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Ein Murines Leberlacerationsmodell zur Vereinfachung der Quantifizierung von trauma-induzierter hämorrhagischer Koagulopathie, Inflammation und dem Überleben

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DOI:

10.3791/72215

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25. September 2026

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1Division of Hematology and Cellular Therapy, Department of Medicine, University of California San Diego

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen ein reproduzierbares murine Modell einer Leberlaceration mit ausgeprägter Blutung vor, das Blutverlust, traumainduzierte Gerinnungsstörungen und Überlebensraten integriert. Das Modell ermöglicht die Bewertung hämostatischer Interventionen, einschließlich rekombinantes Faktor VIIa und Tranexamsäure, in Kombination mit Analysen der Gerinnung, Fibrinolyse und Mortalität, und bietet eine kostengünstige, skalierbare Plattform für mechanistische und translationsorientierte Forschung bei Blutungen.

Zusammenfassung

Unkontrollierte Blutungen sind nach wie vor eine der Hauptursachen für vermeidbare Todesfälle bei Verletzten, und die traumabedingte Gerinnungsstörung (TIC) ist ein wesentlicher Faktor für die frühe Sterblichkeit. Experimentelle Modelle, die Blutungen und die damit verbundenen gerinnungsstörungsbedingten Reaktionen zuverlässig nachbilden, sind für mechanistische Untersuchungen und die Bewertung gezielter therapeutischer Maßnahmen unerlässlich. Hier beschreiben wir ein standardisiertes murines Modell einer schweren Blutung mittels einer reproduzierbaren Leberverletzung (LL), die eine präzise Quantifizierung der Blutung ermöglicht und gleichzeitig systemische Gerinnungsstörungen, entzündliche Marker und die Sterblichkeit erfasst.

Mäuse erhalten eine standardisierte mediane Laparotomie gefolgt von einer LL, und der Blutverlust wird anhand von blutgetränkten Schwämmen quantifiziert. Systemische Marker der Gerinnung, Fibrinolyse und Entzündungsmarker werden vor dem Eingriff sowie zu vordefinierten, seriellen Zeitpunkten danach durch retroorbitale Blutentnahme erhoben. Die LL mit Blutverlust erzeugt zuverlässig eine TIC (gekennzeichnet durch eine Verlängerung der aktiven partiellen Thromboplastinzeit (aPTT), einen Anstieg des Thrombin-Antithrombin-(TAT)-Komplexes, eine selektive Verminderung der Gerinnungsfaktoren (F) V und VIII sowie eine Aktivierung der Fibrinolyse). Parallel dazu zeigt sich eine Entzündungsaktivierung durch erhöhte Interleukin-6-(IL-6)-Werte. Darüber hinaus ermöglicht das Modell auch Überlebensanalysen nach der Naht der medianen Inzision.

Als translationale Anwendung werden rhFVIIa und TXA verwendet, um zu belegen, dass das Modell empfindlich auf die Blutstillung durch pharmakologische Modulation der Gerinnungs- und fibrinolytischen Parameter reagiert. Im Vergleich zu Großtiermodellen bietet dieses murine System eine kostengünstige, vielseitige und leicht skalierbare Möglichkeit, innovative, gezielte Interventionen bei traumatischer Blutung zu untersuchen.

Einleitung

Trauma ist eine der häufigsten Todes- und Invaliditätsursachen bei jungen Erwachsenen (Alter < 45 Jahre)1,2, wobei unkontrollierte Blutungen eine wesentliche Ursache für die frühe Mortalität darstellen3. Ein entscheidender Faktor für ungünstige Behandlungsergebnisse bei schwer verletzten Patienten ist die Entwicklung einer traumainduzierten Gerinnungsstörung (TIC)4,5. TIC ist eine komplexe, multifaktorielle Dysregulation der Hämostase, die durch einen Mangel an Gerinnungsfaktoren V und VIII6,7, eine gestörte Fibrinolyse7,8,9 sowie eine systemische Entzündungsaktivierung10 gekennzeichnet ist. TIC trägt zu anhaltenden Blutungen bei und ist mit einem erhöhten Transfusionsbedarf11, Organversagen5 und einer erhöhten Mortalität assoziiert, trotz Fortschritten in der Schadenskontroll-Reanimation und therapeutischer Maßnahmen5.

Experimentelle Modelle, die einen hämorrhagischen Schock mit den damit verbundenen koagulopathischen Veränderungen zuverlässig reproduzieren, sind daher unerlässlich für die mechanistische Erforschung und Bewertung gezielter hämostatischer Maßnahmen. Bei kontrollierten Blutungsmodellen wird standardisiertes Blut entnommen, was möglicherweise keine Gewebeverletzung verursacht und somit nicht zu der systemischen Koagulopathie beiträgt, wie sie bei klinischem Trauma beobachtet wird12. Daher sollten Blutungsmodelle, die eine Verletzung eines parenchymatösen Organs einbeziehen, eine größere klinische Relevanz bieten, sofern anhaltende Blutung und systemische Reaktionen quantitativ erfasst werden können13,14,15,16. Komplexere Modelle der traumainduzierten Koagulopathie (TIC) kombinieren traumatische Hirnverletzungen, Frakturen von Langknochen oder Gliedmaßen, Weichteilverletzungen, Laparotomien und kontrollierten hämorrhagischen Schock, um mehrere Komponenten eines schweren Traumas nachzubilden17,18. Obwohl diese Ansätze eine umfassendere Darstellung eines Polytraumas ermöglichen, können die mehrfachen Verletzungsverfahren und physiologischen Eingriffe die technische Komplexität und die experimentelle Variabilität erhöhen.

