mann-Whitney-U-Tests, der einfaktoriellen Varianzanalyse, des Kruskal-Wallis-Tests, des Chi-Quadrat-Tests oder des exakten Fisher-Tests durchgeführt. Fehlende Daten wurden vor der Modellerstellung überprüft. Teilnehmer mit fehlendem wichtigem Diagnosestatus, fehlenden prätherapeutischen Biomarkerwerten, fehlendem TNM-Stadium oder fehlenden Daten zu Überleben/Progression wurden gemäß den vorab festgelegten Einschlusskriterien ausgeschlossen. Nicht wesentliche Kovariaten mit einem Fehlendanteil unter 5,0 % wurden mittels multipler Imputation durch verkettete Gleichungen mit 20 imputierten Datensätzen und 20 Iterationen behandelt¹⁷. Die Imputationsmodelle umfassten Diagnosegruppe, Zentrum, Alter, Geschlecht, Rauchgeschichte, Alkoholkonsum, Biomarkerwerte, TNM-Stadium, Behandlungsmodalität, OS-Status, PFS-Status und Nachbeobachtungszeit. Analysen an vollständigen Fällen wurden als Sensitivitätsanalysen durchgeführt.

Das diagnostische Modell wurde an der Trainingskohorte entwickelt. Zur Berechnung der Fläche unter der Kurve, Sensitivität, Spezifität, positiven Vorhersagewerte, negativen Vorhersagewerte, Genauigkeit und des F1-Scores wurden Receiver-Operating-Characteristic-Kurven verwendet. Die Flächen unter den Kurven wurden mittels des DeLong-Tests¹⁸ verglichen. Als ergänzende diagnostische Bewertung kamen Precision-Recall-Kurven zum Einsatz. Die Kalibrierung wurde anhand von Kalibrierungskurven, Brier-Scores, Kalibrierungsinterzepten und Kalibrierungssteigungen beurteilt. Die klinische Nützlichkeit wurde mittels Decision-Curve-Analyse¹⁹ evaluiert. Die interne Validierung erfolgte durch 1.000 Bootstrap-Stichproben, um die diskriminative Leistung und Kalibrierung unter Korrektur für Optimismus zu schätzen. Die externe Validierung wurde durchgeführt, indem die aus der Trainingskohorte stammende Gleichung, Standardisierungsparameter und der Schwellenwert direkt auf Zentrum B angewandt wurden, ohne erneutes Anpassen.

Für die prognostische Analyse wurden Kaplan-Meier-Kurven erstellt, um das Gesamtüberleben (OS) und das progressionsfreie Überleben (PFS) zwischen den Gruppen mit unterschiedlicher Biomarker-Belastung zu vergleichen, und der Log-Rang-Test wurde zur Beurteilung von Überlebensunterschieden verwendet. Die Cox-Regression mit proportionalen Hazards diente der Schätzung von Hazard-Ratios und 95%-Konfidenzintervallen. Variablen mit klinischer Relevanz sowie Variablen, die in der univariablen Analyse mit den Ergebnissen assoziiert waren, wurden für multivariable Modelle berücksichtigt. Die Modellleistung wurde anhand des Harrellschen C-Index, zeitabhängiger ROC-Kurven (receiver operating characteristic), Kalibrierungskurven, Brier-Scores und der Entscheidungskurvenanalyse bewertet²⁰. Die prognostische Kalibrierung wurde nach 1, 3 und 5 Jahren überprüft. Die Annahme proportionaler Hazards wurde mithilfe von Schoenfeld-Residuen und Log-minus-Log-Überlebensplots geprüft²¹. Die globalen Schoenfeld-Test-P-Werte betrugen 0,42 für das OS-Modell und 0,37 für das PFS-Modell. Multikollinearität wurde vor der endgültigen Interpretation des Modells anhand von Varianzinflationsfaktoren überprüft, wobei alle Kandidatenvariablen in den endgültigen diagnostischen und prognostischen Modellen Varianzinflationsfaktoren unter 2,1 aufwiesen. Der zusätzliche prognostische Wert jenseits des TNM-Stadiums und konventioneller klinisch-pathologischer Modelle wurde mittels Net Reclassification Improvement und Integrated Discrimination Improvement bewertet. Die im Trainingskollektiv geschätzten Modellparameter wurden ohne Neuanpassung auf die externe Validierungskohorte angewandt²². Alle Tests waren zweiseitig, und ein P < 0,05 galt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Teilnehmerfluss und Reproduzierbarkeit des Assays

Insgesamt wurden 326 Personen untersucht, von denen 49 ausgeschlossen wurden: 12 hatten vor der Blutentnahme eine antitumorale Therapie erhalten, 8 wiesen ein anderes primäres Malignom auf, 9 hatten eine schwere Infektion, Autoimmunerkrankung oder unkontrollierte Komorbiditäten, die wahrscheinlich die serumgebundenen Tumormarker beeinflusst hätten, 11 zeigten Hämolyse, Lipämie, ikterische Interferenzen, unzureichendes Serumvolumen oder eine verlängerte Probenaufarbeitungszeit, und 9 hatten fehlende wichtige klinische, pathologische oder Nachbeobachtungsdaten. Die endgültige analytische Studienpopulation umfasste 277 Teilnehmer: 167 Patienten mit ösophagealem Plattenepithelkarzinom (ESCC), 55 Patienten mit benigner Ösophaguserkrankung und 55 gesunde Kontrollpersonen. Zentrum A stellte 194 Teilnehmer für den Trainingskohorten, und Zentrum B stellte 83 Teilnehmer für die externe Validierungskohorte. Der Teilnehmerfluss, die Kohortenzuordnung, der Workflow der Biomarker-Testung, die Entwicklung des diagnostischen Modells, die externe Validierung und das prognostische Modellierungsgerüst sind in Abbildung 1 dargestellt, und die Details zur Einschluss- und Ausschlusskriterien sind in Ergänzende Tabelle 1 zusammengefasst.

Die Zwischenanalysen- und Zwischenzentren-Reproduzierbarkeit wurde anhand von 30 verblindeten Serumaliquoten untersucht. Die Variationskoeffizienten zwischen den Zentren betrugen 4,8 % für das karzinoembryonale Antigen (CEA), 5,6 % für das Plattenepithelkarzinom-Antigen (SCC-Ag) und 5,1 % für das Kohlenhydrat-Antigen 125 (CA125). Die entsprechenden intraklassen Korrelationskoeffizienten lagen bei 0,94, 0,92 bzw. 0,93. Vor der statistischen Standardisierung und der Modellerstellung war keine zentrumspezifische Neukalibrierung erforderlich. Die Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit der Assays sind in Supplementary Table 2 enthalten.

Grundlegende Merkmale der Studienpopulation

Das mediane Alter der Gesamtpopulation betrug 59 Jahre (IQR, 53–66 Jahre), und 198 Teilnehmer (71,5 %) waren männlich. Bei 141 Teilnehmern (50,9 %) wurde aktueller oder ehemaliger Rauchkonsum angegeben, und bei 127 Teilnehmern (45,8 %) wurde aktueller oder ehemaliger Alkoholkonsum berichtet. Die Kohorte umfasste 167 ESCC-Patienten (60,3 %), 55 Patienten mit benigner Speiseröhrenerkrankung (19,9 %) und 55 gesunde Kontrollpersonen (19,9 %). Die medianen Serumspiegel von CEA, SCC-Ag und CA125 betrugen jeweils 3,9 ng/mL (IQR, 2,0–6,6 ng/mL), 1,4 ng/mL (IQR, 0,8–2,3 ng/mL) und 22,8 U/mL (IQR, 13,9–35,7 U/mL). Alter, Geschlecht, Rauchanamnese, Alkoholkonsum, diagnostische Gruppe und Ausgangswerte der serumbasierten Biomarker waren zwischen der Trainings- und der externen Validierungskohorte vergleichbar (Tabelle 1).

