Zuogui-Pille moduliert die Osteoblasten-Osteoklasten-Kopplung bei ovariektomierten Ratten: Eine 3x3-faktoriell gestaltete Studie

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht die Wirkung der Zuogui-Pille auf die postmenopausale Osteoporose bei ovariectomierten Ratten unter Verwendung eines dreifaktoriellen Versuchsdesigns. Die Ergebnisse stützen synergistische Effekte der Yin- und Yang-Bestandteile auf den Knochenstoffwechsel und die damit verbundenen Marker des EphB4/EphrinB2-Signalwegs, obwohl der mechanistische Nachweis bislang assoziativ und nicht kausal ist.

Zusammenfassung

Postmenopausale Osteoporose wird durch eine östrogenmangelsbedingte Entkopplung von Knochenbildung und -resorption verursacht. Diese Studie quantifizierte die unabhängigen und wechselwirkenden Effekte von yin-stärkenden Teilformulierungen der Zuogui-Pille in einem ovariell-entfernten Rattenmodell und untersuchte Zusammenhänge mit dem EphB4/EphrinB2/RhoA/Alkalische-Phosphatase-Weg. Gemäß ARRIVE 2.0 wurden 130 spezifisch pathogenfreie weibliche Sprague-Dawley-Ratten zufällig auf 13 Gruppen (n=10/Gruppe) verteilt, darunter neun Gruppen nach einem 3×3-Faktoriellen Design. Endpunkte umfassten P1NP, CTX-1, die mittels Dual-Energie-Röntgenabsorptiometrie (DXA) gemessene femorale Knochendichte, trabekuläre Histologie sowie die Expression von Boten-Ribonukleinsäure und Proteinen, gemessen mittels reverser Transkriptions-quantitativer Polymerase-Kettenreaktion und Western Blotting. Die vollständige Formulierung (I2A2) war mit höheren P1NP-, niedrigeren CTX-1- und höheren BMD-Werten im Vergleich zur Modellgruppe assoziiert. Die Faktoranalyse ergab eine Yin-Yang-Wechselwirkung zwischen P1NP und BMD, was auf eine pharmakologische Synergie hindeutet. Molekulare Veränderungen waren mit einer erhöhten Expression von EphB4/EphrinB2/ALP und einer verminderten Expression von RhoA assoziiert. Diese Ergebnisse stützen einen Zusammenhang zwischen der Behandlung mit der Zuogui-Pille, verbesserter Knochenphänotypen und einer Modulation von Pfadmarkern; eine kausale Pfadabhängigkeit erfordert die Validierung durch Inhibitoren, Gen-Knockdown und Co-Kulturversuche.

Einleitung

Die postmenopausale Osteoporose (PMOP) betrifft eine große Zahl von Frauen und ist gekennzeichnet durch eine durch Östrogenmangel verursachte Störung des ausgewogenen Knochenumbaus, bei der die Knochenbildung und -resorption nicht mehr im Gleichgewicht sind^1,2. Das Rezeptor-Ligand-System EphB4/EphrinB2 vermittelt die Kommunikation zwischen Osteoblasten und Osteoklasten; die EphB4-Signalübertragung fördert die Differenzierung der Osteoblasten und die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP), während die umgekehrte Signalübertragung über EphrinB2 die Osteoklastogenese über RhoA-vermittelte Mechanismen hemmen kann^3,4. Eine verminderte Kopplung im östrogenarmen Knochengewebe liefert eine mechanistische Begründung für die Untersuchung von therapeutischen Ansätzen, die beide zellulären Komponenten des Knochenumbaus beeinflussen.

Aktuelle Therapien gegen Osteoporose, einschließlich antiresorptiver und anaboler Wirkstoffe, verringern das Frakturrisiko, können jedoch bei Langzeitanwendung durch mangelnde Therapietreue, Kosten, Kontraindikationen, Rebound-Effekte oder unerwünschte Ereignisse begrenzt sein⁵. Daher sind weiterhin Behandlungskandidaten wissenschaftlich relevant, die die Knochenbildung fördern und gleichzeitig eine übermäßige Resorption begrenzen.