Trotz jahrzehntelanger Forschung sind klinisch relevante und reproduzierbare experimentelle Modelle der traumainduzierten Koagulopathie (TIC) weiterhin begrenzt und heterogen. Übersichtsarbeiten haben die Notwendigkeit robuster Modelle hervorgehoben, die die klinische Abfolge von Gewebeschädigung und hämorrhagischem Schock genauer nachbilden und die Beurteilung therapeutischer Maßnahmen ermöglichen17,19. Komplexe Modelle, die umfangreiche Instrumentierungen erfordern, wie beispielsweise Herzkatheterisierung und kontinuierliche hämodynamische Überwachung, können detaillierte physiologische Informationen liefern, benötigen jedoch auch spezielle Ausrüstung und zusätzliche prozedurale Eingriffe. Um Barrieren in der Traumaforschung abzubauen, erscheint die Vereinfachung des experimentellen Ansatzes unter Beibehaltung der wesentlichen Merkmale der TIC entscheidend. Hier beschreiben wir ein standardisiertes murines Modell, das zu einem unkontrollierten hämorrhagischen Schock14 führt, indem reproduzierbare Leberläsionen (LL) eingesetzt werden, die zu starkem Blutverlust führen und zentrale Merkmale der TIC nachahmen. Dieses Modell ermöglicht die Beurteilung von Gerinnungs- und entzündlichen Reaktionen, einschließlich allgemeiner Gerinnungsparameter (aPTT und Thrombinbildung), selektiver Depletion von Gerinnungsfaktoren (FV und FVIII) als Kennzeichen der TIC, Markern der Fibrinolyse sowie der Zytokine. Um die Empfindlichkeit und Relevanz dieses Modells für menschliche Traumata zu demonstrieren, untersuchen wir die Wirkungen von rhFVIIa (prohämostatisches Mittel) und TXA (antifibrinolytisches Mittel), die bei der Traumareanimation eingesetzt werden, auf Schwere des Blutungsereignisses, Fortschreiten der Gerinnungsstörung und Überlebensraten.

Das Modell ermöglicht außerdem eine serielle und terminale Blutentnahme, wodurch eine longitudinale Beurteilung der Gerinnungs- und Entzündungsverläufe in Bezug auf die Schwere der Verletzung und therapeutische Maßnahmen möglich wird. Insgesamt bietet das Modell ein reproduzierbares und skalierbares murines System zur Untersuchung der traumainduzierten Koagulopathie (TIC) im Kontext einer ausgeprägten Blutung sowie zur Evaluierung hämostatischer und gezielter pharmakologischer Interventionen unter Verwendung klinisch relevanter Endpunkte wie Blutverlust, Gerinnungsstörung, Fibrinolyse, Entzündung und Überleben.

Im Vergleich zu zuvor veröffentlichten murinen Leberlacerationsmodellen, einschließlich des Protokolls beschrieben von Dyer et al.13, weist diese Methode mehrere entscheidende methodische Fortschritte auf. Dazu gehören die quantitative gravimetrische Messung des Blutverlusts, die Standardisierung der Verletzungsschwere durch Normierung der lacerierten Lebermasse auf das Körpergewicht sowie ein umfassendes Profiling von TIC, Fibrinolyse und Entzündung. Darüber hinaus ermöglicht das Modell serielle Probennahmen, pharmakologische Modulation und Überlebensanalysen, die Bauchdeckenverschluss-Techniken detailliert beschreiben und somit physische Genesung statt Beendigung erlauben. Alle Verfahren können innerhalb eines einzigen experimentellen Ansatzes durchgeführt werden und bieten eine skalierbare und translationale Plattform zur Untersuchung von Blutungen und gezielten hämostatischen Interventionen.

Protokoll

Alle Tierversuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California San Diego (UCSD) genehmigt. C57BL/6J-Mäuse wurden in der hauseigenen Zuchtanlage der UCSD gezüchtet und gehalten. Sowohl männliche als auch weibliche Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen wurden in den Experimenten verwendet. Eine schematische Übersicht zum experimentellen Arbeitsablauf und Zeitplan ist in Abbildung 1, Zusatzmaterial dargestellt.

HINWEIS: Die Stichprobengrößen wurden basierend auf vorläufigen Experimenten, der erwarteten Variabilität einzelner Endpunkte und früheren Erfahrungen mit dem murinen Leberverletzungsmodell bestimmt. Die endgültigen Stichprobengrößen für einzelne experimentelle Endpunkte und Versuchsgruppen sind in den entsprechenden Abbildungslegenden angegeben. Bei Lebergewichtsmessungen wurden Daten aus mehreren unabhängigen Experimenten zusammengefasst, um die Konsistenz zwischen den experimentellen Kohorten zu bewerten. Bei Koagulationsassays, die in getrennten Experimenten durchgeführt wurden, wurden bereits analysierte Proben in mehreren Durchläufen einbezogen, um die Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit zwischen den Assays zu überwachen.

1. Vorbereitung vor dem Experiment

  1. Sammlung der Basislinienproben (Tag -1)
    1. Entnehmen Sie 24 Stunden vor dem Experiment jeweils etwa 200 µL Blut von jedem Maus (8–10 Wochen alt) über den retroorbitalen Zugang, um die Basisparameter zu bestimmen.
    2. Injizieren Sie nach der Blutentnahme subkutan etwa 200 µL sterile, injizierbare Kochsalzlösung.
    3. Stellen Sie die Mäuse in saubere Käfige unter standardisierten Laborbedingungen mit einer kontrollierten Temperatur von 20–24 °C, relativer Luftfeuchtigkeit von 30 %–70 % und einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Wechsel; Futter und Wasser sind bis zum Tag des Experiments ad libitum verfügbar.
  2. Vorbereitung der Käfige (Tag 0)
    1. Bringen Sie die Maus am Tag des Experiments in einen sauberen Käfig, der mit frischen Papiertüchern ausgelegt ist.
    2. Entfernen Sie Futter und Wasser 15 Minuten vor dem Experiment und entziehen Sie beides, bis die Absorptions-Schwämme nach der Operation entfernt werden.

2. Vorbereitung des Instruments und des Operationsfeldes

  1. Instrumentensterilisation
    1. Die chirurgischen Instrumente, Baumwolle, Applikatoren und Filterpapiere durch Autoklavieren sterilisieren.
    2. Die chirurgische Arbeitsfläche mit 70%igem Ethanol desinfizieren.
  2. Chirurgietischvorbereitung
    1. Die sterilen Instrumente auf einem sterilen Tuch anordnen.
    2. Einen Edelstahlbehälter mit 70%igem Ethanol und steriler Baumwolle zur vorübergehenden Reinigung der Instrumente bereitstellen.
    3. Einen Mikrokugel-Sterilisator einschalten und auf 150 °C aufheizen lassen, um die Instrumente zwischen den Tieren zu sterilisieren.

