Diese Studie untersucht die Wirkung der Zuogui-Pille auf die postmenopausale Osteoporose bei ovariectomierten Ratten unter Verwendung eines dreifaktoriellen Versuchsdesigns. Die Ergebnisse stützen synergistische Effekte der Yin- und Yang-Bestandteile auf den Knochenstoffwechsel und die damit verbundenen Marker des EphB4/EphrinB2-Signalwegs, obwohl der mechanistische Nachweis bislang assoziativ und nicht kausal ist.
Forschungsartikel
Zuogui-Pille moduliert die Osteoblasten-Osteoklasten-Kopplung bei ovariektomierten Ratten: Eine 3x3-faktoriell gestaltete Studie
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11. September 2026
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Postmenopausale Osteoporose wird durch eine östrogenmangelsbedingte Entkopplung von Knochenbildung und -resorption verursacht. Diese Studie quantifizierte die unabhängigen und wechselwirkenden Effekte von yin-stärkenden Teilformulierungen der Zuogui-Pille in einem ovariell-entfernten Rattenmodell und untersuchte Zusammenhänge mit dem EphB4/EphrinB2/RhoA/Alkalische-Phosphatase-Weg. Gemäß ARRIVE 2.0 wurden 130 spezifisch pathogenfreie weibliche Sprague-Dawley-Ratten zufällig auf 13 Gruppen (n=10/Gruppe) verteilt, darunter neun Gruppen nach einem 3×3-Faktoriellen Design. Endpunkte umfassten P1NP, CTX-1, die mittels Dual-Energie-Röntgenabsorptiometrie (DXA) gemessene femorale Knochendichte, trabekuläre Histologie sowie die Expression von Boten-Ribonukleinsäure und Proteinen, gemessen mittels reverser Transkriptions-quantitativer Polymerase-Kettenreaktion und Western Blotting. Die vollständige Formulierung (I2A2) war mit höheren P1NP-, niedrigeren CTX-1- und höheren BMD-Werten im Vergleich zur Modellgruppe assoziiert. Die Faktoranalyse ergab eine Yin-Yang-Wechselwirkung zwischen P1NP und BMD, was auf eine pharmakologische Synergie hindeutet. Molekulare Veränderungen waren mit einer erhöhten Expression von EphB4/EphrinB2/ALP und einer verminderten Expression von RhoA assoziiert. Diese Ergebnisse stützen einen Zusammenhang zwischen der Behandlung mit der Zuogui-Pille, verbesserter Knochenphänotypen und einer Modulation von Pfadmarkern; eine kausale Pfadabhängigkeit erfordert die Validierung durch Inhibitoren, Gen-Knockdown und Co-Kulturversuche.
Einleitung
Die postmenopausale Osteoporose (PMOP) betrifft eine große Zahl von Frauen und ist gekennzeichnet durch eine durch Östrogenmangel verursachte Störung des ausgewogenen Knochenumbaus, bei der die Knochenbildung und -resorption nicht mehr im Gleichgewicht sind1,2. Das Rezeptor-Ligand-System EphB4/EphrinB2 vermittelt die Kommunikation zwischen Osteoblasten und Osteoklasten; die EphB4-Signalübertragung fördert die Differenzierung der Osteoblasten und die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP), während die umgekehrte Signalübertragung über EphrinB2 die Osteoklastogenese über RhoA-vermittelte Mechanismen hemmen kann3,4. Eine verminderte Kopplung im östrogenarmen Knochengewebe liefert eine mechanistische Begründung für die Untersuchung von therapeutischen Ansätzen, die beide zellulären Komponenten des Knochenumbaus beeinflussen.
Aktuelle Therapien gegen Osteoporose, einschließlich antiresorptiver und anaboler Wirkstoffe, verringern das Frakturrisiko, können jedoch bei Langzeitanwendung durch mangelnde Therapietreue, Kosten, Kontraindikationen, Rebound-Effekte oder unerwünschte Ereignisse begrenzt sein5. Daher sind weiterhin Behandlungskandidaten wissenschaftlich relevant, die die Knochenbildung fördern und gleichzeitig eine übermäßige Resorption begrenzen.
