Methodenartikel

Ein optimiertes Protokoll für das durch Führungsdrähte induzierte Modell der Aortenklappenstenose bei Mäusen

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DOI:

10.3791/72218

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21. August 2026

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1Laboratory of Cardiac Structure and Function, Institute of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, 3Cardiac Structure and Function Research Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein optimiertes Modell der drahtführergestützten Aortenklappenstenose bei C57BL/6-Mäusen. Eine benutzerdefinierte, dreidimensional gedruckte vaskuläre Stützplattform ermöglicht eine präzise Kontrolle von Blutungen und führt zu einer Überlebensrate von 95 % nach 24 Stunden (19/20) sowie zu einer Modellerfolgsrate von 90 % nach vier Wochen (18/20).

Zusammenfassung

Die Aortenklappenstenose (AKS) ist eine bedeutende kardiovaskuläre Erkrankung mit zunehmender Prävalenz in alternden Populationen. Aufgrund des Mangels an erkranktem Klappengewebe sind jedoch mechanistische Studien und die Entwicklung von Therapien stark eingeschränkt. Dieses Protokoll beschreibt die Einrichtung und Optimierung eines reproduzierbaren Mausmodells der AKS, das auf der Methode der durch einen Guidewire verursachten Klappenverletzung nach Honda basiert und durch ein kontrolliertes Blutungsmanagement weiter verbessert wurde. Männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse werden einer durch einen Guidewire verursachten Aortenklappenverletzung unterzogen; das Verfahren wird durch eine eigens entwickelte, 3D-gedruckte vaskuläre Stützplattform verfeinert, die eine präzise Kontrolle der Blutung während des Ein- und Ausziehens des Guidewires ermöglicht. Die Auswertungskriterien umfassen die Überlebensrate nach 24 Stunden, die echokardiographische Beurteilung nach 4 Wochen sowie die histopathologische Validierung. Das optimierte Protokoll erreicht eine 24-Stunden-Überlebensrate von 95 % (19 von 20 Tieren); unter den Überlebenden erfüllten 94,7 % (18 von 19) nach 4 Wochen das vorab definierte hämodynamische Erfolgskriterium, was einer Gesamterfolgsrate des Modells von 90 % (18 von 20 Tieren) entspricht, bestätigt durch Echokardiographie und histologische Analyse. Dieses standardisierte Modell bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Plattform, um Mechanismen der Klappendegeneration zu untersuchen und potenzielle therapeutische Ansätze zu evaluieren.

Einleitung

Herzklappenerkrankungen stellen sowohl in Industrie- als auch in Entwicklungsländern weiterhin eine erhebliche gesundheitliche Belastung dar, wobei die Prävalenz parallel zur Alterung der Bevölkerung zunimmt1. Obwohl die transkathetergestützte Aortenklappenimplantation (TAVI) die Behandlung der schweren Aortenstenose revolutioniert hat2,3, sind die zellulären und molekularen Mechanismen, die zur Klappenentartung führen, noch nicht vollständig verstanden, und es existiert keine zugelassene pharmakologische Therapie, um den Krankheitsverlauf zu verlangsamen oder rückgängig zu machen4,5. Ein zentrales Hindernis in der Forschung zu Klappenerkrankungen ist die begrenzte Verfügbarkeit erkrankten Gewebes für Untersuchungen6,7. Menschliche Aortenklappenproben sind nur in unzureichender Menge zugänglich, und tierische Modelle, die pathologische Veränderungen der Klappen zuverlässig nachbilden, waren bisher ebenfalls selten8. Diese Lücke hat nachhaltige Bemühungen zur Entwicklung tierischer Modelle vorangetrieben, die die hämodynamischen und histologischen Merkmale der Aortenklappenstenose (AVS) reproduzieren.

Konventionelle Ernährungsansätze, wie eine lang andauernde fettreiche Fütterung bei ApoE⁻/⁻-Mäusen, erfordern 20–24 Wochen und weisen geringe Erfolgsraten auf, wobei nur eine Minderheit der Tiere ein eindeutiges stenotisches Phänotyp9,10,11,12 entwickelt. Das von Honda et al. beschriebene Modell der drahtführergestützten Klappenverletzung behebt viele dieser Nachteile, indem die Klappensegel mechanisch über einen Zugang zur Arteria carotis verletzt werden13. Die ursprüngliche Technik umfasst die Dissektion der Arteria carotis, den retrograden Durchtritt des Drahtführers bis zur Aortenklappe, wiederholtes Kratzen der Segel sowie Drehung des Drahts – was innerhalb weniger Tage rasche hämodynamische Veränderungen hervorruft und nach 4 Wochen zu einem stabilen stenotischen Phänotyp führt13,14,15,16. Aufgrund ihrer vergleichsweise schnellen und direkten Durchführung wurde die Honda-Methode in der jüngeren Klappenforschung weit verbreitet übernommen. Dennoch bestehen mehrere wichtige Wissenslücken. Vollständige Angaben zum operativen Vorgehen wurden in der Literatur bisher nicht umfassend dokumentiert, eine Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren fehlt, und die Bedeutung der Blutstillung – ein wesentlicher Faktor für die perioperative Morbidität in diesem Modell – wurde bisher nie systematisch untersucht. Diese Inkonsistenzen beeinträchtigen die Reproduzierbarkeit und schränken die klinische Übertragbarkeit ein.

Es wurde vermutet, dass eine systematische Optimierung der Blutstillung die perioperative Überlebensrate und die Modellzuverlässigkeit signifikant verbessern könnte. Dieses Protokoll stellt einen verfeinerten und standardisierten Ansatz vor, der auf der Honda-Methode aufbaut und eine eigens entworfene, 3D-gedruckte vaskuläre Stützplattform einführt. Die Vorrichtung ermöglicht eine einstellbare longitudinale Spannung an der Arteria carotis und sorgt so für eine vollständige vorübergehende Hämostase während der Einführung und Entfernung des Führungsdrahts, ohne das Gefäß zu quetschen. Mit diesem Ansatz erreicht das optimierte Protokoll eine Überlebensrate von 95 % nach 24 Stunden (19 von 20 Tieren); unter den Überlebenden erfüllten 94,7 % (18 von 19) nach vier Wochen das vorab definierte hämodynamische Erfolgskriterium, was einer Gesamterfolgsrate des Modells von 90 % entspricht (18 von 20 Tieren). Eine Schritt-für-Schritt-Dokumentation des Verfahrens wird bereitgestellt, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren zu erleichtern.