Zuogui-Pille (ZGP; Zuo Gui Wan) ist ein klassisches, mehrkomponentiges Rezept, das in der traditionellen chinesischen Medizin bei Nierenessenzmangel eingesetzt wird, einem theoretischen Muster, das mit Knochenschwäche in Verbindung gebracht wird. Zu den Yin-nährenden Bestandteilen gehören Rehmannia glutinosa (zubereitete Wurzel, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (Rhizom, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (Frucht, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (Frucht, Gou Qi Zi, 12 g), Plastrongelatine aus Chinemys reevesii (aus Plastron gewonnene Gelatine, Gui Ban Jiao, 12 g) und Cyathula officinalis (Wurzel, Chuan Niu Xi, 9 g). Zu den Yang-stärkenden Bestandteilen gehören Cuscuta australis (Samen, Tu Si Zi, 12 g) und Geweihgelatine aus Cervus elaphus (aus Geweih gewonnene Gelatine, Lu Jiao Jiao, 12 g). Nach der klassischen Theorie besagt das Prinzip der Yang-Suche innerhalb des Yin, dass Yang-stärkende Kräuter eine Yin-nährende Grundlage verstärken können, anstatt einfach als unabhängige Zusatzstoffe zu wirken. Klinische Belege und präklinische Studien berichten über antiosteoporotische Wirkungen von ZGP oder ZGP-haltigen Interventionen, einschließlich Effekte auf die Knochendichte (BMD), Osteogenese und pharmakokinetisches Verhalten^6,7,8,9,10.

Die Neuheit dieser Studie liegt in der formalen dreifach faktoriellen Aufteilung der Yin-nährenden und Yang-stärkenden Komponenten bei ovarioresezierten (OVX) Ratten, verbunden mit einer gleichzeitigen Beurteilung der Knochenphänotypen und Marker des EphB4/EphrinB2/RhoA/ALP-Signalwegs. Dieser Ansatz prüft die Theorie der Formelverträglichkeit direkter als Studien, die lediglich die vollständige Rezeptur oder einen einzelnen Vergleichsarm verwenden, und berücksichtigt gleichzeitig, dass Veränderungen der Signalwegmarker assoziativ bleiben, sofern sie nicht mechanistisch blockiert oder stillgelegt werden¹¹.

Protokoll

Alle Verfahren in dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Inner Mongolia Medical University (Genehmigungsnummer: YKD202404105) genehmigt und gemäß ARRIVE 2.0¹² durchgeführt.

Studienaufbau

Die Studie wurde am tierexperimentellen Forschungsplattform der Medizinischen Universität Innere Mongolei durchgeführt. Ein vollständiger dreifaktorieller Versuchsplan mit zwei Faktoren wurde angewandt: Yin-nährende Grundformulierung (I; drei Dosisstufen: 0, 27, 54 g Rohdrogenäquivalent) und Yang-stärkende Formulierung (A; drei Dosisstufen: 0, 8, 16 g Rohdrogenäquivalent), was neun Faktorzellen sowie vier Referenzgruppen ergab. Der faktorielle Versuchsplan ist in Tabelle 1 dargestellt. I2A2 steht für die vollständige ZGP-Formel in klinischem Äquivalentdosis. Zur Dosisumrechnung wurde die Körperoberflächenmethode verwendet (Ratte: Mensch Faktor = 6,25)¹³.

Tiere, Randomisierung und Verblindung

Einhundertdreißig spezifisch pathogenfreie weibliche Sprague-Dawley-Ratten (6 Monate alt, 220–250 g) wurden mithilfe einer computergenerierten Zufallszahlentabelle zugeordnet. Die Zuordnungscodes wurden von einem Forscher, der nicht an der Ergebnisbewertung beteiligt war, in nummerierte, versiegelte Umschläge gelegt. Die Ratten wurden zu 3–4 Tieren pro belüftetem Käfig bei einem 12-Stunden-Licht-/Dunkelwechsel bei 22 ± 2 ^oC und 50–60 % Luftfeuchtigkeit gehalten und erhielten ad libitum Wasser, Standard-Nageternahrung mit dokumentiertem Gehalt an Calcium und Phosphor, Käfigaktivität sowie Umgebungsanreicherung. Molekulare Analysen, histologische Bewertung, Bildquantifizierung und Densitometrie wurden von Forschern durchgeführt, die über die Zuordnung uninformiert waren. Die Stichprobengröße wurde anhand einer a-priori-Durchführbarkeitsanalyse bestimmt, wodurch sich n = 10 pro Gruppe ergab.

