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Forschungsartikel
Diese Studie bewertet das humane Wings apart-ähnliche (hWAPL) Protein als serumbasierten diagnostischen Biomarker beim Zervixkarzinom mittels integrativer bioinformatischer Analyse und Serumvalidierung und zeigt, dass die Kombination von serumgebundenem hWAPL mit dem Plattenepithelkarzinom-Antigen die diagnostische Leistung verbessert.
Krebs des Gebärmutterhalses stellt weltweit weiterhin eine erhebliche Bedrohung für die Gesundheit von Frauen dar, und zuverlässige serologische Biomarker für die Früherkennung und therapeutische Stratifikation sind begrenzt. Das humane Wings-apart-like-(hWAPL-)Protein ist in die Karzinogenese des Gebärmutterhalskrebses involviert, doch sein diagnostischer und klinischer Wert ist bisher nicht vollständig geklärt. Um diese Lücke zu schließen, integrierte die vorliegende Studie öffentliche Multi-Omics-Datensätze, darunter The Cancer Genome Atlas, GEPIA2, das Human Protein Atlas und Einzelzell-Transkriptomdaten, um die Expression von hWAPL, klinisch-pathologische Assoziationen, Immuninfiltration, Ko-Expressionsnetzwerke, posttranslationale Modifikationen und Vorhersagen zur Arzneimittelsensitivität zu charakterisieren. Diese Befunde wurden in einer unabhängigen Einzelzentrum-Serumkohorte evaluiert, die 89 Patientinnen mit histologisch bestätigtem Plattenepithelkarzinom des Gebärmutterhalses und 89 gesunde weibliche Kontrollpersonen umfasste. Die Serumspiegel von hWAPL und des Plattenepithelkarzinom-Antigens (SCC) wurden gemessen, und die diagnostische Leistung wurde mittels ROC-Kurvenanalyse (receiver operating characteristic) bewertet. In silico war hWAPL in mehreren malignen Erkrankungen breit hochreguliert, insbesondere beim Gebärmutterhalskrebs, angereichert in malignen epithelialen Zellen und Monozyten/Makrophagen und assoziiert mit kürzerem progressionsfreiem Intervall, vorhergesagter verminderten Empfindlichkeit gegenüber Cisplatin, Paclitaxel und 5-Fluorouracil sowie vorhergesagter Sensitivität gegenüber MCL-1- und Wee1-Inhibitoren. In der Serumkohorte waren die hWAPL-Spiegel bei den Patientinnen signifikant höher als bei den Kontrollen und unterschieden zwischen Gebärmutterhalskrebs und Kontrollen mit einer Fläche unter der Kurve von 0,961, was über dem Wert für SCC allein lag. Die Kombination von hWAPL mit SCC verbesserte die diagnostische Leistung weiter (Fläche unter der Kurve: 0,974; Sensitivität: 93,3 %; Spezifität: 95,5 %). Diese Ergebnisse legen nahe, dass hWAPL im Serum ein potenziell neuartiger diagnostischer Biomarker für das Plattenepithelkarzinom des Gebärmutterhalses ist, dessen Leistung durch die Kombination mit SCC gesteigert wird, während die beobachteten Assoziationen mit Chemoresistenz und der Umgestaltung der immunologischen Mikroumgebung hypothetischer Natur sind und experimentelle Bestätigung erfordern.
Krebs des Gebärmutterhalses ist weltweit die viertgrößte maligne Erkrankung und die viertgrößte Todesursache im Zusammenhang mit Krebserkrankungen bei Frauen, wobei im Jahr 2022 etwa 660.000 Neudiagnosen und 350.000 Todesfälle verzeichnet wurden1. Diese Krankheitslast betrifft überproportional Länder mit niedrigem und mittlerem Einkommen, in denen systematische Screening-Programme weiterhin unzureichend sind2. Obwohl HPV-Impfungen und Pap-Abstrich-Screenings in zahlreichen Ländern mit hohem Einkommen die Inzidenzraten erfolgreich gesenkt haben, weisen aktuelle diagnostische Ansätze erhebliche Einschränkungen auf. Der HPV-DNA-Test zeigt eine suboptimale Spezifität, und die zytologische Beurteilung ist von Natur aus subjektiv und variabel. Diese Mängel verdeutlichen die dringende Notwendigkeit innovativer, objektiver und minimalinvasiver Serum-Biomarker, um die bestehenden diagnostischen Verfahren zu ergänzen.