Zuogui-Pille (ZGP; Zuo Gui Wan) ist ein klassisches, mehrkomponentiges Rezept, das in der traditionellen chinesischen Medizin bei Nierenessenzmangel eingesetzt wird, einem theoretischen Muster, das mit Knochenschwäche in Verbindung gebracht wird. Zu den Yin-nährenden Bestandteilen gehören Rehmannia glutinosa (zubereitete Wurzel, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (Rhizom, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (Frucht, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (Frucht, Gou Qi Zi, 12 g), Plastrongelatine aus Chinemys reevesii (aus Plastron gewonnene Gelatine, Gui Ban Jiao, 12 g) und Cyathula officinalis (Wurzel, Chuan Niu Xi, 9 g). Zu den Yang-stärkenden Bestandteilen gehören Cuscuta australis (Samen, Tu Si Zi, 12 g) und Geweihgelatine aus Cervus elaphus (aus Geweih gewonnene Gelatine, Lu Jiao Jiao, 12 g). Nach der klassischen Theorie besagt das Prinzip der Yang-Suche innerhalb des Yin, dass Yang-stärkende Kräuter eine Yin-nährende Grundlage verstärken können, anstatt einfach als unabhängige Zusatzstoffe zu wirken. Klinische Belege und präklinische Studien berichten über antiosteoporotische Wirkungen von ZGP oder ZGP-haltigen Interventionen, einschließlich Effekte auf die Knochendichte (BMD), Osteogenese und pharmakokinetisches Verhalten6,7,8,9,10.
Die Neuheit dieser Studie liegt in der formalen dreifach faktoriellen Aufteilung der Yin-nährenden und Yang-stärkenden Komponenten bei ovarioresezierten (OVX) Ratten, verbunden mit einer gleichzeitigen Beurteilung der Knochenphänotypen und Marker des EphB4/EphrinB2/RhoA/ALP-Signalwegs. Dieser Ansatz prüft die Theorie der Formelverträglichkeit direkter als Studien, die lediglich die vollständige Rezeptur oder einen einzelnen Vergleichsarm verwenden, und berücksichtigt gleichzeitig, dass Veränderungen der Signalwegmarker assoziativ bleiben, sofern sie nicht mechanistisch blockiert oder stillgelegt werden11.
Protokoll
Alle Verfahren in dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Inner Mongolia Medical University (Genehmigungsnummer: YKD202404105) genehmigt und gemäß ARRIVE 2.012 durchgeführt.
Studienaufbau
Die Studie wurde am tierexperimentellen Forschungsplattform der Medizinischen Universität Innere Mongolei durchgeführt. Ein vollständiger dreifaktorieller Versuchsplan mit zwei Faktoren wurde angewandt: Yin-nährende Grundformulierung (I; drei Dosisstufen: 0, 27, 54 g Rohdrogenäquivalent) und Yang-stärkende Formulierung (A; drei Dosisstufen: 0, 8, 16 g Rohdrogenäquivalent), was neun Faktorzellen sowie vier Referenzgruppen ergab. Der faktorielle Versuchsplan ist in Tabelle 1 dargestellt. I2A2 steht für die vollständige ZGP-Formel in klinischem Äquivalentdosis. Zur Dosisumrechnung wurde die Körperoberflächenmethode verwendet (Ratte: Mensch Faktor = 6,25)13.
Tiere, Randomisierung und Verblindung
Einhundertdreißig spezifisch pathogenfreie weibliche Sprague-Dawley-Ratten (6 Monate alt, 220–250 g) wurden mithilfe einer computergenerierten Zufallszahlentabelle zugeordnet. Die Zuordnungscodes wurden von einem Forscher, der nicht an der Ergebnisbewertung beteiligt war, in nummerierte, versiegelte Umschläge gelegt. Die Ratten wurden zu 3–4 Tieren pro belüftetem Käfig bei einem 12-Stunden-Licht-/Dunkelwechsel bei 22 ± 2 oC und 50–60 % Luftfeuchtigkeit gehalten und erhielten ad libitum Wasser, Standard-Nageternahrung mit dokumentiertem Gehalt an Calcium und Phosphor, Käfigaktivität sowie Umgebungsanreicherung. Molekulare Analysen, histologische Bewertung, Bildquantifizierung und Densitometrie wurden von Forschern durchgeführt, die über die Zuordnung uninformiert waren. Die Stichprobengröße wurde anhand einer a-priori-Durchführbarkeitsanalyse bestimmt, wodurch sich n = 10 pro Gruppe ergab.
