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Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Diese Studie stellt einen zwei Zentren umfassenden ambispektiven Workflow zur Messung des serumgebundenen karzinoembryonalen Antigens, des Plattenepithelkarzinom-Antigens und des Kohlenhydrat-Antigens 125 sowie zur Validierung ihres kombinierten diagnostischen und prognostischen Werts beim ösophagealen Plattenepithelkarzinom vor.
Das ösophageale Plattenepithelkarzinom ist weiterhin schwierig, frühzeitig zu diagnostizieren und vor der Behandlung präzise einzustufen. Die konventionelle Tumor-Node-Metastase-Stadieneinteilung liefert wesentliche anatomische Informationen, spiegelt jedoch die zirkulierende biologische Heterogenität nicht vollständig wider. Diese zweizentrische, ambispektive Beobachtungsstudie entwickelte und validierte extern ein kombiniertes Serum-Biomarker-Panels, das das karzinoembryonale Antigen, das Plattenepithelkarzinom-Antigen und das Kohlenhydrat-Antigen 125 zur diagnostischen Differenzierung und prognostischen Risikobewertung beim ösophagealen Plattenepithelkarzinom umfasst. Insgesamt wurden 277 Probanden aus einem Tertiary Hospital und einem kommunalen Gesundheitszentrum rekrutiert, darunter 167 Patienten mit ösophagealem Plattenepithelkarzinom, 55 Patienten mit benignen ösophagealen Erkrankungen und 55 gesunde Kontrollpersonen. Die Kohorte des Tertiary Hospitals diente der Modellentwicklung und internen Validierung, während die Kohorte des kommunalen Zentrums zur externen Validierung herangezogen wurde. Vor der Behandlung wurden die Serum-Biomarker vor der initialen Therapie gemessen, logarithmisch transformiert, anhand der Parameter der Trainingskohorte standardisiert und in diagnostische logistische Regressionsmodelle sowie prognostische Cox-Regressionsmodelle mit proportionalen Hazards eingegeben. Das kombinierte Panel zeigte eine höhere diagnostische Trennschärfe als jeder einzelne Marker, mit einer Fläche unter der ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic) von 0,869 in der Trainingskohorte und 0,842 in der externen Validierungskohorte. Ein höherer kombinierter Biomarker-Burden war assoziiert mit einer Tumorlänge von mindestens 5 cm, einem pT3–4-Befund, Lymphknotenmetastasen und einer Tumor-Node-Metastase-Stadieneinteilung im Stadium III–IV. In der Überlebensanalyse prognostizierte ein hoher kombinierter Biomarker-Burden unabhängig von den wichtigsten klinisch-pathologischen Faktoren ein schlechteres Gesamtüberleben und progressionsfreies Überleben. Das integrierte prognostische Modell, das den Biomarker-Burden mit klinisch-pathologischen Variablen kombiniert, schnitt besser ab als die Tumor-Node-Metastase-Stadieneinteilung allein, mit einem C-Index von 0,792 in der Trainingskohorte und 0,761 in der externen Validierung. Diese Ergebnisse untermauern die Verwendung des Serum-Panels aus karzinoembryonalem Antigen, Plattenepithelkarzinom-Antigen und Kohlenhydrat-Antigen 125 als praktische, nichtinvasive Ergänzung zur Beurteilung vor der Behandlung und zur individualisierten Risikostratifizierung beim ösophagealen Plattenepithelkarzinom.
Das ösophageale Plattenepithelkarzinom ist ein bedeutender histologischer Subtyp des Ösophaguskarzinoms und stellt insbesondere in China in Ostasien weiterhin eine erhebliche klinische Belastung dar1. Obwohl die endoskopische Diagnose, die bildgebende Beurteilung, die Chirurgie, die Radiochemotherapie und die systemische Therapie das klinische Management verbessert haben, bleibt die Prognose für viele Patienten unbefriedigend2. Ein wichtiger Grund hierfür ist, dass die Erkrankung häufig erst nach lokaler Invasion oder lymphogener Streuung diagnostiziert wird3. Ein weiterer Grund liegt darin, dass Patienten mit dem gleichen Tumor-Node-Metastasen-Stadium dennoch in der Therapieantwort, dem Rezidivrisiko und dem Überlebensverlauf variieren können4. Diese Unterschiede zeigen, dass die alleinige anatomische Stadieneinteilung die biologische Variabilität des ösophagealen Plattenepithelkarzinoms nicht vollständig beschreiben kann.
Die aktuelle klinische Beurteilung stützt sich hauptsächlich auf Endoskopie mit Biopsie, radiologische Stadieneinteilung und die pathologische Beurteilung nach der Operation. Diese Methoden sind unverzichtbar, weisen jedoch Grenzen auf, wenn sie für wiederholte Überwachungen, die Abschätzung des Therapierisikos vor Behandlungsbeginn oder umfassende Screenings eingesetzt werden. Die Endoskopie ist invasiv und weniger geeignet für häufige Nachuntersuchungen, während die Computertomographie und die endosonographische Untersuchung subtile Invasionen oder kleine metastatische Läsionen übersehen können5. Bildbasierte und molekulare prognostische Modelle haben die Risikovorhersage beim Plattenepithelkarzinom des Ösophagus verbessert, doch viele erfordern spezialisierte Plattformen, die Nachbearbeitung von Bildern, die Sequenzierung von Gewebeproben oder rechnergestützte Analysen, die nicht in allen klinischen Laboren routinemäßig verfügbar sind6,7. Ein kostengünstiger und wiederholbarer, auf Blutproben basierender Ansatz könnte daher nützliche zusätzliche Informationen liefern, insbesondere wenn Ärzte vor der definitiven Therapie eine Risikostratifizierung vor der Behandlung benötigen.
