Vierzig erwachsene männliche Spezifische Pathogen-freie (SPF) Sprague–Dawley (SD) Ratten, die 240–280 g wiegen, wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology gekauft [Lizenznummer: SCXK (Jing) 2021-0011]. Alle Ratten wurden im Labortierzentrum der Universität Peking für Chinesische Medizin unter kontrollierten Bedingungen untergebracht, mit einer Raumtemperatur von 23 °C ± 1 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 % ± 5 % und einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus, mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Ratten wurden für 5 Tage akklimatisiert, während der gleichzeitig das Laufbandtraining zur Akklimatisierung durchgeführt wurde. Die Tiere durchliefen einmal täglich eine Laufbandgewöhnung mit einer Geschwindigkeit von 10 m/min für 15 Minuten pro Sitzung ohne elektrische Stimulation, um den Handhabungsstress zu reduzieren.
Basierend auf unserer vorherigen Studie liegt die Erfolgsrate der PSS-Induktion mittels der Methode der mittleren Gehirnarterien-Okklusion (MCAO) bei etwa 60 %. Mit einer Zufallszahlentabelle wurden 9 Ratten im Voraus zufällig als Scheingruppe ausgewählt; Die übrigen 31 Ratten wurden für die Modellkonstruktion verwendet. Nach erfolgreicher Modellierung wurden diese Ratten zufällig in die Modellgruppe und die MSSA-Gruppe eingeteilt. Letztlich wurden in jede Gruppe neun Ratten aufgenommen. Dieses Experiment wurde gemäß den 3R-Prinzipien des Labortierschutzes durchgeführt und vom Tierethikkomitee der Pekinger Universität für Chinesische Medizin (BUCM 20250915-008) genehmigt.
Modellgründung
Das MCAO-Modell wurde bei Ratten mit einer modifizierten intraluminalen Filamenttechnik etabliert. Die Ratten wurden mit 3 % Isofluran zur Einleitung betäubt, und die Anästhesie wurde mit 1,5 % Isofluran in Sauerstoff abgegeben, bei einer konstanten Durchflussrate von 1 l/min während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Es wurde ein Mittellinien-Halsschnitt gemacht, gefolgt von einer stumpfen Dissektion, um die rechte arteriale Halsschlagader (CCA), die arterie der externen Halsschlagader (ECA) und die arterie der internen Halsschlagader (ICA) freizulegen. Eine Nylon-Monofilamentnaht (Durchmesser 0,36 ± 0,02 mm) wurde über das ECA in die ICA eingeführt und bewegte sich etwa 18–20 mm bis zum Ursprung der mittleren Großhirnarterie (MCA), um eine arterielle Verschlusserscheinung zu erreichen. Die Gefäße wurden ligiert und der Schnitt geschlossen. Anschließend wurden die Ratten auf ein Heizkissen gelegt, bis sie sich von der Narkose erholten. Die Ratten in der Schein-operierten Gruppe unterzogen sich identischer chirurgischer Exposition mit CCA, ICA und ECA ohne Einsetzen des intraluminalen Filaments.
Nach der Operation erhielten alle MCAO-Ratten eine standardisierte postoperative Versorgung. Die Tiere wurden in den ersten 12 Stunden auf einem 37°C-Heizkissen gehalten, um Unterkühlung zu verhindern. Chirurgische Schnitte wurden drei Tage lang täglich gereinigt, Ampicillin (100 mg/kg) wurde per intraperitonealer Injektion zur Infektionsprophylaxe verabreicht, und weiche Lebensmittel wurden bereitgestellt, um eine ausreichende Ernährung zu gewährleisten. Allgemeine Aktivität, Nahrungsaufnahme, Wundzustand und motorische Funktion der Gliedmaßen wurden täglich von den postoperativen Tagen 1 bis 10 überwacht.