3. Vorbereitung der Temperaturhaltung

  1. Vorbereitung der isothermen Unterlage
    1. Aktivieren Sie die isotherme Heizunterlage unmittelbar vor der Operation gemäß den Herstelleranweisungen.
    2. Stellen Sie die isotherme Heizunterlage so ein, dass die Körpertemperatur der Maus während der Anästhesie und Operation im Zielbereich von 36–37 °C gehalten wird.
    3. Überprüfen Sie eine gleichmäßige Wärmeverteilung über die gesamte Oberfläche der Unterlage.
    4. Platzieren Sie die Unterlage auf dem Operationsplatz und decken Sie sie mit einem sterilen Tuch ab.
    5. Verbinden Sie das Operationsbrett mit dem Isofluran-Anästhesiesystem.

4. Anästhesie und präoperative Verfahren

  1. Einleitung der Anästhesie
    1. Leiten Sie die Anästhesie ein, indem Sie die Maus in eine Induktionskammer mit 2 % Isofluran in 2 L/min Sauerstoff stellen.
    2. Überprüfen Sie eine ausreichende Anästhesie mittels Zehenquetschreflex.
    3. Notieren Sie das Körpergewicht vor der Operation.
  2. Analgesie und Applikation der Behandlung
    1. Verabreichen Sie Buprenorphin (3,25 mg/kg, subkutan) zur Schmerzlinderung.
    2. Bereiten Sie hämostatische Agentien nach Bedarf vor.
    3. Verabreichen Sie für die Behandlungsgruppen rekombinantes humanes aktiviertes Faktor-VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) oder Tranexamsäure (10 mg/kg) mittels retroorbitaler intravenöser Injektion 5 Minuten vor der Verletzung.
    4. Verabreichen Sie Kontrolltieren ein äquivalentes Volumen (~100 µL) sterile, injektionsfähige Kochsalzlösung.

5. Chirurgische Vorbereitung

  1. Vorbereitung der Operationsstelle
    1. Überführen Sie die anästhetisierte Maus auf die Operationsplatte, die auf der isothermen Unterlage positioniert ist.
    2. Während des gesamten chirurgischen Eingriffs die Anästhesie über eine Nasenkonneke mit 1,5–2 % Isofluran in 2 L/min Sauerstoff aufrechterhalten.
    3. Die Maus in Rückenlage bringen und alle vier Gliedmaßen mit Klebeband fixieren.
    4. Den Bauchbereich rasieren.
    5. Die aseptische Vorbereitung durchführen, indem Povidon-Iod und 70 %igen Ethanol abwechselnd dreimal angewendet werden.

6. Leberverletzungsverfahren

  1. Vorwiegen von Materialien
    1. Wiegen Sie zwei 1,5-mL-Röhrchen vor, einschließlich eines Röhrchens mit 0,5 mL Salzlösung und eines leeren Röhrchens.
    2. Wiegen Sie drei primäre und zwei sekundäre Absorptionsdreiecke pro Tier vor und notieren Sie deren Gesamtmasse.
    3. Wiegen Sie ein Wiegeschälchen pro Tier vor, um anschließend das exzidierte Lebergewebe zu wiegen.
  2. Induktion einer Leberverletzung
    1. Führen Sie eine mediane Laparotomie von etwa 0,5 Zoll (12,7 mm) Länge durch, um die Leber freizulegen.
    2. Platzieren Sie zwei Absorptionsdreiecke entlang der rechten und linken Bauchwand, wobei Kontakt mit der Leber vermieden werden sollte.
    3. Exteriorisieren Sie das linke Leberlappen und identifizieren Sie die Lappenränder, um den Umfang der Gewebeentfernung zu standardisieren. Vermeiden Sie unbeabsichtigte Gewebeverletzungen.
    4. Längen Sie mit scharfen Scheren etwa 75 % des Läppchens in einer einzigen kontrollierten Bewegung, um Konsistenz zwischen den Tieren sicherzustellen.
    5. Überführen Sie das exzidierte, verletzte Gewebe in das vorab gewogene leere Röhrchen, um anschließend den Schweregrad der Verletzung zu quantifizieren.
    6. Bringen Sie ein drittes Absorptionsdreieck in die Bauchhöhle ein, um eine gleichmäßige Blutsammlung während der Blutungsphase zu erleichtern.
  3. Schneller Bauchverschluss zur Aufrechterhaltung der internen Blutung (kritischer Schritt)
    1. Schließen Sie die Bauchwand unmittelbar innerhalb von ca. 10–15 s mit zwei chirurgischen Autoklipsen.
    2. Stellen Sie eine präzise Ausrichtung der Schnittränder sicher, um einen lückenlosen Verschluss zu erreichen. Unvollständige Verschlüsse können zu äußerer Blutung und einer Unterschätzung des Blutverlusts führen.
    3. Üben Sie gleichmäßigen, aber sanften Zug während des Verschlusses aus, wobei eine Kompression der Bauchinhalte vermieden werden sollte, da dies die Blutungsdynamik beeinflussen könnte.
    4. Verstärken Sie den Verschluss mit Gewebekleber (2–3 Tropfen), um einen vollständig abgedichteten Bauchraum sicherzustellen.
  4. Überwachung nach der Verletzung
    1. Wiegen Sie das exzidierte Lebergewebe und normieren Sie die Messung auf das Körpergewicht, um Ausmaß und Schwere der Leberverletzung zu quantifizieren und zu bestätigen.
    2. Bringen Sie die Maus in den Käfig zurück, der auf einer isothermen Unterlage steht.
    3. Lassen Sie die Blutung 60 Minuten lang für die Endpunkt- und Überlebenskohorte fortschreiten.

