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Methodenartikel

Nachweis von intratumoralen Immunzell-Antigenen in einem immunkompetenten Glioblastom-Stammzell-Modell mittels substratbasierter Immunhistochemie

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DOI:

10.3791/72193

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21. August 2026

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1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Studie stellt einen detaillierten, reproduzierbaren, auf Substraten basierenden Immunhistochemie-Workflow für den konsistenten Nachweis einzelner und doppelter Antigene in formalinfixierten, paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten von Glioblastom-Stammzell-abstammigen Tumoren bereit. Das Protokoll ermöglicht die Identifizierung verschiedener Immun- und Tumormarker und berücksichtigt dabei technische Herausforderungen, wobei es auch für andere Tumormodelle geeignet sein könnte.

Zusammenfassung

Glioblastom (GBM) ist die häufigste und tödlichste primäre bösartige Hirnerkrankung, für die es derzeit keine wirksamen Therapien gibt. Es zeichnet sich durch eine stark immunsuppressive Tumormikroumgebung aus, die unter anderem durch therapieresistente GBM-Stammzellen-ähnliche Zellen (GSCs) verursacht wird. Hier beschreiben wir reproduzierbare substratbasierte Einzel- und Doppelfärbungs-Immunhistochemie-(IHC-)Protokolle zum Nachweis von tumorinfiltrierenden, immunzellassoziierten Oberflächen- und intrazellulären Antigenen in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Hirntumorschnitten. Die Hirntumoren stammten von murinen GSCs, die orthotop in immunkompetenten Mäusen implantiert worden waren. Der Einzelfarben-IHC-Arbeitsablauf verwendet ein auf der Speiserrübisperoxidase (HRP) basierendes chromogenes Nachweissystem zur Visualisierung einzelner Immunzellantigene, während der Doppelfarben-IHC-Arbeitsablauf eine sequenzielle, auf alkalischer Phosphatase (AP) basierende Färbestrategie nutzt, um zwei Immunzellantigene gleichzeitig im selben Gewebeschnitt nachzuweisen, einschließlich Arbeitsabläufen, die Primärantikörper gleicher Wirtsursprungs verwenden. Diese Methoden bieten einen praktischen und reproduzierbaren Rahmen für die chromogene Analyse von tumorinfiltrierenden, immunzellassoziierten Antigenen in GBM-Geweben und könnten möglicherweise auf andere präklinische Tumormodelle sowie potenziell auf menschliche FFPE-Proben übertragen werden.

Einleitung

Glioblastom (GBM) ist ein aggressiver, hochinvasiver und heterogener primärer maligner Hirntumor, der trotz der derzeitigen Standardtherapien mit einer schlechten Überlebensrate der Patienten assoziiert ist1. Ein charakteristisches Merkmal des GBM ist seine stark immunsuppressive Tumormikroumgebung (TME), die zur Resistenz gegenüber immuntherapeutischen Strategien beiträgt2,3. Mehrere Mechanismen führen zur Immunsuppression beim GBM, darunter eine verminderte Infiltration von Effektor-T-Zellen sowie die Induktion von T-Zell-Dysfunktion und -Erschöpfung4. Darüber hinaus fördern Glioblastom-stammähnliche Zellen (GSCs), eine Teilpopulation von GBM-Zellen, die Immunflucht weiter, indem sie eine immunologisch „kalte“ TME aufrechterhalten, die durch begrenzte zytotoxische Immunaktivität gekennzeichnet ist5. Diese Merkmale verdeutlichen die Bedeutung einer genauen Charakterisierung der tumorinfiltrierenden Immunzellenpopulationen und ihrer funktionellen Zustände in der TME des GBM.

Die Immunhistochemie (IHC) gehört nach wie vor zu den am häufigsten verwendeten Methoden zur Beurteilung der Immunzellinfiltration in Tumorgeweben, da sie die Gewebearchitektur erhält und gleichzeitig die Visualisierung, Lokalisierung und semiquantitative Bewertung zellulärer Marker in situ6,7,8,9,10,11,12 ermöglicht. Frühere immunhistochemische und Immunprofiling-Studien haben unser Verständnis der immunologischen Landschaft des GBM erheblich erweitert und Immunzellpopulationen identifiziert, die mit Tumorprogression und therapeutischer Ansprechbarkeit assoziiert sind12,13,14,15,16. Die einfarbige chromogene IHC ist besonders nützlich zur Detektion einzelner Immunmarker in formalinfixierten, paraffineinbetteten (FFPE) Gewebeschnitten12,13,15,17,18,19,20. Im Gegensatz dazu ermöglicht die zweifarbige chromogene IHC die simultane Visualisierung von zwei Markern im selben Gewebeschnitt, wodurch die Beurteilung des zellulären Phänotyps, der Proliferation oder des Aktivierungsstatus erleichtert wird12,19,21.

Trotz dieser Fortschritte sind praktische und standardisierte substratbasierte chromogene IHC-Protokolle, die auf immunokompetente, aus GSCs stammende GBM-Modelle anwendbar sind, weiterhin begrenzt. Zudem ist die chromogene IHC beim GBM schwieriger als bei vielen anderen soliden Tumoren, da eine spärliche und heterogene Infiltration von Immunzellen, eine ausgeprägte intratumorale Heterogenität sowie ein stark immunsuppressives und komplexes TME die genaue Visualisierung und Interpretation mehrerer zellulärer Populationen im selben Gewebeschnitt erschweren2,3,4. Die duale chromogene IHC bringt zusätzliche technische Herausforderungen mit sich, insbesondere wenn beide primären Antikörper in derselben Wirtsart erzeugt wurden, was eine sorgfältige Optimierung der Antikörperverträglichkeit, eine sequenzielle Färbestrategie zur gleichzeitigen Detektion zweier Antigene im selben Gewebeschnitt und die Auswahl eines chromogenen Substrats zur sicheren Unterscheidung der Marker unter dem Lichtmikroskop erfordert.

Hier beschreiben wir reproduzierbare, substratbasierte Einzel- und Doppelfärbungs-IHC-Protokolle, die repräsentative, tumorinfiltrierende Immunzellen assoziierte Oberflächen- und intrazelluläre Antigene in einem immunokompetenten orthotopen GBM-Modell, das von 005 GSC abgeleitet ist, erfolgreich nachweisen22,23,24. Diese substratbasierten chromogenen IHC-Protokolle können auch an andere präklinische Tumormodelle sowie möglicherweise an humanes FFPE-Tumor­material angepasst werden. Das gewonnene Maushirngewebe wurde wie zuvor beschrieben19 über Nacht (~12 h) in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert, gefolgt von der routinemäßigen Gewebeverarbeitung und Paraffineinbettung. Die FFPE-Blöcke wurden in Schnitten von 5 µm Dicke19 auf positiv geladene Objektträger aufgebracht und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert. Die Einzelfärbungs-IHC verwendet ein auf Horseradish-Peroxidase (HRP) basierendes chromogenes Nachweissystem mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) als Substrat, um ein braunes Signal zu erzeugen, das die Einzelantigene unter dem Lichtmikroskop sichtbar macht. Dieser Arbeitsablauf eignet sich zum Nachweis sowohl membranassoziiierter als auch intrazellulärer Antigene in FFPE-Gewebeschnitten.