Neurologische Defizite wurden von Forschern bewertet, die auf die Gruppenzuweisung blind waren, anhand des Zea Longa neurologischen Defizit-Scores, und der Muskeltonus wurde mit der Modifizierten Ashworth-Skala (MAS) bewertet. Die Untersuchungen wurden 1 Tag vor der Operation (Tag −1), am Tag vor MCAO (Tag 0) sowie an den postoperativen Tagen 1, 3, 5, 7 und 10 durchgeführt. Ratten mit Zea Longa- und MAS-Werten ≥1 am postoperativen Tag 3 galten als erfolgreiche PSS-Modelle.
MSSA-Behandlung
Die Interventionen begannen am postoperativen Tag 3. Die Akupunkturstimulationsstelle der Kopfhaut war die ipsilesionale MS-6-Linie (vordere parietotemporale schräge Linie). Gemäß dem National Standard for Standardized Manipulations of Scalp Acupuncture (GB/T 21709.2-2021) erstreckt sich die MS 6-Reihe von GV 21 (Qianding) bis GB 6 (Xuanli).
Einweg-sterile Akupunkturnadeln (0,25 × 13 mm) wurden unter der Galea aponeurotica bei GV 21 in einem etwa 15° schrägen Winkel zur Kopfhaut eingeführt und bewegten sich entlang der vorderen parietotemporalen Schrägen Linie bis zu einer Tiefe von etwa 10 mm in Richtung GB 6. Eine schnelle Drehung (200 Umdrehungen/min) wurde kontinuierlich 1 Minute lang angewendet. Nach 15 Minuten Nadelfesthalt wurde dieselbe Drehbewegung einmal wiederholt, was zu einer Gesamtzeit der Nadelbindung von 30 Minuten führte. Während der gesamten Nadelhaltzeit durchliefen die Ratten gleichzeitig ein Laufbandtraining mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 m/min.
Ratten in den von Schein betriebenen und Modellgruppen erhielten weder Akupunktur noch Laufbandübung. Um unspezifische Handhabungs- und Fesselbelastungen zu kontrollieren, wurden sie vorsichtig in nicht-kompressiven Strumpfhaltern für 30 Minuten pro Tag gehalten und festgehalten, entsprechend der gesamten täglichen Interventionsdauer der MSSA-Gruppe.
Verhaltensbewertungen
Zea Longa-Score für neurologische Defizite:
Neurologische Defizite bei Ratten wurden mit dem Zea Longa-Bewertungssystem16 bewertet. Folgende Kriterien wurden angewendet: Ein Wert von 0 zeigte keine neurologische Beeinträchtigung und normale uneingeschränkte Bewegung; Ein Wert von 1 deutet auf eine unvollständige Dehnung der vorderen oder Hintergliedmaße zur betroffenen Seite hin; ein Wert von 2 zeigte das Kreisen zur gegenseitlichen Seite während der Fortbewegung; Ein Wert von 3 zeigte einen Sturz auf die gegenseitliche Seite beim Gehen; und eine Punktzahl von 4 deutete auf Bewusstseinsverlust bei Ausbleiben spontaner Gehbewegung hin.
MAS für Muskeltonus:
Der Muskeltonus wurde mit MAS17 bewertet. Die Kriterien wurden wie folgt definiert: Grad 0, keine Zunahme des Muskeltonus; Grad 1, leichte Zunahme des Muskeltonus, mit einem vorübergehenden Fangen oder minimalem Widerstand am Ende der passiven Beugung und Dehnung; Grad 1+, deutlicher Anstieg des Muskeltonus, mit einem vorübergehenden Fangen im mittleren Bewegungsumfang und anhaltendem Widerstand in der zweiten Bewegungshälfte; Grad 2, ausgeprägter Anstieg des Muskeltonus, mit Widerstand über den Großteil des Bewegungsumfangs erkennbar, obwohl die Gliedmaße leicht beweglich blieb; Grad 3, erheblicher Anstieg des Muskeltonus, der passive Beugung und Dehnung erschwerte; und Grad 4, eingeschränkte passive Bewegung aufgrund der Gelenksteifigkeit. Die Klasse 1+ erhielt eine Punktzahl von 2 Punkten, was in dieser Studie10 eine maximale MAS-Punktzahl von 5 Punkten ergibt.