7. Blutentnahme und Quantifizierung des Blutverlusts

  1. Blutprobenentnahme und -verarbeitung
    1. Reanästhesieren Sie die Maus für die Endpunkt-Kohorte mit Isofluran 60 Minuten nach Leberverletzung.
    2. Reanästhesieren Sie die Maus für die Überlebenskohorte mit Isofluran 6 Stunden und 7 Tage nach Leberverletzung zur Blutentnahme.
    3. Entnehmen Sie das Blut mittels retroorbitaler Punktion in Röhrchen mit Natriumcitrat-Lösung (Blut-zu-Antikoagulans-Verhältnis: 9:1) zur Plasmagewinnung.
    4. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten bei 2.000 × g, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation 5 Minuten bei 12.000 × g, um plättchenarmes Plasma für nachfolgende Gerinnungs- und Fibrinolyse-Assays zu erhalten.
  2. Blutverlustmessung
    1. Öffnen Sie den Bauchraum bei beiden Kohorten (Endpunkt- und Überlebenskohorte) 60 Minuten nach Leberverletzung erneut und entfernen Sie die Blut enthaltenden Absorptions-Schwämme.
    2. Überführen Sie alle blutgetränkten Schwämme in ein vorher gewogenes Röhrchen mit steriler Kochsalzlösung.
    3. Verwenden Sie zusätzliche vorher gewogene Absorptions-Schwämme, um verbliebenes Blut in der Bauchhöhle aufzusaugen.
    4. Wägen Sie das Sammelröhrchen nach der Blutentnahme, um das Endgewicht des Röhrchens zu ermitteln.
    5. Berechnen Sie den Blutverlust mithilfe der folgenden gravimetrischen Gleichung:
      Blutverlust (µL/g) = [(Endgewicht des Röhrchens − Anfangsgewicht des Röhrchens – Gewicht des Absorptions-Schwamms) / Körpergewicht der Maus] × 1000.
      HINWEIS: Alle Gewichte werden in Gramm angegeben. Der Faktor 1.000 wandelt Gramm Blut in Mikroliter um, unter der Annahme einer Blutdichte von etwa 1 g/mL.
  3. Überlebens- und longitudinale Endpunkt-Kohorte
    1. Unmittelbar nach der Blutverlustmessung 60 Minuten nach der Verletzung schließen Sie den Schnitt mit chirurgischen Klammer und Gewebekleber, um eine vollständig abgedichtete Bauchhöhle sicherzustellen.
    2. Spritzen Sie 400 µL sterile Kochsalzlösung subkutan vor der Ausnarkose.
    3. Bringen Sie die Maus in die Standardhaltung zurück, überwachen Sie sie kontinuierlich während des Aufwachens aus der Narkose und untersuchen Sie sie 2 h, 6 h und 24 h nach der Operation sowie danach täglich bis zum Tag 7.

8. Nachsorge nach der Operation

  1. Postoperative Überwachung
    1. Überwachen Sie die Tiere während der frühen Erholungsphase von der Anästhesie kontinuierlich auf Anzeichen von Belastung oder Morbidität.
    2. Notieren Sie den Überlebensstatus und klinische Beobachtungen bei jeder geplanten Untersuchung.
  2. Unterstützende Versorgung
    1. Verabreichen Sie täglich 400 µL sterile Kochsalzlösung subkutan für 3 Tage.
    2. Verabreichen Sie Analgetika (Buprenorphin, 3,25 mg/kg, subkutan) alle 72 Stunden gemäß dem genehmigten Tierpflegeprotokoll.
    3. Halten Sie die Mäuse in Standardhaltung mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
  3. Humane Endpunkte
    1. Überwachen Sie die Tiere auf vordefinierte humane Endpunkte, einschließlich schwerer oder anhaltender Lethargie, Unfähigkeit zur Fortbewegung oder zum Erreichen von Futter oder Wasser, schwerer Atemnot, Unansprechbarkeit oder anderer Anzeichen schwerer Belastung, wie sie im genehmigten institutionellen Tierpflegeprotokoll festgelegt sind.
    2. Töten Sie Tiere, die die vordefinierten humanen Endpunkte erreichen, gemäß den institutionellen Richtlinien.
    3. Führen Sie die Überlebensüberwachung bis zum Tag 7 oder bis zum Erreichen eines humanen Endpunkts fort.

9. Endpunkte und Gewebegewinnung

  1. Versuchen Sie Mäuse zu vordefinierten experimentellen Zeitpunkten und gewinnen Sie Blut mittels retroorbitärer Punktion.
  2. Töten Sie die Tiere durch CO₂-Inhalation gemäß den institutionellen Richtlinien.
  3. Entnehmen Sie Organe und verarbeiten Sie die Gewebe gemäß der angegebenen nachgeschalteten Verfahren für die histologische Analyse.

10. Gerinnungs-, Fibrinolyse- und Zytokin-Analysen

HINWEIS: Reagenzien, Test-Kits und Geräte, die für diese Verfahren verwendet werden, sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

  1. Bestimmung der aPTT
    1. Alle Gerinnungszeiten mit dem im Materialverzeichnis aufgeführten Gerinnungsanalysegerät erfassen.
    2. 25 µL Mausplasma mit 25 µL aPTT-Reagenz mischen und 3 min bei 37 °C inkubieren. Die Gerinnung durch Zugabe von 25 µL CaCl₂ (25 mM) in HBS (20 mM HEPES, 147 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7,4) einleiten und die Gerinnungszeit aufzeichnen.
  2. Bestimmung der Aktivität von FV, FII und FX
    1. 5 µL Mausplasma mit 20 µL des entsprechenden faktordefizienten Plasmas und 25 µL HBS, das 0,5 % Rinderserumalbumin enthält, mischen.
    2. 1 min bei 37 °C inkubieren und die Gerinnung durch Zugabe des im Materialverzeichnis aufgeführten Innovin-Reagenz einleiten.
    3. Die Faktoraktivität relativ zum entsprechenden Kalibrierungs-/Referenzsystem bestimmen.
  3. Bestimmung von FVIII
    1. FVIII mittels chromogenem FVIII-Assay gemäß den Herstelleranweisungen bestimmen.
  4. Bestimmung von Fibrinogen
    1. Die Fibrinogenkonzentration nach der Methode von Clauss bestimmen. 10 µL Mausplasma zu 40 µL HEPES-puffertem Salzlösung, das 0,01 % Rinderserumalbumin enthält, hinzufügen und 3 min bei 37 °C inkubieren.
    2. Die Bildung des Gerinnsels durch Zugabe von 25 µL Thrombin (25 U/mL) einleiten und die Fibrinogenkonzentration anhand der Assay-Kalibrierung ermitteln.
  5. Bestimmung von Plasmabiomarkern
    1. Plasma-TAT-Komplexe, PAP-Komplexe und D-Dimer mit den im Materialverzeichnis aufgeführten kommerziell erhältlichen Assay-Kits messen. Jeden Assay gemäß den Herstelleranweisungen durchführen.
    2. Assay-spezifische Standards, Kalibratoren und Kontrollen gemäß den Angaben der Hersteller verwenden und die Analytkonzentrationen anhand der entsprechenden Standardkurven berechnen.
  6. Bestimmung von IL-6 im Plasma
    1. Die Konzentrationen von IL-6 im Plasma zu Beginn sowie 60 min und 6 h nach Leberverletzung mittels des im Materialverzeichnis aufgeführten multiplexen Zytokinassays messen.
    2. Den Assay gemäß den Herstelleranweisungen durchführen und die Daten mit der Q-View-Software des Herstellers analysieren.