Protokoll

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“ durchgeführt und von dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des West China Hospital genehmigt (Protokoll-Nr. 20240311055). Es wurden männliche C57BL/6-Mäuse (8–10 Wochen; etwa 22–25 g) und weibliche C57BL/6-Mäuse (8–10 Wochen; etwa 18–20 g) verwendet. Alle in diesem Protokoll verwendeten Materialien, Reagenzien, Geräte, Software und speziell angefertigten Vorrichtungen, einschließlich der individuell angefertigten 3D-gedruckten vaskulären Stützplattform, sind in der Tabelle der Materialien aufgelistet.

1. Präoperative Vorbereitung und chirurgischer Schnitt

  1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran (3 % zur Induktion, 1,5–2 % zur Aufrechterhaltung), das in 100 % Sauerstoff verdampft wird. Überprüfen Sie die ausreichende Narkosetiefe durch das Fehlen von Flexionsreflexen der Pfote (Zehenquetschung).
    ACHTUNG: Isofluran ist ein flüchtiges Anästhetikum. Verwenden Sie es mit aktiver Absaugung oder in gut belüfteten Bereichen, tragen Sie geeignete PSA und befolgen Sie die Sicherheitsvorschriften Ihrer Institution.
  2. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine temperaturgeregelte Operationsplattform, die auf 37 °C gehalten wird.
  3. Bereiten Sie das Operationsfeld vor, indem Sie die vordere Halsregion mit einer chemischen Haarentfernungscreme enthaaren.
  4. Desinfizieren Sie die Haut mit drei abwechselnden Zyklen aus Povidon-Iod (oder Chlorhexidin) und 70 %igem Alkohol (oder warmer steriler Kochsalzlösung), wobei Sie mit dem Antiseptikum abschließen.
  5. Infiltrieren Sie 0,5 %iges Lidocain entlang der geplanten Inzisionslinie subkutan zur präemptiven lokalen Analgesie.
  6. Führen Sie anschließend mit Mikroscheren einen longitudinalen medianen Hautschnitt (ca. 1,0–1,5 cm) am vorderen Hals durch, leicht rechts der Trachealmedianlinie.
    ACHTUNG: Mikroscheren, Nadeln, Führungsdrähte und andere spitze Gegenstände können Verletzungen verursachen. Handhaben Sie sie sorgfältig und entsorgen Sie benutzte spitze Gegenstände in zugelassenen Spitzenbehältern.

2. Isolation der Gefäße und Nahtplatzierung

  1. Unter einem chirurgischen Stereomikroskop die rechte Arteria carotis communis (RCCA) durch stumpfe Dissektion durch die überliegenden Faszienschichten und Muskelschichten freilegen. Die RCCA vorsichtig vom benachbarten Nervus vagus und dem umgebenden Bindegewebe lösen, wobei mechanische Reizungen des Nervus vagus vermieden werden müssen.
    ANMERKUNG: Die Speicheldrüsen und freigelegten Gewebe während des gesamten Eingriffs mit warmer steriler Kochsalzlösung feucht halten, um Austrocknung zu verhindern.
  2. Das distale Ende der RCCA mit einer 6-0-Seidennaht dauerhaft ligieren, wobei ein sicherer, rutschfester Knoten angelegt wird.
  3. Einen lose sitzenden Schlingeknoten aus 6-0-Seidennaht um das proximale Segment der RCCA legen und offen lassen, um ihn später während der Einführung des Führungsdrahts zu verwenden.

3. Applikation der Plattform und Arteriotomie

HINWEIS: Sterilisieren Sie die 3D-gedruckte Plattform vor der Operation mit Ethylenoxid (EtO)-Gas, gefolgt von einer ausreichenden Belüftung, und sterilisieren Sie alle metallenen chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren.

ACHTUNG: Ethylenoxid ist toxisch, entzündlich und krebserregend. Die Sterilisation mit EtO nur in zugelassenen Einrichtungen durchführen, ausreichende Belüftung gewährleisten und die institutionellen Vorschriften zur Entsorgung von Abfällen befolgen.

  1. Führen Sie die 3D-gedruckte vaskuläre Stützplattform vorsichtig unter das isolierte Segment der RCCA ein und positionieren Sie die umgekehrt V-förmige Spitze direkt unterhalb des Gefäßes.
  2. Stellen Sie die Plattform langsam ein, um die longitudinale Spannung an der RCCA zu erhöhen, indem Sie die vorher platzierten Nähte in immer höher liegende Seitenkerben einhaken.
    HINWEIS: Die umgekehrt V-förmige Spitze ist mit einem Winkel von 120° ausgelegt, um sich der Krümmung des Gefäßes anzupassen, ohne die Gefäßwand zu quetschen. Beenden Sie das Erhöhen der Spannung genau an dem Punkt, an dem die arterielle Pulsation visuell nicht mehr wahrnehmbar ist. Dieser entscheidende visuelle Endpunkt gewährleistet eine vorübergehende Hämostase, ohne das Gefäß übermäßig zu schädigen.
  3. Erstellen Sie mit einer Mikroschere eine kleine transversale Arteriotomie (etwa die Hälfte des Gefäßumfangs) an dem stabilisierten RCCA-Segment. Bei korrekt eingestellter Spannung sollte dabei kein oder nur minimales Bluten auftreten.

4. Einführung des Führungsdrahts und Verletzung der Herzklappe

  1. Unter mikroskopischer Sicht führen Sie den Führungsdraht (0,014 Zoll / 0,36 mm Durchmesser) in retrograder Richtung zum Aortenwurzelbereich über die transversale Arteriotomie in das arterielle Lumen ein.
    ANMERKUNG: Dieser Kaliber entspricht den in der Literatur beschriebenen Führungsdraht-Verletzungsmodellen und liegt nahe am Lumendurchmesser der murinen RCCA (~0,4–0,5 mm), was ein Verhältnis von Führungsdraht zu Gefäßdurchmesser von etwa 0,7–0,9 ergibt.
    ACHTUNG: Der Führungsdraht kann Gefäße oder umliegende Gewebe durchstoßen. Führen Sie ihn langsam unter Sichtkontrolle ein und entsorgen Sie verwendete Führungsdrahts als scharfe oder kontaminierte chirurgische Abfälle.
  2. Ziehen Sie den zuvor platzierten proximalen Slipknoten fest um Gefäß und Führungsdraht, um am Einführort vollständige Hämostase zu erreichen. Sobald der Slipknoten gesichert ist, entfernen Sie die 3D-gedruckte Plattform vorsichtig von unterhalb des Gefäßes.
    ANMERKUNG: Falls unerwartete Blutung während der Einführung auftritt oder der Führungsdrahtdurchmesser zu starkem Reibungswiderstand führt, positionieren Sie die Plattform vorübergehend neu, um die Hämostase zu unterstützen, oder verringern Sie die Spannung der Plattform leicht, um eine Erweiterung des Gefäßlumens zu ermöglichen, bevor Sie erneut versuchen, einzuführen.
  3. Führen Sie den Führungsdraht vorsichtig in retrograder Richtung durch die RCCA, vorbei am Aortenbogen und in Richtung Aortenklappe. Bestätigen Sie unter Echokardiographie in Echtzeit, dass die Spitze des Führungsdrahts die Aortenklappe passiert und in den linken Ventrikel eingedrungen ist.
  4. Während der proximale Slipknoten vollständig festgezogen bleibt, um die Hämostase aufrechtzuerhalten, führen Sie die mechanische Klappenverletzung durch Ausführung von 100 Vor-Zurück-Bewegungen (Push-Pull) über die Aortenklappe, gefolgt von 100 Rotationsbewegungen des Führungsdrahts gegen die Klappensegel, durch.
    ANMERKUNG: Die Anzahl von 100 Push-Pull- und 100 Rotationsbewegungen wurde durch umfangreiche interne Optimierung ermittelt und stellt das beste Verhältnis aus Verfahrensdauer und zuverlässiger Induktion einer hämodynamisch signifikanten Stenose dar.