Unter den 167 ESCC-Patienten betrug das mediane Alter 61 Jahre (IQR, 55–68 Jahre), und 133 Patienten (79,6 %) waren männlich. Die Tumoren befanden sich am häufigsten im mittleren thorakalen Ösophagus (89/167, 53,3 %), gefolgt vom unteren thorakalen Ösophagus (56/167, 33,5 %) und dem oberen thorakalen Ösophagus (22/167, 13,2 %). Mäßig differenzierte und schlecht differenzierte Tumoren machten jeweils 81 Fälle (48,5 %) und 66 Fälle (39,5 %) aus. Bei 68 Patienten (40,7 %) betrug die Tumorlänge mindestens 5 cm, bei 121 Patienten (72,5 %) lag eine pT3–4-Erkrankung vor, bei 100 Patienten (59,9 %) wurde eine Lymphknotenmetastasierung festgestellt, und bei 111 Patienten (66,5 %) wurde ein Tumor-Node-Metastase-(TNM-)Stadium III–IV beobachtet. Eine lymphovaskuläre Invasion wurde bei 65 Patienten (38,9 %) nachgewiesen. Die primäre Behandlung bestand bei 113 Patienten (67,7 %) aus einer radikalen Operation mit oder ohne adjuvante Therapie, bei 32 Patienten (19,2 %) aus einer definitiven Radiochemotherapie und bei 22 Patienten (13,2 %) aus einer palliativen systemischen oder supportiven Therapie. Die wichtigsten klinisch-pathologischen Variablen waren zwischen den ESCC-Kohorten für das Training und die externe Validierung vergleichbar (Tabelle 2).

Mehrdimensionale Verteilung von Serum-Biomarkern über die Studiengruppen hinweg

Die Verteilungen von Serum-CEA, SCC-Ag und CA125 unterschieden sich zwischen Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC), Kontrollen mit benignen Ösophaguserkrankungen und gesunden Kontrollen (Abbildung 2). Nach logarithmischer Transformation wiesen alle drei Biomarker höhere Konzentrationen in der ESCC-Gruppe auf als in den beiden nicht malignen Gruppen. Der mediane CEA-Spiegel betrug bei ESCC-Patienten 5,2 ng/mL im Vergleich zu 2,4 ng/mL bei Kontrollen mit benignen Ösophaguserkrankungen und 1,9 ng/mL bei gesunden Kontrollen. Der mediane SCC-Ag-Spiegel lag bei ESCC-Patienten bei 1,9 ng/mL im Vergleich zu 0,9 ng/mL und 0,7 ng/mL in den anderen Gruppen. Der mediane CA125-Spiegel betrug bei ESCC-Patienten 28,9 U/mL im Vergleich zu 18,7 U/mL und 16,1 U/mL in den anderen Gruppen. Die gruppenspezifischen Verteilungen der Serum-Biomarker sind in Ergänzende Tabelle 3 zusammengefasst.

CEA und SCC-Ag zeigten eine deutlichere Trennung zwischen ESCC und nicht-malignen Kontrollen als CA125. In der zweidimensionalen Verteilung der logarithmisch transformierten CEA- und SCC-Ag-Werte lagen die ESCC-Proben häufiger im Bereich höherer Werte, während sich die gesunden Kontrollen häufiger im Bereich niedrigerer Werte gruppierten. Eine hohe kombinierte Biomarkerbelastung, definiert als Anstieg von mindestens zwei der drei Marker, wurde bei 61 von 167 ESCC-Patienten (36,5 %), bei 8 von 55 Kontrollen mit benignen Ösophaguserkrankungen (14,5 %) und bei 4 von 55 gesunden Kontrollen (7,3 %) beobachtet. Die Verteilung der erhöhten Biomarkerbelastung unterschied sich signifikant zwischen den drei Gruppen (P < 0,001), wie ebenfalls in Supplementary Table 3 berichtet.

Entwicklung der kombinierten diagnostischen Signatur in der Trainingskohorte

Die kombinierte diagnostische Signatur wurde in der Trainingskohorte unter Verwendung log-transformierter Werte von CEA, SCC-Ag und CA125 entwickelt (Abbildung 3). Die paarweise Korrelationsanalyse zeigte moderate positive Korrelationen zwischen den drei Markern. Die stärkste Korrelation wurde zwischen CEA und SCC-Ag (r = 0.58) beobachtet, gefolgt von SCC-Ag und CA125 (r = 0.47) sowie CEA und CA125 (r = 0.41), was ein gemeinsames Modell unterstützt, ohne die Marker als austauschbare Messgrößen zu behandeln.

In der univariablen logistischen Regression waren CEA, SCC-Ag und CA125 jeweils mit dem ESCC-Status assoziiert, mit Odds Ratios von 2,81, 3,94 bzw. 2,14. Im multivariablen diagnostischen Modell zeigte SCC-Ag den größten adjustierten Effekt (OR, 2,87; 95 % CI, 1,62–5,09; P < 0,001), gefolgt von CEA (OR, 1,80; 95 % CI, 1,19–2,72; P = 0,006) und CA125 (OR, 1,52; 95 % CI, 1,03–2,25; P = 0,034). Die Koeffizienten des diagnostischen Modells sind in Supplementary Table 4 zusammengefasst. Der endgültige diagnostische lineare Prädiktor war:

LPdiagnostic = -0,46 + 0,59 × zlnCEA + 1,05 × zlnSCC - Ag + 0,42 × zlnCA125

Die individuelle vorhergesagte Wahrscheinlichkeit von ESCC wurde wie folgt berechnet:

PESCC = 1/1 + exp( -LPdiagnostic )

Die vorhergesagte Wahrscheinlichkeitsverteilung aus dem kombinierten diagnostischen Modell zeigte eine Trennung zwischen Teilnehmern mit ESCC und solchen ohne ESCC. Der optimale Cutoff lag bei 0,57. Bei diesem Cutoff erreichte das kombinierte Modell eine Fläche unter der Receiver-Operating-Characteristic-Kurve (AUC) von 0,869 (95 % CI, 0,817–0,921) mit einem positiven Vorhersagewert von 85,8 % und einem negativen Vorhersagewert von 73,0 % in der Trainingskohorte.

Diagnostische Leistung und externe Validierung des kombinierten Biomarker-Panels

In der Trainingskohorte zeigte SCC-Ag die höchste diagnostische Leistungsfähigkeit unter den drei einzelnen Biomarkern mit einer AUC von 0,802 (95 % CI, 0,735–0,869). Die AUCs für CEA und CA125 betrugen jeweils 0,711 (95 % CI, 0,635–0,786) und 0,668 (95 % CI, 0,591–0,744). Das kombinierte Panel erreichte die höchste Gesamtdiskriminierungsleistung mit einer AUC von 0,869 (95 % CI, 0,817–0,921), einer Sensitivität von 79,8 %, einer Spezifität von 81,2 %, einem positiven Vorhersagewert von 85,8 %, einem negativen Vorhersagewert von 73,0 %, einer Genauigkeit von 80,4 % und einem F1-Score von 82,7 % (Tabelle 3).