Serumtumormarker sind in diesem Kontext attraktiv, da sie routinemäßig verfügbar, minimalinvasiv und leicht wiederholbar sind. Das karzinoembryonale Antigen spiegelt die Tumormasse und eine abnorme zelluläre Differenzierung wider, während das Plattenepithelkarzinom-Antigen enger mit der malignen Transformation des Plattenepithels assoziiert ist8. Das Kohlenhydrat-Antigen 125 wurde mit systemischer entzündlicher Aktivität, Beteiligung des Serums und Krankheitsprogression bei mehreren Malignitäten in Verbindung gebracht9. Diese Marker repräsentieren nicht dasselbe biologische Signal. Stattdessen erfassen sie möglicherweise sich überlappende, aber unterschiedliche Dimensionen der Tumormasse, des Plattenepithel-Phänotyps, der systemischen Antwort und der Wechselwirkung zwischen Wirt und Tumor. Aus diesem Grund kann ein kombiniertes Markerpanel besser abschneiden als ein einzelner Marker, wenn das Ziel darin besteht, ein ösophagales Plattenepithelkarzinom zu identifizieren und das klinische Risiko abzuschätzen10.
Frühere Studien haben Serum-Tumormarker, entzündliche Indikatoren, bildgebende Merkmale, molekulare Profile und zusammengesetzte prognostische Modelle beim ösophagealen Plattenepithelkarzinom und verwandten gastrointestinalen Krebserkrankungen evaluiert11,12. Viele veröffentlichte Modelle konzentrieren sich jedoch entweder auf die Diagnose oder die Prognose, verwenden Einzelzentren-Kohorten, weisen keine unabhängige externe Validierung auf oder liefern nur begrenzte Angaben zu Marker-Transformation, Cut-off-Auswahl, Kalibrierung und Reproduzierbarkeit des Modells. Die Neuheit der vorliegenden Studie liegt in der Entwicklung eines praktischen Serum-Panel mit drei Markern, das routinemäßig gemessene Parameter – carcinoembryonales Antigen, Plattenepithelkarzinom-Antigen und Kohlenhydrat-Antigen 125 – nutzt, um sowohl die diagnostische Differenzierung als auch die prognostische Risikostratifizierung innerhalb eines einzigen zweizentrischen Workflows zu unterstützen. Das Modell wurde an einer Kohorte eines tertiären Krankenhauses entwickelt und anschließend ohne erneute Optimierung an einer unabhängigen Kohorte eines Versorgungszentrums getestet, wodurch die Stabilität in unterschiedlichen klinischen Settings bewertet werden konnte.
Diese Studie entwickelte und validierte ein kombiniertes Serum-Biomarker-Panel, das auf dem carcinoembryonalen Antigen, dem Antigen des Plattenepithelkarzinoms und dem Kohlenhydrat-Antigen 125 basiert. Die Analyse verfolgte zwei miteinander verknüpfte Zielsetzungen. Erstens sollte geprüft werden, ob das kombinierte Panel die diagnostische Unterscheidung zwischen ösophagealem Plattenepithelkarzinom und nicht-malignen Kontrollen im Vergleich zu einzelnen Serummarkern verbesserte. Zweitens sollte ermittelt werden, ob die vor der Behandlung bestehende Belastung mit kombinierten Biomarkern zusätzliche prognostische Informationen jenseits herkömmlicher klinisch-pathologischer Variablen und des Tumor-Node-Metastasen-Stadiums lieferte. Durch diese Struktur konnte die Studie beurteilen, ob ein routinemäßig verfügbares Serum-Biomarker-Panel als nichtinvasive Ergänzung zur pathologischen Diagnose, bildgebenden Beurteilung und anatomischen Stadieneinteilung bei der prätherapeutischen klinischen Evaluation dienen kann.
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Diese Studie an menschlichen Probanden, klinischen Aufzeichnungen und Serumperlen wurde gemäß der Deklaration von Helsinki und den institutionellen Anforderungen für die Forschung am Menschen durchgeführt13. Das Studienprotokoll wurde von der Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine unter der Genehmigungsnummer CJ28J12-45 geprüft und genehmigt. Für retrospektiv erhobene anonymisierte klinische Daten und Restserumproben wurde die Anforderung einer zusätzlichen schriftlichen informierten Einwilligung gemäß den ethischen Richtlinien der Institution aufgehoben. Für prospektiv gesammelte Proben wurde vor der Einbindung eine schriftliche informierte Einwilligung eingeholt. Alle Teilnehmerinformationen und Serumproben wurden vor der Analyse anonymisiert. Studienkennungen dienten der Datenverknüpfung, und keine personenbezogenen Identifikationsmerkmale waren im Analyse-Datensatz enthalten.