OVX-Modell und Drogenbehandlung
Eine bilaterale OVX wurde unter Inhalationsnarkose mit Isofluran durchgeführt, das über einen Präzisionsverdampfer verabreicht wurde. Die Anästhesie wurde mit 3–4 % in Sauerstoff induziert und über eine Nasenkonne an 1,5–2,5 % aufrechterhalten. Eine ausreichende Narkosetiefe wurde durch das Fehlen der Fußreflexe und des Augenlidreflexes bei stabiler Atmung bestätigt. Der Erfolg der OVX wurde durch das Ausbleiben des vaginalen Östruszyklus am Tag 5 sowie durch die Abnahme der BMD 12 Wochen nach der Operation überprüft. Nach der Modellvalidierung wurde eine Magensonde-Behandlung über 8 Wochen verabreicht (1 mL/100 g/Tag). Die Dekokte wurden durch sequenzielle Wasserextraktion unter siedenden Bedingungen (100 °C, Rückfluss) hergestellt: 10-fache Volumenmenge für 2 Stunden, gefolgt von 8-facher Volumenmenge für 1,5 Stunden, filtriert durch vier Lagen medizinischer Gaze und unter vermindertem Druck auf 0,968 g Rohdroge/mL konzentriert. Der konzentrierte Extrakt wurde bei 4 °C gelagert und innerhalb von 7 Tagen nach der Herstellung verwendet. Als positive Kontrollen dienten Gusukang-Granulat (1,8 g/kg/Tag) und Diäthylstilöstrol (0,04 mg/kg/Tag). Zum Versuchsende wurden die Ratten mit 5 % Isofluran tief anästhesiert, bis der Fuß- und Hornhautreflex ausblieb, anschließend exsanguiert und durch Halsdislokation getötet. Der Tod wurde durch das Erliegen von Herzschlag und Atmung bestätigt. Die Kadaver und Gewebe wurden als biologische Abfälle entsorgt; chemische Rückstände als gefährliche Abfälle; Nadeln oder Klingen wurden in zugelassenen Spitzenbehältern deponiert.
Endpunkte
Serum-P1NP und CTX-1 wurden mittels Sandwich-ELISA (Jiyinmei)14 gemessen. Die femorale BMD wurde mittels DXA quantifiziert. Die trabekuläre Histologie wurde durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung bei 200facher Vergrößerung beurteilt. Die Genexpression wurde mittels RT-qPCR unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode bestimmt und auf Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) normalisiert. Die Proteinausprägung wurde mittels Western Blot und ImageJ-Quantifizierung analysiert (siehe Tabelle der Materialien). Die beobachteten molekularen Gewichte und Antikörper-Kataloginformationen sind in ergänzender Tabelle 1 angegeben. Die Primersequenzen lauteten: EphB4 vorwärts/rückwärts, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; EphrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.
Statistische Analyse
Die Normalverteilung wurde mithilfe des Shapiro-Wilk-Tests überprüft, und die Varianzhomogenität wurde vor der parametrischen Analyse mit dem Levene-Test bewertet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben, und alle Fehlerbalken in den quantitativen Abbildungen kennzeichnen die SD. Eine zweifaktorielle ANOVA wurde auf die neun Faktorzellen angewandt, um Haupteffekte sowie die Wechselwirkung zwischen I und A zu schätzen, wobei die partielle Eta-Quadrat-Größe (ηp2) als Effektstärke diente. Pairwise-Vergleiche über alle 13 Gruppen hinweg wurden mittels einer einfaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Korrektur durchgeführt. Die statistischen Analysen wurden in GraphPad Prism durchgeführt. Die Signifikanzsymbole sind einheitlich wie folgt definiert: *, **, ***, **** stehen für p <0,05, p <0,01, p <0,001, p <0,0001 im Vergleich zum Modell; #, ##, ###, #### zeigen dieselben Schwellenwerte im Vergleich zum vollständigen ZGP-Formelansatz an.
Ergebnisse
Validierung des Modells durch Vaginalzytologie
Der Erfolg der OVX wurde bei allen ovariektomierten Tieren bestätigt, wie der Verlust des Östruszyklus innerhalb von 5 Tagen nach der Operation belegt (Abbildung 1A), während die sham-operierten Tiere einen 4-Tage-Zyklus beibehielten (Abbildung 1B). Nach 12 Wochen zeigte die DXA eine geringere femorale BMD in der OVX-Modellgruppe im Vergleich zu den Sham-Kontrollen (0,214 ± 0,020 vs. 0,281 ± 0,019 mg/cm3; Bonferroni-angepasstes p < 0,001), was die Etablierung des OVX-induzierten Knochenverlustmodells vor der Behandlung untermauert.
Knochendichte
Die vollständige ZGP-Formel (I2A2) zeigte unter den faktoriellen Teilformulierungen die höchste BMD-Wiederherstellung und war statistisch vergleichbar mit beiden positiven Kontrollen (Tabelle 2, Abbildung 2). Alle faktoriellen Teilformulierungen erhöhten die BMD im Vergleich zur Modellgruppe. Eine alleinige starke Yin-nährende Wirkung (I3A1: 0,253 mg/cm3) und eine alleinige starke Yang-stärkende Wirkung (I1A3: 0,243 mg/cm3) blieben niedriger als die volle ZGP-Formel (I2A2: 0,307 mg/cm3), was für eine Wechselwirkung und nicht für einen einfachen Dosis-Effekt spricht.