Die Receiver-Operating-Characteristic-Kurven bestätigten die höhere diagnostische Trennschärfe des kombinierten Panels im Vergleich zu einzelnen Biomarkern (Abbildung 4A). Bei der optimalen Cutoff-Schwelle von 0,57 zeigte das kombinierte Panel eine Sensitivität von 79,8 % und eine Spezifität von 81,2 %. Die AUC des kombinierten Panels war signifikant höher als die der alleinigen SCC-Ag (P = 0,032). Die interne Bootstrap-Validierung mit 1.000 Resampling-Durchgängen ergab eine Optimismus-korrigierte AUC von 0,856, eine Optimismus-korrigierte Kalibrierungssteigung von 0,97 und eine Optimismus-korrigierte Brier-Score von 0,154. Die Schätzungen zur internen Validierung sind in Ergänzungstabelle 4 angegeben.

In der externen Validierungskohorte zeigte die Precision-Recall-Analyse die höchste durchschnittliche Präzision bei der Unterscheidung von ESCC und gesunden Kontrollen (AP = 0,912; Abbildung 4B). Die durchschnittliche Präzision betrug 0,863 für ESCC im Vergleich zu nicht-ESCC und 0,841 für ESCC im Vergleich zu benignen Speiseröhrenerkrankungen. Die durchschnittliche Präzision für ESCC im Frühstadium im Vergleich zu nicht-malignen Kontrollen lag bei 0,535. Die Kalibrationsanalyse zeigte eine Übereinstimmung zwischen den vorhergesagten Wahrscheinlichkeiten und den beobachteten Ergebnissen in beiden Kohorten (Abbildung 4C). Der Brier-Score betrug 0,148 mit einer Kalibrierungssteigung von 1,02 und einem Achsenabschnitt von 0,01 in der Trainingskohorte. In der externen Validierungskohorte lag der Brier-Score bei 0,164, die Kalibrierungssteigung bei 0,93 und der Kalibrierungsachsenabschnitt bei −0,04. Die Entscheidungskurvenanalyse zeigte einen höheren Nettovorteil für das kombinierte Panel im Vergleich zu den Strategien „alle behandeln“ und „keinen behandeln“ über die meisten Wahrscheinlichkeitsschwellen hinweg (Abbildung 4D).

Die Ergebnisse der externen Validierung sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Das kombinierte Panel erreichte eine AUC von 0,842 (95 % KI, 0,753–0,930) für ESCC im Vergleich zu Nicht-ESCC mit einer Sensitivität von 75,5 %, einer Spezifität von 76,7 %, einer Genauigkeit von 75,9 %, einem Brier-Score von 0,164, einer Kalibrierungssteigung von 0,93 und einem Nettovorteil von 0,218 bei einer Schwellenwahrscheinlichkeit von 0,30. Die AUCs betrugen 0,801 (95 % KI, 0,686–0,916) für ESCC im Vergleich zu benignen Speiseröhrenerkrankungen, 0,889 (95 % KI, 0,800–0,979) für ESCC im Vergleich zu gesunden Kontrollen und 0,818 (95 % KI, 0,704–0,932) für frühes Stadium von ESCC im Vergleich zu nicht-malignen Kontrollen. Die höchste Spezifität wurde für ESCC im Vergleich zu gesunden Kontrollen (86,7 %) beobachtet, während frühes Stadium von ESCC im Vergleich zu nicht-malignen Kontrollen eine Sensitivität von 70,6 % und eine Spezifität von 78,3 % aufwies.

Klinikopathologisches Assoziationsprofil des kombinierten Biomarker-Panels bei ESCC

Die Assoziation zwischen der Erhöhung von Serum-Biomarkern und klinisch-pathologischen Merkmalen wurde bei Patienten mit Ösophagus-Plattenepithelkarzinom (ESCC) untersucht (Tabelle 5). Alter und Geschlecht zeigten nur eine begrenzte Assoziation mit der Erhöhung einzelner Biomarker. Patienten im Alter von mindestens 65 Jahren wiesen einen höheren Anteil an hohem kombiniertem Biomarker-Burden auf als Patienten unter 65 Jahren (47,6 % gegenüber 29,8 %; P = 0,028), während das Geschlecht keine Assoziation mit der Erhöhung einzelner Biomarker oder dem kombinierten Biomarker-Burden zeigte.

Tumorbasierte Variablen zeigten stärkere Assoziationen mit der Erhöhung von Biomarkern. Eine hohe kombinierte Biomarkerbelastung war bei 50,0 % der Patienten mit einer Tumorlänge von mindestens 5 cm vorhanden, im Vergleich zu 27,3 % der Patienten mit einer Tumorlänge unter 5 cm (P = 0,004). Die hohe kombinierte Biomarkerbelastung trat auch häufiger bei Patienten mit schlechter Differenzierung auf als bei denen mit guter oder mäßiger Differenzierung (50,0 % vs. 28,2 %; P = 0,006), bei Patienten mit pT3–4-Erkrankung im Vergleich zu pT1–2-Erkrankung (42,1 % vs. 21,7 %; P = 0,011), bei Patienten mit Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu Patienten ohne Lymphknotenmetastasen (43,0 % vs. 26,9 %; P = 0,038) sowie bei Patienten mit TNM-Stadium III–IV im Vergleich zu TNM-Stadium I–II (43,2 % vs. 23,2 %; P = 0,009).

Die Visualisierung auf Patientenebene zeigte, dass höhere kombinierte Risikoscores mit fortgeschritteneren klinisch-pathologischen Merkmalen einhergingen (Abbildung 5A). Patienten mit höheren Scores wurden häufiger als pT3–4, lymphknotenpositiv, schlecht differenziert oder TNM-Stadium III–IV klassifiziert. Die Boxplot-Analyse zeigte eine nach oben verschobene Verteilung der Biomarker bei Patienten mit größerer Tumorlänge, schlechter Differenzierung, pT3–4-Erkrankung, lymphknotenpositivem Befund und TNM-Stadium III–IV (Abbildung 5B). Der Sankey-Plot zeigte, dass Patienten mit zwei oder drei erhöhten Biomarkern häufiger dem TNM-Stadium III–IV zugeordnet wurden, während Patienten ohne erhöhte Biomarker häufiger dem TNM-Stadium I–II zugeordnet waren (Abbildung 5C). Die Assoziation zwischen der kombinierten Belastung mit Biomarkern und der Verteilung der TNM-Stadien war statistisch signifikant (P < 0,001).

Prognostische Stratifikation basierend auf dem kombinierten Serum-Biomarker-Panels

Die mediane Nachbeobachtungszeit für ESCC-Patienten betrug 34 Monate. Während der Nachbeobachtung wurden 78 Todesfälle und 96 ereignisfreie Überlebensereignisse erfasst. Details zu Nachbeobachtung und Ereignissen sind in Zusatz-Tabelle 5 zusammengefasst. Eine hohe kombinierte Biomarkerlast war mit schlechteren Überlebensergebnissen assoziiert. In der univariablen Cox-Regression war eine hohe kombinierte Biomarkerlast mit einem erhöhten Risiko für Tod (HR, 2,91; 95 % CI, 1,89–4,46; P < 0,001) und Progression oder Tod (HR, 2,63; 95 % CI, 1,80–3,84; P < 0,001) verbunden. Nach Anpassung für Alter, Tumorlänge, Differenzierung, pT-Stadium, Lymphknotenmetastasen und Behandlungsmodalität blieb die hohe kombinierte Biomarkerlast unabhängig mit dem Gesamtüberleben (OS; HR, 2,24; 95 % CI, 1,41–3,54; P = 0,001) und dem progressionsfreien Überleben (PFS; HR, 2,03; 95 % CI, 1,35–3,05; P = 0,001) assoziiert. Im Gegensatz dazu waren erhöhte CEA-, SCC-Ag- und CA125-Werte nicht mehr statistisch signifikant, wenn sie einzeln in die multivariablen Modelle eingeschlossen wurden. Die Ergebnisse der Cox-Regression sind in Tabelle 6 zusammengefasst.