Die Doppelfärbung mittels IHC ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von zwei Antigenen im selben Gewebeschnitt, erfordert jedoch eine zusätzliche Optimierung, um die Verträglichkeit der Antikörper und eine klare Trennung der chromogenen Signale sicherzustellen. Die chromogene Doppelfärbung mittels IHC ist vergleichsweise einfach, wenn die primären Antikörper in verschiedenen Wirtsarten erzeugt wurden, sodass spezies-spezifische sekundäre Antikörper verwendet werden können. Der gleichzeitige Nachweis wird hingegen technisch anspruchsvoller, wenn beide primären Antikörper aus derselben Wirtsart stammen. Um diese Herausforderung zu bewältigen, verwendet der hier beschriebene Workflow für die Doppelfärbung mittels IHC eine sequenzielle chromogene Färbung basierend auf alkalischer Phosphatase (AP) unter Verwendung unterschiedlicher Substrate, um unter dem Lichtmikroskop eine klare visuelle Unterscheidung zwischen den beiden Antigensignalen zu ermöglichen.

Beide Arbeitsabläufe umfassen die Entparaffinierung des Gewebes, Rehydratisierung, Epitop-Aufdeckung, Blockierung, Färbung, Dehydratisierung, Klärung und Eindeckung. Die Zubereitung der Reagenzien ist entscheidend für die Qualität und Reproduzierbarkeit der Färbung (siehe Supplementary File 1). Ebenso sind geeignete Verdünnungen der primären Antikörper entscheidend für eine erfolgreiche Färbemethode, die unmittelbar vor Gebrauch in 2,5 % normalem Pferde- oder Ziegenserum erfolgt, abhängig von der Wirtsart des entsprechenden sekundären Antikörpers (siehe Tabelle 1). Eine Liste art-spezifischer sekundärer Antikörper, die für Einzel- und Doppelfärbungen verwendet werden, ist ebenfalls in Tabelle 2 dargestellt. Die Einzelfärbung mittels IHC verwendet auf Xylol basierende Klär- und Eindeckreagenzien, während die Doppelfärbung mittels IHC xylolfreie Alternativen (z. B. Histo-Clear) erfordert, da das Substrat in Xylol teilweise löslich ist (siehe Liste der Substrate in Tabelle 3).

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit allen einschlägigen behördlichen und institutionellen Richtlinien durchgeführt, einschließlich des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (IACUC-Protokollnummern: 2004N000067 und LA24-0045).

HINWEIS: Mehrere Schritte sowohl bei Einzel- als auch bei Doppelfärbungs-IHC-Protokollen beinhalten entzündliche Reagenzien, darunter Ethanol und Gewebe-Entfettungsmittel. Daher sollten Verfahren, die entzündliche Chemikalien umfassen – einschließlich Deparaffinierung, Rehydratisierung, Dehydratisierung, Entfettung und Eindecken – in einer zertifizierten Abzugshaube unter Anwendung geeigneter Laborsicherheitsmaßnahmen durchgeführt werden. Entzündliche Reagenzien sollten in korrekt beschrifteten, verschraubbaren Glasbehältern vorbereitet und in dafür vorgesehenen Schränken für entzündliche Stoffe aufbewahrt werden, gemäß den Sicherheitsrichtlinien der Institution. Die Materialien und Reagenzvolumina sind für die Batch-Verarbeitung von bis zu 48 Objektträgern ausgelegt (zwei Färbevorrichtungen, 24 Objektträger pro Vorrichtung), obwohl der Arbeitsablauf je nach experimentellen Anforderungen leicht skaliert werden kann.

1. Einzelfarben-IHC für FFPE-Gehirntumorschnitte

HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt eine substratbasierte Einzelfarben-IHC zur Detektion repräsentativer Oberflächen- und intrazellulärer Antigene in FFPE-Gehirntumorschnitten, die aus dem orthotopen 005 GSC-Modell stammen.