Das Plattenepithelkarzinom-Antigen (SCC-Ag) dient als vorherrschender serologischer Biomarker für das zervikale Plattenepithelkarzinom, einen histologischen Subtyp, der etwa 85–90 % aller Gebärmutterhalskrebsfälle ausmacht3. Eine systematische Übersichtsarbeit und Metaanalyse zeigte, dass erhöhte SCC-Ag-Werte vor der Behandlung bei Plattenepithelkarzinomen mit deutlich schlechteren Gesamtüberlebensraten und progressionsfreien Überleben assoziiert sind4. Im Hinblick auf die Rezidivüberwachung weist SCC-Ag eine Sensitivität von 78,9 % und eine Spezifität von 91,2 % für das Plattenepithelkarzinom auf4. Dennoch ist die Eignung von SCC-Ag für die Früherkennung begrenzt, da erhöhte Werte nur bei 28–88 % der Personen mit diagnostiziertem zervikalem Plattenepithelkarzinom beobachtet werden5. Zudem zeigen viele Tumoren im Frühstadium keine erhöhten SCC-Ag-Konzentrationen, und dieser Biomarker ist für nicht-plattenepitheliale histologische Varianten nicht relevant3. Daher stellt die Entdeckung neuer serumbasierter Biomarker, die eine verbesserte diagnostische Sensitivität, insbesondere für das zervikale Karzinom im Frühstadium, bieten, eine bedeutende und bisher ungelöste klinische Herausforderung dar.
Neben SCC-Ag wurden mehrere andere zirkulierende Marker beim Zervixkarzinom untersucht, darunter das karzinoembryonale Antigen, das Tumormarker-Antigen CA-125, das Zytokeratin-19-Fragment (CYFRA 21-1) sowie neuerdings zirkulierende Tumor-DNA und HPV-DNA in zellfreier Form. In der Praxis sind diese Marker jedoch durch eine begrenzte Sensitivität für die frühen Krankheitsstadien, eine geringe Spezifität für die Plattenepithelhistologie, die beim Zervixkarzinom vorherrscht, oder die Notwendigkeit spezialisierter molekularer Plattformen, die bisher nicht flächendeckend verfügbar sind, eingeschränkt. Dieser Befund lässt erheblichen Spielraum für einen Proteinkomponenten-Marker, der sowohl mechanistisch mit der Karzinogenese des Zervixkarzinoms verknüpft ist als auch mittels eines routinemäßigen Immunoassays messbar ist.
Das humane wings apart-ähnliche Gen (hWAPL), auch als WAPL bezeichnet, kodiert einen für die korrekte Trennung von Schwesterchromatiden während der Mitose essentiellen Kohäsionsfreisetzungsfaktor6. Zunächst von Oikawa et al. identifiziert, wurde hWAPL als ein neuartiges humanes Gen charakterisiert, dessen Expression durch die HPV-Onkoproteine E6 und E7 induziert wird. Es zeigt eine starke Expression in karzinomatösen Zervixkarzinomen, während in anderen normalen und neoplastischen Geweben lediglich minimale Expression beobachtet wird7. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die hWAPL-mRNA-Spiegel im Zervixkarzinom im Vergleich zum benignen zervikalen Epithel deutlich erhöht sind, wobei die Expression mit steigendem Grad der zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN) zunimmt8,9. Aus mechanistischer Sicht führt eine dysregulierte Überexpression von WAPL zu Störungen der Mitose und Zytokinese, fördert dadurch chromosomale Instabilität und begünstigt die Tumorprogression10. Zudem trägt WAPL wesentlich zur Tumorentstehung und zur Regulation des Zellzyklusfortschritts bei. In verschiedenen zervikalen Epithelproben wurden mehrere alternativ gespleißte Isoformen von WAPL identifiziert, was seine molekulare Diversität unterstreicht11. Neben seiner etablierten Beteiligung an der Entstehung von Zervixkarzinomen zeigen zunehmende Evidenzen auch die diagnostische Nützlichkeit von hWAPL bei zervikalen Läsionen auf. Außerdem reduzierte eine TAT-vermittelte Herunterregulation von hWAPL die Expression von HPV E6, hemmte die Tumoreinwanderung und Koloniebildung in zervikalen Krebsstammzellen und verringerte das Tumorwachstum in Nacktmausmodellen signifikant12. Diese Befunde legen nahe, dass hWAPL als Marker für die Proliferation zervikaler Krebsstammzellen dient und ein potenziell geeignetes therapeutisches Ziel darstellt12.