5. Abzug des Führungsdrahts und Wundverschluss

  1. Nach Beendigung der Ventilverletzung den Führungsdraht langsam aus dem Gefäß zurückziehen.
  2. Den proximalen Schiebeknoten unmittelbar in einen dauerhaften Festknoten umwandeln, um die proximale RCCA abzubinden und jegliche postprozedurale Blutung zu verhindern.
  3. Die Hautinzision mit Einzelknopfnähten aus 5-0-Nylon oder chirurgischen Wundclips verschließen.
  4. Keine postoperativen nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAR) verabreichen. Keine perioperativen Antibiotika verabreichen, da der Eingriff unter aseptischen Bedingungen durchgeführt wird.
  5. Das Tier in einen sauberen, beheizten Erholungskäfig verbringen und kontinuierlich überwachen, bis die vollständige Bewegungsfähigkeit wiederhergestellt ist.

6. Echokardiographische Beurteilung der transvalvulären Hämodynamik

  1. Führen Sie echokardiographische Untersuchungen an allen überlebenden Mäusen vier Wochen nach der Operation durch, um den Schweregrad der Aortenklappenstenose zu bewerten.
  2. Induzieren Sie die Anästhesie, indem Sie das Tier in eine Induktionskammer mit 3 % Isofluran in 100 % Sauerstoff stellen. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Bestätigung des Fehlens des Zehe-zieh-Reflexes. Entfernen Sie die Behaarung der vorderen Brustwand mithilfe einer chemischen Haarentfernungscreme. Tragen Sie einen Augensalben auf beide Augen auf, um eine Hornhauttrockenheit zu verhindern.
  3. Bringen Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage auf eine temperaturregulierte Bildgebungsplattform.
  4. Befestigen Sie die Pfoten an Oberflächen-Elektrokardiogramm-(EKG-)Elektroden zur kontinuierlichen Überwachung der Herzfrequenz. Titrieren Sie die Isoflurankonzentration (typischerweise 1,0–1,5 %), um eine stabile physiologische Herzfrequenz von 450–550 Schlägen pro Minute aufrechtzuerhalten.
  5. Reinigen Sie die vordere Brustwand und tragen Sie eine reichliche Schicht vorgewärmten akustischen Koppelgels auf.
  6. B-Modus-Bildaufnahme
    1. Verwenden Sie ein Vevo-3100-Ultraschallsystem mit einem MX550D-Wandler (40 MHz) und drücken Sie die B-Modus-Taste, um die Live-Zweidimensional-Bildgebung zu starten.
    2. Platzieren Sie den Wandler in linker parasternaler Position, um eine parasternale Langachsenansicht des linken Ventrikels, der Aortenklappe und der aufsteigenden Aorta zu erhalten. Optimieren Sie Tiefe, Breite und 2D-Verstärkung.
  7. M-Modus-Aufnahme und Messung des linken Ventrikels
    1. Gehen Sie von der parasternalen Langachsenansicht aus und drücken Sie die M-Modus-Taste. Positionieren Sie die Abtastlinie quer durch den linken Ventrikel auf Höhe der Papillarmuskeln.
    2. Drücken Sie auf Start, um die Aufnahme zu beginnen. Sobald eine stabile Spur über mindestens drei Herzzyklen erfasst ist, drücken Sie auf Speichern.
    3. Verwenden Sie in Vevo LAB das LV-Tracing-Tool, um das Ende der Diastole und Systole entlang des Endokards nachzuzeichnen, und erfassen Sie die inneren Dimensionen des linken Ventrikels, die Dicken der vorderen und hinteren Wand (LVAWd, LVPWd) sowie die Masse des linken Ventrikels.
  8. Verändern Sie die Position und den Winkel des Wandlers, um eine spezifische Aortenbogenansicht zu erhalten.
    ​HINWEIS: Die Erstellung dieser spezifischen Aortenbogenansicht ist entscheidend für genaue transvalvuläre Geschwindigkeitsmessungen, da sie eine optimale Ausrichtung des Ultraschallstrahls mit der Strömungsrichtung des Blutes durch die Aortenklappe gewährleistet.
  9. Farb-Doppler-Beurteilung
    1. Gehen Sie von der Aortenbogenansicht aus und drücken Sie die Farb-Taste. Positionieren Sie das Farb-Feld über der Aortenklappe und dem proximalen Abschnitt der aufsteigenden Aorta.
    2. Passen Sie die Farbskala und die Verstärkung so an, dass der systolische Jet deutlich sichtbar ist, ohne Aliasing-Effekte. Drücken Sie Start, dann Speichern.
  10. Pulsierende Wellen-Doppler-Geschwindigkeitsmessung
    1. Drücken Sie die PW-Doppler-Taste. Positionieren Sie das Messvolumen am engsten Punkt des Jets (Vena contracta) und aktivieren Sie die Winkelkorrektur (<60°).
    2. Drücken Sie Start, um die Spektralaufzeichnung zu beginnen; sobald mindestens drei Herzzyklen erfasst sind, drücken Sie Speichern. Messen Sie in Vevo LAB die maximale transvalvuläre Geschwindigkeit mit dem Peak-Velocity-Tool, wobei mindestens drei Zyklen gemittelt werden.