T2WI-Neuroimaging zur Quantifizierung des zerebralen Infarktvolumens
Alle T2WI-Scans wurden mit einem PharmaScan-MRT-Scanner aufgenommen, der mit der ParaVision 360-Software (Version 3.5) betrieben wurde. Eine T2-gewichtete Turbo-Schnellerfassung mit Relaxationsverstärkung (T2_TurboRARE, auch SELTENE/schnelle Spin-Echo [FSE])-Pulssequenz genannt wurde bei MCAO-Ratten zur Quantifizierung des zerebralen Infarktvolumens angewendet. Die Bildparameter waren wie folgt konfiguriert: Wiederholungszeit (TR) = 3000,0 ms, Echozeit (TE) = 33,0 ms, Sichtfeld (FOV) = 35,00 × 35,00 mm2, Matrixgröße = 250 × 250, Schnittdicke = 0,80 mm, Anzahl der Schnitte = 35, Anzahl der Anregungen (NEX) = 3,0 und Flip-Winkel (FA) = 180,0°. Die zerebralen Infarktregionen wurden in der ITK-SNAP-Software (Version 4.4.0) manuell von einem einzelnen Forscher abgegrenzt, der auf Gruppenzuweisung anhand von Signalintensitätsänderungen und morphologischen Merkmalen, die mit einem ischämischen Infarkt übereinstimmen, blind war. Das Infarktvolumen des Gehirns wurde dann automatisch von der Software berechnet.
DTI-Neuroimaging zur Bewertung der mikrostrukturellen Integrität der weißen Substanz
MRT-Daten wurden mit einem 7,0 T PharmaScan-Magnetresonanzscanner aufgenommen. Die Anästhesie wurde mit 3 % Isofluran in Druckluft (0,4–0,6 L/min) induziert und während der gesamten DTI-Aufnahme mit 1 % Isofluran aufrechterhalten. Die Körperkerntemperatur wurde während des gesamten Bildgebungsverfahrens mit einem thermostatisch gesteuerten Wasserbad aufrechterhalten.
Während des MRT-Scans wurde zunächst eine Dreiebenen-Lokalisierungssequenz angewendet, um das Rattenhirn im Magneten zu positionieren. DTI wurde mit einer axialen Single-Shot-Spin-Echo-Echo-Echo-Bildabbildung mit folgenden Parametern durchgeführt: TR/TE = 3000/27 ms, Matrix = 90 × 75, FOV = 20 × 15 mm2, Schnittdicke = 0,7 mm, 30 Diffusionsgradienten-Richtungen und b-Werte von 0 und 1000 s/mm2. Für die DTI-Analyse wurden in der externen Kapsel auf Hirnschnitten 1,3 mm unterhalb von Bregma interessante Bereiche gezeichnet. Parametrische Karten der fraktionierten Anisotropie (FA), mittlerer Diffusivität (MD), axialer Diffusivität (AD) und radialer Diffusivität (RD) wurden mit der ParaVision 360-Software rekonstruiert. Die Daten werden als Verhältnis der betroffenen Hemisphäre zur kontralateralen gesunden Hemisphäre angegeben.