Obwohl diese Ergebnisse ermutigend sind, bleiben mehrere wichtige Fragen unbeantwortet. Erstens wurde die Fähigkeit von serumgebundenem hWAPL, Patientinnen mit Zervixkarzinom von gesunden Individuen zu unterscheiden, sowie seine Leistung im Vergleich zu oder in Kombination mit dem etablierten Biomarker SCC, bisher nicht in einer streng kontrollierten Studienpopulation untersucht. Zweitens ist der Zusammenhang zwischen den Konzentrationen von hWAPL im Serum und dem HPV-Infektionsstatus sowie wichtigen klinisch-pathologischen Merkmalen wie klinischem Stadium, histologischem Grad und lymphatischer Metastasierung weiterhin unklar. Drittens wurde bisher nicht untersucht, ob hWAPL und SCC einen komplementären diagnostischen Nutzen bieten.
Obwohl hWAPL auf Gewebe- und Zellebene untersucht wurde, gibt es bisher keine Studie, die belegt, ob das Protein im Blutkreislauf nachweisbar ist oder ob eine serumbasierte Messung Zervixkarzinome von einer Kontrollgruppe unterscheiden kann; genau diese Wissenslücke schließt die vorliegende Studie. Aufbauend auf früheren, jedoch nicht wiederholenden gewebebasierten Berichten kombinierten wir eine integrative bioinformatische Analyse von hWAPL, unter Verwendung von Daten aus The Cancer Genome Atlas und anderen öffentlich zugänglichen Datenbanken, mit der ersten serumbasierten Untersuchung des Proteins in einem unabhängigen, single-center Kollektiv bestehend aus 89 Patientinnen mit Zervixplattenepithelkarzinom und 89 gesunden weiblichen Kontrollpersonen. Das primäre Ziel bestand darin, die diagnostische Leistung von serumgebundenem hWAPL zu ermitteln, ausgedrückt als Fläche unter der Receiver-Operating-Characteristic-Kurve, um Zervixplattenepithelkarzinome von gesunden Kontrollen sowohl allein als auch in Kombination mit SCC-Ag zu unterscheiden; das primäre Outcome-Maß war daher die Fläche unter der Kurve, wobei Empfindlichkeit und Spezifität am optimalen Youden-Schwellenwert sekundäre Maße darstellten. Sekundäre Zielsetzungen waren die Charakterisierung des Zusammenhangs von serumgebundenem hWAPL mit dem HPV-Status und anderen klinisch-pathologischen Merkmalen sowie die Generierung mechanistischer Hypothesen zum biologischen Kontext von hWAPL mittels bioinformatischer Analysen.
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Die Studie wurde von der Ethikkommission des Provinzkrankenhauses Shaanxi (Genehmigungsnummer 2024-R055) genehmigt und gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Von jedem Teilnehmer wurde vor der Blutentnahme eine schriftliche, informierte Einwilligung eingeholt. Alle menschlichen Blut- und Serumproben wurden gemäß den institutionellen Richtlinien der Abteilung für Labormedizin gesammelt, bearbeitet und gelagert.
Alle venösen Blut- und Serumproben wurden als potenziell infektiöses biologisches Material behandelt. Die Probenaufbereitung erfolgte in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 durch geschultes Personal, das die entsprechende persönliche Schutzausrüstung trug. Einweg-Plastikwaren, Pipettenspitzen und verwendete Mikroplatten, die mit biologischem Material in Kontakt gekommen waren, wurden entweder autoklaviert oder als biohazardöser Abfall gesammelt und gemäß lokalen Vorschriften über den lizenzierten medizinischen Abfallstrom der Einrichtung entsorgt.
Überblick zum Studiendesign:
Der Arbeitsablauf dieser Studie ist in einem schematischen Studiendesign dargestellt (Supplementary Figure S1) und in zwei komplementäre Arme unterteilt. Im in silico-Arm wurden öffentliche transkriptomische, Einzelzell-, Protein-, posttranslationale Modifikations-, Immun- und Arzneimittelsensitivitäts-Datensätze analysiert, um den biologischen Kontext von hWAPL zu charakterisieren und mechanistische Hypothesen zu generieren. Im experimentellen Arm wurden hWAPL und SCC-Ag im Serum in einem unabhängigen Einzelzentrum-Kohortenkollektiv gemessen, und ihre diagnostische Leistung – einzeln und in Kombination – wurde mittels ROC-Analyse (Receiver Operating Characteristic) und logistischer Regression bewertet. Die beiden Arme wurden ausschließlich auf der Ebene der Interpretation zusammengeführt, wobei der Serum-Arm die einzige experimentelle Validierung lieferte.