7. Histologische Aufarbeitung und Färbung der Aortenwurzel

  1. Nach der echokardiographischen Untersuchung die tiefe Narkose durch Überprüfung des vollständigen Fehlens des Zehe-Reflexes bestätigen. Durchführen der zervikalen Dislokation als sekundäre Tötungsmethode gemäß den AVMA-Leitlinien für die Tötung von Tieren (Ausgabe 2020) und institutionell genehmigten Protokollen.
    ACHTUNG: Tierische Kadaver, entfernte Gewebe und blutkontaminierte Materialien stellen biologische/animalische Abfälle dar. Diese sind gemäß den Vorschriften der Institution für Biosicherheit und Tierhaltung zu entsorgen.
  2. Mittels chirurgischer Mikroschere eine Thorakotomie durchführen, um das Herz freizulegen.
  3. Eine Perfusionsnadel in die Herzspitze des linken Ventrikels einführen und die systemische Durchblutung mit kalter steriler, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) spülen. Ein erfolgreicher Perfusionsvorgang zeigt sich durch die Aufhellung der Leber und Lunge.
  4. Das intakte Herz entnehmen und zur vollständigen Fixierung mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd (PFA) eintauchen.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist toxisch und reizend. 4 % PFA stets in einer chemischen Abzugshaube unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PPE) handhaben und PFA-Abfälle als gefährliche chemische Abfälle entsorgen.
  5. Das fixierte Gewebe in einen automatisierten Gewebeprozessor überführen, um eine schrittweise Dehydrierung über eine gestufte Ethanolreihe durchzuführen, gefolgt von einer Klärung mit Xylol und einer Infiltration mit Paraffinwachs bei 65 °C.
    ACHTUNG: Xylol ist entflammbar und toxisch, heißes Paraffin kann Verbrennungen verursachen. Xylol stets in einer Abzugshaube oder einem zugelassenen Prozessgerät handhaben und xylolhaltige Abfälle als gefährliche chemische Abfälle entsorgen.
  6. Die aufgearbeiteten Herzen in Paraffinblöcken einbetten.
    HINWEIS: Die korrekte Orientierung des Herzens beim Einbetten ist entscheidend. Das Herz so positionieren, dass Querschnitte durch die Aortenwurzel auf Höhe der drei Taschenklappenblättchen ermöglicht werden.
  7. Mittels eines Rotationsmikrotoms serielle Querschnitte von 4–5 µm Dicke durch die Ebene der Aortenklappe schneiden, wobei sichergestellt werden muss, dass alle drei Klappenblättchen erfasst werden. Die Schnitte auf Objektträger aufbringen und bei Raumtemperatur lagern.
  8. An ausgewählten Präparaten eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) durchführen, um die Gewebemorphologie, strukturelle Umbauprozesse und die Dicke der Klappenblättchen zu beurteilen.
  9. An benachbarten seriellen Schnitten eine Von-Kossa-Färbung durchführen, um dystrophische Verkalkungen nachzuweisen und zu quantifizieren, die sich als dunkelbraune bis schwarze Mineralablagerungen innerhalb der Klappenblättchen darstellen.

8. Schein-Operation

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt das Sham-Kontrollverfahren. Sham-Mäuse erhalten dieselbe Anästhesie, Hautvorbereitung, Gefäßexposition, Arteriotomie und retrograde Führungsdrahtinjektion wie die Gruppe mit aortaler Drahtverletzung (AWI); der Führungsdraht wird bis zur supravalvulären Ebene vorgeschoben, jedoch nicht über die Aortenklappe hinausgeführt, und es wird keine mechanische Klappenverletzung durchgeführt.

  1. Betäuben Sie die Maus und bereiten Sie das Operationsfeld wie in den Schritten 1.1. bis 1.5. beschrieben vor.
  2. Legen Sie unter stereomikroskopischer Sicht die RCCA durch stumpfe Dissektion frei, wie in Schritt 2.1. beschrieben.
  3. Ligieren Sie das distale Ende der RCCA dauerhaft mit einer 6-0-Seidennaht und legen Sie einen lockeren proximalen Schlingeknoten an (wie in den Schritten 2.2–2.3).
  4. Führen Sie die transversale Arteriotomie durch und bringen Sie den Führungsdraht ein, wie in den Schritten 3.1–4.2 beschrieben.
  5. Schieben Sie den Führungsdraht unter echokardiographischer Kontrolle retrograd bis zur supravalvulären Ebene der aufsteigenden Aorta vor, wobei sichergestellt werden muss, dass die Spitze des Führungsdrahts NICHT das Aortenklappenventil durchquert.
    HINWEIS: Führen Sie NICHT die in Schritt 4.4. beschriebenen Push-Pull- oder rotatorischen Klapppenetrierungsbewegungen durch. Ziehen Sie den Führungsdraht zurück und ligieren Sie sofort die proximale RCCA, wie in den Schritten 5.1–5.2 beschrieben.
  6. Schließen Sie den Hautschnitt mit Einzelknopfnähten aus 5-0-Nylon oder Wundclips.
    HINWEIS: Wie bei der AWI-Gruppe wird intraoperativ Analgesie durch lokale Infiltration mit Lidocain bereitgestellt (Schritt 1.5). Überführen Sie das Tier in einen beheizten Erholungskäfig und überwachen Sie es, bis es vollständig mobil ist.
  7. Unterziehen Sie die Sham-Mäuse derselben postoperativen Überwachung, der echokardiographischen Untersuchung nach 4 Wochen sowie der histologischen Aufarbeitung wie die AWI-Gruppe.

9. Statistische Analyse und Studiendesign

  1. Im Verlauf der Studie wurden 20 Mäuse (10 männliche, 10 weibliche) der AWI-Prozedur unterzogen und 6 C57BL/6-Mäuse (3 männliche, 3 weibliche) der Sham-Prozedur.
  2. Messen Sie die maximale transvalvuläre Geschwindigkeit (das Kriterium für den Modellerfolg) bei allen überlebenden Tieren (19 AWI, 6 Sham).
  3. Analysieren Sie detaillierte echokardiographische und histologische Parameter in einer vorab festgelegten, geschlechtsbalancierten Untergruppe von 6 AWI-Mäusen (3 männliche, 3 weibliche).
  4. Stellen Sie sicher, dass alle echokardiographischen und histologischen Messungen durch Untersucher durchgeführt werden, die bezüglich der Gruppenzuordnung verblindet sind.
  5. Prüfen Sie die Daten vor der Anwendung parametrischer Tests auf Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilk-Test. Vergleichen Sie zwei unabhängige Gruppen (AWI vs. Sham) mittels eines ungepaarten zweiseitigen Student-t-Tests.
  6. Analysieren und stellen Sie Überlebensdaten mit der Kaplan-Meier-Methode dar.
  7. Führen Sie alle Analysen in GraphPad Prism durch. Geben Sie die Daten als Mittelwert ± SEM an, wobei ein p < 0,05 als statistisch signifikant gilt.