OVX-Modell und Drogenbehandlung

Eine bilaterale OVX wurde unter Inhalationsnarkose mit Isofluran durchgeführt, das über einen Präzisionsverdampfer verabreicht wurde. Die Anästhesie wurde mit 3–4 % in Sauerstoff induziert und über eine Nasenkonne an 1,5–2,5 % aufrechterhalten. Eine ausreichende Narkosetiefe wurde durch das Fehlen der Fußreflexe und des Augenlidreflexes bei stabiler Atmung bestätigt. Der Erfolg der OVX wurde durch das Ausbleiben des vaginalen Östruszyklus am Tag 5 sowie durch die Abnahme der BMD 12 Wochen nach der Operation überprüft. Nach der Modellvalidierung wurde eine Magensonde-Behandlung über 8 Wochen verabreicht (1 mL/100 g/Tag). Die Dekokte wurden durch sequenzielle Wasserextraktion unter siedenden Bedingungen (100 °C, Rückfluss) hergestellt: 10-fache Volumenmenge für 2 Stunden, gefolgt von 8-facher Volumenmenge für 1,5 Stunden, filtriert durch vier Lagen medizinischer Gaze und unter vermindertem Druck auf 0,968 g Rohdroge/mL konzentriert. Der konzentrierte Extrakt wurde bei 4 °C gelagert und innerhalb von 7 Tagen nach der Herstellung verwendet. Als positive Kontrollen dienten Gusukang-Granulat (1,8 g/kg/Tag) und Diäthylstilöstrol (0,04 mg/kg/Tag). Zum Versuchsende wurden die Ratten mit 5 % Isofluran tief anästhesiert, bis der Fuß- und Hornhautreflex ausblieb, anschließend exsanguiert und durch Halsdislokation getötet. Der Tod wurde durch das Erliegen von Herzschlag und Atmung bestätigt. Die Kadaver und Gewebe wurden als biologische Abfälle entsorgt; chemische Rückstände als gefährliche Abfälle; Nadeln oder Klingen wurden in zugelassenen Spitzenbehältern deponiert.

Endpunkte

Serum-P1NP und CTX-1 wurden mittels Sandwich-ELISA (Jiyinmei)¹⁴ gemessen. Die femorale BMD wurde mittels DXA quantifiziert. Die trabekuläre Histologie wurde durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung bei 200facher Vergrößerung beurteilt. Die Genexpression wurde mittels RT-qPCR unter Verwendung der 2^-ΔΔCt-Methode bestimmt und auf Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) normalisiert. Die Proteinausprägung wurde mittels Western Blot und ImageJ-Quantifizierung analysiert (siehe Tabelle der Materialien). Die beobachteten molekularen Gewichte und Antikörper-Kataloginformationen sind in ergänzender Tabelle 1 angegeben. Die Primersequenzen lauteten: EphB4 vorwärts/rückwärts, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; EphrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.

Statistische Analyse

Die Normalverteilung wurde mithilfe des Shapiro-Wilk-Tests überprüft, und die Varianzhomogenität wurde vor der parametrischen Analyse mit dem Levene-Test bewertet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben, und alle Fehlerbalken in den quantitativen Abbildungen kennzeichnen die SD. Eine zweifaktorielle ANOVA wurde auf die neun Faktorzellen angewandt, um Haupteffekte sowie die Wechselwirkung zwischen I und A zu schätzen, wobei die partielle Eta-Quadrat-Größe (ηp²) als Effektstärke diente. Pairwise-Vergleiche über alle 13 Gruppen hinweg wurden mittels einer einfaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Korrektur durchgeführt. Die statistischen Analysen wurden in GraphPad Prism durchgeführt. Die Signifikanzsymbole sind einheitlich wie folgt definiert: *, **, ***, **** stehen für p <0,05, p <0,01, p <0,001, p <0,0001 im Vergleich zum Modell; #, ##, ###, #### zeigen dieselben Schwellenwerte im Vergleich zum vollständigen ZGP-Formelansatz an.