Genexpressionsprofilierung bei Pan-Krebs und Plattenepithelkarzinom des Zervix
RNA-Sequenzierungsdaten aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA) wurden über den UCSC Xena Browser bezogen. Alle in dieser Studie verwendeten öffentlichen Datenbanken und Web-Tools wurden zwischen September und Oktober 2025 abgerufen, und die jeweiligen Versionen sowie Zugriffsdaten sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt. Die Expressionsniveaus von WAPL, quantifiziert als Fragmente pro Kilobase Transkriptlänge pro Million kartierte Reads (FPKM), wurden einer log₂-Transformation unterzogen, wobei ein Pseudocount von 1 addiert wurde. Diese transformierten Werte wurden anschließend verwendet, um Vergleichsanalysen zwischen malignen Geweben und jeweils passenden angrenzenden normalen Proben über mehrere Krebsarten hinweg durchzuführen. Für die gezielte Untersuchung von Zervixmalignitäten wurden WAPL-Expressionsdaten spezifisch für das Plattenepithelkarzinom und das Endozervixkarzinom (CESC) extrahiert. Das Expressionsprofil in diesen Tumorproben wurde anschließend visualisiert und mit den Expressionsniveaus in normalen zervikalen epithelialen Kontrollgeweben verglichen.
Analyse der WAPL-Transkript-Isoformen
Die Expressionsprofile der WAPL-Transkript-Isoformen wurden mithilfe der GEPIA2-Datenbank untersucht. Spezifische Isoformen wurden anhand ihrer entsprechenden Ensembl-Transkript-Identifikatoren (ENST) abgegrenzt. Die Expressionsniveaus wurden als Logarithmus zur Basis 2 der Transkripte pro Million plus eins [log₂(TPM+1)] berechnet und grafisch als Violin-Plots dargestellt.
Analyse der Einzelzell-RNA-Sequenzierung
Der scRNA-seq-Datensatz GSE168652 wurde aus dem Gene Expression Omnibus (GEO)-Repository bezogen. Die Datenvorverarbeitung, Qualitätsbewertung, Normalisierung und Clusterung wurden mit der Plattform scCancerExplorer durchgeführt. Zellen mit weniger als 200 exprimierten Genen sowie Gene, die in weniger als drei Zellen nachgewiesen wurden, wurden ausgeschlossen. Die Normalisierung erfolgte mithilfe des Log-Normalisierungsansatzes mit einem Skalierungsfaktor von 10.000.
Die 2.000 variabelsten Gene wurden mithilfe einer varianzstabilisierenden Transformation identifiziert und anschließend für die Hauptkomponentenanalyse (PCA) verwendet. Zur Dimensionsreduktion wurde die uniforme Mannigfaltigkeitsapproximation und -projektion (UMAP) basierend auf den ersten 30 Hauptkomponenten angewandt. Die graphenbasierte Clusterung erfolgte über den Louvain-Algorithmus mit einer Auflösung von 0,8. Zellcluster wurden anhand etablierter Markergene annotiert. Die Expressionsniveaus von WAPL wurden in verschiedenen Zellpopulationen gemessen, und die Zellzyklusphasen wurden mittels der CellCycleScoring-Methode bestimmt.
Proteinausdruck und Analyse posttranslationaler Modifikationen
Der Ausdruck und die subzelluläre Verteilung von WAPL in CSCC wurden mithilfe der Human Protein Atlas-Datenbank bewertet. Posttranslationale Modifikationsstellen (PTM) wurden mit PhosphoSitePlus identifiziert. Darüber hinaus wurden potenzielle Assoziationen zwischen den WAPL-Expressionsniveaus und Genen, die an Proteinmodifikationsprozessen beteiligt sind – insbesondere AKT1, AKT2, KAT2B, EP300, USP7 und KAT5 – im Kontext von CSCC mit dem Xiantao Academic-Tool13,14,15,16,17 untersucht.
Ko-Expressionsnetzwerk- und funktionelle Anreicherungsanalyse
Die mittels des STAR-Aligners verarbeiteten und auf Transkripte pro Million (TPM) normalisierten RNA-Sequenzierungsdaten für TCGA-CSCC wurden vom Genomic Data Commons (GDC)-Portal bezogen. Um Gene zu identifizieren, die ko-exprimiert sind mit WAPL, wurde ein Screening-Schwellenwert basierend auf einem absoluten Pearson-Korrelationskoeffizienten von mehr als 0,6 und einem statistischen Signifikanzniveau von P < 0,05 angewandt.