LFB-Färbung zur Beurteilung der Myelinverletzung und Remyelinisierung
Die LFB-Färbung wurde durchgeführt, um strukturelle Schäden an myelinisierten Axonen in der äußeren Kapsel zu bewerten. Myelin-Verletzung, gekennzeichnet durch Myelin-Verdünnung und Vakuolation, wurde durch Messung der integrierten optischen Dichte (IOD) von LFB-gefärbten myelinisierten Fasern innerhalb des ROI in der externen Kapsel mit der ImageJ-Software (Version 6.0; Graustufenschwelle 35–225) quantifiziert. Basierend auf dem stereotaxischen Atlas18 des Rattenhirns wurden für jedes Tier drei koronale Schnitte mit Bregma +1,0 mm, −1,3 mm und −1,6 mm analysiert, entsprechend den vorderen, mittleren und mittleren hinteren Teilen der äußeren Kapsel. Die mittlere IOD über die drei Abschnitte hinweg wurde berechnet, um jedes Tier darzustellen (n = 4 pro Gruppe). Die ipsilateralen IOD-Werte wurden auf die kontralaterale Seite normalisiert und als Prozentsatzvon 19 angegeben.
Elektrophysiologische Aufzeichnungen zur Beurteilung der Erregbarkeit von Wirbelsäulenreflexen
Der spinale monosynaptische H-Reflex wurde mit einem biologischen Funktionsexperimentsystem aufgezeichnet. Die Ratten wurden leicht mit α-Chloralose (50 mg/kg, intraperitoneal) betäubt, um die Erregbarkeit des spinalen Reflexes während elektrophysiologischer Aufnahmen zu erhalten. Der linke Ischiasnerv wurde durch eine stumpfe Dissektion freigelegt und auf bipolare Hakenelektroden zur elektrischen Stimulation gesetzt. Eine ölige Vitaminlösung wurde intermittierend auf den freiliegenden Nerv aufgetragen, um die Gewebehydration und die Neurallebensfähigkeit zu erhalten. Ein Paar Edelstahl-Aufnahmeelektroden wurde in die interosseusen Muskeln der linken Hinterpfote eingeführt, und eine Masseelektrode wurde im Schwanz eingesetzt. Der H-Reflex wurde mit einem monopolar-bipolaren Pulsstimulator mit einer Pulsdauer von 100 μs ausgelöst. Die H-Reflex-Schwelle und die motorische Schwelle (MT) wurden mittels inkrementeller elektrischer Stimulation bestimmt, wobei der Strom in 0,05 mA-Schritten auf eine maximale Intensität von 3,0 mA erhöht wurde, um irreversible periphere Nervenverletzungen zu vermeiden.
Mit derselben Stimulationsintensität, die den maximalen H-Reflex (Hmax) auslöste, wurden Pulsreize unterschiedlicher Frequenzen (0,3, 5 und 10 Hz) geliefert, um H-Reflexamplituden bei unterschiedlichen Stimulationsfrequenzen zu erhalten. Wiederholte Impulsstimulation bei 0,3 Hz wurde angewendet, um zu überprüfen, dass die M-Wellenamplitude innerhalb von 95 % ihres Anfangswerts blieb; ansonsten wurde der Datensatz verworfen. Die H-reflexartige frequenzabhängige Depression (FDD) wurde als Prozentsatz des H-Wellen/M-Wellen-Amplitudenverhältnisses (H/M-Verhältnis) bei 5 Hz und 10 Hz relativ zu 0,3 Hz berechnet, wobei das H/M-Verhältnis bei 0,3 Hz als Basisreferenz10 diente.
Datenanalyse
Statistische Analysen wurden mit SPSS-Software (Version 20.0) durchgeführt. Kontinuierliche Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Die Normalität der Daten wurde mit dem Shapiro–Wilk-Test bewertet. Die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um konventionelle Bildgebende Ergebnisse und andere quantitative Variablen zwischen den Gruppen zu vergleichen. Wenn die Varianzhomogenität erfüllt war, wurden Bonferroni-Post-hoc-Tests durchgeführt; ansonsten wurde Dunnetts T3-Test angewendet. Verhaltensdaten wurden mittels zweiseitiger ANOVA analysiert, wobei experimentelle Gruppe und postoperative Zeitpunkte als feste Faktoren dienten. Die Spearman-Korrelationsanalyse wurde verwendet, um Assoziationen zwischen Studienvariablen zu bewerten. Ein Wert von p < 0,05 galt als statistisch signifikant.