Ergebnisse

Entwicklung einer 3D-gedruckten Plattform zur Blutstillung

Um die perioperative Blutung – die Hauptursache für Morbidität und Mortalität im herkömmlichen, drahtgeführt induzierten AVS-Modell – zu bekämpfen, wurde eine 3D-gedruckte vaskuläre Stützplattform konstruiert (Abbildung 1). Die Plattform wurde mittels Stereolithographie (SLA) aus einem biokompatiblen (USP-Klasse VI / ISO 10993-konformen) Photopolymerharz gefertigt und weist eine strukturelle Dicke von 1,07 mm auf. Nach dem Druck wurden die Bauteile mit Isopropylalkohol gewaschen, um nicht ausgehärtetes Harz zu entfernen, und anschließend unter ultraviolettem Licht nachgehärtet. Die vollständige Konstruktionsdatei (.stp) wird bereitgestellt, sodass die Plattform auf gängigen SLA-Systemen reproduziert werden kann. Die Plattform weist eine nach unten gerichtete, V-förmige apikale Oberfläche mit einem Scheitelwinkel von 120° (Abbildung 1A–B), das der Krümmung der isolierten rechten Arteria carotis communis entspricht, ohne eine übermäßige Wandkompression auszulösen. Mehrere stufenförmige seitliche Ausstülpungen (Abbildung 1C–D) ermöglicht es dem Operateur, die vorab platzierten Nähte zu verknoten und eine einstellbare longitudinale Spannung auf den Gefäßabschnitt auszuüben. Die Spannung wird schrittweise erhöht, bis die arterielle Pulsation nicht mehr sichtbar ist – ein visueller Endpunkt, der auf eine ausreichende vorübergehende Hämostase hinweist. Diese Vorgehensweise schafft ein stabiles chirurgisches Feld für die Arteriotomie und die Einführung des Führungsdrahts, wobei gleichzeitig übermäßige Quetschverletzungen der Gefäßwand vermieden werden.

Intraoperative Bestätigung der Führungsdrahtpositionierung

Die korrekte Platzierung des Führungsdrahts wurde während des Eingriffs in zwei Stadien überprüft. Zunächst wurde unter direkter stereomikroskopischer Sichtung beobachtet, wie der Führungsdraht durch die transversale Arteriotomie in retrograder Richtung in das Lumen der RCCA eindrang (Abbildung 2A). Zweitens bestätigte die echokardiographische Echtzeitbildgebung, dass die Führungsdrahtspitze die Aortenklappe passiert und den linken Ventrikel erreicht hatte. Die B-Bild-Modus-Bildgebung identifizierte den Führungsdraht als hyperechogenen linearen Artefakt, der die Ebene der Aortenklappe durchquert. (Abbildung 2B). Die Farbdopplersonographie zeigte eine lokal begrenzte turbulente Strömung auf Höhe der Aortenklappe, was eine zusätzliche Bestätigung der Führungsdrahtpositionierung über die Klappensegel hinweg lieferte (Abbildung 2C; Ergänzendes Video 1).

Perioperative Überlebensrate und Modellerfolgsrate

Die Integration der spannungsverstellbaren Plattform in den chirurgischen Arbeitsablauf führte zu einer hohen Überlebensrate in der frühen Phase. Die Kaplan-Meier-Analyse zeigte eine Überlebensrate von 95 % 24 Stunden nach der Operation (19 von 20 Mäusen; Abbildung 3A). Die Obduktion des einzigen nicht überlebenden Tieres ergab keine Hinweise auf eine schwere Blutung, strukturelle Schäden oder eine myokardiale Ischämie, was darauf hindeutet, dass der Tod auf anästhesiebedingte Komplikationen und nicht auf chirurgisches Trauma zurückzuführen war. Der Modellerfolg nach 4 Wochen wurde anhand eines vorab festgelegten Kriteriums bewertet: eine maximale transvalvikuläre Flussgeschwindigkeit von mehr als 2.000 mm/s, ergänzt durch unterstützende histologische Befunde. Von den 19 überlebenden Tieren erfüllten 18 (94,7 %) diese Bedingung, was einer Gesamterfolgsrate des Modells von 90 % in der gesamten Kohorte entspricht (18 von 20 Mäusen; Abbildung 3B). Die Ergebnisse waren zwischen den Geschlechtern vergleichbar: Die Überlebensrate nach 24 Stunden betrug bei Männchen 9 von 10 und bei Weibchen 10 von 10; die Erfolgsrate des Modells nach 4 Wochen lag bei beiden Geschlechtern bei 9 von 10 (90 %); der einzige perioperative Todesfall betraf ein Männchen (anästhesiebedingt) und der einzige Modellversuch, der fehlschlug, betraf ein überlebendes Weibchen.

Echokardiographische Bestätigung einer Aortenstenose

Die transthorakale Echokardiographie vier Wochen nach der Operation bestätigte hämodynamische Veränderungen, die bei der AWI-Gruppe mit einer schweren Aortenstenose übereinstimmen. Die quantitativen echokardiographischen Werte werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben; die Parameter der linksventrikulären Funktion und Remodelung wurden bei 6 Sham- und 6 AWI-Mäusen analysiert, während die maximale transvalvuläre Geschwindigkeit bei allen überlebenden AWI-Mäusen und Sham-Kontrollen gemessen wurde (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Die linksventrikuläre Ejektionsfraktion war in der AWI-Gruppe vier Wochen nach der Operation leicht niedriger als bei den Sham-Kontrollen (56,21 ± 1,15 % vs. 61,57 ± 2,12 %; p = 0,0503; Abbildung 3C), ein Unterschied, der keine statistische Signifikanz erreichte. Pulsierende Doppler-Aufzeichnungen zeigten bei der AWI-Gruppe einen deutlichen Anstieg der transvalvulären Jetgeschwindigkeit, die 2740,89 ± 104,10 mm/s erreichte, verglichen mit 988,00 ± 126,24 mm/s in der Sham-Kontrollgruppe (Abbildung 3D). Die quantitative Analyse bestätigte eine hochsignifikante Erhöhung der maximalen transvalvulären Jetgeschwindigkeit in der AWI-Gruppe im Vergleich zu den Sham-Kontrollen (p < 0,0001; Abbildung 3E). Im Einklang mit einer frühen Phase der Anpassung an eine Drucküberlastung zeigte die AWI-Gruppe ein konzentrisches linksventrikuläres Remodeling: die diastolische Dicke der vorderen Wand war signifikant erhöht (LVAWd 1,14 ± 0,02 vs. 0,96 ± 0,03 mm; p = 0,0016; Abbildung 3F), während die diastolische Dicke der hinteren Wand und die linksventrikuläre Masse erhöht waren, jedoch keine statistische Signifikanz erreichten (LVPWd 1,01 ± 0,12 vs. 0,76 ± 0,02 mm, p = 0,0650, Abbildung 3G; LV-Masse 124,51 ± 10,63 vs. 104,47 ± 2,45 mg, p = 0,0961, Abbildung 3H).