Um die mit WAPL assoziierten biologischen Funktionen zu untersuchen, wurde zunächst eine Analyse der differentiellen Expression durchgeführt, bei der die Patienten anhand des medianen Expressionswerts als Grenzwert in Gruppen mit hoher und niedriger WAPL-Expression eingeteilt wurden. Differenziell exprimierte Gene wurden mit der Xiantao-Academic-Plattform identifiziert und anschließend einer Anreicherungsanalyse der Genontologie unter Einbeziehung der Kategorien biologischer Prozess, zelluläre Komponente und molekulare Funktion sowie einer Pfadanalyse der Kyoto-Enzyklopädie für Gene und Genome (KEGG) unterzogen. Unabhängig davon wurden Protein-Interaktionsbeziehungen, an denen WAPL beteiligt ist, mittels STRING untersucht, und das resultierende Interaktionsnetzwerk wurde in Cytoscape rekonstruiert und analysiert.
Die Gen-Set-Enrichment-Analyse (GSEA) wurde unter Verwendung der Datenbanken Reactome, WikiPathways und KEGG durchgeführt, wobei die Screening-Kriterien bei einem absoluten normalisierten Anreicherungsscore (|NES|) > 1 und einer falschen Entdeckungsrate (FDR) < 0,25 festgelegt wurden.
Analysen der Immuninfiltration
Die rechnergestützten Werkzeuge TIMER 2.0 und xCell wurden verwendet, um transkriptomische Daten aus dem TCGA-CESC-Kollektiv zu analysieren, wodurch die quantitative Beurteilung des Infiltrationsstatus für 24 unterschiedliche Immunzellpopulationen ermöglicht wurde.
Vorhersage der Arzneimittelsensitivität
Vorhersagen zur Arzneimittelsensitivität wurden anhand der GDSC2-Datenbank mithilfe des oncoPredict-R-Pakets abgeleitet. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) wurde für ein Panel von 86 chemotherapeutischen Verbindungen berechnet.
Überlebens- und Diagnoseanalyse
Kurven für das Gesamtüberleben (OS) und das progressionsfreie Intervall (PFI) wurden mithilfe der Xiantao-Analyseplattform erstellt, wobei die Patientenkohorten anhand des medianen WAPL-Expressionsniveaus in zwei Gruppen eingeteilt wurden. Die prognostische Bedeutung der Variablen wurde anhand univariater und multivariater Cox-Regressionmodelle mit proportionalen Hazards bewertet. Um die diagnostische Leistungsfähigkeit von WAPL und SCC (SERPINB3) bei der Unterscheidung von CSCC und angrenzendem Normalgewebe zu prüfen, wurde eine ROC-Kurvenanalyse (Receiver Operating Characteristic) auf Transkriptomdaten angewandt, die als Transkripte pro Million (TPM) aus dem Cancer Genome Atlas stammten.
Sammlung von Serumproben und ELISA
Diese Studie erhielt die Genehmigung der Institutional Review Board des Provinzialkrankenhauses Shaanxi (Genehmigungsnummer 2024-R055) und wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Insgesamt wurden 89 Serumproben von Patientinnen mit histopathologisch bestätigtem CSCC sowie 89 altersangepasste gesunde weibliche Kontrollen gewonnen. Das mittlere Alter betrug in der CSCC-Gruppe 54 Jahre (Spannweite 31–77 Jahre) und in der Kontrollgruppe 41 Jahre (Spannweite 30–52 Jahre). Alle Gebärmutterhalskrebsfälle waren zum Zeitpunkt der Blutentnahme neu diagnostiziert und noch nicht therapiert; die Proben wurden vor Beginn jeglicher Operation, Chemotherapie oder Strahlentherapie entnommen. Wir weisen darauf hin, dass, obwohl die beiden Gruppen aus einem vergleichbaren klinischen Umfeld stammten, der Altersunterschied zwischen den Gruppen 13 Jahre betrug. Dieser Unterschied wird direkt im Ergebnisteil und in einer speziellen altersadjustierten Sensitivitätsanalyse untersucht und im Diskussionsteil als Limitation anerkannt.
Venöses Blut wurde in röhrchen ohne Antikoagulanzien gesammelt, bei Raumtemperatur 10–20 min gerinnen gelassen und anschließend 20 min bei 2.000–3.000 × g zentrifugiert. Das Serum wurde innerhalb von 1 h nach der Entnahme abgetrennt, unverzüglich aliquotiert und bei −20 °C gelagert; das Zeitintervall zwischen der Phlebotomie und dem Einfrieren überschritt bei keiner Probe 2 h. Die Aliquots wurden vor der Analyse nur einem einzigen Gefrier-Tau-Zyklus unterzogen, und alle Messungen wurden innerhalb von drei Monaten nach der Lagerung abgeschlossen. Das erhaltene Serum wurde in Aliquots aufgeteilt und bei −20 °C aufbewahrt. Hämolytische oder lipämische Proben wurden von der Analyse ausgeschlossen.