  1. Dewachsfung (20 min):
    1. Legen Sie die Objektträger in einen Polyoxymethylen-(POM-)Objektträgerhalter und tauchen Sie den Halter nacheinander in zwei mit Xylol I und Xylol II gefüllte Färbegefäße ein, jeweils 10 Minuten lang in einem Abzug. Achten Sie darauf, dass die Gewebeschnitte während der Deparaffinierung vollständig mit Xylol bedeckt bleiben.
      ACHTUNG: Führen Sie diesen Schritt unter einer chemischen Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) durch, einschließlich Laborkittel, Schutzbrille, Gesichtsmaske und Handschuhen. Lassen Sie die Schnitte in diesem und allen folgenden Schritten nicht austrocknen, da dies zu Gewebeschäden und Verlust der Schnitte führen kann. Bewahren Sie Xylollösungen in luftdichten Glasbehältern auf und verwenden Sie sie erneut, sofern sie sauber erscheinen.
  2. Stufenweise Rehydrierung (15 min):
    1. Rehydrieren Sie die Schnitte nacheinander in 100 %, 90 % und 70 % Ethanol jeweils 5 min. Dazu tauchen Sie die Objektträger für 5 min in 100 % Ethanol im Färbebehälter (danach das 100 % Ethanol zur Wiederverwendung in die Glasflasche zurückgeben), anschließend für 5 min in 90 % Ethanol (danach zurück in die Flasche) und schließlich für 5 min in 70 % Ethanol (danach zurück in die Flasche).
      ACHTUNG: Führen Sie diesen Schritt unter einem chemischen Abzug durch und verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung wie in Schritt 1.1 beschrieben. Diese Ethanol-Lösungen können in mehreren Experimenten wiederverwendet werden, sofern sie in luftdicht verschlossenen Glasbehältern gelagert und sauber erscheinen.
  3. Wasserwässerung (5 min):
    1. Legen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in destilliertes Wasser, wodurch der Rehydratisierungsprozess abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Bereiten Sie während dieses Schritts 600 mL (für 1 Objektträgergestell) bis 800 mL (für 2 Objektträgergestelle) von 1× Pufferlösung zur Antigen-Retrieval (10 mM Natriumcitrat-Puffer) in einem 2-L-Mikrowellengeeigneten Glasbecher gemäß den aufgeführten Anweisungen in der Zusatzdatei 1.
  4. Antigen-Retrieval (~20 min):
    1. Decken Sie den 2-L-Becher, der den frisch zubereiteten 10 mM Zitrat-Antigen-Retrieval-Puffer enthält, mit Parafilm ab, um übermäßige Verdunstung während des Vorwärmens und der längeren Mikrowellenbehandlung zu verhindern.
    2. Stechen Sie einige Löcher in die Plastikfolie, um zu verhindern, dass der Puffer durch den während des Kochens der Gewebeschnitte entstehenden Überdruck abgeblasen wird.
      HINWEIS: Verwenden Sie PSA wie in Schritt 1.1.
    3. Erhitzen Sie die frisch zubereitete 10 mM Natriumcitrat-Pufferlösung zur Antigen-Retrieval 3 Minuten lang vor. Geben Sie das Objektträgergestell mit den rehydrierten Gewebeschnitten in die vorgewärmte Antigen-Retrieval-Lösung.
    4. Dann Gewebeschnitte für 15 min bei maximaler Mikrowellenleistung (z. B. P10) erhitzen, dabei das Becherglas sorgfältig überwachen, um sicherzustellen, dass die Schnitte untergetaucht bleiben und nicht durch Verdunstung austrocknen.
      HINWEIS: Alternativ kann die Antigen-Retrieval in einer Kunststoff-Färbewanne, die sich in einem Dampfgarer befindet, für etwa 15 Minuten durchgeführt werden, was eine schonendere Erhitzungsmethode mit geringerem Überwachungsaufwand ermöglicht. Puffer mit Natriumcitrat (10 mM, pH 6,0) wurde erfolgreich validiert und als Antigen-Retrieval-Puffer für alle aufgelisteten primären Antikörper verwendet. Tabelle 1. Abhängig vom Primärantikörper und den Empfehlungen des Herstellers können andere Puffer, wie EDTA oder Tris-EDTA, für Antikörper erforderlich sein, die in dieser Studie nicht untersucht wurden. 
  5. Abkühlen (10–20 min):
    1. Entfernen Sie das Becherglas aus der Mikrowelle, stellen Sie es auf den Arbeitsplatz und lassen Sie es 20 min bei Raumtemperatur abkühlen. Um die Abkühlung zu beschleunigen, stellen Sie das Becherglas etwa 10 min in eiskaltes Leitungswasser.
      ACHTUNG: Es wird äußerst heiß sein; verwenden Sie geeignete hitzebeständige Handschuhe oder Bechermanschetten, um es zu handhaben. Tragen Sie die PSA wie in Schritt 1.1.
  6. Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)-Waschschritt (~10 min):
    1. Entfernen Sie den Objektträgerhalter aus dem Becher und tauchen Sie die Objektträger in 1× DPBS-Lösung im Färbebehälter.
    2. Spülen Sie die Schnitte zweimal in 1× DPBS jeweils 5 min unter Verwendung sanfter, statischer Wäschen, um ein Ablösen des Gewebes zu vermeiden.
  7. Hydrophobe Barriere (<1 min/Objektträger):
    1. Während der DPBS-Waschung (Schritt 1.6) jede Folie einzeln vorsichtig entfernen und den Bereich um den Gewebeschnitt herum mit fusselfreien Tüchern (z. B. Kim Wipes) sanft abwischen, wobei direkter Kontakt mit dem Gewebe selbst vermieden werden sollte.
    2. Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere, wie beispielsweise einen Peroxidase-Anti-Peroxidase-(PAP)-Stift, um eine flüssigkeitsabweisende Barriere um jeden Gewebeschnitt zu zeichnen, und legen Sie den Objektträger anschließend zurück in die DPBS-Spüllösung im Färbebehälter. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Objektträger.
      HINWEIS: Eine hydrophobe Barriere um das Gewebe verhindert das Überschwappen von Reagenzien zwischen den Sektionen und trägt dazu bei, Antikörper auf dem Gewebe zu halten.
  8. Endogene Peroxidase blockieren (5 min):
    1. Verwerfen 1× DPBS aus dem Färbebehälter entfernen, dann 3 % H₂O₂ Lösung, wobei sichergestellt werden muss, dass die Objektträger oder Gewebeschnitte 5 min vollständig darin eingetaucht sind.
      HINWEIS: Prolongierte Inkubation in 3% H₂O₂ kann das Gewebe beschädigen. Die Blockade der endogenen Peroxidase-Aktivität ist ein entscheidender Schritt, um Hintergrundfärbungen durch endogene Peroxidase während der Farbentwicklung zu vermeiden. Verwenden Sie PSA wie in Schritt 1.1.
  9. DPBS-Waschschritt (~12 min):
    1. Verwerfen Sie die 3% H₂O₂ Lösung und spülen Sie die Objektträger erneut in 1× DPBS zweimal für jeweils 5 min.
    2. Nach der zweiten Wäsche die Objektträger aus dem Objektträgerbehälter nehmen, flach in die feuchte Kammer legen und destilliertes Wasser an die Ränder der feuchten Kammer geben.
    3. Lassen Sie die Schnitte nicht austrocknen, sondern fahren Sie sofort mit der Blockierung in Schritt 1.10 fort.
      HINWEIS: Jede aufgeführte befeuchtete Kammer in der Tabelle der Materialien bietet Platz für und kann 30 Objektträger aufnehmen.
  10. Serum-Blockade (~70 min):
    1. Fügen Sie 50 hinzu µL von 5 %iger Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung pro Schnitt und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, wobei der Deckel der feuchten Kammer geschlossen bleibt, um eine Verdunstung des Blockierpuffers aus den Gewebeschnitten zu verhindern.
    2. Nach 30 Minuten die Objektträger vorsichtig auf fusselfreie Tücher, die auf der Arbeitsbank liegen, klopfen, um das BSA zu entfernen.
    3. Dann 2,5 % normales Pferde- oder Ziegen-Serum (ein Tropfen pro Schnitt) zugeben, passend zur Wirtsart des sekundären Antikörpers, und die Schnitte weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur mit geschlossenem Deckel der befeuchteten Kammer inkubieren. Anschließend die Objektträger vorsichtig auf absorbierendem Papier oder fusselfreien Tüchern abstreifen, um das Serum zu entfernen, und unverzüglich mit Schritt 1.11 fortfahren.
      HINWEIS: Lassen Sie die Schnitte nicht austrocknen. Bereiten Sie die primären Antikörper in der geeigneten Blockierpufferlösung vor (siehe Tabelle 1) gegen Ende des Blockierungsschritts, damit sie nach Abschluss der Blockierung für Schritt 1.11 bereitstehen.
  11. Inkubation mit dem Primärantikörper (~16 h):
    1. Applizieren Sie ~50 µL der primären Antikörper, optimal verdünnt im geeigneten Blockpuffer (siehe Tabelle 1), auf Gewebeschnitte auf und inkubieren Sie über Nacht (~16 h) bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die vorgesehenen Bereiche der befeuchteten Kammer mit destilliertem Wasser gefüllt sind, um die Kammer über Nacht feucht zu halten. Achten Sie zudem darauf, dass die vorgesehenen Bereiche/Kammern für die Gewebeschnitte nicht mit destilliertem Wasser gefüllt werden, da dies zu einer Überspülung der Gewebeschnitte führen kann.