Ergebnisse

Validierung des Modells durch Vaginalzytologie

Der Erfolg der OVX wurde bei allen ovariektomierten Tieren bestätigt, wie der Verlust des Östruszyklus innerhalb von 5 Tagen nach der Operation belegt (Abbildung 1A), während die sham-operierten Tiere einen 4-Tage-Zyklus beibehielten (Abbildung 1B). Nach 12 Wochen zeigte die DXA eine geringere femorale BMD in der OVX-Modellgruppe im Vergleich zu den Sham-Kontrollen (0,214...

Diskussion

Der faktorielle Interaktionsterm unterstützt eine nichtadditive Beziehung zwischen den Yin-nährenden und Yang-stärkenden Komponenten von ZGP. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem traditionellen Prinzip, Yang innerhalb von Yin zu suchen, wonach erwartet wird, dass Yang-stärkende Bestandteile die Yin-nährende Basis aktivieren oder potenzieren¹⁵. Der Befund sollte als pharmakologische Synergie auf Formulierungsebene interpretiert werden. Er identifiziert nicht die einzelnen wirksamen Inhaltsstof...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1% Ammoniaklösung	N/A	N/A	Färbungslösung nach der Hämatoxylin-Differenzierung.
1% Salzsäurealkohol	N/A	N/A	Differenzierungslösung für die Hämatoxylin-Färbung.
2x qPCR-Mix	N/A	N/A	Master-Mix für quantitative PCR. Reaktionsvolumen pro Ansatz: 12,5 µL.
4% Paraformaldehydlösung	N/A	N/A	Fixierung der linken Femur- und Tibiaproben für die histologische Analyse.
5x Lade-Puffer	N/A	N/A	Denaturierung der Proben vor der Elektrophorese.
ALP-Primärantikörper	Affinity Biosciences	N/A	Western-Blot-Antikörper. Verdünnung: 1:2000. RRID und Chargennummer sind für JoVE erforderlich.
ALP-Primerpaar	N/A	N/A	Die ALP-mRNA wurde mittels qRT-PCR gemessen, jedoch liefert die übergeordnete Primer-Tabelle keine ALP-Primersequenzen. Bestätigung durch den Autor erforderlich.
Biotin-Antikörper-Reagenz	Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei	Kit-Komponente	Wird während des ELISA in die Proben-Wells gegeben.
Gelatine aus Hirschgeweih von Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Yang-stärkende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4. Die Gelatine wurde in die Dekoktion eingeschmolzen.
Gelatine aus Plastron von Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4. Die Gelatine wurde in die Dekoktion eingeschmolzen.
Chloroform	N/A	N/A	Phasentrennung während der RNA-Extraktion.
Kühlstufe	Leica	1150	Kryo- oder Kühlunterstützung für den Schnittprozess.
Cornus officinalis, Shan Zhu Yu	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4.
Cuscuta australis, Tu Si Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Yang-stärkende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4.
Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 9 g, Verhältnis 3.
DEPC-behandeltes PBS	N/A	N/A	Spülen der Lendenwirbel L4 bis L5 vor der Sofortgefrierung in flüssigem Stickstoff.
Diethylstilbestrol	N/A	N/A	Positivkontrolle mit westlichem Medikament. Dosis: 0,04 mg/kg/Tag, 1 mL/100 g/Tag. Im übergeordneten Dokument liegt eine inkonsistente chinesische Nomenklatur vor, die als Diethylstilbestrol harmonisiert werden sollte.
Dioscorea opposita, Huai Shan Yao	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4.
dNTP-Gemisch	N/A	N/A	Bestandteil der Reversen Transkription.
ECL-Chemilumineszenzreagenz	N/A	N/A	Nachweismittel für Western Blot.
ELISA-Färbreagenz A	Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei	Kit-Komponente	Färbentwicklungsreagenz für ELISA.
ELISA-Färbreagenz B	Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei	Kit-Komponente	Färbentwicklungsreagenz für ELISA.