Die Quantifizierung der Serumspiegel des hWAPL-Proteins erfolgte mithilfe eines kommerziell erhältlichen enzymgekoppelten Immunosorbens-Assays (ELISA) nach dem Prinzip des Doppelantikörpersandwichs. Kurz gesagt, wurden sowohl Kalibrierstandards als auch Testproben verdoppelt in Mikrotiterplattenmulden pipettiert, die zuvor mit einem für hWAPL spezifischen Erfassungsantikörper beschichtet worden waren, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 37 °C. Nach einer Reihe von Waschschritten zur Entfernung nicht gebundenen Materials wurde ein gegen hWAPL gerichteter Detektionsantikörper, markiert mit Meerrettichperoxidase (HRP), hinzugegeben und unter identischen Bedingungen inkubiert.
Nach weiterem Waschen wurden jeweils 50 µL der chromogenen Substratlösungen A und B in die Vertiefungen gegeben und 10 min im Dunkeln bei 37 °C zur Entwicklung inkubiert. Anschließend wurden 50 µL Stopplösung zugegeben, um die enzymatische Reaktion zu beenden. Die optische Dichte wurde innerhalb von 15 min nach Reaktionsstopp bei einer primären Wellenlänge von 450 nm mit einer Referenzablesung bei 630 nm gemessen. Unter Verwendung seriell verdünnter Kalibratoren, die einen Konzentrationsbereich von 10–450 pg/mL abdeckten, wurde eine Standardkurve erstellt. Die hWAPL-Konzentration jeder unbekannten Probe wurde durch Interpolation aus dieser Standardkurve ermittelt und entsprechend eventueller vorgängiger Verdünnungen angepasst. Der Test wurde streng gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Gemäß den Spezifikationen des Herstellers liegt der funktionale Nachweisbereich des Kits bei 10–450 pg/mL. Die Proben wurden abschließend fünffach verdünnt gemessen; Proben, deren optische Dichte über der des höchsten Kalibrators lag, wurden zusätzlich verdünnt und erneut analysiert, wobei der gesamte Verdünnungsfaktor bei der Rückrechnung berücksichtigt wurde. Die analytische Leistung wurde im Serum-Matrix vor der Analyse der Studienproben überprüft: Ein seriell verdünnter Serum-Pool mit hoher Konzentration zeigte eine akzeptable Linearität über den gesamten Kalibrierbereich, und die Wiederfindungsrate des rekombinanten Kalibrators in drei Serum-Pools lag innerhalb eines akzeptablen Bereichs, was mit dem Double-Antibody-Sandwich-Design des Kits übereinstimmt. Die untere Quantifizierungsgrenze entsprach dem niedrigsten Kalibrator (10 pg/mL). Wir weisen darauf hin, dass dieses Kit laut Herstellerangabe ausschließlich für Forschungszwecke bestimmt ist und kein klinisch validiertes In-vitro-Diagnostikum darstellt; die absoluten Konzentrationen und die abgeleiteten Schwellenwerte sollten daher, wie unten diskutiert, als gerätespezifisch und vorläufig betrachtet werden.
Parallel dazu wurden die Serum-SCC-Ag-Spiegel mit der Abbott Alinity i-Plattform mittels eines chemilumineszenten mikropartikulären Immunoassays (CMIA) quantifiziert, wobei die obere Referenzgrenze bei 1,5 ng/mL lag. Alle analytischen Verfahren wurden im Duplikat von Laborpersonal durchgeführt, das bezüglich des Krankheitsstatus und aller klinischen Variablen – einschließlich klinischem Stadium, histologischem Grad und HPV-Status – verblindet war. Sowohl die interassay- als auch die intraassay-Variationskoeffizienten der eingesetzten Methoden lagen unter 10 %.
Statistische Analyse
Da die Konzentrationen von hWAPL im Serum gemäß dem Shapiro-Wilk-Test nicht der Normalverteilungsannahme genügten (alle P < 0,05), wurden die nachfolgenden Analysen mit nichtparametrischen Methoden durchgeführt. Stetige Variablen werden daher als Mediane mit Interquartilsbereichen (IQRs) angegeben. Unterschiede zwischen zwei unabhängigen Gruppen wurden mittels des Mann-Whitney-U-Tests bewertet, während Vergleiche zwischen drei oder mehr Gruppen mit dem Kruskal-Wallis-H-Test durchgeführt wurden. Zusammenhänge zwischen Variablen wurden mithilfe der Rangkorrelationsanalyse nach Spearman für stetige oder ordinale Daten sowie mit dem punktbiserialen Korrelationskoeffizienten für binäre Variablen, wie den HPV-Infektionsstatus, untersucht. Überlebensendpunkte wurden mit dem Log-Rang-Test verglichen, und Hazard-Ratios mit 95 % Konfidenzintervallen wurden anhand von Cox-Regressionen mit proportionalen Hazards geschätzt.