  12. DPBS (0,1 % Tween 20) Waschschritt (~18–20 min):
    1. Stellen Sie einen Objektträgerhalter in einen Färbebehälter und füllen Sie ihn mit Waschpuffer (1× DPBS, 0,1 % Tween 20
    2. Nach der Übernacht-Inkubation die Objektträger aus der befeuchteten Kammer nehmen, die primären Antikörper vorsichtig durch Antippen der Objektträger auf saugfähigem Papier entfernen und anschließend die Objektträger in eine Objektträgerhalterung geben, die in Waschpuffer (1× DPBS, 0,1 % Tween 20) in einem Färbebehälter und verwerfen Sie die Waschlösung.
    3. Anschließend waschen Sie die Schnitte in 1× DPBS (0,1 % Tween 20) dreimal für jeweils 5 min waschen, dann die Objektträger aus dem Objektträgerhalter nehmen und flach in die befeuchtete Kammer legen und unverzüglich mit Schritt 1,13 fortfahren.
      HINWEIS: Die Dauer jeder Waschung kann auf 10–15 min verlängert werden, falls nach der Farbentwicklung in Schritt 1.15 eine hohe Hintergrundanfärbung beobachtet wird. Das Waschen sollte sanft und statisch erfolgen (kein Schütteln oder Schwenken), um ein Ablösen des Gewebes von den Objektträgern zu verhindern.
  13. Inkubation mit sekundärem Antikörper (~32–35 min):
    1. Geben Sie einen Tropfen/Schnitt des geeigneten HRP-konjugierten sekundären Antikörpers (gegen Kaninchen- oder Ratten-IgG, je nach Bedarf; siehe Tabelle 2) und inkubieren Sie die Gewebeschnitte 30 Minuten bei Raumtemperatur mit geschlossenem Deckel der befeuchteten Kammer.
      HINWEIS: Der sekundäre Antikörper kann im Schritt 1.15 mit PBS 1:1 verdünnt werden, um die Hintergrundfärbung zu reduzieren.
  14. DPBS (0,1 % Tween 20) Wäsche (~18–20 min):
    1. Nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper die Objektträger aus der befeuchteten Kammer nehmen und die Objektträger vorsichtig auf saugfähigem Papier abstreifen, um die sekundären Antikörper zu entfernen.
    2. Anschließend die Objektträger in einen Objektträgerhalter geben, der in Waschpuffer (1× DPBS mit 0,1 % Tween 20) in einem Färbebehälter kurz waschen und den Waschpuffer entsorgen.
    3. Anschließend die Gewebeschnitte dreimal mit 1 ml waschen× DPBS (0,1 % Tween 20) je 5 min
      1. Bevor der Chromogenentwicklungsschritt (d. h. Schritt 1.15) begonnen wird, einen separaten Objektträgerhalter in ein mit destilliertem Wasser gefülltes Färbegefäß stellen, eine vorbereitende Maßnahme für Schritt 1.16, um die chromogene Reaktion zu stoppen.
      2. Während des letzten Waschschritts frisch die DAB-Arbeitslösung herstellen (1 Tropfen Chromogen pro 1 mL Substrat; siehe Zusatzdatei 1).
  15. Chromogenentwicklung (30 s–5 min):
    1. Nach dem dritten Waschschritt in Schritt 1.14 die Objektträger aus dem Objektträgergestell nehmen und flach auf die Arbeitsfläche mit weißem Hintergrund legen.
    2. Applizieren Sie 50 µL von DAB-Arbeitslösung zu jedem Schnitt geben und die Entwicklung einer braunen Färbung an einem weißen Hintergrund oder unter dem Lichtmikroskop visuell überwachen.
      HINWEIS: Verwenden Sie PSA wie in Schritt 1.1 beschrieben. Die Verwendung von weißem Saugpapier erleichtert die Visualisierung der Braunfärbung während der DAB-Chromogen-Stufe. Die Farbentwicklung kann bei einigen Markern 20–60 Sekunden und bei anderen 2–5 Minuten dauern (siehe Einzelheiten in Schritt 1.16).
  16. Reaktion anhalten (1–2 min):
    1. Sobald in Schritt 1.15 das gewünschte braune Farbsignal erscheint, stoppen Sie die Reaktion unverzüglich, indem Sie den Objektträger in einen Behälter mit destilliertem Wasser aus Schritt 1.14.3.1 eintauchen.
    2. Schieben Sie die Objektträger 1 Minute lang in destilliertem Wasser nach. Entsorgen Sie das destillierte Wasser und fahren Sie anschließend mit Schritt 1.17 (Gegenfärbung) fort.
      HINWEIS: Die Objektträger können bis zu 1 h in destilliertem Wasser verbleiben, ohne die Färbung zu beeinträchtigen. Die für die Farbentwicklung benötigte Zeit bestimmt den Zeitpunkt für die Einleitung des Stoppschritts. Außerdem kann die Reaktionszeit variieren, wenn sich 2–3 Marker (wie CD3, CD4, CD8 oder andere) auf demselben Objektträger befinden (wie im vorliegenden Fall); beispielsweise dauert die Farbentwicklung im hier beschriebenen System für CD8 in der Regel etwa 30 Sekunden.+ Zellen, 1–3 min für CD3+ oder CD4+ Zellen oder länger (3–5 min) für Granzym B+ und Ki67+ Zellen. Aufgrund von Unterschieden im zeitlichen Verlauf der Farbentwicklung kann der gesamte Objektträger nicht zur Reaktionsbeendigung in destilliertes Wasser getaucht werden. Stattdessen wird die Reaktion für jeden Schnitt einzeln durch Zugabe von 200–300 µL µL destilliertes Wasser direkt auf jeden Schnitt.
  17. Gegenfärbung (<1 min):
    1. Um den Kontrast zur braunen Färbung zu verbessern, verdünnte Hämatoxylinlösung (1:3 in destilliertem Wasser) zum Färbebehälter hinzufügen und sicherstellen, dass die Objektträger etwa 10–20 s in der verdünnten Hämatoxylinlösung eingetaucht bleiben.
      HINWEIS: Falls der DAB-Hintergrund stark ist, längere Gegeneinfärbung (bis zu 1 Minute) oder kurz unverdünnte Hämoskylin verwenden.
  18. Leitungswasser-Wäsche (6 min):
    1. Entfernen Sie die Hämatoxylin aus dem Färbebehälter und geben Sie es zur Wiederverwendung in die Glasflasche zurück.
    2. Die Objektträger 1 min lang mit Leitungswasser spülen, anschließend 5 min lang mit langsam fließendem Leitungswasser spülen, wobei die Schnitte stets der direkten Wasserströmung abgewandt gehalten werden. Das Leitungswasser entsorgen und mit Schritt 1.19 fortfahren.
      HINWEIS: Die verbleibenden Schritte bis zum Auftragen werden in einer Abzugshaube durchgeführt.
  19. Stufenweise Dehydrierung (15–17 min):
    1. Die Objektträger im Färbebehälter 5 min lang in 70 %igem Ethanol inkubieren (anschließend das 70 %ige Ethanol zur Wiederverwendung in die Glasflasche zurückgeben), danach 5 min lang in 90 %igem Ethanol (dieses anschließend ebenfalls in die Flasche zurückgeben) und schließlich 5 min lang in 100 %igem Ethanol (dieses anschließend ebenfalls in die Flasche zurückgeben).
    2. Weiter zu Schritt 1.20.
      HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Abzugsanlage durch. Für diesen Dehydrierungsschritt werden dieselben Ethanol-Lösungen aus Schritt 1.2 verwendet, die mehrfach wiederverwendet werden können, sofern sie sauber erscheinen.
  20. Klären:
    1. Verwenden Sie dieselben Xylol-Lösungen I und II, die für die Entparaffinierung verwendet wurden (Schritt 1.1), um die Gewebeschnitte/Präparate zu reinigen.
    2. Zuerst die Objektträger 10 Minuten lang in Xylol-Lösung I im Färbebehälter eintauchen (anschließend das Xylol I zur Wiederverwendung in die Glasflasche zurückgeben) und danach weitere 10 Minuten in Xylol-Lösung II.
    3. Die Objektträger bis zum Auftragen (d. h. Schritt 1.21) in Xylol II belassen.
      HINWEIS: Lassen Sie die Schnitte während dieses Schritts niemals austrocknen, da ausgetrocknete Schnitte spröde werden; falls erforderlich, können die Schnitte daher länger in Xylol II verbleiben, um sie anschließend einzulegen.
  21. Einbetten:
    1. Entfernen Sie die Objektträger einzeln aus Xylol II und legen Sie sie flach in eine chemische Abzugshaube. Geben Sie einen Tropfen Xylol-basiertes Eindeckmedium auf ein passend großes Deckglas und legen Sie das Deckglas mit der Mediumseite auf den Objektträger, sodass das Eindeckmedium den Gewebeschnitten zugewandt ist.
    2. Drücken Sie vorsichtig mit dem Daumen auf die Deckglasauflage, um das Einbettungsmedium gleichmäßig über alle drei Abschnitte zu verteilen und Luftblasen zu entfernen.
      HINWEIS: 24 × Für die Abdeckung von drei Abschnitten auf einem Objektträger wird ein 50-mm-Deckglas benötigt; 24 × 40 mm Deckglas für zwei Schnitte; und 24 × 24-mm-Deckglas für einen Schnitt. Es ist wichtig, das Auflegen innerhalb von 30 Sekunden pro Objektträger abzuschließen, da das Einbettmedium aufgrund der konstanten Luftzirkulation im Abzug schnell austrocknen kann, wodurch Xylol II rasch vom Objektträger verdunstet und die Schnitte spröde werden.
  22. Lufttrocknung und Lichtmikroskopie:
    1. Trocknen Sie die Objektträger mindestens 2 Stunden im Abzug lufttrocken, bevor Sie sie unter dem Lichtmikroskop auswerten und abbilden. Nach dem Trocknen können die präparierten Objektträger jahrelang bei Raumtemperatur in Objektträgerboxen aufbewahrt werden.