Histopathologische Validierung der Klappenumbildung und -verkalkung

Die histologische Untersuchung der Aortenwurzeln bestätigte die echokardiographischen Befunde. Die quantitativen histologischen Werte sind als Mittelwert ± SEM angegeben und wurden an 6 Sham- und 6 AWI-Mäusen analysiert. Die H&E-Färbung der AWI-Gruppe zeigte eine ausgeprägte Verdickung der Taschenklappenblättchen und eine strukturelle Desorganisation, Merkmale, die in den Sham-Kontrollen nicht vorhanden waren (Abbildung 3I). Die quantitative Morphometrie bestätigte eine signifikante Zunahme der mittleren Dicke der Klappenblättchen in der AWI-Gruppe im Vergleich zur Sham-Gruppe (p < 0,0001; Abbildung 3J). Die Von-Kossa-Färbung zeigte ausgedehnte dystrophische Verkalkungen innerhalb der verdickten Klappenblättchen der AWI-Gruppe, erkennbar als dunkelbraune bis schwarze Mineraleinlagerungen. Die Sham-Kontrollen wiesen vernachlässigbare Mineraleinlagerungen auf (Abbildung 3K). Die quantitative Bildanalyse ergab eine signifikante Zunahme der gesamten verkalkten Fläche (µm2) in der AWI-Gruppe im Vergleich zu den Sham-Kontrollen (p < 0,0001; Abbildung 3L).

Mechanische Bauteilzeichnungen; beschriftete Abschnitte A–D zur Veranschaulichung der Konstruktionsvorgaben.
Abbildung 1: Konstruktion der 3D-gedruckten vaskulären Stützplattform in vier Ansichten. (A) Schrägansicht von vorne links. (B) Schrägansicht von hinten rechts. (C) Seitenprofilansicht der gesamten Längsgeometrie der Plattform. (D) Schräge Ansicht mit Hervorhebung des umgekehrt V-förmigen Apexbereichs. Bauteilbezeichnungen: 110, Plattformkörper; 120, seitliche Arme; 121, stufenförmige Seitenkerben; 130, Arbeitsende; 140, umgekehrt V-förmige Einführungsapex; 150, Gefäßkontaktierende Stützfläche; 160, Übergangsneigung zwischen benachbarten Kerben; 190, rechte Arteria carotis communis (RCCA). Die Plattform wird aus biokompatiblem Photopolymerharz hergestellt (strukturelle Dicke: 1,07 mm). Die 3D-Strukturzeichnung wurde von den Autoren anhand der ursprünglichen CAD-Konstruktionsdatei (.stp) der vaskulären Stützplattform mithilfe von FreeCAD, einer kostenlosen und quelloffenen CAD-Visualisierungs- und Modellierungssoftware, erstellt. Es wurden keine Zeichnungen aus Drittpublikationen oder urheberrechtlich geschützte Abbildungen verwendet. Die ursprüngliche CAD-Konstruktionsdatei ist als ergänzende Datei verfügbar. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Chirurgische Anordnung mit Kathetereinlage; Ultraschallbilder des Blutflusses und der Gefäßdarstellung.
Abbildung 2: Intraoperative und echokardiographische Bestätigung der Führungsdrahtpositionierung. (A) Intraoperatives Foto, das die retrograde Einlage des Führungsdrahts (Pfeil) durch die transversale Arteriotomie in das Lumen der rechten Arteria carotis communis (RCCA) unter direkter stereomikroskopischer Sicht darstellt. (B) B-Modus-echokardiographisches Bild, das den Führungsdraht (als hyperechogenes lineares Artefakt identifiziert; Pfeil) zeigt, der die Aortenklappe durchquert und in den linken Ventrikel eintritt. (C) Farbdoppler-echokardiographisches Bild, das lokalisierten turbulenten Fluss auf Höhe der Aortenklappe zeigt und damit die Positionierung des Führungsdrahts durch die Klappensegel bestätigt. Die Echtzeit-Farbdoppler-Darstellung des transvalvulären Flusses während der Führungsdrahtpositionierung ist in ergänzendem Video 1 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Überlebensanalyse, Vergleichsdiagramm, transvalvuläre Jetgeschwindigkeit, Echokardiogramm, histologische Ergebnisse.
Abbildung 3: Überleben, hämodynamische Parameter, ventrikuläre Remodeling- und histopathologische Ergebnisse des optimierten aortalen Drahtverletzungsmodells (AWI). (A) Kaplan-Meier-Überlebenskurve für 24 Stunden bei AWI-Mäusen (n = 20). (B) Modellerfolg (rot) im Vergleich zum Versagen (schwarz) in der AWI-Gruppe nach 4 Wochen (n = 20); Erfolg wurde definiert als Spitzen-Transvalvulärgeschwindigkeit > 2.000 mm/s. (C) Ejektionsfraktion (EF; p = 0,0503). (D) Repräsentative Puls-Wellen-(PW-)Doppler-Echokardiogramme einer Scheinoperation (links) und einer AWI-Maus (rechts). (E) Spitzen-Transvalvulärgeschwindigkeit (n = 19 AWI, n = 6 Scheinoperation; p < 0,0001). (F) Diastolische Dicke der vorderen linken Ventrikelwand (LVAWd; p = 0,0016). (G) Diastolische Dicke der hinteren linken Ventrikelwand (LVPWd; p = 0,0650). (H) Masse des linken Ventrikels (p = 0,0961). (I) Repräsentative mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbte Aortenwurzelschnitte (Scheinoperation, links; AWI, rechts). (J) Dicke der Aortenklappenblättchen (p < 0,0001). (K) Repräsentative mit Von Kossa gefärbte Aortenwurzelschnitte (Scheinoperation, links; AWI, rechts). (L) Gesamtfläche der Kalziumablagerung (µm2; p < 0,0001). Maßstabsbalken = 500 µm. Bei allen quantitativen Balkendiagrammen stellen die Balken die Mittelwerte dar und die Fehlerbalken die Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Quantitative Vergleiche zwischen den Gruppen Scheinoperation und AWI in den Panels C, E–H, J und L wurden mit einem ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. Die quantitativen Daten stammen aus den Gruppen Scheinoperation und AWI (n = 6 pro Gruppe), mit Ausnahme der Spitzen-Transvalvulärgeschwindigkeit in Panel E, die bei allen überlebenden AWI-Mäusen und Scheinoperationskontrollen gemessen wurde (n = 19 AWI, n = 6 Scheinoperation). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Er ergänzendes Video 1: Farbdopplerechokardiographische Darstellung des transvalvulären Blutflusses während der Führungsdrahtpositionierung. Das Video zeigt in Echtzeit die Farbdoppler-Bildgebung auf Höhe der Aortenklappe während des AWI-Verfahrens und veranschaulicht den lokal begrenzten turbulenten Fluss, der durch die Positionierung des Führungsdrahts über die Klappensegel hinweg verursacht wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt detailliert ein stabiles und sicheres Tiermodell der Aortenstenose. Eine Besonderheit dieses Ansatzes ist eine Hilfsplattform, die die Einführung eines Führungsdrahts in die Arteria carotis communis erleichtert. Die Plattform wird mittels Stereolithographie (SLA) aus einem biokompatiblen Photopolymerharz gedruckt (strukturelle Dicke 1,07 mm) und weist eine umgekehrt V-förmige apikale Oberfläche mit einem Spitzenwinkel von 120° auf; die vollständige Konstruktionsdatei ist als ergänzende .stp-Datei frei verfügbar. Diese Vorrichtung gewährleistet einen sanften Eintritt des Führungsdrahts, kontrolliert objektiv den perioperativen Blutverlust und schützt dadurch sowohl das kurz- als auch das langfristige Überleben der Modellmäuse. Seit der ursprünglichen Beschreibung wurde das durch den Führungsdraht induzierte Modell weiter verfeinert und charakterisiert, einschließlich Varianten mit gestufter Schwere, bei denen die Verletzungsintensität titriert wird, um eine Stenose von leichter bis schwerer Ausprägung zu erzeugen17, sowie aktuelle Berichte, die perioperative Komplikationen dokumentieren18; das vorliegende Protokoll baut auf diesen Arbeiten auf, indem es systematisch das Problem der perioperativen Blutung adressiert.