Studiendesign und Kohortenzuordnung
Diese zweizentrische ambispektive Beobachtungsstudie untersuchte den diagnostischen und prognostischen Wert eines kombinierten Serum-Biomarker-Panels, das das karzinoembryonale Antigen (CEA), das Plattenepithelkarzinom-Antigen (SCC-Ag) und das Kohlenhydrat-Antigen 125 (CA125) für das ösophageale Plattenepithelkarzinom (ESCC) umfasst. Retrospektive Daten wurden aus geeigneten klinischen Befunden und verbliebenen Serumproben vor der Behandlung gewonnen, und eine prospektive Rekrutierung diente der Sammlung zusätzlicher Serumproben vor der Behandlung sowie der Durchführung der Nachbeobachtung im selben Studienrahmen. Die Teilnehmer wurden von einem tertiären Krankenhaus und einem kommunalen Gesundheitszentrum zwischen Januar 2021 und Dezember 2024 rekrutiert, wobei die Nachbeobachtung bis zum 31. Dezember 2025 fortgesetzt wurde. Zentrum A war das tertiäre Krankenhaus und diente als Trainingskohorte für die Modellentwicklung, Schätzung der Koeffizienten, Auswahl der Cutoff-Werte und interne Validierung. Zentrum B war das kommunale Gesundheitszentrum und fungierte als externe Validierungskohorte. Die Studie wurde gemäß den Richtlinien für die transparente Berichterstattung über multivariable Vorhersagemodelle für individuelle Prognose oder Diagnose (TRIPOD) berichtet14.
Insgesamt wurden 277 Teilnehmer eingeschlossen, darunter 194 aus Zentrum A und 83 aus Zentrum B. Der Trainingskohorte gehörten 114 Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC), 40 Kontrollen mit benignen ösophagealen Erkrankungen und 40 gesunde Kontrollen an. Die externe Validierungskohorte umfasste 53 Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC), 15 Kontrollen mit benignen ösophagealen Erkrankungen und 15 gesunde Kontrollen. Zur Minimierung von Informationslecks und zur Prüfung der Modellstabilität in einem unabhängigen klinischen Umfeld erfolgte die zentrumsbasierte Zuordnung anstelle einer zufälligen Aufteilung. In der diagnostischen Analyse wurden die Serumspiegel von CEA, SCC-Ag und CA125 bei Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC), bei Patienten mit benignen ösophagealen Erkrankungen sowie bei gesunden Kontrollen verglichen. Die prognostische Analyse beschränkte sich auf Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC) und untersuchte, ob die kombinierte Belastung durch Biomarker die Risikostratifizierung für das Gesamtüberleben (OS) und das progressionsfreie Überleben (PFS) verbesserte. Das Studiendesign, die Teilnehmerrekrutierung, die Kohortenzuordnung, der Workflow zur Analyse der serumbasierten Biomarker, die Entwicklung des diagnostischen Modells, die externe Validierung sowie der Vergleich der prognostischen Modelle sind in Abbildung 1 zusammengefasst.
Der Teilnehmerfluss umfasste die Einschreibung, Ausschlüsse, die diagnostische Gruppierung und die zentrumsbasierte Zuordnung. Insgesamt wurden 326 Personen untersucht. 49 Personen wurden ausgeschlossen, darunter 12 mit einer antitumoralen Therapie vor der Blutentnahme, 8 mit einem weiteren primären Malignom, 9 mit schwerer Infektion, Autoimmunerkrankung oder unkontrollierten Komorbiditäten, die wahrscheinlich die serumgebundenen Tumormarker beeinflusst hätten, 11 mit Hämolyse, Lipämie, ikterischer Interferenz, unzureichendem Serumvolumen oder verlängertem Verarbeitungsintervall sowie 9 mit fehlenden wichtigen klinischen, pathologischen oder Nachsorge-Daten. Die endgültige analytische Studienpopulation umfasste 277 Teilnehmer: 167 ESCC-Patienten, 55 Kontrollpersonen mit benignen Speiseröhrenerkrankungen und 55 gesunde Kontrollpersonen.
Begründung zur Stichprobengröße
Die Stichprobengröße wurde anhand der konsekutiven Verfügbarkeit geeigneter Teilnehmer, Vorbehandlungs-Serumproben und Nachverfolgungsinformationen während des vorgegebenen Studienzeitraums bestimmt. Das diagnostische Modell verwendete drei kontinuierliche Serum-Biomarker als Kandidaten-Prädiktoren. In der Trainingskohorte standen 114 ESCC-Fälle und 80 Nicht-ESCC-Kontrollen zur Verfügung, was 38,0 ESCC-Fällen und 26,7 Nicht-ESCC-Kontrollen pro Kandidaten-Biomarker-Prädiktor entspricht. Dies unterstützte eine logistische Regression mit geringer Dimensionalität und verringerte das Überanpassungsrisiko. Die externe Validierungskohorte umfasste 53 ESCC-Fälle und 30 Nicht-ESCC-Kontrollen und wurde ausschließlich zur Validierung verwendet, ohne dass die Koeffizienten neu geschätzt wurden. Die Begründung der Stichprobengröße orientierte sich an aktuellen Grundsätzen für Vorhersagemodelle, die auf der Häufigkeit des Endpunkts, der Anzahl der Kandidaten-Prädiktorparameter, der erwarteten Modellleistung und einer unabhängigen Validierung basieren, anstatt auf zufälliger Datenaufteilung15.
Rekrutierung der Teilnehmer, Eignungskriterien und Datenerhebung
Die Teilnehmer wurden kontinuierlich während des Studienzeitraums rekrutiert. In Zentrum A wurden ESCC-Patienten aus den Abteilungen Thoraxchirurgie, Gastroenterologie und Onkologie rekrutiert. In Zentrum B wurden ESCC-Patienten über screeningsbasierte Programme in der Gemeinschaft, Nachsorgeakten oder Überweisungswegen identifiziert und nur dann eingeschlossen, wenn eine histopathologische Bestätigung und vorbehandlungsbedingte Serumproben vorlagen. Kontrollpersonen mit benignen Speiseröhrenerkrankungen wurden aus Personen rekrutiert, die eine Gastroskopie wegen Dysphagie, Refluxsymptomen oder Verdacht auf Speiseröhrenveränderungen durchlaufen hatten und nicht-maligne pathologische Befunde aufwiesen. Gesunde Kontrollpersonen wurden aus Routine-Gesundheitsuntersuchungen im gleichen Zeitraum ausgewählt und wiesen keine Vorgeschichte von Malignitäten, aktiven Infektionen, schweren Leber- oder Nierenfunktionsstörungen oder bildgebenden/endoskopischen Hinweisen auf raumfordernde Läsionen der Speiseröhre auf.