ELISA-Stopp-Lösung	Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei	Kit-Komponente	Wird verwendet, um die Farbreaktion im ELISA zu beenden.
Enzymmarkiertes ELISA-Reagenz	Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei	Kit-Komponente	Wird in nicht leere Wells im ELISA gegeben.
EphB4-Primärantikörper	Proteintech	N/A	Western-Blot-Antikörper. Verdünnung: 1:2000. RRID und Chargennummer sind für JoVE erforderlich.
EphB4-Primerpaar	N/A	PCR-Produkt 232 bp	Forward: CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Reverse: GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Tippfehler in der übergeordneten Tabelle: „Rat RphB4“ sollte „Rat EphB4“ lauten.
ephrinB2-Primärantikörper	Affinity Biosciences	N/A	Western-Blot-Antikörper. Verdünnung: 1:2000. RRID und Chargennummer sind für JoVE erforderlich.
ephrinB2-Primerpaar	N/A	PCR-Produkt 172 bp	Forward: CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Reverse: ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT.
Ethanol, absolut und abgestuft 95 %, 85 %, 75 %	N/A	N/A	Gradienten-Dehydrierung und -Rehydrierung während der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung.
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	Im Quellartikel nicht angegeben: Tierzertifikat und Lizenznummer	Spezifisch pathogenfrei, 6 Monate alt, gesunde nicht trächtige Weibchen. In der chinesischen Quelle: 230 bis 270 g; in einem früheren englischen Entwurf: 220 bis 250 g. Endgültigen Wertebereich vor Einreichung verifizieren.
GAPDH-Primärantikörper	Servicebio	N/A	Ladekontroll-Antikörper. Verdünnung: 1:2000. RRID und Chargennummer sind für JoVE erforderlich.
GAPDH-Primerpaar	N/A	PCR-Produkt 253 bp	Forward: ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Reverse: TTTGAGGGTGCAGCGAACTT.
GraphPad Prism-Software	GraphPad Software	Version 9.4.1; RRID:SCR_002798	Statistische Analyse und Erstellung von Diagrammen. Normalverteilung, Varianzhomogenität, ANOVA, Bonferroni-Korrektur und Effektstärken müssen in den Ausgabedateien enthalten sein.
Gusukang-Granulat	Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	Positivkontrolle mit traditioneller chinesischer Medizin. Dosis: 1,8 g/kg/Tag oder 0,5 mL/100 g/Tag.
Hämatoxylin-Färbelösung	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Histologische Färbung. In der Quellprozedur: 5-minütige Hämatoxylin-Färbung.
Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge	N/A	TG16W	Zentrifugation für Serum- und Nukleinsäureverfahren.
Hologic Dual-Energy-Röntgenabsorptiometer	Hologic	N/A	Analyse der Knochendichte. In der Quelle werden in-vivo- und ex-vivo-Scans des Femurs berichtet.
ImageJ-Software	National Institutes of Health	RRID:SCR_003070	Densitometrische Quantifizierung von Western-Blot-Banden. Version im Quellartikel nicht angegeben.
Induktionsherd	Midea	N/A	In der chinesischen Instrumententabelle aufgeführt.
Isfluran	N/A	N/A	Anästhesie für bilaterale Ovariiektomie und Positionierung für DXA. Der überarbeitete Protokollteil sollte Induktion, Aufrechterhaltung, Applikationsweg und Kriterien für die Anästhesietiefe spezifizieren.
Isopropanol	N/A	N/A	RNA-Präzipitation während der Extraktion.
Flüssiger Stickstoff	N/A	N/A	Sofortgefrierung der Lendenwirbelproben.
Lycium barbarum, Gou Qi Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4.
Mikroplattenreader	N/A	AMR-100	Detektion der ELISA-Absorption bei 450 nm.
Mikroplattenwascher	N/A	APW-200	Waschschritt für ELISA-Platten.
MMLV-Reversetranskriptase	N/A	N/A	Enzym für die Reverse Transkription.
Neutrales Einbettungsgummi	Sinopharm Group	N/A	Einbettmedium für Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Objektträger.