Die Kaplan-Meier-Analyse zeigte eine deutliche Trennung zwischen den Gruppen mit hohem und niedrigem kombiniertem Biomarker-Belastungsgrad (Abbildung 6A,B). Die mediane OS betrug 38 Monate in der Gruppe mit geringer Belastung und 19 Monate in der Gruppe mit hoher Belastung (log-rank P < 0,001). Die mediane PFS betrug 28 Monate in der Gruppe mit geringer Belastung und 13 Monate in der Gruppe mit hoher Belastung (log-rank P < 0,001). Das integrierte prognostische Modell wies eine höhere zeitabhängige Diskriminierung auf als der TNM-Stadium allein (Abbildung 6C), mit AUC-Werten von 0,829, 0,806 und 0,781 nach 1, 3 bzw. 5 Jahren im Vergleich zu 0,701, 0,676 und 0,648 für das alleinige TNM-Stadium. Die Verbesserung des C-Index gegenüber dem alleinigen TNM-Stadium betrug 0,130 in der Trainingskohorte und 0,120 in der externen Validierungskohorte. Die Nachsorge-Landmark-Heatmap zeigte eine zunehmende kumulative Mortalität über die Risikostrata hinweg (Abbildung 6D). Im niedrigen Risikodrittel betrugen die kumulativen Mortalitätswahrscheinlichkeiten 6 %, 12 %, 24 %, 37 % und 52 % nach 6, 12, 24, 36 bzw. 60 Monaten. Die entsprechenden Wahrscheinlichkeiten betrugen 14 %, 26 %, 44 %, 59 % und 74 % im mittleren Risikodrittel und 28 %, 47 %, 68 %, 82 % und 91 % im hohen Risikodrittel.

Externe Validierung und zusätzlicher prognostischer Nutzen des integrierten Modells

Das integrierte Modell zeigte in beiden Kohorten die höchste prognostische Diskriminierung unter den evaluierten Modellen. In der Trainingskohorte betrug der C-Index für das integrierte Modell 0,792 im Vergleich zu 0,736 für das klinisch-pathologische Modell, 0,703 für das Biomarker-Panel allein und 0,662 für den TNM-Status allein. In der externen Validierungskohorte lag der C-Index für das integrierte Modell bei 0,761 im Vergleich zu 0,708, 0,681 und 0,641 für die anderen Modelle. Auch die zeitabhängigen AUCs sprachen für das integrierte Modell. In der Trainingskohorte erreichte das integrierte Modell AUCs von 0,829, 0,806 und 0,781 nach 1, 3 bzw. 5 Jahren. In der externen Validierungskohorte betrugen die entsprechenden AUCs 0,801, 0,774 und 0,748. Im Vergleich zum TNM-Status allein zeigte das integrierte Modell eine NRI von +0,274 und eine IDI von +0,102. Die interne Bootstrap-Validierung ergab einen optimistisch-korrigierten C-Index von 0,779 für das integrierte Modell. Die Leistungsmetriken der Modelle sind in Tabelle 7 dargestellt, zusätzliche Ergebnisse zur prognostischen Validierung finden sich in der ergänzenden Tabelle 5.

Das Modellvergleichsdiagramm zeigte für das integrierte Modell in beiden Kohorten den höchsten Harrells C-Index (Abbildung 7A). Das Nomogramm bezog Alter, Tumorlänge, histologische Differenzierung, pT-Stadium, Lymphknotenstatus, initiale Behandlungsmodalität und hohe kombinierte Biomarkerlast ein, um die Überlebenswahrscheinlichkeiten nach 1, 3 und 5 Jahren (OS) abzuschätzen (Abbildung 7B). In der externen Validierungskohorte lagen die Kalibrierungskurven für das 1-, 3- und 5-Jahres-OS nahe an der idealen Referenzlinie (Abbildung 7C). Die Brier-Scores betrugen jeweils 0,141, 0,164 und 0,178, mit Kalibrierungssteigungen von 0,97, 0,93 und 0,91. Die Entscheidungskurvenanalyse zeigte, dass das integrierte Modell über den relevanten Bereich der Schwellenwahrscheinlichkeiten hinweg einen höheren Nettovorteil aufwies als das alleinige TNM-Stadium, das klinisch-pathologische Modell sowie die Strategien „alle behandeln“ oder „keinen behandeln“ (Abbildung 7D). Bei einer Schwellenwahrscheinlichkeit von 0,30 betrug der Nettovorteil für das integrierte Modell 0,181 im Vergleich zu 0,139 für das klinisch-pathologische Modell und 0,117 für das alleinige TNM-Stadium. Diese Ergebnisse zur Kalibrierung und Entscheidungskurve sind in Ergänzende Tabelle 5 zusammengefasst.

VERFÜGBARKEIT VON DATEN:

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind öffentlich im Figshare-Repository verfügbar: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33154580.v1.