ESCC-Patienten waren berechtigt, wenn bei ihnen ein primäres Ösophaguskarzinom durch eine gastroskopische Biopsie oder postoperative Pathologie bestätigt wurde, sie vor der Blutentnahme keine antitumorale Therapie erhalten hatten und vollständige klinische Basisdaten, pathologische Befunde sowie vorbehandlungsbezogene Serumproben vorlagen. Teilnehmer wurden ausgeschlossen, wenn sie ein anderes primäres Malignom aufwiesen, zuvor eine antitumorale Therapie vor der Blutentnahme erhalten hatten, eine schwere akute Infektion, eine aktive Autoimmunerkrankung, nicht kontrollierte Komorbiditäten mit wahrscheinlichem Einfluss auf die Serumtumormarkerwerte, sichtbare Hämolyse, Lipämie, ikterische Interferenz, unzureichendes Serumvolumen, fehlende wichtige klinische Variablen oder keine verfügbaren Nachsagedaten hatten. Die prognostische Analyse beschränkte sich auf ESCC-Patienten mit verfügbarer Tumor-Node-Metastase-(TNM-)Stadieneinteilung und messbaren Überlebens- oder Progressionsendpunkten. Patienten mit einer Nachsorge von weniger als 6 Monaten wurden einbezogen, wenn innerhalb dieses Zeitraums ein Tod oder ein Progress auftrat.
Zu den Basisvariablen gehörten Alter, Geschlecht, Rauchgeschichte, Alkoholkonsumgeschichte, Body-Mass-Index, Studienzentrum, Diagnosegruppe, Läsionstyp sowie die Serumspiegel von CEA, SCC-Ag und CA125. Bei Patienten mit Ösophaguskarzinom (ESCC) wurden zusätzliche Variablen erfasst, darunter Tumorlokalisation, Tumorlänge, histologische Differenzierung, Invasions Tiefe, Lymphknotenstatus, TNM-Stadium, lymphovaskuläre Invasion, initiale Behandlungsmodalität, Rezidiv, Progression, Überlebensstatus und Datum der letzten Nachuntersuchung. Die Rauchgeschichte wurde definiert als gegenwärtiges Rauchen oder früheres regelmäßiges Rauchen von mindestens 100 Zigaretten im Laufe des Lebens. Die Alkoholkonsumgeschichte wurde definiert als Alkoholkonsum von mindestens einmal pro Woche über einen Zeitraum von mehr als sechs Monaten. Die TNM-Klassifikation erfolgte gemäß der achten Auflage des Stadiensystems des American Joint Committee on Cancer/Union for International Cancer Control für Ösophaguskarzinom16. Pathologische Präparate von Fällen mit Ösophaguskarzinom (ESCC) und benignen Läsionen wurden unabhängig voneinander von zwei erfahrenen Pathologen überprüft, wobei bei Uneinigkeiten ein dritter Pathologe zur Konsensfindung hinzugezogen wurde.
Zwei geschulte Forscher extrahierten unabhängig voneinander klinische Informationen aus elektronischen Patientenakten, pathologischen Befunden, Labordaten, Behandlungsunterlagen, Nachsorgeakten und Sterberegistern mithilfe eines vorab festgelegten Datenwörterbuchs. Unstimmigkeiten wurden durch Überprüfung der Originaldokumente geklärt, wobei ein dritter Forscher bei Bedarf die endgültige Entscheidung traf. Die Tumoralokalisation wurde in obere, mittlere oder untere Speiseröhre unterteilt. Die histologische Differenzierung wurde als gut, mäßig oder schlecht differenziert klassifiziert. Die Einheiten für kontinuierliche Variablen wurden vor der Analyse in beiden teilnehmenden Zentren standardisiert.
Blutentnahme, Serumverarbeitung und Biomarkerbestimmung
Alle Blutproben wurden vor der initialen Behandlung, innerhalb von 7 Tagen nach der pathologischen Bestätigung und mindestens 3 Tage vor Therapiebeginn entnommen. Zwischen 7:00 Uhr und 9:00 Uhr morgens wurden periphere venöse Blutproben von 5–8 mL nach einer nächtlichen Fastenphase unter Verwendung von Röhrchen mit Serumtrenngel entnommen. Die Probenentnahme wurde verschoben, wenn der Teilnehmer innerhalb von 72 Stunden vor der Entnahme eine Bluttransfusion, eine Albumininfusion mit großem Volumen oder ein invasives Verfahren erhalten hatte. Die Proben durften 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen und wurden anschließend 10 Minuten lang bei 1.500 × g zentrifugiert. Das Serum wurde abgetrennt und in 3–5 mit Barcode beschriftete Röhrchen portioniert, wobei jede Portion 300–500 µL enthielt. Die Aliquote wurden bis zur Analyse bei −80 °C gelagert, wobei kein Aliquot mehr als einem Einfrier- und Auftauzyklus unterzogen wurde. Proben mit sichtbarer Hämolyse, Lipämie, ikterischer Störung, unzureichendem Volumen oder einer Zeitspanne zwischen Probenentnahme und Einfrieren von mehr als 2 Stunden wurden ausgeschlossen.