Physiologische Kochsalzlösung	N/A	N/A	Fahrzeug-Gavage für die Leerkontrolle, die Scheinoperation und die Modellgruppen.
Oligo(dT)18-Primer	N/A	N/A	Wird für die Reverse Transkription verwendet.
Penicillin	N/A	N/A	Postoperative Infektionsprophylaxe. Dosis: 20.000 U/kg intramuskulär über 3 Tage.
Druckkochtopf	Xinfei	N/A	In der chinesischen Instrumententabelle aufgeführt.
Proteaseinhibitor	N/A	N/A	Wird während der Proteingewinnung hinzugefügt.
Protein-Lysepuffer	N/A	N/A	Proteingewinnung aus Knochengewebe für Western Blot.
PVDF-Membran	N/A	N/A	Transfermembran für Western Blot, aktiviert durch Methanol.
qRT-PCR-Gerät	N/A	N/A	Quantitative reverse Transkription-PCR für EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP und GAPDH.
Rat CTX-1 ELISA-Kit	Jiyinmei	JYM0026Ra	Sandwich-ELISA für das C-terminale Telopeptid des Typ-I-Kollagens im Serum. Detektion bei 450 nm.
Rat P1NP ELISA-Kit	Jiyinmei	JYM0030Ra	Sandwich-ELISA für das N-terminale Propeptid des Prokollagens vom Typ I im Serum. Detektion bei 450 nm.
Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 24 g, Verhältnis 8.
RhoA-Primärantikörper	Proteintech	N/A	Western-Blot-Antikörper. Verdünnung: 1:2000. RRID und Chargennummer sind für JoVE erforderlich.
RhoA-Primerpaar	N/A	PCR-Produkt 177 bp	Forward: GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Reverse: ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminologie wurde von RHoA auf RhoA harmonisiert.
RNase-Inhibitor	N/A	N/A	Bestandteil der Reversen Transkription.
RNase-freies Wasser	N/A	N/A	Auflösung der RNA nach dem Trocknen.
Rotationsmikrotom	Leica	2245	Histologisches Schneiden.
Sekundärantikörper für Western Blot	N/A	N/A	Verdünnung: 1:15000. Wirtsreaktivität und RRID sind für JoVE erforderlich.
Magermilchpulver, 5%	N/A	N/A	Blockiermittel für Western Blot, 2 h bei Raumtemperatur.
Objektträger-Auftrags- und Backmaschine	Jinhua Yidi	N/A	Objektträgerpräparation für die Histologie.
Natriumpentobarbital, 3%	N/A	N/A	Letale Anästhesie vor der Blutentnahme aus der Bauchaorta im chinesischen Originaldokument. Endgültiges Euthanasieverfahren und Bestätigungsmethode müssen verifiziert werden.
Standardprobenverdünnungsmittel	Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei	Kit-Komponente	Wird für serielle Verdünnungen der Standards im ELISA-Verfahren verwendet.
TBST-Puffer	N/A	N/A	Waschpuffer für Western Blot.
Thermostatischer Schüttelinkubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	N/A	Laborinkubation und Schütteln.
TRIzol-Reagenz	N/A	N/A	RNA-Extraktion aus 100 mg Knochengewebe.
Aufrechter Mikroskop	Leica	DM1000	Histologische Hämatoxylin- und Eosin-Bildgebung bei 200facher Vergrößerung.
Wasserbad-Thermostatin kubator	N/A	GNP-9080	Inkubation für Assay-Verfahren.
Wasserlösliche Eosin-Färbelösung	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Histologische Gegenfärbung. In der Quellprozedur: 3-minütige Eosin-Färbung.
Elektrophorese-System für Western Blot	N/A	N/A	Proteintrennung. Elektrophorese im Quellprotokoll: zunächst 80 V, dann 120 V.
Bildgebungssystem für Western Blot	N/A	N/A	Chemilumineszenz-Aufnahme der Membran. Für die Einreichung sind ungekürzte Membranbilder erforderlich.
Übertragungssystem für Western Blot	N/A	N/A	Proteinübertragung auf PVDF-Membran. Übertragungsbedingungen: 400 mA, 90 min, Eisbad.
Xylol	N/A	N/A	Entwachsen und Gewebeklärung während der Histologie.
Komponentenkräuter der Zuogui-Pille	Beijing Tongrentang	N/A	Acht-Kräuter-Formulierung: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, Gelatine aus Plastron von Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis und Gelatine aus Hirschgeweih von Cervus elaphus.