Mehrere Schritte in diesem Protokoll sind entscheidend für eine erfolgreiche Modellinduktion und erfordern besondere Aufmerksamkeit. Erstens muss der Grad der longitudinalen Spannung, die über die 3D-gedruckte Plattform aufgebracht wird, präzise kalibriert werden: Die Spannung sollte nur so weit erhöht werden, bis die arterielle Pulsation visuell nicht mehr wahrnehmbar ist. Unzureichende Spannung führt zu anhaltender Blutung während der Arteriotomie, während übermäßige Spannung eine Endothelschädigung und einen Gefäßriss begünstigt. Zweitens muss der proximale Schiebeknoten vor dem Entfernen der Plattform sicher um Gefäß und Führungsdraht angezogen werden; eine vorzeitige Entfernung der Plattform bei unzureichend gesichertem Schiebeknoten ist die häufigste Ursache für Blutungen während des Eingriffs. Drittens ist die Bestätigung des Eintritts des Führungsdrahts in das linke Ventrikel unter echokardiographischer Kontrolle unerlässlich. Ohne diese Verifizierung kann der Operateur nicht sicherstellen, dass sich der Führungsdraht korrekt an der Aortenklappe positioniert hat, und eine unvollständige Verletzung führt zum Scheitern des Modells.

Mehrere häufige Komplikationen können vorhergesehen und behandelt werden. Tritt während der Einführung des Führungsdrahtes Blutung auf, sollte die Plattform unterhalb des Gefäßes neu positioniert werden, um vorübergehend die Hämostase wiederherzustellen, bevor fortgefahren wird. Bei Tieren mit kleineren Karotisgefäßen kann eine leichte Verringerung der Plattformspannung das Gefäßlumen erweitern, um den Führungsdraht aufzunehmen. Dieses Modell weist mehrere Limitationen auf, die bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden sollten. Die mechanische Drahtverletzung führt zu einer akuten mechanischen und entzündlichen Klappenverletzung, die sich von dem chronischen, lipidgetriebenen degenerativen Prozess unterscheidet, der die humane calcifizierende Aortenstenose charakterisiert17,19,20,21. Folglich könnten die histologischen Merkmale – obwohl sie eine Blättchenverdickung und dystrophische Verkalkung reproduzieren – möglicherweise nicht alle molekularen Ereignisse der menschlichen Erkrankung vollständig nachbilden. Das Protokoll wurde an männlichen und weiblichen C57BL/6-Mäusen im Alter von 8–10 Wochen entwickelt und validiert; die Anwendbarkeit auf andere Stämme oder ältere Tiere bedarf jedoch einer unabhängigen Validierung. Geschlechtsbezogene Unterschiede im Durchmesser der Arteria carotis und in der Herzanatomie können den chirurgischen Aufwand und die hämodynamischen Ergebnisse beeinflussen; Forscher werden ermutigt, das Geschlecht als biologische Variable in nachgeschalteten Analysen anzugeben22. Zudem ist die dauerhafte Ligatur der rechten Arteria carotis communis integraler Bestandteil des Verfahrens, obwohl der Circulus arteriosus Willisii bei Mäusen eine kollaterale zerebrale Perfusion ermöglicht und keine offensichtlichen neurologischen Defizite beobachtet wurden, können subtile kognitive oder zerebrovaskuläre Effekte nicht ausgeschlossen werden. Eine Ausgangs-Echokardiographie (vor dem Eingriff) wurde in dieser Studie nicht durchgeführt; die gleichzeitige Sham-Gruppe diente als Kontrolle für die normale Klappenfunktion, und eine Baseline-Aufnahme wird, wo möglich, empfohlen, um einen intra-individuellen Vergleich zu ermöglichen und seltene spontane Aortenklappenabweichungen bei C57BL/6-Mäusen (~0,3 % in unveränderten Stämmen) auszuschließen. Eine Aorteninsuffizienz wurde in dieser Studie nicht systematisch bewertet; die Häufigkeit einer verletzungsbedingten Aorteninsuffizienz und ihr Zusammenhang mit der Schwere der Stenose bedürfen einer gezielten Untersuchung und werden in zukünftigen Arbeiten adressiert.

Mögliche Nachteile der Plattform sollten ebenfalls berücksichtigt werden. Die Vorrichtung könnte benachbarte Strukturen mechanisch reizen, einschließlich des Vagusnervs, der entlang der Arteria carotis verläuft; dieses Risiko wird durch die abgerundeten, stumpfen Kanten der Plattform, deren dem Gefäßverlauf angepasste Spitze mit einem Öffnungswinkel von 120° und die kurze Applikationsdauer minimiert, und im Rahmen dieser Studie wurden keine Atemstörungen oder anderen offensichtlichen Komplikationen beobachtet, die auf das Gerät zurückzuführen wären. Im Vergleich zu etablierten alternativen Methoden bietet dieses optimierte Protokoll mehrere praktische Vorteile. Diätetische Modelle bei ApoE⁻/⁻-Mäusen erfordern eine 20–24-wöchige Fütterung mit fettreicher Nahrung und führen zu variablen stenotischen Phänotypen, wobei viele Tiere keine hämodynamisch signifikante Erkrankung entwickeln. Das vorliegende Protokoll erzeugt innerhalb von 4 Wochen einen konsistenten stenotischen Phänotyp mit einer Gesamterfolgsrate von 90 % (18 von 20 Tieren). Im Vergleich zur ursprünglichen Honda-Drahtführungsmethode liegt der wesentliche Fortschritt dieses Protokolls in der systematischen Kontrolle von perioperativen Blutungen mittels der 3D-gedruckten Plattform.