Serum-CEA, SCC-Ag und CA125 wurden mithilfe automatisierter chemilumineszenter Immunassay-Systeme gemäß den Herstelleranweisungen bestimmt. Serumproben wurden vor der Analyse bei 4 °C aufgetaut, vorsichtig gemischt und nach Möglichkeit in einem einzigen Durchgang analysiert. Falls eine Batch-Analyse erforderlich war, wurde die Reihenfolge der Proben so organisiert, dass keine systematische Gruppierung nach Erkrankungsstatus, Zentrum, pathologischem Stadium oder Follow-up-Ergebnis vorlag. Proben, deren Werte über dem analytischen Messbereich lagen, wurden gemäß den Reagenzianweisungen verdünnt und erneut getestet. Das Laborpersonal war unkenntlich gegenüber der Zugehörigkeit der Teilnehmergruppe, dem pathologischen Stadium, dem Behandlungsstatus und dem Follow-up-Ergebnis.
Die klinischen Schwellenwerte betrugen 5,0 ng/mL für CEA, 1,5 ng/mL für SCC-Ag und 35 U/mL für CA125, basierend auf lokalen Laborstandards und den Referenzintervallen der Hersteller. Diese Schwellenwerte wurden verwendet, um die Markererhöhung und eine hohe kombinierte Biomarkerlast für assoziationsanalytische Untersuchungen bezüglich klinisch-pathologischer Parameter sowie für die Überlebensstratifizierung zu definieren. Für die diagnostische Klassifizierung wurden datenbasierte Cutoffs ausschließlich im Trainingskollektiv anhand des Youden-Index ausgewählt und anschließend unverändert auf die externe Validierungskohorte angewandt. Vor der Durchführung der Tests erfolgten die Kalibrierung des Instruments und die interne Qualitätskontrolle. Hoch- und niedrigkonzentrierte Kontrollen wurden an jedem Testtag mitgeprüft, und die Tests wurden nur durchgeführt, wenn die Ergebnisse der Qualitätskontrolle innerhalb des akzeptierten Bereichs lagen.
Die Zwischenanalysen- und Zwischenzentren-Reproduzierbarkeit wurde vor der endgültigen Modellanalyse anhand verblindeter Überbrückungs-Serumaliquots und routinemäßiger Qualitätskontrollmaterialien beurteilt. Ein Überbrückungssatz aus 30 verblindeten Serumaliquots wurde in beiden Laborabläufen getestet. Die Zwischenzentren-Variationskoeffizienten betrugen 4,8 % für CEA, 5,6 % für SCC-Ag und 5,1 % für CA125. Die entsprechenden Intraklassen-Korrelationskoeffizienten lagen bei 0,94 für CEA, 0,92 für SCC-Ag und 0,93 für CA125. Es erfolgte keine zenterspezifische Nachkalibrierung der Assays, da keine systematischen Abweichungen den vorab definierten Bereich der laborinternen Qualitätskontrolle überschritten. Die endgültigen Biomarkerwerte wurden vor der Modellerstellung durch Einheitenstandardisierung und statistische Standardisierung basierend auf der Trainingskohorte harmonisiert.
Kombinierte Biomarker-Definition und Modellkonstruktion
Das kombinierte Panel aus Serum-Biomarkern bestand aus CEA, SCC-Ag und CA125. Für die Analyse der klinisch-pathologischen Assoziationen und die Kaplan-Meier-Überlebensstratifizierung wurde jeder Marker entsprechend der vordefinierten klinischen Schwelle als erhöht oder nicht erhöht klassifiziert. Ein hoher kombinierter Biomarker-Belastungswert wurde definiert als Erhöhung von mindestens zwei der drei Marker. Für die diagnostische und prognostische Modellierung wurden die drei Biomarker als kontinuierliche Variablen beibehalten, mittels des natürlichen Logarithmus transformiert und mit Hilfe des Mittelwerts und der Standardabweichung aus der Trainingskohorte standardisiert. Die gleichen Transformationsparameter wurden auf die externe Validierungskohorte angewandt.
Die standardisierten log-transformierten Biomarker wurden anhand der folgenden Parameter der Trainingskohorte berechnet:
zlnCEA = (lnCEA - 1,42)/0,71
zlnSCC - Ag = (lnSCC - Ag - 0,28)/0,57
zlnCA125 = (lnCA125 - 3,05)/0,62
Die kombinierte diagnostische Panel wurde mittels multivariater logistischer Regression in der Trainingskohorte erstellt. Der diagnostische lineare Prädiktor wurde wie folgt berechnet:
LPdiagnostic = -0,46 + 0,59 × zlnCEA + 1,05 × zlnSCC - Ag+0,42 × zlnCA125
Die individuelle vorhergesagte Wahrscheinlichkeit von ESCC wurde wie folgt berechnet:
PESCC = 1/1+exp(-LPdiagnostic)
Die optimale diagnostische Grenze für das kombinierte Panel betrug 0,57, ausgewählt in der Trainingskohorte anhand des Youden-Index und unverändert in der externen Validierung angewandt.