2. Zweifarbige IHC für FFPE-Gehirntumorschnitte

HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt ein substratbasiertes zweifärbiges chromogenes IHC-Verfahren zur gleichzeitigen Detektion zweier Antigene im selben FFPE-Gehirntumorgewebeabschnitt. Im Vergleich zur einfarbigen IHC ist das zweifarbige Verfahren zeitaufwändiger, da es aufeinanderfolgende Färbungszyklen mit separaten Inkubationen der primären Antikörper erfordert, einschließlich jeweils einer Übernacht-Inkubation pro Färbungsdurchgang. Dieses erweiterte Verfahren ermöglicht jedoch eine zuverlässige gleichzeitige Antigen-Detektion im selben Gewebeschnitt, wobei die Gewebemorphologie erhalten bleibt und unter Lichtmikroskopie eine klare Trennung der chromogenen Signale gewährleistet ist.

  1. Dekparaffinisierung (20 min):
    1. Führen Sie den gleichen Dekparaffinisierungsprozess wie oben für die Einzelfarben-IHC in Schritt 1.1 in einer chemischen Abzugshaube durch, verwenden Sie jedoch xylolfreie Klarmittel (z. B. Histo-Clear I und Histo-Clear II anstelle von Xylol).
      ACHTUNG: Tragen Sie PSA wie in Schritt 1.1 und führen Sie diesen Schritt unter einer chemischen Abzugshaube durch. Histo-Clear wird empfohlen, da das Chromogen teilweise in Xylol löslich ist und eine xylolfreie Aufarbeitung hilft, die Färbungsintensität während der Zweifarben-IHC zu erhalten. Lassen Sie die Schnitte nicht austrocknen. Diese Klarmittel können wiederverwendet werden, wenn sie in luftdicht verschlossenen Glasbehältern aufbewahrt werden und sauber erscheinen.
  2. Stufenweise Rehydratisierung (15 min):
    1. Wie bei der Einzelfarben-IHC gemäß Schritt 1.2; rehydrieren Sie die Schnitte schrittweise mit abnehmender Ethanol-Konzentration (100 %, 90 % und 70 %) jeweils 5 min.
      ​HINWEIS: Hier wird eine separate Serie xylolfreier gestaffelter Ethanol-Lösungen verwendet, da die für die Einzelfarben-IHC in Schritt 1.2 verwendeten gestaffelten Ethanol-Lösungen wahrscheinlich mit Xylol II kontaminiert sind.
  3. Spülen mit Wasser (5 min):
    1. Wie bei der Einzelfarben-IHC in Schritt 1.3; legen Sie die Objektträger 5 min in destilliertes Wasser, um die Rehydratisierung abzuschließen.
      ​HINWEIS: Wie in Schritt 1.3; bereiten Sie während dieser 5-minütigen Phase die Antigen-Retrieval-Lösung vor.
  4. Antigen-Retrieval (~20 min): Führen Sie das gleiche Antigen-Retrieval-Verfahren wie für die Einzelfarben-IHC in Schritt 1.4 beschrieben durch.
  5. Abkühlen (10–20 min): Führen Sie den gleichen Abkühlprozess wie für die Einzelfarben-IHC in Schritt 1.5 beschrieben durch.
  6. DPBS-Spülen (10 min): Führen Sie den Vorgang zum Abwaschen der Antigen-Retrieval-Lösung wie für die Einzelfarben-IHC in Schritt 1.6 beschrieben durch.
  7. Hydrophober Rand (<1 min/Objektträger):
    1. Während des DPBS-Spülens in Schritt 2.6 bilden Sie einen hydrophoben Rand um die Gewebeschnitte, indem Sie das gleiche Verfahren/Protokoll wie in Schritt 1.7 anwenden.
    2. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um eine flüssigkeitsabweisende Barriere um jeden Gewebeschnitt zu ziehen, und legen Sie den Objektträger anschließend in die DPBS-Spüllösung im Färbebehälter zurück. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Objektträger.
  8. Blockierung der alkalischen Phosphatase (5 min):
    1. Nachdem die hydrophoben Ränder auf allen Gewebeschnitten angebracht wurden, nehmen Sie die Objektträger aus dem Färbebehälter, legen Sie sie flach in die befeuchtete Kammer, geben Sie pro Schnitt einen Tropfen Endogen-Alkalische-Phosphatase-Blockierungslösung (z. B. BLOXALL) hinzu und inkubieren Sie die Schnitte 5 min. Fahren Sie anschließend unverzüglich mit Schritt 2.9 fort.
      ​HINWEIS: Da in der Zweifarben-IHC-Protokoll konjugierte sekundäre Antikörper gegen alkalische Phosphatase (AP) verwendet werden, ist es wichtig, die endogene alkalische Phosphatase-Aktivität zu blockieren, um Hintergrundsignale während der roten oder blauen Farbentwicklung zu reduzieren. Die BLOXALL-Blockierungslösung wird hier verwendet, um die endogene alkalische Phosphatase zu hemmen. Sie hemmt zudem die endogene Peroxidase, weshalb diese Blockierungslösung auch im Einzelfarben-IHC-Protokoll zur Blockierung der endogenen Peroxidase-Aktivität anstelle der 3 %igen H₂O₂-Lösung eingesetzt werden kann.
  9. DPBS-Spülen (10 min):
    1. Spülen Sie die Objektträger zweimal je 5 min in 1× DPBS-Lösung im Färbebehälter.
    2. Nach dem zweiten Spülschritt nehmen Sie die Objektträger aus dem Färbebehälter, legen Sie sie flach in die befeuchtete Kammer und geben Sie destilliertes Wasser an die Ränder der befeuchteten Kammer.
      HINWEIS: Lassen Sie die Schnitte nicht austrocknen; fahren Sie daher unverzüglich mit der Blockierung unspezifischer Antigen-Antikörper-Bindung in Schritt 2.10 fort.
  10. Serumblockierung (~70 min):
    1. Führen Sie den gleichen Serumblockierungsprozess wie im Einzelfarben-IHC-Protokoll in Schritt 1.10 durch.
      1. Blockieren Sie zunächst mit dem universellen Blockierpuffer (5 % BSA; 50 µL/Schnitt) 30 min bei Raumtemperatur und anschließend mit 2,5 % normalem Pferdeserum (ein Tropfen/Schnitt), das der Wirtsart des sekundären AP-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpers entspricht, weitere 30 min bei Raumtemperatur mit geschlossenem Deckel der befeuchteten Kammer.
      2. Entfernen Sie nach dieser Zeit vorsichtig durch Antippen auf saugfähigem Papier das Serum und fahren Sie mit Schritt 2.11 fort.
        HINWEIS: Bereiten Sie den Primärantikörper I (siehe Tabelle 1) während der letzten Minute der Blockierphase vor, wie in Schritt 1.10 beschrieben.
  11. Inkubation mit Primärantikörper I (~16 h):
    1. Führen Sie die Inkubation mit dem Primärantikörper wie in Schritt 1.11 durch. Geben Sie beispielsweise je Gewebeschnitt etwa 50 µL Kaninchen-anti-CD3-Antikörper, 1:100 in 2,5 %igem normalem Pferdeserum verdünnt (siehe Tabelle 1), hinzu.
    2. Inkubieren Sie über Nacht (~16 h) bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
  12. DPBS (0,1 % Tween 20)-Spülen (~18–20 min):
    1. Führen Sie das gleiche Spülverfahren (3 Spülschritte, jeweils 5 min) wie im Einzelfarben-IHC-Protokoll in Schritt 1.12 durch.
    2. Nach dem dritten Spülschritt legen Sie die Objektträger flach in die befeuchtete Kammer. Fahren Sie unverzüglich mit Schritt 2.13 fort.
      HINWEIS: Gleiche Hinweise wie in Schritt 1.12, z. B. kann jede Spüldauer auf 10–15 min verlängert werden, und das Spülen sollte sanft und ohne Bewegung erfolgen. Lassen Sie die Schnitte nicht austrocknen.
  13. Inkubation mit Sekundärantikörper I (~32–35 min):
    1. Geben Sie pro Schnitt einen Tropfen des AP-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörpers (siehe Tabelle 2) hinzu und inkubieren Sie die Gewebeschnitte 30 min bei Raumtemperatur mit geschlossenem Deckel der befeuchteten Kammer.
      HINWEIS: Der Sekundärantikörper kann 1:1 in PBS verdünnt werden, um das Hintergrundsignal in Schritt 2.15 zu reduzieren.