Ergebnisse

Das LL-Modell führt bei Mäusen zu reproduzierbaren und standardisierten Verletzungsschweregraden. Abbildung 1A zeigt die Konsistenz des Gewichts des verletzten Lebergewebes, normiert auf das Körpergewicht (%KG), mit einem medianen Verletzungsgrad von 1,4 % KG über alle Versuchsgruppen hinweg. Diese Konsistenz bestätigt eine zuverlässige chirurgische Induktion und ermöglicht die Reproduzierbarkeit zwischen Tieren und unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Die Fähigkeit, den Schweregrad der Verletzung zu standardisieren, ist entscheidend, um downstream gerichtete physiologische Reaktionen unabhängig von Variabilitäten im Gewebeschaden zu bewerten.

Die Validierung der Blutungsreaktion und therapeutischen Modulation innerhalb des Modells ist in Abbildung 1B dargestellt. Die Mäuse erhielten vorab Kochsalzlösung, das präventive hämostatische Mittel rhFVIIa oder den antifibrinolytischen Wirkstoff TXA, und der Blutverlust wurde quantifiziert und auf das Körpergewicht normiert (µL/g). Bei mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen trat nach LL eine erhebliche Blutung auf, während bei mit rhFVIIa oder TXA behandelten Mäusen ein reduzierter Blutverlust beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass dieses Modell in der Lage ist, pharmakologische Modulationen der Blutung zu erfassen und hämostatische Interventionen unter Bedingungen einer unkontrollierten Blutung zu bewerten.

Das Modell zeigt auch Schlüsselmerkmale einer traumainduzierten Gerinnungsstörung. Wie in Abbildung 1C dargestellt, führte LL zu einer Verlängerung der aPTT, was auf eine beeinträchtigte Gerinnung nach der Verletzung hinweist. Die Behandlung mit rhFVIIa oder TXA verminderte diese Verlängerung, was auf eine Wiederherstellung der Gerinnungsfunktion schließen lässt. Ebenso war die Thrombinbildung, gemessen anhand von TAT-Komplexen, nach LL erhöht und durch TXA-Behandlung verringert, während rhFVIIa die TAT-Spiegel nicht senkt (Abbildung 1D), was auf eine Modulation der Gerinnungsaktivierung hindeutet.

Die weitere Charakterisierung der Gerinnungsstörung ist in Abbildung 2 dargestellt. LL führte zu einem selektiven Abbau der Gerinnungsfaktoren V und VIII, was mit einer TIC übereinstimmt, und diese Veränderungen wurden durch die Behandlung mit rhFVIIa oder TXA wieder normalisiert (Abbildung 2A,B). Im Gegensatz dazu waren die Faktoren II und X nicht signifikant verändert (Abbildung 2C,D), was darauf hinweist, dass diese Veränderungen im Kontext erhaltener Faktoren II und X auftreten und somit einen TIC-dominanten statt eines disseminierten intravasalen Gerinnungssyndroms (DIC)-ähnlichen Phänotyp unterstützen.

Die Entwicklung der Fibrinolyse nach LL ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Fibrinogenspiegel waren nach der Verletzung vermindert, was auf einen Verbrauch hinweist, und wurden durch rhFVIIa oder TXA nicht vollständig wiederhergestellt (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu waren fibrinolytische Marker, einschließlich Plasmin-Antiplasmin-(PAP)-Komplexe und D-Dimer, nach LL erhöht. rhFVIIa senkte die Konzentration der PAP-Komplexe, veränderte jedoch die D-Dimer-Spiegel nicht signifikant. TXA verringerte sowohl die PAP-Komplex- als auch die D-Dimer-Spiegel nach LL (Abbildung 3B,C).

Abschließend werden systemische entzündliche Reaktionen und Überlebensergebnisse in Abbildung 4 bewertet. Die Plasmaspiegel von Interleukin-6 (IL-6) werden 60 Minuten und 6 h nach LL in allen Behandlungsgruppen gemessen. Die IL-6-Spiegel sind zu frühen Zeitpunkten in allen Gruppen erhöht (Abbildung 4A). Die Überlebensrate über einen Zeitraum von 7 Tagen wird mittels Kaplan-Meier-Analyse ermittelt. Die 7-Tage-Überlebensrate beträgt 75 % in der Saline-Gruppe, 55 % in der rhFVIIa-Gruppe und 80 % in der TXA-behandelten Gruppe. Zwischen der Saline- und der TXA-Gruppe zeigt sich kein signifikanter Unterschied, wohingegen die Überlebensrate in der rhFVIIa-Gruppe im Vergleich zu den Saline- und TXA-Gruppen signifikant vermindert ist (Abbildung 4B).