Die prognostische Biomarker-Score wurde mithilfe einer Cox-Proportionalitäts-Modellierung konstruiert. Als Vergleichsmodell für die anatomische Stadieneinteilung diente das alleinige TNM-Stadium-Modell. Das Biomarker-Modell verwendete die kombinierte Biomarker-Belastung. Das klinisch-pathologische Modell umfasste Alter, Tumorlänge, histologische Differenzierung, pT-Stadium, Lymphknotenstatus und initiale Behandlungsmodalität. Dem klinisch-pathologischen Modell wurde im integrierten Modell eine hohe kombinierte Biomarker-Belastung hinzugefügt. Für das OS wurde der integrierte prognostische lineare Prädiktor wie folgt berechnet:
LPOS = 0.33 × Alter ≥65 Jahre + 0,36 × Tumorlänge ≥5 cm + 0,25 × schlechte Differenzierung + 0,31 × pT3
- 4-Stadium + 0,66 × Lymphknotenmetastase
-0,58 × Radikaloperation - basierende Behandlung
+0,81 × highcombinedbiomarkerburden
Für PFS wurde der integrierte prognostische lineare Prädiktor wie folgt berechnet:
LPPFS = 0,27 × Alter ≥ 65 Jahre + 0,31 × Tumorlänge ≥ 5 cm + 0,24 × schlechte Differenzierung + 0,25 × pT3
-4. Stadium + 0,55 × Lymphknotenmetastase
– 0,46 × Radikaloperation – basierende Behandlung
+0,71 × hohe kombinierte Biomarkerlast
Alle binären Variablen in den prognostischen Gleichungen wurden mit 1 kodiert, wenn vorhanden, und mit 0, wenn nicht vorhanden. Alle Koeffizienten, Standardisierungsparameter und Schwellenwerte wurden anhand der Trainingskohorte geschätzt und ohne erneute Optimierung direkt auf die externe Validierungskohorte angewandt.
Diagnostische und prognostische Endpunkte
Die pathologische Diagnose wurde als diagnostischer Referenzstandard verwendet. Der primäre diagnostische Endpunkt war die Unterscheidung zwischen ESCC und Nicht-ESCC-Kontrollen, einschließlich benigner Speiseröhrenerkrankungen und gesunder Kontrollen. Zu den sekundären diagnostischen Endpunkten gehörten die Unterscheidung zwischen ESCC und benigner Speiseröhrenerkrankung, ESCC und gesunden Kontrollen sowie zwischen frühen ESCC-Stadien und nicht malignen Kontrollen. Frühe ESCC-Stadien wurden als TNM-Stadium I–II definiert. Die diagnostische Leistung wurde anhand von Receiver-Operating-Characteristic-Kurven, Fläche unter der Kurve, Sensitivität, Spezifität, positivem Vorhersagewert, negativem Vorhersagewert, Genauigkeit, F1-Score, Precision-Recall-Kurven, Kalibrationskurven, Brier-Scores, Kalibrationsintercepts, Kalibrierungssteigungen und der Entscheidungskurvenanalyse bewertet.
Die prognostische Analyse wurde ausschließlich bei Patienten mit Ösophagus-Plattenepithelkarzinom (ESCC) durchgeführt. Der primäre prognostische Endpunkt war das Gesamtüberleben (OS), definiert als der Zeitraum vom Datum der ersten definitiven antitumoralen Behandlung bis zum Tod aus beliebiger Ursache. Der sekundäre prognostische Endpunkt war das progressionsfreie Überleben (PFS), definiert als der Zeitraum von der Erstbehandlung bis zur dokumentierten Krankheitsprogression, Rezidiv oder dem Tod. Bei Patienten, die einer kurativen Operation unterzogen wurden, galt ein lokales Rezidiv, eine Fernmetastasierung oder ein tumorbedingter Tod als PFS-Ereignis, sofern nach der Operation kein Residualläsion vorhanden war. Bei Patienten, die eine definitive Radiochemotherapie oder eine palliative Behandlung erhielten, wurde die Progression anhand bildgebender Verfahren, endoskopischer Beurteilung und klinischer Evaluation festgestellt.
Nachsagedaten wurden durch ambulante Besuche, Krankenhausaufenthaltsakten, Gemeinschaftsnachsorgeakten, Überweisungsakten und telefonischen Kontakt erhoben. Die Patienten wurden in den ersten 2 Jahren nach der Behandlung alle 3 Monate, von Jahr 3 bis 5 alle 6 Monate und danach jährlich nachbetreut. Patienten ohne Tod, Rezidiv oder Progress zum Zeitpunkt des letzten Nachsagekontakts wurden zum Datum ihres letzten bestätigten Kontakts zensiert. Die Ergebnisereignisse wurden unabhängig voneinander von zwei Untersuchern überprüft. Wenn sich die Ereignisdaten zwischen den Quellen unterschieden, wurden Bildgebungsberichte, Entlassungsakten, endoskopische Berichte, Überweisungsdokumente und Sterberegisterakten geprüft, um das endgültige Ereignisdatum festzulegen. Das Nachsage-Stichtag war für beide teilnehmenden Zentren der 31. Dezember 2025.
Statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde mit R 4.3.2 und SPSS 27.0 durchgeführt. Stetige Variablen wurden je nach Verteilung als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median (Interquartilbereich) zusammengefasst. Kategoriale Variablen wurden als Häufigkeiten und Prozentanteile dargestellt. Gruppenvergleiche wurden je nach Eignung mittels des t-Tests für unabhängige Stichproben, des Mann-Whitney-U-Tests, der einfaktoriellen Varianzanalyse, des Kruskal-Wallis-Tests, des Chi-Quadrat-Tests oder des exakten Fisher-Tests durchgeführt. Fehlende Daten wurden vor der Modellerstellung überprüft. Teilnehmer mit fehlendem wichtigem Diagnosestatus, fehlenden prätherapeutischen Biomarkerwerten, fehlendem TNM-Stadium oder fehlenden Daten zu Überleben/Progression wurden gemäß den vorab festgelegten Einschlusskriterien ausgeschlossen. Nicht wesentliche Kovariaten mit einem Fehlendanteil unter 5,0 % wurden mittels multipler Imputation durch verkettete Gleichungen mit 20 imputierten Datensätzen und 20 Iterationen behandelt17. Die Imputationsmodelle umfassten Diagnosegruppe, Zentrum, Alter, Geschlecht, Rauchgeschichte, Alkoholkonsum, Biomarkerwerte, TNM-Stadium, Behandlungsmodalität, OS-Status, PFS-Status und Nachbeobachtungszeit. Analysen an vollständigen Fällen wurden als Sensitivitätsanalysen durchgeführt.