  14. DPBS (0,1 % Tween 20)-Spülen (~18–20 min):
    1. Führen Sie das gleiche Spülverfahren mit 1× DPBS/0,1 % Tween 20 wie in Schritt 1.14 durch.
    2. HINWEIS: Während des letzten Spülschritts bereiten Sie frisch die Substrat-Arbeitslösung (5 mL, wie empfohlen; siehe Tabelle 3) gemäß Herstelleranleitung vor (siehe Reagenzvorbereitung in Zusatzdatei 1).
  15. Rote Farbentwicklung (12–15 min):
    1. Nach Abschluss von Schritt 2.14 legen Sie die Objektträger flach auf die Arbeitsfläche mit weißem Hintergrund, z. B. weißem saugfähigem Papier, wie in Schritt 1.15 beschrieben.
    2. Rühren Sie die frisch zubereitete rote Substrat-Arbeitslösung gründlich um, geben Sie dann je Gewebeschnitt 50 µL hinzu (entsorgen Sie überschüssige Lösung).
    3. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte bei Raumtemperatur, bis die rote Farbe erscheint, und kontrollieren Sie regelmäßig alle 2–3 min gegen einen weißen Hintergrund oder unter dem Lichtmikroskop.
      HINWEIS: Die für die rote Farbentwicklung benötigte Zeit variiert je nach Marker und kann 20–30 min betragen. Bei der Färbung von CD3+-Zellen in 005 Gehirntumorschnitten mit dem AP-Detektionssystem tritt die rote Farbentwicklung jedoch üblicherweise innerhalb von 12–15 min auf.
  16. Puffer-Spülen (5 min):
    1. Sobald in Schritt 2.15 das gewünschte rote Farbsignal erscheint, spülen Sie die Schnitte 5 min im Färbebehälter mit 1× DPBS/0,1 % Tween 20.
    2. Während dieser Spülphase bereiten Sie frisch den Primärantikörper II in einem geeigneten Blockierpuffer vor (z. B. Kaninchen-anti-Ki67-Antikörper 1:100 in 2,5 %igem normalem Pferdeserum verdünnt; siehe Tabelle 1).
      HINWEIS: Im Gegensatz zum Spülen mit destilliertem Wasser in der Einzelfarben-IHC (Schritt 1.16) wird hier DPBS/0,1 % Tween 20 verwendet, um nicht nur die Reaktion zu stoppen, sondern auch überschüssiges Chromogen gründlich zu entfernen und für den zweiten Färbungszyklus vorzubereiten.
  17. Inkubation mit Primärantikörper II (~16 h):
    1. Bringen Sie die Objektträger in die befeuchtete Kammer und geben Sie je Gewebeschnitt etwa 50 µL frisch zubereiteten Kaninchen-anti-Ki67-Antikörper hinzu. Inkubieren Sie über Nacht (~16 h) bei 4 °C.
  18. DPBS (0,1 % Tween 20)-Spülen (~18–20 min):
    1. Führen Sie das gleiche Verfahren wie in Schritt 1.12 durch.
    2. Nach dem dritten Spülschritt nehmen Sie die Objektträger aus dem Färbebehälter und legen Sie sie flach in die befeuchtete Kammer. Fahren Sie unverzüglich mit Schritt 2.19 fort.
  19. Inkubation mit Sekundärantikörper II (~32–35 min):
    1. Führen Sie das gleiche Verfahren wie in Schritt 2.13 durch. Geben Sie pro Schnitt einen Tropfen des AP-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG (siehe Tabelle 2) hinzu und inkubieren Sie die Gewebeschnitte 30 min bei Raumtemperatur mit geschlossenem Deckel der befeuchteten Kammer.
  20. DPBS (0,1 % Tween 20)-Spülen (~18–20 min):
    1. Führen Sie das gleiche Spülverfahren mit 1× DPBS/0,1 % Tween 20 wie in Schritt 1.14 durch.
      HINWEIS: Während des letzten Spülschritts bereiten Sie frisch die Substrat-Arbeitslösung (5 mL, wie empfohlen; siehe Tabelle 3) gemäß Herstelleranleitung vor (siehe Reagenzvorbereitung in Zusatzdatei 1).
  21. Blaue Farbentwicklung (10–12 min):
    1. Nach Abschluss von Schritt 2.20 legen Sie die Objektträger flach auf die Arbeitsfläche mit weißem Hintergrund.
    2. Rühren Sie die frisch zubereitete blaue Substrat-Arbeitslösung gründlich um, geben Sie dann je Gewebeschnitt 50 µL hinzu (entsorgen Sie überschüssige Lösung).
    3. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte bei Raumtemperatur, bis die blaue Farbe erscheint, und kontrollieren Sie regelmäßig alle 2–3 min gegen einen weißen Hintergrund oder unter dem Lichtmikroskop.
      HINWEIS: Wie bei der roten Farbentwicklung in Schritt 2.15 kann die für die blaue Farbentwicklung benötigte Zeit 20–30 min betragen. Bei der Färbung von Ki67+-Zellen in 005 Gehirntumorschnitten mit dem AP-Detektionssystem tritt die blaue Färbung jedoch innerhalb von 10–12 min auf.
  22. Puffer-Waschen (5 min):
    1. Sobald in Schritt 2.21 das gewünschte blaue Farbsignal erscheint, tauchen Sie die Schnitte 5 min im Färbebehälter in 1× DPBS/0,1 % Tween 20 ein. Entsorgen Sie die Waschlösung.
  23. Spülen mit Wasser (1 min): Spülen Sie die Schnitte 1 min mit destilliertem Wasser. Entsorgen Sie das destillierte Wasser nach dem Spülen.
  24. Stufenweise Dehydratisierung (15–17 min):
    1. Tauchen Sie die Objektträger im Färbebehälter 5 min in 70 % Ethanol (danach das 70 % Ethanol zur Wiederverwendung in die Glasflasche zurückgeben), gefolgt von 5 min in 90 % Ethanol (danach zurück in die Flasche) und schließlich 5 min in 100 % Ethanol (danach zurück in die Flasche).
    2. Wiederholen Sie jeden Schritt in einer Abzugshaube. Fahren Sie mit Schritt 2.25 fort.
      HINWEIS: Die gleichen (xylolfreien) Ethanol-Lösungen aus Schritt 2.2 werden in diesem Dehydratisierungsschritt verwendet und können bei sauberem Erscheinungsbild mehrfach wiederverwendet werden.
  25. Xylolfreie Klärung:
    1. Verwenden Sie die gleichen xylolfreien Lösungen (d. h. Histo-Clear), die in Schritt 2.1 verwendet wurden, um die Gewebeschnitte/Objektträger zu reinigen.
      1. Tauchen Sie die Objektträger zunächst 10 min im Färbebehälter in xylolfreie Lösung I (danach zur Wiederverwendung in die Glasflasche zurückgeben) und anschließend weitere 10 min in xylolfreie Lösung II.
      2. Lassen Sie die Objektträger in xylolfreier Lösung II, bis die Deckglas-Aufbringung (d. h. Schritt 2.26) abgeschlossen ist.
        HINWEIS: Die Schnitte können bei Bedarf länger in xylolfreier Lösung II verbleiben, um die Aufbringung zu ermöglichen.
        ACHTUNG: Tragen Sie PSA wie in Schritt 1.1 und führen Sie diesen Schritt unter einer chemischen Abzugshaube durch.
  26. Xylolfreie Eindeckung:
    1. Nehmen Sie die Objektträger einzeln aus xylolfreier Lösung II und legen Sie sie flach in eine Abzugshaube. Geben Sie einen Tropfen xylolfreies Eindeckmedium auf ein passend großes Deckglas und legen Sie das Deckglas mit der Mediumseite auf den Objektträger, sodass das Medium die Gewebeschnitte bedeckt.
    2. Drücken Sie das Deckglas vorsichtig mit dem Daumen an, um das Eindeckmedium gleichmäßig über alle drei Schnitte zu verteilen und Luftblasen zu entfernen.
      HINWEIS: Schließen Sie die Eindeckung innerhalb von 30 s pro Objektträger ab, da das Eindeckmedium schnell austrocknen kann. Tragen Sie PSA wie in Schritt 1.1 und führen Sie diesen Schritt unter einer chemischen Abzugshaube durch.
  27. Trocknen an der Luft und Lichtmikroskopie: Lassen Sie die Objektträger in der Abzugshaube mindestens 2 h lang an der Luft trocknen, bevor Sie sie mit einem Lichtmikroskop auswerten und abbilden. Nach dem Trocknen können die eingedeckten Objektträger jahrelang bei Raumtemperatur in Objektträgerboxen aufbewahrt werden.