Blutungen während der Einführung des Führungsdrahts wurden als Komplikation der ursprünglichen Technik erkannt, jedoch bisher unzureichend behandelt. In der retrospektiven Erfahrung derselben Arbeitsgruppe mit dem konventionellen (vor der Plattform-Ära) Verfahren (mehr als 400 Fälle) trat eine schwere intraoperative Blutung in geschätzten ~40 % der Fälle auf, mit einer Mortalität nach der Blutung von ~60 % und einer Überlebensrate nach 24 Stunden von ~75 %, wobei die Blutung – hauptsächlich an der Karotiszugangsstelle – praktisch für alle perioperativen Todesfälle verantwortlich war. Dies steht im Einklang mit Qian et al., die Blutungen an der Karotispunktionsstelle als Hauptursache für perioperative Todesfälle in diesem Modell identifizierten. Durch die Kontrolle des Blutverlusts erhöhte die 3D-gedruckte Plattform die Überlebensrate nach 24 Stunden auf 95 %, wobei in der vorliegenden Kohorte kein blutungsbedingter Todesfall beobachtet wurde. Da Blutungen nun kein limitierendes Problem mehr darstellen, kann die Intensität der mechanischen Verletzung variiert werden, um einen gestuften Schweregrad der Stenose zu erzeugen. Diese Einstellbarkeit besitzt direkte translationale Relevanz: Für therapeutische Kandidaten mit moderaten Effektstärken mag eine schwerere Ausgangsverletzung erforderlich sein, um behandlungsbedingte Unterschiede sichtbar zu machen, die andernfalls in einem milderem Modell verborgen blieben.

Dieses Modell eignet sich gut für verschiedene nachgeschaltete Untersuchungskategorien. Da das stenotische Phänotyp innerhalb eines definierten und reproduzierbaren Zeitraums entsteht, kann es als Plattform für die präklinische Bewertung von pharmakologischen Therapiekandidaten dienen, die darauf abzielen, die Kalkbildung oder Fibrose der Herzklappe zu verlangsamen23. Das Modell ist außerdem mit genetischen Ansätzen kompatibel: Das Protokoll kann auf transgene oder Knockout-Mäuse im C57BL/6-Hintergrund angewendet werden, um den Beitrag spezifischer Signalwege zum Fortschreiten der Klappenerkrankung zu untersuchen. Zusätzlich bietet der vierwöchige Beobachtungszeitraum ein praktisches Zeitfenster für die serielle echokardiographische Überwachung der Krankheitsentwicklung oder des Behandlungsansprechens. Die Konstruktionsdateien der 3D-gedruckten Plattform können frei als ergänzende .stp-Datei geteilt werden, und die Standardisierung dieses Geräts zwischen verschiedenen Laboren wird voraussichtlich die Reproduzierbarkeit zwischen den Standorten weiter verbessern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Projekt der nationalen Wissenschafts- und Technologiemajorkonzepte zu nichtübertragbaren chronischen Krankheiten (2026ZD0554300); die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (U23A20395, 82170375, 82500455); die Natürliche Wissenschaftliche Stiftung der Provinz Sichuan (2026NSFSC0552); die Grundlagenforschungsfonds der zentralen Hochschulen; die Wissenschafts- und Technologieprojekte der autonomen Region Xizang, China (XZ202501ZY0120); sowie das „1.3·5“-Projekt des West China Hospital der Sichuan-Universität (ZYGD23021, 23HXFH009). Die Autoren danken Qipu Feng (Tierversuchszentrum, West China Hospital, Sichuan-Universität) für die Unterstützung bei der Ultraschalluntersuchung an Kleintieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3D-gedruckte vaskuläre StützplattformMaßanfertigungN/VIndividuell 3D-gedruckte vaskuläre Stützplattform; ergänzende CAD-Datei im .stp-Format bereitgestellt.
4 % ParaformaldehydServicebioG1101-3MLGewebefixierung
Nylon-Nahtmaterial 5-0Jinhuan MedicalF503Hautverschluss mittels Einzelknäuelnähten
Seiden-Nahtmaterial 6-0Jinhuan MedicalRC411Dauerhafte Ligatur der distalen RCCA und proximale Schlingennaht
akustisches Kopplungsgel (vorgewärmt)KepplerKL-250Echokardiographie
Biokompatibles photopolymeres HarzFormlabsRS-F2-BMCL-01SLA-Druckmaterial zur Herstellung der individuellen 3D-gedruckten vaskulären Stützplattform.
C57BL/6-Mäuse (8–10 Wochen; Männchen 22–25 g, Weibchen 18–20 g)GemPharmatechC57BL/6Beide Geschlechter werden verwendet; Haltung unter Standardbedingungen
Gasförmiges EthylenoxidInstitutionelle SterilisationseinrichtungN/VSterilisation der individuell 3D-gedruckten vaskulären Stützplattform.
FreeCADFreeCAD-Projektvereinigung1.1.1CAD-Visualisierung und Erzeugung der 3D-Konstruktionszeichnung aus der .stp-Datei.
GraphPad PrismGraphPad Software9.0Statistische Analyse und Diagrammerstellung
Führungsdraht, 0,014-Zoll-DurchmesserBoston ScientificH749393071900mechanische Aortenklappenverletzung
Hämatoxylin- und Eosin-Färbekit (H&E)BeyotimeC0105SBlättchenmorphologie und -dicke
IsofluranRWD Life ScienceR510-22-23 % Induktion; 1,5–2 % Erhaltung in 100 % O2
LidocainShijiazhuang Pharmaceutical GroupH14024045präemptive lokale Infiltration an der Schnittstelle (0,5 %, Schritt 1,5)
Mikrochirurgische SchereRWD Life ScienceF11022-11Hautschnitt, Arteriotomie, Thorakotomie
MX550D-Wandler (40 MHz)FUJIFILM VisualSonicsMX550DEchokardiographie
Haarentfernungscreme (Nair)Nair255 gZur Enthaarung der vorderen Halsregion und Brustwand
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)ServicebioG4202-100MLPerfusion
RotationsmikrotomLeica BiosystemsRM2125 RTSSerieller Schnitt bei 4–5 µm
Stereomikroskop (chirurgisch)OlympusSZX7Gefäßisolation und Mikrochirurgie
Ultraschallsystem Vevo 3100 mit hoher AuflösungFUJIFILM VisualSonicsVevo 3100Echokardiographie
Von-Kossa-FärbekitServicebioG1043-20MLNachweis dystropher Kalzifizierung
XylolNanjing Chemical Reagent Co., Ltd.C0430530209Gewebeklärung während der Paraffinierung.

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