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Abbildung 1: Validierung des Leberlappenverletzungsmodells (LL): Reproduzierbarkeit der Verletzungsschwere, quantitativer Blutverlust und Induktion einer Gerinnungsstörung. Schwere innere Blutungen werden durch eine mediane Laparotomie gefolgt von einer standardisierten LL ausgelöst. Mäuse erhalten vor der Verletzung eine Vorbehandlung mit Kochsalzlösung (~100 µL) oder rekombinantem humanem aktiviertem Faktor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) bzw. Tranexamsäure (TXA; 10 mg/kg), um die pharmakologische Modulation von Blutung und Gerinnungsstörung zu untersuchen. (A) Die Verletzungsschwere wird als normalisiertes Gewicht des verletzten Lebergewebes bezogen auf das Körpergewicht (%BW) quantifiziert und zeigt eine reproduzierbare Induktion einer standardisierten Verletzung über alle Tiere hinweg. (B) Der Blutverlust wird gravimetrisch bestimmt und auf das Körpergewicht normiert (µL/g), wodurch eine messbare Blutung nachweisbar ist, die durch die Gabe von TXA vermindert wird. (C) Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und (D) Thrombin–Antithrombin-Komplexe (TAT) zeigen eine reproduzierbare Induktion einer Gerinnungsstörung nach LL, wobei eine Modulation nach Behandlung mit rhFVIIa oder TXA beobachtet wird. Die Daten sind als individuelle Werte mit Median und Interquartilsabstand dargestellt; Vergleiche erfolgten mittels des nichtparametrischen Mann–Whitney-U-Tests (n = 5–21). ****P ≤ 0,0001. Übernommen mit Genehmigung von Joseph et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Validierung der trauminduzierten Gerinnungsstörung (TIC) nach Leberlazeration (LL): selektiver Verlust von Gerinnungsfaktoren. Schwere innere Blutungen werden durch eine mediane Laparotomie gefolgt von einer standardisierten LL ausgelöst. Mäuse erhalten vor der Verletzung eine Vorbehandlung mit Kochsalzlösung (~100 µL) oder rekombinantem humanem aktiviertem Faktor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) bzw. Tranexamsäure (TXA; 10 mg/kg), um die pharmakologische Modulation der Gerinnungsstörung zu untersuchen. Die Gerinnungsparameter werden 60 Minuten nach der LL bestimmt. (A) Die Spiegel von Faktor V und (B) Faktor VIII zeigen einen reproduzierbaren Abfall nach LL, was mit einer TIC übereinstimmt. (C) Faktor II und (D) Faktor X bleiben relativ erhalten, was auf einen selektiven Verlust von Gerinnungsfaktoren und keinen globalen Verbrauch hinweist. Die Daten sind als individuelle Werte mit Median und Interquartilsabstand dargestellt (n = 7–10). Statistische Vergleiche erfolgten mittels des nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Tests. ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. Übernommen mit Genehmigung von Joseph et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Validierung der fibrinolytischen Aktivierung nach Leberverletzung (LL). Schwere innere Blutungen werden durch eine mediane Laparotomie gefolgt von einer standardisierten LL ausgelöst. Mäuse erhalten vor der Verletzung eine Vorbehandlung mit Kochsalzlösung (~100 µL), rekombinantem humanem aktiviertem Faktor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) oder Tranexamsäure (TXA; 10 mg/kg), um die pharmakologische Modulation der Fibrinolyse zu untersuchen. Die fibrinolytischen Parameter werden 60 Minuten nach der LL bestimmt. (A) Fibrinogenspiegel zeigen einen Verbrauch nach der Verletzung, was mit einer Aktivierung der Fibrinolyse und einer Depletion von Gerinnungsfaktoren übereinstimmt. (B) Plasmin–Antiplasmin- (PAP-)Komplexe und (C) D-Dimer-Spiegel sind nach LL erhöht, was auf eine aktive Fibrinabbauaktivität und eine systemische fibrinolytische Aktivierung hinweist. Die Daten sind als individuelle Werte mit Median und Interquartilsabstand dargestellt (n = 8–13). Statistische Vergleiche wurden mit dem nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. Angepasst mit Genehmigung von Joseph et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Validierung der systemischen Entzündungsreaktion und Überlebensbewertung nach Leberruptur (LL). Schwere innere Blutungen werden durch eine mediane Laparotomie gefolgt von einer standardisierten LL ausgelöst. Die Mäuse erhalten vor der Verletzung eine Vorbehandlung mit Kochsalzlösung (100 µL), rekombinantem humanem aktiviertem Faktor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) oder Tranexamsäure (TXA; 10 mg/kg). Nach der Verletzung wird der Bauchschnitt mit Wundclips und Gewebekleber verschlossen, und die Tiere werden in ihre Heimkäfige zurückgebracht. Die unterstützende Versorgung umfasst die tägliche subkutane Gabe von Kochsalzlösung (400 µL) für die ersten drei Tage nach der Verletzung. Plasmaproben werden 60 Minuten und 6 Stunden nach der LL entnommen, um die systemische Entzündungsaktivierung zu bewerten. (A) Die Interleukin-6 (IL-6)-Spiegel zeigen eine anhaltende systemische Entzündungsreaktion nach der Verletzung. Die Daten sind als individuelle Werte mit Median und Interquartilsabstand dargestellt. Statistische Vergleiche wurden mit dem nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test durchgeführt (n = 9–13). (B) Die Überlebensrate über sieben Tage wird mittels Kaplan-Meier-Analyse ermittelt und zeigt die Eignung des Modells für langfristige, ereignisbasierte Endpunkte (n = 20). ****P ≤ 0.0001. Übernommen mit Genehmigung von Joseph et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 1 (Zusatzmaterial): Schematische Übersicht über das Leberlacerationsmodell und den experimentellen Zeitplan. Diese Abbildung fasst den experimentellen Arbeitsablauf für das standardisierte murine Modell der Leberlaceration (LL) bei unkontrollierter Blutung zusammen. Die Mäuse erhalten eine mediane Laparotomie, gefolgt von einer reproduzierbaren Laceration von etwa 75 % des linken Leberlappens. Vor der Verletzung erhalten die Tiere entweder Kochsalzlösung (~100 µL, Fahrzeugkontrolle) oder rekombinantes humanes aktiviertes Faktor-VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) bzw. Tranexamsäure (TXA; 10 mg/kg), verabreicht intravenös mittels retroorbitalem Spritzen 5 min vor der LL. Die Quantifizierung des Blutverlusts erfolgt mittels vorab gewogener Bauchtücher, die zum Zeitpunkt der Verletzung intraabdominal platziert, 60 min nach der LL entnommen und erneut gewogen werden, um die Gesamtblutung zu bestimmen. Anschließend wird der Bauch mit Wundclips und Gewebekleber verschlossen. Blutproben werden bei der Endpunkt-Kohorte nach 60 min sowie bei der Überlebenskohorte nach 6 h und 7 Tagen über den retroorbitalen Zugang entnommen. Das Plasma wird nach 60 min auf Gerinnungsparameter hin analysiert, einschließlich der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT), der Aktivität von Gerinnungsfaktoren, Thrombin-Antithrombin-(TAT)-Komplexen, Plasmin-α2-Antiplasmin-(PAP)-Komplexen und D-Dimeren. Die Zytokin-Profilanalyse erfolgt nach 60 min und 6 h. Das Überleben wird über einen Zeitraum von 7 Tagen überwacht. Angepasst mit Genehmigung von Joseph et al.16. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In dieser Studie stellen wir ein reproduzierbares murine Modell einer schweren Blutung mittels standardisierter LL vor, das die quantitative Beurteilung des Blutverlusts, die Charakterisierung der TIC und der Entzündungsreaktion sowie die Überlebensanalyse in einem einzigen Experiment integriert. Das Modell erzeugt eine konsistente Verletzungsschwere, wie durch vergleichbare auf das Körpergewicht normierte Gewichte der Leberläsion gezeigt wird, und ermöglicht gleichzeitig eine reproduzierbare Bewertung der Blutungs- und systemischen hämostatischen Reaktionen über verschiedene experimentelle Gruppen hinweg. Die Verwendung eines Kleinsäugermodells mit standardisierter Verletzung und quantitativen Endpunkten ermöglicht eine effiziente Beurteilung mehrerer experimenteller Zielgrößen innerhalb eines einzigen experimentellen Ansatzes und unterstützt so die reproduzierbare und skalierbare Untersuchung der TIC, ohne technisch anspruchsvolle Verfahren zu erfordern.