Das diagnostische Modell wurde an der Trainingskohorte entwickelt. Zur Berechnung der Fläche unter der Kurve, Sensitivität, Spezifität, positiven Vorhersagewerte, negativen Vorhersagewerte, Genauigkeit und des F1-Scores wurden Receiver-Operating-Characteristic-Kurven verwendet. Die Flächen unter den Kurven wurden mittels des DeLong-Tests18 verglichen. Als ergänzende diagnostische Bewertung kamen Precision-Recall-Kurven zum Einsatz. Die Kalibrierung wurde anhand von Kalibrierungskurven, Brier-Scores, Kalibrierungsinterzepten und Kalibrierungssteigungen beurteilt. Die klinische Nützlichkeit wurde mittels Decision-Curve-Analyse19 evaluiert. Die interne Validierung erfolgte durch 1.000 Bootstrap-Stichproben, um die diskriminative Leistung und Kalibrierung unter Korrektur für Optimismus zu schätzen. Die externe Validierung wurde durchgeführt, indem die aus der Trainingskohorte stammende Gleichung, Standardisierungsparameter und der Schwellenwert direkt auf Zentrum B angewandt wurden, ohne erneutes Anpassen.
Für die prognostische Analyse wurden Kaplan-Meier-Kurven erstellt, um das Gesamtüberleben (OS) und das progressionsfreie Überleben (PFS) zwischen den Gruppen mit unterschiedlicher Biomarker-Belastung zu vergleichen, und der Log-Rang-Test wurde zur Beurteilung von Überlebensunterschieden verwendet. Die Cox-Regression mit proportionalen Hazards diente der Schätzung von Hazard-Ratios und 95%-Konfidenzintervallen. Variablen mit klinischer Relevanz sowie Variablen, die in der univariablen Analyse mit den Ergebnissen assoziiert waren, wurden für multivariable Modelle berücksichtigt. Die Modellleistung wurde anhand des Harrellschen C-Index, zeitabhängiger ROC-Kurven (receiver operating characteristic), Kalibrierungskurven, Brier-Scores und der Entscheidungskurvenanalyse bewertet20. Die prognostische Kalibrierung wurde nach 1, 3 und 5 Jahren überprüft. Die Annahme proportionaler Hazards wurde mithilfe von Schoenfeld-Residuen und Log-minus-Log-Überlebensplots geprüft21. Die globalen Schoenfeld-Test-P-Werte betrugen 0,42 für das OS-Modell und 0,37 für das PFS-Modell. Multikollinearität wurde vor der endgültigen Interpretation des Modells anhand von Varianzinflationsfaktoren überprüft, wobei alle Kandidatenvariablen in den endgültigen diagnostischen und prognostischen Modellen Varianzinflationsfaktoren unter 2,1 aufwiesen. Der zusätzliche prognostische Wert jenseits des TNM-Stadiums und konventioneller klinisch-pathologischer Modelle wurde mittels Net Reclassification Improvement und Integrated Discrimination Improvement bewertet. Die im Trainingskollektiv geschätzten Modellparameter wurden ohne Neuanpassung auf die externe Validierungskohorte angewandt22. Alle Tests waren zweiseitig, und ein P < 0,05 galt als statistisch signifikant.
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Teilnehmerfluss und Reproduzierbarkeit des Assays
Insgesamt wurden 326 Personen untersucht, von denen 49 ausgeschlossen wurden: 12 hatten vor der Blutentnahme eine antitumorale Therapie erhalten, 8 wiesen ein anderes primäres Malignom auf, 9 hatten eine schwere Infektion, Autoimmunerkrankung oder unkontrollierte Komorbiditäten, die wahrscheinlich die serumgebundenen Tumormarker beeinflusst hätten, 11 zeigten Hämolyse, Lipämie, ikterische Interferenzen, unzureichendes Serumvolu...
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Diese zweizentrische Studie entwickelte und validierte extern ein kombiniertes Serum-Biomarker-Panel, das CEA, SCC-Ag und CA125 zur diagnostischen und prognostischen Beurteilung bei ESCC integriert. Das kombinierte Panel zeigte eine bessere Leistung als jeder einzelne Biomarker bei der Unterscheidung von ESCC und nicht-malignen Kontrollen und behielt im externen Validierungskohort eine akzeptable Diskriminierungsfähigkeit bei. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren ESCC-Studien überein, die zeigen, dass serumbasierte Tumorm...