Die diagnostische Leistung wurde mittels ROC-Kurvenanalyse bewertet, wobei der optimale Cut-off-Wert für jeden Biomarker durch Maximierung des Youden-Index bestimmt wurde. Unterschiede in der Fläche unter der Kurve (AUC) wurden mit der DeLong-Methode geprüft. Um die kombinierte diagnostische Aussagekraft zu untersuchen, wurde ein binäres logistisches Regressionsmodell mit dem Krankheitsstatus (CSCC = 1; Kontrolle = 0) als abhängige Variable und dem serumgebundenen hWAPL sowie dem SCC-Antigen als unabhängige Prädiktoren erstellt. Die resultierenden vorhergesagten Wahrscheinlichkeiten wurden als kompositiver Score für die anschließende ROC-Analyse gespeichert.
Die unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten zwischen den Gruppen mit hohem und niedrigem WAPL-Spiegel wurde mit dem limma-Paket bewertet, wobei Schwellenwerte von einem adjustierten P < 0,05 und einem |log₂-Fold-Change| > 0,3 angewandt wurden. Statistische Signifikanz wurde als zweiseitiger P-Wert < 0,05 definiert. Alle Analysen wurden mit SPSS, R oder den angegebenen Online-Tools durchgeführt. Zu den verwendeten R-Paketen gehörten survival, survminer, pROC, ggplot2, oncoPredict und limma. Bei allen hochdimensionalen Analysen, bei denen viele Hypothesen gleichzeitig geprüft wurden – nämlich den pan-kutanen Vergleichen, dem Ko-Expressions-Screening, den Analysen zur differentiellen Expression und funktionalen Anreicherung sowie der Analyse der Medikamentenempfindlichkeit – wurden die P-Werte mittels der False-Discovery-Rate nach Benjamini–Hochberg für multiple Vergleiche korrigiert, und es werden, wo zutreffend, die adjustierten P-Werte angegeben; die paarweisen Korrelationen zwischen hWAPL und einzelnen Genen oder Anteilen von Immunzellen werden mit nominalen P-Werten berichtet, und diese Korrelationsergebnisse gelten als hypothesebildend, nicht als bestätigend. Da einige klinisch-pathologische Felder im öffentlichen Kollektiv unvollständig besetzt waren, wurden Fälle mit fehlenden Daten paarweise aus der jeweiligen Analyse ausgeschlossen, anstatt sie zu imputieren, und die Anzahl der auswertbaren Fälle wird für jede Variable in Tabelle 1 angegeben. Um den Altersunterschied zwischen den Serumkollektiven zu berücksichtigen, wurde eine Sensitivitätsanalyse mittels altersadjustierter binärer logistischer Regression durchgeführt, und die Spearman-Korrelation zwischen serumgebundenem hWAPL und Alter wurde innerhalb jeder Gruppe berechnet.
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Weit verbreitete Hochregulation von hWAPL in menschlichen Malignomen, insbesondere in Zervixkarzinomgeweben
Die Pan-Krebs-Analyse von TCGA-Datensätzen zeigte, dass WAPL in der Mehrheit der soliden Tumoren im Vergleich zu den entsprechenden normalen Geweben signifikant erhöhte Expression aufweist (Abbildung 1A). Bemerkenswerterweise war hWAPL unter 21 anderen Krebsarten, einschließlich invasivem Brustkarzinom (BRCA), Kolonadenokarzinom (COAD), Ö...
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Unsere Pan-Krebs-Analyse der TCGA-Daten zeigte, dass die Expression von WAPL in den meisten soliden Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe deutlich erhöht ist, wobei die stärkste Hochregulation in CESC beobachtet wurde. Diese Beobachtung steht im Einklang mit früheren Befunden, nach denen hWAPL-mRNA vorwiegend im Zervixkarzinom exprimiert wird und in anderen normalen sowie malignen Geweben nur geringfügig vorkommt7. Oikawa et al. charakterisierten hWAPL ursprünglich als...