Abbildung 1: Studiendesign und analytischer Arbeitsablauf. Schematische Übersicht über die Teilnehmerrekrutierung, Zuordnung der Kohorten, Messung der Serum-Biomarker, Entwicklung des diagnostischen Modells, externe Validierung und Erstellung des prognostischen Modells. Zentrum A diente als Trainingskohorte, Zentrum B als externe Validierungskohorte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Verteilung der Serum-Biomarker CEA, SCC-Ag und CA125 über die Studiengruppen hinweg. (A) Violin- und Boxplots, die logarithmisch transformierte Serumspiegel der Biomarker bei Patienten mit ESCC, bei Kontrollen mit benignen Speiseröhrenerkrankungen und gesunden Kontrollen zeigen. (B) Bivariate Verteilung der logarithmisch transformierten Werte von CEA und SCC-Ag. (C) Radarplot, der das kombinierte Biomarkerprofil über die diagnostischen Gruppen hinweg zusammenfasst. (D) Verteilung der erhöhten Biomarkerlast über die diagnostischen Gruppen hinweg. CEA = carcinoembryonic antigen; SCC-Ag = squamous cell carcinoma antigen; CA125 = carbohydrate antigen 125; ESCC = esophageal squamous cell carcinoma. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Entwicklung der kombinierten diagnostischen Signatur in der Trainingskohorte. (A) Korrelations-Heatmap der log-transformierten CEA-, SCC-Ag- und CA125-Werte. (B) Ergebnisse der univariablen und multivariablen logistischen Regression für einzelne Biomarker und das kombinierte Diagnosemodell. (C) Vorausgesagte Wahrscheinlichkeitsverteilung für ESCC- und Nicht-ESCC-Teilnehmer basierend auf dem kombinierten Diagnosemodell. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Diagnostische Leistung und externe Validierung des kombinierten Biomarkerpanels. (A) Receiver-Operating-Characteristic-Kurven zum Vergleich einzelner Biomarker und des kombinierten Panels in der Trainingskohorte. (B) Precision-Recall-Kurven über verschiedene Szenarien der externen Validierung hinweg. (C) Kalibrierungsplots für die Trainings- und die extern validierte Kohorte. (D) Entscheidungskurvenanalyse, die den Nettonutzen über verschiedene Schwellenwahrscheinlichkeiten hinweg darstellt. ROC = Receiver Operating Characteristic. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Klinisch-pathologisches Assoziationsprofil der kombinierten Biomarker-Panel bei ESCC. (A) Übersicht auf Patientenebene der kombinierten Risikoscores, der Spiegel serumbasierter Biomarker und klinisch-pathologischer Merkmale. (B) Boxplots zur Darstellung der Biomarker-Verteilung in den wichtigsten klinisch-pathologischen Untergruppen. (C) Sankey-Diagramm zur Darstellung des Zusammenhangs zwischen erhöhter Biomarker-Belastung und TNM-Stadium. TNM = Tumor-Node-Metastase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Prognostische Stratifikation basierend auf der kombinierten Biomarkerlast. (A) Kaplan-Meier-Kurven für das Gesamtüberleben in Abhängigkeit von der kombinierten Biomarkerlast. (B) Kaplan-Meier-Kurven für das progressionsfreie Überleben in Abhängigkeit von der kombinierten Biomarkerlast. (C) Zeitabhängige ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) zum Vergleich des integrierten Modells mit dem alleinigen TNM-Stadium. (D) Heatmap, die kumulative Mortalitätswahrscheinlichkeiten über Risikotertile und Follow-up-Zeitpunkte hinweg zeigt. OS = Gesamtüberleben; PFS = progressionsfreies Überleben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Externe Validierung und klinische Anwendung des integrierten prognostischen Modells. (A) Vergleich des Harrellschen C-Index verschiedener prognostischer Modelle in den Trainings- und externen Validierungskohorten. (B) Nomogramm zur Abschätzung des Gesamtüberlebens nach 1, 3 und 5 Jahren unter Einbeziehung von Alter, Tumorlänge, histologischer Differenzierung, pT-Stadium, Lymphknotenstatus, initialer Behandlungsmodalität und hohem kombiniertem Biomarker-Burden. (C) Kalibrierungsdiagramme der externen Validierung für das Gesamtüberleben nach 1, 3 und 5 Jahren. (D) Entscheidungskurvenanalyse zum Vergleich des integrierten Modells mit dem alleinigen TNM-Stadium, dem klinisch-pathologischen Modell sowie Strategien der vollständigen oder gar keinen Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Variable	Gesamt (n = 277)	Trainingskohorte, Zentrum A (n = 194)	Externe Validierungskohorte, Zentrum B (n = 83)	P-Wert
Alter, Jahre, Median (IQR)	59 (53–66)	59 (52–65)	60 (54–67)	0.284
Männliches Geschlecht, n (%)	198 (71,5)	137 (70,6)	61 (73,5)	0,622
Aktueller/ehemaliger Raucher, n (%)	141 (50,9)	95 (49,0)	46 (55,4)	0,321
Aktueller/ehemaliger Alkoholkonsum, n (%)	127 (45,8)	87 (44,8)	40 (48,2)	0,603
Diagnosegruppe, n (%)				0,701
ESCC	167 (60,3)	114 (58,8)	53 (63,9)
Benigne Speiseröhrenerkrankung	55 (19,9)	40 (20,6)	15 (18,1)
Gesunde Kontrollen	55 (19,9)	40 (20,6)	15 (18,1)
Serum-CEA, ng/mL, Median (IQR)	3,9 (2,0–6,6)	3,8 (1,9–6,4)	4,1 (2,1–6,8)	0,367
Serum-SCC-Ag, ng/mL, Median (IQR)	1,4 (0,8–2,3)	1,4 (0,8–2,2)	1,5 (0,9–2,4)	0,418
Serum-CA125, U/mL, Median (IQR)	22,8 (13,9–35,7)	22,4 (13,5–34,9)	23,6 (14,6–36,8)	0,447

Tabelle 1: Baseline-Charakteristika der Teilnehmer in den Trainings- und externen Validierungskohorten. Demografische Merkmale, die Zusammensetzung der Kohorten sowie die Ausgangswerte der Serumspiegel von CEA, SCC-Ag und CA125 sind für die Gesamtpopulation, die Trainingskohorte und die externe Validierungskohorte zusammengefasst.

Variable	Gesamt-ESCC (n = 167)	Trainingskohorte (n = 114)	Externe Validierungskohorte (n = 53)	P-Wert
Alter, Jahre, Median (IQR)	61 (55–68)	61 (55–67)	62 (56–68)	0.386
männliches Geschlecht, n (%)	133 (79,6)	91 (79,8)	42 (79,2)	0,931
aktueller/ehemaliger Raucher, n (%)	110 (65,9)	74 (64,9)	36 (67,9)	0,701
aktueller/ehemaliger Alkoholkonsum, n (%)	95 (56,9)	66 (57,9)	29 (54,7)	0,688
Tumorlokalisation, n (%)				0,879
obere Thoraxregion	22 (13,2)	15 (13,2)	7 (13,2)
mittlere Thoraxregion	89 (53,3)	60 (52,6)	29 (54,7)
untere Thoraxregion	56 (33,5)	39 (34,2)	17 (32,1)
histologische Differenzierung, n (%)				0,944
gut differenziert	20 (12,0)	14 (12,3)	6 (11,3)
mäßig differenziert	81 (48,5)	56 (49,1)	25 (47,2)
schlecht differenziert	66 (39,5)	44 (38,6)	22 (41,5)
Tumorlänge ≥5 cm, n (%)	68 (40,7)	45 (39,5)	23 (43,4)	0,621
pT3–4-Stadium, n (%)	121 (72,5)	82 (71,9)	39 (73,6)	0,821
Lymphknotenmetastase, n (%)	100 (59,9)	68 (59,6)	32 (60,4)	0,924
TNM-Stadium III–IV, n (%)	111 (66,5)	75 (65,8)	36 (67,9)	0,785
Lymphovaskuläre Invasion, n (%)	65 (38,9)	42 (36,8)	23 (43,4)	0,404
primäre Behandlungsmodalität, n (%)				0,753
radikale Operation ± adjuvante Therapie	113 (67,7)	79 (69,3)	34 (64,2)
definitive Chemoradiotherapie	32 (19,2)	21 (18,4)	11 (20,8)
palliative systemische/unterstützende Behandlung	22 (13,2)	14 (12,3)	8 (15,1)

Tabelle 2: Klinisch-pathologische Merkmale von ESCC-Patienten in den Trainings- und externen Validierungskohorten. Tumorlokalisation, histologische Differenzierung, Tumorlänge, pT-Stadium, Lymphknotenstatus, TNM-Stadium, lymphovaskuläre Invasion und primäre Behandlungsmodalität werden zwischen ESCC-Patienten in den Trainings- und externen Validierungskohorten verglichen.

Modell	Optimaler Cutoff	AUC (95% CI)	Sensitivität (%)	Spezifität (%)	PPV (%)	NPV (%)	Genauigkeit (%)	F1-Score (%)
CEA	4.85 ng/mL	0.711 (0.635–0.786)	58,8	76,2	77,9	56,6	66,2	67,1
SCC-Ag	1.52 ng/mL	0.802 (0.735–0.869)	70,2	78,8	82,5	65,6	73,8	76,1
CA125	31,8 U/mL	0.668 (0.591–0.744)	44,7	82,5	78,5	52,4	60,3	57
Kombiniertes Panel	0,57	0.869 (0.817–0.921)	79,8	81,2	85,8	73	80,4	82,7

Tabelle 3: Diagnostische Genauigkeit einzelner Biomarker und des kombinierten Serum-Biomarker-Panels in der Trainingskohorte. Die diagnostische Leistung wird angegeben mit optimalem Cutoff, Fläche unter der Receiver-Operating-Characteristic-Kurve, Sensitivität, Spezifität, positiver prädiktiver Wert, negativer prädiktiver Wert, Genauigkeit und F1-Score.