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Die Autoren danken dem Personal der Abteilung für Labormedizin, Jiangsu-Provinzkrankenhaus für Chinesische Medizin, Anschlusskrankenhaus der Nanjing-Universität für Chinesische Medizin, und dem Gesundheitszentrum Nanhu Community in Nanjing für ihre Unterstützung bei der Probenentnahme, Laboruntersuchungen und Datenverwaltung.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zugriff auf CEA-Kalibratoren | Beckman Coulter | 33205 | Kalibrierung für das Serum-CEA-Assay |
| Zugriff auf CEA-Qualitätskontrollen | Beckman Coulter | 33029 | Tägliche interne Qualitätskontrolle für das Serum-CEA-Assay |
| Zugriff auf CEA-Reagenzienpackung | Beckman Coulter | 33200 | Bestimmung des CEA im Serum mit dem UniCel DxI 800 Access Immunoassay-System |
| Justierbare Mikropipette, 100–1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Portionierung des Serums nach der Zentrifugation |
| ARCHITECT CA 125 II Kalibratoren | Abbott Diagnostics | 02K4502 | Kalibrierung für das Serum-CA125-Assay |
| ARCHITECT CA 125 II Kontrollen | Abbott Diagnostics | 02K4511 | Tägliche interne Qualitätskontrolle für das Serum-CA125-Assay |
| ARCHITECT CA 125 II Reagenzienkit | Abbott Diagnostics | 02K4529 | Bestimmung des CA125 im Serum mit dem ARCHITECT i2000SR Immunoassay-Analysator |
| ARCHITECT i2000SR Immunoassay-Analysator | Abbott Diagnostics | i2000SR | Automatisierte chemilumineszente Mikropartikel-Immunoassay-Plattform zur Untersuchung von SCC-Ag und CA125 |
| ARCHITECT SCC-Kalibrator | Abbott Diagnostics | 8D1801 | Kalibrierung für das Serum-SCC-Ag-Assay |
| ARCHITECT SCC-Kontrollen | Abbott Diagnostics | 8D1810 | Tägliche interne Qualitätskontrolle für das Serum-SCC-Ag-Assay |
| ARCHITECT SCC-Reagenzienkit | Abbott Diagnostics | 8D1828 | Bestimmung des SCC-Ag im Serum mit dem ARCHITECT i2000SR Immunoassay-Analysator |
| Barcode-Etikettendrucker | Brady | BMP51 | Barcode-Etikettierung von Serum-Aliquots und kryogenen Gefäßen |
| Blutentnahmenadel | BD Biosciences | 367286 | Periphere venöse Blutentnahme |
| Kryogenlagerbox | Corning | 431131 | Geordnete Lagerung von gefrorenen Serum-Aliquots |
| Kryogengefäß, 2,0 mL, Außengewinde, selbststehend | Corning | 430659 | Barcode-beschriftete Lagerung von Serum-Aliquots bei −80 °C |
| Datenextraktionsformular und vordefiniertes Datenwörterbuch | Studiengruppe | Nicht zutreffend | Standardisierte Extraktion klinischer, pathologischer, laborbezogener und Nachverfolgungsvariablen |
| dcurves-Paket | R-Paket | Version 0.4.0 | Entscheidungskurvenanalyse und Schätzung des klinischen Nutzens |
| Elektronisches Patientenaktensystem | Teilnehmende Krankenhäuser | Nicht zutreffend | Extraktion von demografischen, klinischen, therapeutischen und Nachverfolgungsdaten |
| Gefilterte Pipettenspitzen, 100–1000 µL | Eppendorf | 30073594 | Kontaminationskontrollierte Serum-Aliquotierung |
| ggplot2-Paket | R-Paket | Version 3.5.1 | Statistische Visualisierung und Abbildungserstellung |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 27.0 | Vergleiche der Basisliniendaten und ergänzende statistische Prüfungen |
| Laborinformationsverwaltungssystem | Labor des teilnehmenden Krankenhauses | Nicht zutreffend | Abruf und Verknüpfung von Serum-Biomarker-Testdatensätzen |
| mice-Paket | R-Paket | Version 3.16.0 | Mehrfache Imputation durch verkettete Gleichungen |
| nricens-Paket | R-Paket | Version 1.6 | Analyse der Netto-Reklassifizierungsverbesserung |
| Pathologie-Berichtssystem | Teilnehmende Krankenhäuser | Nicht zutreffend | Bestätigung der ESCC-Diagnose, gutartiger Pathologie, Tumoreigenschaften und stagingbezogener Variablen |
| pROC-Paket | R-Paket | Version 1.18.5 | Analyse der ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic) und DeLong-Vergleich |
| R-Statistiksoftware | R Foundation for Statistical Computing | Version 4.3.2 | Statistische Analyse, Modellbildung, Validierung und Erstellung von Abbildungen |
| Kühlzentrifuge | Eppendorf | 5810 R | Serumtrennung durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 10 min |
| rms-Paket | R-Paket | Version 6.8-1 | Kalibrationsanalyse, Nomogrammerstellung und Unterstützung von Regressionsmodellen |
| Serumtrenn-Röhrchen für die Blutentnahme, 5 mL | BD Biosciences | 367955 | Entnahme nüchternen peripheren venösen Blutes zur Biomarker-Testung im Serum |
| survival-Paket | R-Paket | Version 3.5-7 | Cox-Proportional-Hazards-Regression und Überlebensanalyse |
| survminer-Paket | R-Paket | Version 0.4.9 | Visualisierung der Kaplan–Meier-Kurve |
| Telefonnachverfolgungs-Aufzeichnungsformular | Studiengruppe | Nicht zutreffend | Sammlung und Überprüfung von Informationen zu Überleben, Rezidiv, Progression und letztem Kontakt |
| timeROC-Paket | R-Paket | Version 0.4 | Zeitabhängige ROC-Kurvenanalyse |
| Ultra-niedertemperaturgefrierschrank | Thermo Fisher Scientific | TSX60086A | Lagerung von Serum-Aliquots bei −80 °C |
| UniCel DxI 800 Access Immunoassay-System | Beckman Coulter | DxI 800 | Automatisierte chemilumineszente Immunoassay-Plattform zur CEA-Bestimmung im Serum |
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