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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Die Autoren möchten sich bei allen Teilnehmern und dem klinischen Personal, die an dieser Studie beteiligt waren, bedanken. Diese Arbeit wurde durch das Programm für Grundlagenforschung in den Naturwissenschaften der Provinz Shaanxi (Förderkennzeichen Nr. 2021JM-552) unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Abbott GmbH, Wiesbaden, Deutschland | Nicht angegeben | Verwendung für die SCC-Ag-Detektion | |
| Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, China | Modell RT-3100 | Verwendung für das Plattenwaschen | |
| Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, Shanghai, China | Modell TLXY-IIC Niedriggeschwindigkeitszentrifuge | Verwendung für die Zentrifugation von Serumproben | |
| Cytoscape Consortium | Version 3.9.1 | Verwendung für die Netzwerkvisualisierung; Netzwerkvisualisierung | |
| National Cancer Institute | https://portal.gdc.cancer.gov; abgerufen im Oktober 2025 | Verwendung für den Abruf von TCGA-CSCC STAR-justierten TPM-Daten; RRID:SCR_014514 | |
| Online-Plattform/Datenbank | Nicht zutreffend | Verwendung für die Vorhersage der Arzneimittelsensitivität; Referenzdaten zur Arzneimittelsensitivität | |
| National Center for Biotechnology Information | GPL24676 Illumina NovaSeq 6000 (Homo sapiens) | Verwendung für den Abruf von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdatensätzen; Einzelzell-RNA-Seq-Datensatz | |
| Online-Plattform | Nicht zutreffend | Verwendung für die Analyse von Transkriptisoformen und Genexpression; Analyse von Transkriptisoformen und Expression | |
| R-Paket | Version 3.4.4 | Verwendung für die Datenvisualisierung | |
| Online-Plattform/Datenbank | Nicht zutreffend | Verwendung für die Analyse von Proteinexpression und subzellulärer Lokalisation; Proteinexpression und Lokalisation | |
| Shanghai Fusheng Biotechnology Co., Ltd. | A977261-96T | A977261-96T; Doppelantikörper-Sandwich-ELISA; Nachweisbereich 10–450 pg/mL; nur für Forschungszwecke (www.affandi-e.com) | |
| R-Paket | Version 3.54.0 | Verwendung für die differentielle Analyse | |
| Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, China | Modell RT-6100 | Verwendung für die Messung der optischen Dichte | |
| R-Paket | Version 0.2 | Verwendung für die Vorhersage der Arzneimittelsensitivität (IC50); RRID:SCR_023220 | |
| Online-Plattform/Datenbank | Nicht zutreffend | Verwendung für die Analyse posttranslationaler Modifikationen; Analyse von posttranslationalen Modifikationsstellen | |
| R-Paket | Version 1.18.0 | Verwendung für die ROC-Kurvenanalyse | |
| R Foundation for Statistical Computing | Version 4.2.1 | Verwendung für statistische und bioinformatische Analysen; statistische und bioinformatische Analyse | |
| Abbott GmbH, Wiesbaden, Deutschland | REF 09P3374 | Verwendung für die Quantifizierung von Serum-SCC-Ag | |
| Online-Plattform | Nicht zutreffend | Verwendung für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse | |
| Sanli Medical Technology Development Co., Ltd., Liuyang, Hunan, China | Nicht angegeben | Verwendung für die venöse Blutentnahme | |
| IBM Corp. | Version 26.0 | Verwendung für die statistische Analyse; statistische Analyse | |
| STRING Consortium | Version 11.5 | Verwendung für die Analyse von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken; Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke | |
| R-Paket | Version 3.4 | Verwendung für die Überlebensanalyse | |
| R-Paket | Version 0.4.9 | Verwendung für die Visualisierung von Überlebenskurven | |
| National Cancer Institute | https://www.cancer.gov/tcga; abgerufen im Oktober 2025 | RRID:SCR_003193; Transkriptomikdaten bei Krebserkrankungen | |
| Online-Plattform | http://timer.cistrome.org; abgerufen im Oktober 2025 | RRID:SCR_018737; Analyse der Immuninfiltration | |
| UCSC Xena Browser | https://xenabrowser.net; abgerufen im Oktober 2025 | Verwendung für den Abruf von TCGA-Daten; TCGA-Datenabruf | |
| Online-Plattform/Werkzeug | Version 1.0 | Verwendung für die Schätzung der Infiltration von Immunzellen | |
| Online-Plattform | https://www.xiantaoxueshu.com; abgerufen im Oktober 2025 | Verwendung für differentielle Expression, Korrelations-, Überlebens- und Diagnoseanalysen |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.