Vergleich	AUC (95% KI)	Sensitivität, %	Spezifität, %	Genauigkeit, %	Brier-Score	Kalibrierungssteigung	Nettogewinn bei Schwellenwahrscheinlichkeit 0,30
ESCC vs Nicht-ESCC	0.842 (0.753–0.930)	75,5	76,7	75,9	0,164	0,93	0,218
ESCC vs benigne Speiseröhrenerkrankung	0.801 (0.686–0.916)	73,6	73,3	73,5	0,171	0,9	0,196
ESCC vs gesunde Kontrollen	0.889 (0.800–0.979)	77,4	86,7	79,5	0,122	0,97	0,252
ESCC im Frühstadium vs nicht-maligne Kontrollen	0.818 (0.704–0.932)	70,6	78,3	76,3	0,153	0,89	0,173

Tabelle 4: Externe Validierung der diagnostischen Leistung des kombinierten Serum-Biomarker-Panels. Die Modellleistung wird in vier diagnostischen Szenarien zusammengefasst: ESCC im Vergleich zu nicht-ESCC, ESCC im Vergleich zu benignen Speiseröhrenerkrankungen, ESCC im Vergleich zu gesunden Kontrollen sowie ESCC im Frühstadium im Vergleich zu nicht-malignen Kontrollen.

Merkmale	Kategorie	Erhöhtes CEA (n %)	Erhöhtes SCC-Ag (n %)	Erhöhtes CA125 (n %)	Hohes kombiniertes Tumormarkerprofil (n %)	P für CEA	P für SCC-Ag	P für CA125	P für kombiniertes Tumormarkerprofil
Alter	<65 Jahre (n = 104)	40 (38,5)	54 (51,9)	29 (27,9)	31 (29,8)	0,129	0,108	0,151	0,028
	≥65 Jahre (n = 63)	32 (50,8)	41 (65,1)	25 (39,7)	30 (47,6)
Geschlecht	Weiblich (n = 34)	13 (38,2)	17 (50,0)	13 (38,2)	12 (35,3)	0,513	0,367	0,402	0,871
	Männlich (n = 133)	59 (44,4)	78 (58,6)	41 (30,8)	49 (36,8)
Tumorlänge	<5 cm (n = 99)	35 (35,4)	49 (49,5)	24 (24,2)	27 (27,3)	0,015	0,021	0,009	0,004
	≥5 cm (n = 68)	37 (54,4)	46 (67,6)	30 (44,1)	34 (50,0)
Differenzierung	Gut/mäßig (n = 103)	38 (36,9)	52 (50,5)	27 (26,2)	29 (28,2)	0,018	0,032	0,027	0,006
	Schlecht (n = 64)	34 (53,1)	43 (67,2)	27 (42,2)	32 (50,0)
pT-Stadium	pT1–2 (n = 46)	13 (28,3)	20 (43,5)	9 (19,6)	10 (21,7)	0,016	0,028	0,036	0,011
	pT3–4 (n = 121)	59 (48,8)	75 (62,0)	45 (37,2)	51 (42,1)
Lymphknotenstatus	Negativ (n = 67)	21 (31,3)	31 (46,3)	15 (22,4)	18 (26,9)	0,012	0,025	0,021	0,038
	Positiv (n = 100)	51 (51,0)	64 (64,0)	39 (39,0)	43 (43,0)
TNM-Stadium	I–II (n = 56)	16 (28,6)	25 (44,6)	11 (19,6)	13 (23,2)	0,008	0,021	0,014	0,009
	III–IV (n = 111)	56 (50,5)	70 (63,1)	43 (38,7)	48 (43,2)

Tabelle 5: Assoziationen zwischen der Erhöhung serumbasierter Biomarker und klinisch-pathologischen Merkmalen bei Patienten mit Ösophagus-Plattenepithelkarzinom (ESCC). Die Anteile an erhöhtem CEA, erhöhtem SCC-Ag, erhöhtem CA125 sowie der hohe kombinierte Biomarker-Belastungswert werden über verschiedene demografische und tumorbasierte Untergruppen hinweg verglichen.

Variable	Univariable HR für OS (95 % KI)	P-Wert	Multivariable HR für OS (95 % KI)	P-Wert	Univariable HR für PFS (95 % KI)	P-Wert	Multivariable HR für PFS (95 % KI)	P-Wert
Alter ≥65 Jahre	1,52 (1,01–2,31)	0,046	1,39 (0,90–2,14)	0,138	1,41 (0,97–2,06)	0,074	1,31 (0,88–1,95)	0,186
männliches Geschlecht	1,18 (0,67–2,08)	0,566	—	—	1,13 (0,69–1,84)	0,632	—	—
Tumorlänge ≥5 cm	1,89 (1,25–2,86)	0,003	1,44 (0,93–2,23)	0,103	1,76 (1,22–2,55)	0,003	1,36 (0,92–2,01)	0,122
schlechte Differenzierung	1,63 (1,07–2,47)	0,024	1,29 (0,84–1,99)	0,245	1,58 (1,09–2,28)	0,016	1,27 (0,86–1,87)	0,228
pT3–4-Stadium	2,04 (1,19–3,49)	0,009	1,36 (0,76–2,44)	0,304	1,92 (1,18–3,11)	0,009	1,29 (0,77–2,18)	0,335
Lymphknotenmetastase	2,46 (1,50–4,03)	<0,001	1,94 (1,15–3,28)	0,013	2,12 (1,37–3,28)	0,001	1,73 (1,08–2,79)	0,023
Radikalchirurgie-basierte Therapie	0,43 (0,28–0,65)	<0,001	0,56 (0,36–0,88)	0,012	0,51 (0,35–0,74)	<0,001	0,63 (0,43–0,94)	0,024
erhöhtes CEA	1,88 (1,24–2,85)	0,003	1,34 (0,86–2,10)	0,199	1,71 (1,18–2,49)	0,005	1,26 (0,84–1,88)	0,267
erhöhtes SCC-Ag	1,95 (1,25–3,03)	0,003	1,29 (0,80–2,08)	0,302	1,82 (1,22–2,72)	0,004	1,25 (0,81–1,93)	0,315
erhöhtes CA125	1,79 (1,16–2,78)	0,009	1,21 (0,76–1,93)	0,421	1,68 (1,13–2,50)	0,011	1,18 (0,77–1,82)	0,446
hohe kombinierte Biomarkerlast	2,91 (1,89–4,46)	<0,001	2,24 (1,41–3,54)	0,001	2,63 (1,80–3,84)	<0,001	2,03 (1,35–3,05)	0,001

Tabelle 6: Univariablee und multivariablee Cox-Regressionanalysen für das Gesamtüberleben und das progressionsfreie Überleben. Hazard-Ratios und 95 % Konfidenzintervalle werden für klinisch-pathologische Variablen, die Erhöhung einzelner Biomarker sowie eine hohe kombinierte Biomarkerbelastung dargestellt.

Modell	C-Index des Trainingskohorte	1-Jahres-AUC der Trainingskohorte	3-Jahres-AUC der Trainingskohorte	5-Jahres-AUC der Trainingskohorte	C-Index der externen Validierung	1-Jahres-AUC der externen Validierung	3-Jahres-AUC der externen Validierung	5-Jahres-AUC der externen Validierung	NRI im Vergleich zu TNM	IDI im Vergleich zu TNM
Nur TNM-Stadium	0.662	0.701	0.676	0.648	0.641	0.672	0.651	0.628	—	—
Nur Biomarker-Panel	0.703	0.744	0.713	0.689	0.681	0.709	0.687	0.666	0.118	0.049
Klinisch-pathologisches Modell	0.736	0.772	0.748	0.721	0.708	0.741	0.719	0.694	0.153	0.061
Integriertes Modell	0.792	0.829	0.806	0.781	0.761	0.801	0.774	0.748	0.274	0.102

Tabelle 7: Vorhersagegenauigkeit verschiedener prognostischer Modelle in den Trainings- und externen Validierungskohorten. Harrells C-Index, zeitabhängige Fläche unter der Kurve, netto Klassifizierungsverbesserung und integrierte Diskriminierungsverbesserung werden verglichen zwischen alleinigem TNM-Status, alleiniger Biomarker-Panels, dem klinisch-pathologischen Modell und dem integrierten Modell.