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Ergebnisse

Die Einzelfarben-IHC unter Verwendung des auf HRP basierenden chromogenen Nachweissystems ergab klare und reproduzierbare Färbungen in FFPE-005-Gehirntumorschnitten. Repräsentative Bilder der Oberflächenantigenfärbung sind in Abbildung 1 dargestellt und zeigen den erfolgreichen Nachweis von T-Zell-Markern (CD3, CD4, CD8), Tumorzell-assoziierten Makrophagen-(TAM-)Markern (CD68, F4/80) sowie des Immun-Checkpoint-Moleküls Programmed Death Ligand 1 (PD-L1). In allen Fällen wurde die positive Fär...

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Diskussion

Diese Studie beschreibt einen detaillierten und reproduzierbaren chromogenen immunhistochemischen Nachweis mittels Substrat-basierter Methode zur Einzel- und Doppelfärbung von Oberflächen- und intrazellulären Antigenen in aus einem orthotopen GSC-Modell stammenden FFPE-Gehirntumorgeweben. Das primäre Ziel dieser Studie war methodischer Natur, nämlich ein praktisches, Schritt-für-Schritt-Protokoll für den zuverlässigen chromogenen Nachweis von Antigenen in immunkompetenten GBM-Geweben zu etablieren.

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Offenlegungen

S.D.R. ist Mitentwickler von Patenten im Zusammenhang mit onkolytischen Herpes-simplex-Viren, die Georgetown University und das Massachusetts General Hospital gehören und von denen Lizenzgebühren von Amgen und Acti\Vec Inc. erhalten wurden; außerdem hat er als Berater für Replimune, Cellinta und Greenfire Bio gearbeitet und Honorare erhalten sowie Honorare und Anteile von EG 427. Die übrigen Autoren erklären, dass dieser Artikel ohne bestehende kommerzielle oder finanzielle Beziehungen verfasst wurde, die als möglicher Interessenkonflikt angesehen werden könnten.