Wichtig ist, dass dieses Modell zentrale Merkmale der traumainduzierten Koagulopathie (TIC) widerspiegelt, einschließlich einer Verlängerung der allgemeinen Gerinnungsparameter (aPTT), einer erhöhten Thrombinbildung, wie sie durch TAT-Komplexe angezeigt wird, einer selektiven Verminderung der Gerinnungsfaktoren V und VIII sowie einer Aktivierung der Fibrinolyse, belegt durch erhöhte PAP-Komplexe und D-Dimer-Bildung. Diese Veränderungen treten bei erhaltener Konzentration der Faktoren II und X auf, was für ein TIC-dominantes gegenüber einem disseminierten intravasalen Gerinnungssyndrom (DIC) sprechendes Phänotyp unterstützt. Die Möglichkeit, diese Parameter gleichzeitig zu quantifizieren, bietet einen translationsrelevanten Rahmen zur Beurteilung der hämostatischen Dysregulation nach traumatischer Verletzung.

Eine zentrale Stärke dieses Modells ist die Einbeziehung des Überlebens als Endpunkt im Kontext traumatischer Blutung. Um klinisch relevante Rettungsstrategien zu testen, untersuchten wir rhFVIIa und TXA, zwei Wirkstoffe, die beim Menschen zur Reanimation nach Trauma eingesetzt oder erforscht werden. TXA zeigte konsistente Effekte bei der Reduktion des Blutverlusts, der Normalisierung der Gerinnungsstörung und der fibrinolytischen Aktivierung, was sich in einer Verbesserung des Überlebens auswirkte. Im Gegensatz dazu führte rhFVIIa zu einer bemerkenswerten Mortalität, verbunden mit einer Überkorrektur hämostatischer Parameter und einer unvollständigen Kontrolle der Fibrinolyse16.

Diese Ergebnisse verdeutlichen einen wichtigen Aspekt des Modells: Das Überleben wird durch ein komplexes Zusammenspiel der Schwere der Blutung, einer Gerinnungsstörung und der systemischen Reaktion bestimmt, nicht durch die isolierte Korrektur einzelner hämostatischer Signalwege. Es scheint, dass dieses Blutungsmodell empfindlich auf die Integration biochemischer hämostatischer Parameter mit dem Überleben reagiert, wobei letzteres ein entscheidender Outcome-Parameter in der klinischen Praxis ist. Obwohl schwere traumatische Blutung die primäre verletzungsbedingte Schädigung darstellt, die in diesem System modelliert wird, könnten auch sekundäre Organverletzungen zum Gesamtergebnis beitragen. In unserer vorherigen Studie mit diesem Modell wurden bei mit rhFVIIa behandelten Mäusen pulmonale Mikrothromben und Fibrinablagerungen beobachtet, die mit einer erhöhten Mortalität assoziiert waren, was auf einen möglichen Beitrag thromboinflammatorischer Organverletzungen zum Outcome hindeutet16.

Obwohl in der vorliegenden Studie keine zeitgleiche Schein-Operation-Gruppe eingeschlossen wurde, haben wir zuvor gezeigt, dass eine Laparotomie ohne Leberverletzung (LL) nicht zu einer TIC führte, was die Notwendigkeit eines zusätzlichen schnellen Blutverlusts (Schock) belegt, um die charakteristischen Gerinnungsstörungen zu erzeugen, die bei einer TIC beobachtet werden14.