Erweiterte Tabelle 1: Teilnehmer-Screening, Ausschlusskriterien und endgültige Kohortenzuordnung. Die Anzahl der Screenings, Ausschlussgründe, die endgültige analytische Stichprobe, die Verteilung auf die diagnostischen Gruppen sowie die zenterspezifische Kohortenzuordnung werden zusammengefasst.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatz-Tabelle 2: Reproduzierbarkeit der Bestimmung von Serum-Biomarkern zwischen verschiedenen Assays und Zentren. Die Ergebnisse der verblindeten Überbrückungstests mit Serum-Aliquoten werden mithilfe der Variationskoeffizienten zwischen Zentren und der Intraklassen-Korrelationskoeffizienten für CEA, SCC-Ag und CA125 zusammengefasst.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Tabelle 3: Verteilung der Serum-Biomarker und kombinierte Biomarkerlast in den diagnostischen Gruppen. Gruppenspezifische Verteilungen der Serum-Biomarker CEA, SCC-Ag und CA125 sowie der Anteil mit hoher kombinierter Biomarkerlast sind für ESCC-Patienten, Kontrollen mit benignen Speiseröhrenerkrankungen und gesunde Kontrollen zusammengefasst.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatz-Tabelle 4: Koeffizienten des diagnostischen Modells und interne Bootstrap-Validierung. Hier sind der Intercept des diagnostischen Modells, die Koeffizienten der Biomarker, die Schätzungen der univariablen und multivariablen logistischen Regression, der Schwellenwert für den Trainingskohorte, die Anzahl der Bootstrap-Stichproben, die optimistischkeitskorrigierte Fläche unter der Kurve, die Kalibrierungssteigung und die Brier-Score zusammengefasst.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Tabelle 5: Ergebnisse zur Nachbeobachtung, zeitpunktbezogenen Mortalität, Kalibrierung und Entscheidungskurvenanalyse für die prognostische Validierung. Dauer der Nachbeobachtung, Überlebensereignisse, medianes OS und PFS nach Gruppe der Biomarkerlast; Verbesserung des C-Index; optimistuskorrigierter C-Index; kumulative zeitpunktbezogene Mortalitätswahrscheinlichkeiten; Brier-Scores für externe Validierung; Kalibrierungssteigungen; und Schätzungen des Nettogewinns aus der Entscheidungskurvenanalyse werden zusammengefasst.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese zweizentrische Studie entwickelte und validierte extern ein kombiniertes Serum-Biomarker-Panel, das CEA, SCC-Ag und CA125 zur diagnostischen und prognostischen Beurteilung bei ESCC integriert. Das kombinierte Panel zeigte eine bessere Leistung als jeder einzelne Biomarker bei der Unterscheidung von ESCC und nicht-malignen Kontrollen und behielt im externen Validierungskohort eine akzeptable Diskriminierungsfähigkeit bei. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren ESCC-Studien überein, die zeigen, dass serumbasierte Tumormarker klinisch relevante diagnostische und prognostische Informationen liefern können, obwohl die Leistung einzelner Marker häufig durch biologische Überschneidungen zwischen malignen und nicht-malignen Erkrankungen begrenzt ist^23,24. Der Hauptbeitrag dieser Studie liegt daher in der Entwicklung eines reproduzierbaren Arbeitsablaufs mit drei Markern, der die prätherapeutische Diagnose, die klinisch-pathologische Korrelation und die Überlebensstratifizierung in ein einziges analytisches Framework integriert.

Die verbesserte Leistung des kombinierten Markers ist biologisch plausibel, da CEA, SCC-Ag und CA125 teilweise unterschiedliche tumorbedingte Prozesse widerspiegeln. SCC-Ag ist eng mit malignen Plattenepithelveränderungen assoziiert und zeigte in dieser Kohorte die stärkste alleinige diagnostische Aussagekraft. CEA könnte die Tumormasse, invasive Phänotypen und systemische maligne Aktivität widerspiegeln, während CA125 vermutlich breitere entzündliche, seröse oder Hinweise auf fortgeschrittene Erkrankung erfasst, anstatt spezifisch auf die Biologie des Ösophagus-Plattenepithelkarzinoms bezogen zu sein^25,26. Die mäßigen Korrelationen zwischen den drei Biomarkern deuten darauf hin, dass die Marker zwar verwandt, aber nicht redundant sind, was die gemeinsame Modellierung unterstützt, anstatt sich auf eine einzelne zirkulierende Messgröße zu verlassen.

Eine hohe kombinierte Biomarkerlast war mit größeren Tumoren, einem pT3–4-Befund, Lymphknotenmetastasen und einem TNM-Stadium III–IV assoziiert, was darauf hindeutet, dass das Panel mehr als nur ein binäres diagnostisches Signal erfasst. Dieses Muster ist klinisch relevant, da das anatomische Stadium weiterhin im Zentrum des Managements des ösophagealen Plattenepithelkarzinoms (ESCC) steht, Patienten innerhalb desselben Stadiums jedoch trotzdem in Bezug auf Tumoraggressivität, systemische Belastung und Überlebensprognose variieren können²⁷. Ein serumbasierter Biomarkerprofil könnte daher dabei helfen, die Risikostratifizierung vor der Behandlung zu verfeinern, insbesondere dann, wenn Ärzte zusätzliche Informationen benötigen, bevor eine Operation, eine definitive Radiochemotherapie, eine systemische Therapie oder ein intensivierter Nachsorgeplan erfolgt. In der Überlebensanalyse blieb eine hohe kombinierte Biomarkerlast unabhängig mit einem schlechteren Gesamtüberleben (OS) und progressionsfreien Überleben (PFS) assoziiert, auch nach Anpassung für wichtige klinisch-pathologische Variablen, und das integrierte Modell zeigte höhere C-Index- und zeitabhängige AUC-Werte als das alleinige TNM-Stadium²⁸.

Im Vergleich zu bildbasierten, radiomischen, Genexpressions- oder Multi-Omics-Modellen weist das vorliegende Panel praktische Vorteile auf, jedoch einen engeren biologischen Umfang. Radiomische und transkriptomische Modelle können räumliche Heterogenität, Merkmale der Tumormikroumgebung und molekulare Subtypen erfassen, und einige haben eine aussichtsreiche prognostische Leistung bei Ösophaguskarzinomen des Plattenepithels (ESCC)^29,30 gezeigt. Diese Ansätze erfordern jedoch oft standardisierte Bildgebungsprotokolle, fortschrittliche computergestützte Analyseverfahren, hochwertige Gewebeproben, Sequenzierplattformen oder spezialisierte bioinformatische Unterstützung. Im Gegensatz dazu werden CEA, SCC-Ag und CA125 in vielen klinischen Laboren routinemäßig bestimmt, sind vergleichsweise kostengünstig und können während der Nachsorge wiederholt werden. Der klinische Nutzen des vorliegenden Panels liegt daher in seiner Zugänglichkeit und Kompatibilität mit klinischen Arbeitsabläufen, nicht in der Fähigkeit, Bildgebung, Pathologie, molekulares Profiling oder die TNM-Klassifikation zu ersetzen.