Danksagungen

D.S. wurde teilweise durch ein Stipendium des College of Science and Technology der North Carolina Agricultural and Technical State University (NCA&T), durch ein Faculty Fellowship Grant (GRADS-4C) an der NCA&T und durch eine Förderung der NIH (1R16NS147983-01) unterstützt. Ebenso wurde S.D.R. teilweise durch die Thomas A. Pappas-Lehrstuhlstiftung für Neurowissenschaften unterstützt, während R.H.N. teilweise durch eine Förderung der NIH (1R35GM153737) unterstützt wurde. Wir danken Dr. Inder Verma und Dr. Yasushi Soda für die 005 GSCs.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Liter-Glasflaschen CorningCORN1395-2LVerwendet zur Herstellung und Lagerung von 10× DPBS, 1× DPBS, destilliertem Wasser und Natriumcitratpuffer
2-Liter-Pyrex-Glasbecher Corning1000-2LVerwendet für die antigenretrieval-Mediation durch Mikrowelle im Natriumcitratpuffer (Arbeitsvolumen 600–800 mL)
2,5 % normales Pferdeserum oder normales ZiegenserumDiese werden zusammen mit den sekundären Antikörpern von Vector Laboratories bereitgestellt. Verwendet zur speziesspezifischen Blockierung und Antikörperverdünnung, abhängig von der Wirtsspezies des sekundären Antikörpers (Anti-Kaninchen- oder Anti-Ratte-IgG), um unspezifische Bindung und Hintergrundfärbung zu minimieren
30 % Wasserstoffperoxid (H2O2)Fisher ScientificBP2633500
500-mL-GlasflaschenVWR InternationalVWRU10754-818Verwendet zur Herstellung und Lagerung von entflammbaren Reagenzien für die einfarbige IHC und xylolfreien Reagenzien für die zweifarbige IHC
saugfähiges Arbeitsflächenpapier mit KimwipesWird während der Färbeprozesse verwendet, um überschüssige Antikörper oder Waschlösung von Gewebeschnitten zu entfernen, bevor aufeinanderfolgende Inkubationen erfolgen, um Reagenzübertragung und Kreuzkontamination zu minimieren
Anti-CD3eAbcamab5690
Anti-CD4 eBioscience14-9766-80
Anti-CD68Abcamab125212
Anti-CD8a eBioscience14-0808-80
Anti-Cleaved Caspase-3CST9661
Anti-F4/80Abcamab111101
Anti-FoxP3Abcamab54501
Anti-GFPAbcamab183734
Anti-Granzym BAbcamab4059
Anti-Ki67Abcamab16667
Anti-NeuNCST24307
Anti-PD-L1Abcamab205921
Anti-pSTAT1CST9167
Anti-T-betAbcamab91109
AP-Anti-Kaninchen-IgGVector LaboratoriesMP-5401
AP-Anti-Ratte-IgGVector LaboratoriesMP-5404-15
BLOXALL-BlockierungslösungVector LaboratoriesSP-6000-100Wird hauptsächlich bei der zweifarbigen IHC verwendet, um die endogene Peroxidase- und Alkalische-Phosphatase-Aktivität zu hemmen
Rinderserumalbumin (BSA)Bioworld22070007-2Verwendet zur Herstellung eines 5 % universellen Blockierungspuffers zur Reduzierung unspezifischer Bindung
Cytoseal-60-Dauereinbettungsmedium Electron Microscopy Sciences18006Xylolkompatibles Einbettungsmedium für die einfarbige IHC
DAB-Substrat und ChromogenDAKOK346811-2Verwendet für die HRP-basierte einfarbige chromogene Detektion. Unmittelbar vor der Verwendung durch Zugabe von 1 Tropfen Chromogen zu 1 mL DAB-Substrat gemäß den Herstelleranweisungen’ herstellen. Nicht verwendete Arbeitslösung sollte nach der Herstellung entsorgt werden. DAB ist ein potenzieller Karzinogen und muss gemäß den Richtlinien der Institution für Biosicherheit und chemische Sicherheit behandelt werden
Destilliertes WasserVerwendet zur Reagenzherstellung, Waschvorgängen und Pufferherstellung. Ultrapure oder Milli-Q-Wasser kann ebenfalls verwendet werden
DPBS (Dulbecco’s phosphatgepufferter Salzlösung) Corning55-031-PC
Ethanol, 200 proof Decon Labs2701
Fisherbrand-Superfrost-Plus-Mikroskop-ObjektträgerFisher Scientific12-550-15Positiv geladene mikroskopische Glasobjektträger für Gewebeschnitte
GlasdeckgläserCorning oder Milipore SigmaDie geeigneten Größen sollten abhängig von der Anzahl der Gewebeschnitte pro Objektträger gewählt werden. Gängige Größen sind: 24 mm × 24 mm (ein Gewebeschnitt), 24 mm × 40 mm (zwei Gewebeschnitte), 24 mm × 50 mm (drei Gewebeschnitte)
HämatoxylinFisher Scientific220-102
Histo-Clear (1 L)Electron Microscopy Sciences64111-01Xylolfreies Aufhellungsmittel für die zweifarbige IHC. Zwei 500-mL-Flaschen mit der Bezeichnung Histo-Clear I und Histo-Clear II herstellen
HRP-Anti-Maus-IgGVector LaboratoriesMP-7402-15
HRP-Anti-Kaninchen-IgGVector LaboratoriesMP-7401
HRP-Anti-Ratte-IgGVector LaboratoriesMP-7444-15
feuchte Inkubationskammern Stellar ScientificHS-120879Für die Inkubation von Gewebeschnitten mit primären und sekundären Antikörpern
Hydrophober Barrierestift (PAP-Stift)Vector LaboratoriesH-4000Wird verwendet, um eine wasserabweisende Barriere um Gewebeschnitte zu erzeugen, um Antikörper und Reagenzien während der Inkubation zu halten und Kreuzkontamination zwischen mehreren Gewebeschnitten auf demselben Objektträger zu verhindern
KimwipesKimtech Science34155Verwendet zur vorsichtigen Entfernung von Restreagenzien und Waschpuffer von Gewebeschnitten
Magnetischer Rührer IKAI-10001529Für die Herstellung von Natriumcitrat- und DPBS-Stammlösungen
MikrowellenofenPanasonic (Modell: NN-L931BF)SN: 6H610500362,2 Kubikfuß Kapazität. Erforderlich für die hitzemediierte Antigenfreisetzung unter Verwendung eines 2-Liter-Glasbechers
Nikon-Lichtmikroskop NikonSN: 707798Nikon Eclipse Ci-L sn: 707798, Sola-Lichtquelle 5M5-LCR-VA sn: 11787, Software: NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00, Kameras: Nikon DS-Fi3 sn: 110865 (Farbe) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (Schwarz-Weiß)
pH-Meter VWR International77619-152Für die Einstellung des pH-Werts des Antigenretrieval-Puffers
PlastikfolieFisher Scientific01810Wird verwendet, um den Antigenretrieval-Puffer während der Mikrowellenbehandlung locker abzudecken, um Verdunstung zu minimieren und Austrocknung des Gewebes zu verhindern
Polyoxymethylen (POM)-Objektträgergestelle MopecSP234Kompatibel mit den oben genannten Färbebehältern; jedes Gestell fasst bis zu 24 Mikroskop-Objektträger
Präzisionswaage Mettler Toledo30697420Für das Wiegen von Natriumcitrat und DPBS-Pulver
KühlschrankThermo ScientificTSG3005CAFür die Lagerung temperatursensitiver Reagenzien und Antikörper
ObjektträgerlagerboxenFisher Scientific22-267294
Färbebehälter/-schalen MopecSP233Jeder Behälter fasst ein 24-Objektträger-Färbegestell
Rührstäbe Fisher Scientific14-512-128Für die Herstellung von Natriumcitrat- und DPBS-Stammlösungen
Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Thermo Scientific ChemicalsAA3643936
Tween 20 Thermo ScientificAAJ20605AP
VectaMount-PT-Dauereinbettungsmedium Vector LaboratoriesH-5600-60Xylolfreies Dauereinbettungsmedium für die zweifarbige IHC
Vector-Blue-Alkalische-Phosphatase-Substrat-Kit Vector LaboratoriesSK-5300Wird zur Entwicklung eines blauen chromogenen Signals während der zweifarbigen, AP-basierten IHC verwendet. Da Vector Blue teilweise in Xylol löslich ist, müssen xylolfreie Aufhellungsmittel und Einbettungsmedien für zweifarbige Färbeprozesse verwendet werden
Vector-Red-Alkalische-Phosphatase-Substrat-KitVector LaboratoriesSK-5100Wird zur Entwicklung eines roten chromogenen Signals während der zweifarbigen, AP-basierten IHC verwendet
Xylol (1 L) StatLab8400-1Wird als Deparaffinierungsmittel und Aufhellungsmittel für die einfarbige IHC verwendet. Zwei 500-mL-Flaschen mit der Bezeichnung Xylol I und Xylol II herstellen

Referenzen

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