Mehrere technische Aspekte sind für die Reproduzierbarkeit dieses Modells wichtig. Der Umfang und die Lokalisation der Leberverletzung (LL) sollten standardisiert sein, da Variationen in der Menge des entfernten Lebergewebes die Schwere der Blutung und die daraus resultierende gerinnungsstörung erheblich beeinflussen können. In unserem Protokoll wird etwa 75 % des linken Leberlappens entfernt, wobei das Gewicht des verletzten Lebergewebes auf das Körpergewicht normalisiert wird, um ein objektives Maß für die Konsistenz der Verletzung zu erhalten. Eine schnelle und sichere Schließung der Bauchhöhle ist ebenfalls entscheidend, um einen externen Blutverlust zu verhindern und während der Beobachtungsphase ein begrenztes intraabdominelles Blutungsmilieu aufrechtzuerhalten. Zur genauen Messung des Blutverlusts sollten vorgewogene Tupfer systematisch vollständig zurückgesammelt werden, wobei das Sammelverfahren und der Zeitpunkt über alle Versuchsgruppen hinweg einheitlich sein müssen. Diese Schritte minimieren variationsbedingte Einflüsse durch den Operateur und sind besonders wichtig, da Unterschiede im anfänglichen Blutverlust die nachfolgende Gerinnungsstörung und das Überleben beeinflussen können. Tritt vor der Naht eine übermäßige Blutung auf oder geht Blut nach außen verloren, sollte das Tier ausgeschlossen werden.

Eine Einschränkung dieses Modells besteht darin, dass es auf Organverletzungen fokussiert ist, was die Heterogenität eines Polytraumas – das langknochige Frakturen, Weichteilquetschtraumata und andere komplexe Schockzustände umfassen kann – nicht widerspiegelt. Diese fokussierte Verletzung ist jedoch auch bewusst als Merkmal des Modells konzipiert, um die Effekte einer schweren Blutung und einer traumainduzierten Koagulopathie (TIC) untersuchen zu können, ohne durch zusätzliche prozedurale Komplexität und Variabilität infolge mehrerer Verletzungsarten beeinträchtigt zu werden. Zusammenfassend bietet dieses murine LL-Modell einen kostengünstigen (im Vergleich zu Studien an großen Tieren), robusten und skalierbaren Ansatz zur Untersuchung von traumabedingter Blutung, TIC und Letalität. Durch die Kombination einer einfachen experimentellen Plattform an kleinen Nagetieren mit standardisierter Verletzung, quantitativer Blutverlustmessung, umfassender hämostaseologischer Profilierung und Überlebensbewertung stellt das Modell eine praktikable Alternative zu aufwändiger instrumentierten Traumamodellen dar. Es ermöglicht eine integrierte Beurteilung des Blutvolumenverlusts, der Koagulation (aPTT, FII, FV, FVIII, FX, TAT), der Fibrinolyse (Fibrinogen, PAP, D-Dimer) sowie von Überlebensendpunkten in einem klinisch relevanten Kontext, der sich besonders gut zur Evaluierung antifibrinolytischer und gezielter hämostasefördernder Interventionen eignet.

Offenlegungen

A.v.D. hat Honorare für die Teilnahme an wissenschaftlichen Beiräten, Beratungstätigkeiten und Vortragsveranstaltungen von BioMarin, Regeneron, Pfizer, Bioverativ/Sanofi, CSL Behring, Novo Nordisk, Spark Therapeutics, Genentech und uniQure erhalten. A.v.D. ist Mitbegründer von Hematherix LLC, einem Biotechnologieunternehmen, das eine superFVa-Therapie für Blutungskomplikationen entwickelt. B.C.J., M.L.C. und R.M. haben keine Offenlegungen zu machen.

Danksagungen

Wir danken Laurent Mosnier, PhD, für technische Beratung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
25-G-NadelBD Diagnostics305124
30-G-NadelBD Diagnostics305106
AnästhesiesystemPatterson Scientific78915712
aPTT-Reagenz – STA-C.K. Prest. 5Stago597
AutoclipFine Science Tools12022-19
Autoclip-ApplikatorFine Science Tools12020-09
Autoclip-EntfernerFine Science Tools12023-00
RinderserumalbuminSigma Aldrich10735078001
CalciumchloridFisher ScientificC79-500
Kapillarrohr – einfachFisher Scientific22-260943
WattestäbchenMedique19-090-701
WattebällchenFisher Scientific22-456-103
D-Dimer-ELISA-KitInvitrogenEEL094
Delta-Phase-Isothermische UnterlageBraintree Scientific50-195-4663
ÄthanolFisher ScientificBP28184
EthiqaFidelisSKU 072117
Faktor-II-defizientes PlasmaAffinity BiologicalsFII-DP
Faktor-V-defizientes PlasmaAffinity BiologicalsFV-DP
Faktor-VIII-defizientes PlasmaAffinity BiologicalsFVIII-DP
Faktor-X-defizientes PlasmaAffinity BiologicalsFX-DP
Filterpapier, extra dick, 7 cm × 8,4 cmFisher ScientificPI88605
Graefe-ForcepsFine Science Tools11049-10
InduktionskammerPatterson Scientific78933385
Injektionsfähiges KochsalzHospira0409-4888-02
InnovinSiemens Healthineers23-044-778
IsofluranMed Vet International50-304-2993
K824086 Chromogenix Coatest SP Faktor VIIIDiapharma K822585
Liqui-Vet-Schnellgewebe-KleberWorld Precision Instrument50-253-9340
Mikroperlen-SterilisatorFisher Scientific14-955-342
Mikrozentrifugenröhrchen – 1,5 mLFisher ScientificAM12400
Multiplex-Kit für MauszytokineQuansys Biosciences 111049MS-13P
PAP-Komplex-Assay-KitBiotechneNBP3-06903
Povidon-JodMed Vet International50-283-2277
rekombinanter humaner aktivierter Faktor VIINovo Nordisk0169-7001
NatriumcitratFisher ScientificS279-500
Chirurgisches TuchStoelting10-000-695
Chirurgische Plattform Equaflow Maus 5 AnästhesieverteilerPatterson Scientific78919268
Chirurgische SchereFine Science Tools91405-11
KlebebandFisher Scientific15-901-5R
TAT-Komplex-Assay-KitSiemens Healthineers23-044-704
ThrombinInvitrogenPIRP43100
TranexamsäureAuromedics55150-0188-10
TrimmerStoelting10-000-792
WAG-Aktivkohle-FiltersystemPatterson Scientific78909457
WiegeschaleFisher Scientific01-549-752

Referenzen

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Trauma-induzierte KoagulopathieHämorrhagie-QuantifizierungEntzündungsmarkerÜberlebensanalyseMessung des BlutverlustsKoagulationsfaktorenFibrinolyse-AktivierungEntzündungsaktivierungpharmakologische Modulation

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