Die Kalibrierungs- und Entscheidungskurvenanalysen unterstützen eine vorsichtige klinische Übertragung. Das kombinierte diagnostische Modell zeigte in den Trainings- und externen Validierungskohorten eine akzeptable Kalibrierung, und die Entscheidungskurvenanalyse deutete auf einen positiven Nettovorteil über klinisch relevante Schwellenwertbereiche hin. Das integrierte prognostische Modell zeigte ebenfalls eine verbesserte Diskriminierung und akzeptable Kalibrierung bei der externen Validierung. Diese Ergebnisse sind wichtig, weil Modelle mit allein hoher Diskriminierung dennoch schlecht kalibriert oder klinisch wenig hilfreich sein können³¹. Durch die Berichterstattung von AUC, C-Index, Kalibrierung, Brier-Scores und Ergebnissen der Entscheidungskurvenanalyse liefert diese Studie eine vollständigere Bewertung der Modellleistung als Studien, die nur auf Diskriminierungsmetriken oder Hazard-Ratio-Werten basieren.

Mehrere Einschränkungen sollten anerkannt werden. Obwohl die Studie eine externe Validierung umfasste, beschränkte sie sich auf zwei Zentren, und die Validierungskohorte war kleiner als die Trainingskohorte. Die Biomarkerwerte wurden nur zum prätherapeutischen Basiszeitpunkt gemessen, sodass longitudinale Veränderungen während der neoadjuvanten Therapie, der Radiochemotherapie, der postoperativen Überwachung oder der Rezidivkontrolle nicht bewertet wurden, obwohl serielle Tumormarker-Trends zusätzliche prognostische Informationen liefern können³². Die Serum-Panels wurden nicht direkt mit Radiomik, Genexpression, zirkulierender Tumor-DNA oder anderen flüssigen Biopsie-Modellen in derselben Patientenpopulation verglichen, und falsch-positive Erhöhungen können bei entzündlichen, benignen oder komorbiden Erkrankungen auftreten. Zusammenfassend zeigte die kombinierte Serum-Analyse von CEA, SCC-Ag und CA125 eine bessere diagnostische Differenzierung als einzelne Biomarker, war mit ungünstigen klinisch-pathologischen Merkmalen assoziiert und verbesserte die prognostische Risikostratifizierung, wenn sie den konventionellen klinischen Variablen hinzugefügt wurde. Weitere multizentrische Validierungen, die serielle Beurteilung von Biomarkern sowie direkte Vergleiche mit bildbasierten und molekularen Modellen sind erforderlich, bevor eine routinemäßige klinische Anwendung erfolgen kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zugriff auf CEA-Kalibratoren	Beckman Coulter	33205	Kalibrierung für das Serum-CEA-Assay
Zugriff auf CEA-Qualitätskontrollen	Beckman Coulter	33029	Tägliche interne Qualitätskontrolle für das Serum-CEA-Assay
Zugriff auf CEA-Reagenzienpackung	Beckman Coulter	33200	Bestimmung des CEA im Serum mit dem UniCel DxI 800 Access Immunoassay-System
Justierbare Mikropipette, 100–1000 µL	Eppendorf	3123000063	Portionierung des Serums nach der Zentrifugation
ARCHITECT CA 125 II Kalibratoren	Abbott Diagnostics	02K4502	Kalibrierung für das Serum-CA125-Assay
ARCHITECT CA 125 II Kontrollen	Abbott Diagnostics	02K4511	Tägliche interne Qualitätskontrolle für das Serum-CA125-Assay
ARCHITECT CA 125 II Reagenzienkit	Abbott Diagnostics	02K4529	Bestimmung des CA125 im Serum mit dem ARCHITECT i2000SR Immunoassay-Analysator
ARCHITECT i2000SR Immunoassay-Analysator	Abbott Diagnostics	i2000SR	Automatisierte chemilumineszente Mikropartikel-Immunoassay-Plattform zur Untersuchung von SCC-Ag und CA125
ARCHITECT SCC-Kalibrator	Abbott Diagnostics	8D1801	Kalibrierung für das Serum-SCC-Ag-Assay
ARCHITECT SCC-Kontrollen	Abbott Diagnostics	8D1810	Tägliche interne Qualitätskontrolle für das Serum-SCC-Ag-Assay
ARCHITECT SCC-Reagenzienkit	Abbott Diagnostics	8D1828	Bestimmung des SCC-Ag im Serum mit dem ARCHITECT i2000SR Immunoassay-Analysator
Barcode-Etikettendrucker	Brady	BMP51	Barcode-Etikettierung von Serum-Aliquots und kryogenen Gefäßen
Blutentnahmenadel	BD Biosciences	367286	Periphere venöse Blutentnahme
Kryogenlagerbox	Corning	431131	Geordnete Lagerung von gefrorenen Serum-Aliquots
Kryogengefäß, 2,0 mL, Außengewinde, selbststehend	Corning	430659	Barcode-beschriftete Lagerung von Serum-Aliquots bei −80 °C
Datenextraktionsformular und vordefiniertes Datenwörterbuch	Studiengruppe	Nicht zutreffend	Standardisierte Extraktion klinischer, pathologischer, laborbezogener und Nachverfolgungsvariablen
dcurves-Paket	R-Paket	Version 0.4.0	Entscheidungskurvenanalyse und Schätzung des klinischen Nutzens
Elektronisches Patientenaktensystem	Teilnehmende Krankenhäuser	Nicht zutreffend	Extraktion von demografischen, klinischen, therapeutischen und Nachverfolgungsdaten
Gefilterte Pipettenspitzen, 100–1000 µL	Eppendorf	30073594	Kontaminationskontrollierte Serum-Aliquotierung
ggplot2-Paket	R-Paket	Version 3.5.1	Statistische Visualisierung und Abbildungserstellung
IBM SPSS Statistics	IBM	Version 27.0	Vergleiche der Basisliniendaten und ergänzende statistische Prüfungen
Laborinformationsverwaltungssystem	Labor des teilnehmenden Krankenhauses	Nicht zutreffend	Abruf und Verknüpfung von Serum-Biomarker-Testdatensätzen
mice-Paket	R-Paket	Version 3.16.0	Mehrfache Imputation durch verkettete Gleichungen
nricens-Paket	R-Paket	Version 1.6	Analyse der Netto-Reklassifizierungsverbesserung
Pathologie-Berichtssystem	Teilnehmende Krankenhäuser	Nicht zutreffend	Bestätigung der ESCC-Diagnose, gutartiger Pathologie, Tumoreigenschaften und stagingbezogener Variablen
pROC-Paket	R-Paket	Version 1.18.5	Analyse der ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic) und DeLong-Vergleich
R-Statistiksoftware	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.3.2	Statistische Analyse, Modellbildung, Validierung und Erstellung von Abbildungen
Kühlzentrifuge	Eppendorf	5810 R	Serumtrennung durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 10 min
rms-Paket	R-Paket	Version 6.8-1	Kalibrationsanalyse, Nomogrammerstellung und Unterstützung von Regressionsmodellen
Serumtrenn-Röhrchen für die Blutentnahme, 5 mL	BD Biosciences	367955	Entnahme nüchternen peripheren venösen Blutes zur Biomarker-Testung im Serum
survival-Paket	R-Paket	Version 3.5-7	Cox-Proportional-Hazards-Regression und Überlebensanalyse
survminer-Paket	R-Paket	Version 0.4.9	Visualisierung der Kaplan–Meier-Kurve
Telefonnachverfolgungs-Aufzeichnungsformular	Studiengruppe	Nicht zutreffend	Sammlung und Überprüfung von Informationen zu Überleben, Rezidiv, Progression und letztem Kontakt
timeROC-Paket	R-Paket	Version 0.4	Zeitabhängige ROC-Kurvenanalyse
Ultra-niedertemperaturgefrierschrank	Thermo Fisher Scientific	TSX60086A	Lagerung von Serum-Aliquots bei −80 °C
UniCel DxI 800 Access Immunoassay-System	Beckman Coulter	DxI 800	Automatisierte chemilumineszente Immunoassay-Plattform zur CEA-Bestimmung im Serum