Serummarker des Knochenumsatzes
Verglichen mit der Modellgruppe war die vollständige Formulierung von ZGP mit einem erhöhten P1NP (+51 %; 95 % KI: 210,3–327,5 pg/mL; p <0,0001) und einem verminderten CTX-1 (−16 %; p <0,01) assoziiert, was auf ein verbessertes Verhältnis von Knochenbildung zu -resorption hindeutet (Abbildung 3A,B). In einigen Vergleichen wiesen die Hochdosis-Monotherapie-Gruppen höhere absolute P1NP-Werte auf, doch das Faktorenmuster sprach für eine optimierte kombinierte Wirkung statt für eine maximale Dosiswirkung in einer einzelnen Therapielinie. Die vollständigen Daten auf Gruppenebene sind in Tabelle 3 enthalten.
Faktorielle ANOVA und synergistische Interaktion
Die zweifaktorielle ANOVA der neun Faktorzellen ergab signifikante Haupteffekte der yinspeisenden und yangstärkenden Faktoren sowie signifikante Wechselwirkungsterme zwischen I und A über alle primären Endpunkte hinweg (Tabelle 4). Der Wechselwirkungseffekt für P1NP (ηp2 = 0.74) legt nahe, dass yangstärkende Komponenten die Wirkung der yinspeisenden Komponenten unter den vorliegenden experimentellen Bedingungen verstärkten.
Knochendichte (Modellvalidierung)
Die Femurdichte war in der Modellgruppe (OVX) niedriger als in der Leer- und der Scheinoperation-Gruppe, was die erfolgreiche Induktion des OVX-Knochenschwund-Phänotyps vor der Behandlung bestätigt, wie in Abbildung 4 gezeigt.
Expression von EphB4/EphrinB2/RhoA/ALP
Die RT-qPCR-Analysen verwendeten biologische Proben jeder Gruppe mit technischen Triplikaten, und die Western-Blot-Densitometrie wurde an unabhängigen biologischen Lysaten durchgeführt (Abbildung 5 und Abbildung 6). Im Vergleich zur Modellgruppe war die vollständige Rezeptur von ZGP mit höheren Werten für EphB4 (0,498 ± 0,009 vs. 0,048 ± 0,002; p < 0,0001), EphrinB2 (0,411 ± 0,036 vs. 0,048 ± 0,003; p < 0,0001) und ALP (0,842 ± 0,019 vs. 0,090 ± 0,003; p < 0,0001), sowie niedrigeren Werten für RhoA (1,658 ± 0,028 vs. 7,332 ± 0,430; p < 0,0001) assoziiert. Diese molekularen Befunde werden als Assoziationen mit Pfadmarkern und nicht als Beweis für eine kausale Vermittlung interpretiert.
Datenverfügbarkeit
Die ursprünglichen Datendateien, die zur Erstellung der Ergebnisse der vorliegenden Studie verwendet wurden, sind als Zusätzliche Codierungsdatei ergänzend zu diesem Artikel verfügbar
Abbildung 1. Repräsentative Vaginalzytologie zur Bestätigung der Östruszyklik nach Ovariectomy (Hämaluminium-Eosin-Färbung, 200x). (A) Repräsentativer Vaginalabstrich einer ovariectomierten Ratte, der eine persistierende, nicht zyklische Zytologie zeigt. (B) Repräsentativer Vaginalabstrich einer sham-operierten Ratte mit normaler Östruszyklik. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2. Femorale BMD über alle Gruppen hinweg. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (SD) an. Die statistischen Symbole geben Bonferroni-korrigierte Vergleiche gegenüber dem Modell oder der vollständigen Formel ZGP an, wie im Abschnitt „Statistische Analyse“ definiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3. Serummarker des Knochenumsatzes. (A) P1NP, ein Marker der Knochenbildung. (B) CTX-1, ein Marker der Knochenresorption. Die Fehlerbalken geben die SD an. Die statistischen Symbole zeigen Bonferroni-korrigierte Vergleiche im Verhältnis zum Modell oder zur vollständigen Formel von ZGP an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4. Femorale Knochendichte zur Bestätigung des durch OVX verursachten Knochenverlusts vor der Behandlung. Säulendiagramm zum Vergleich der femoralen Knochendichte (mg/cm3) zwischen den Gruppen Blank (nicht ovariiektomiert, unbehandelt), Sham-operiert und Modell (OVX) zum Zeitpunkt der Modellvalidierung vor der Behandlung. Die Balken zeigen den Mittelwert ± SD (n = 10/Gruppe). *** = p < 0,001 im Vergleich zu Blank und zu Sham (einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Korrektur). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 5. Relative mRNA-Genexpression. Expressionsniveaus von (A) EphB4 (B) EphrinB2 (C) RhoA (D) ALP, bestimmt mittels der 2^-ΔΔCt-Methode und auf GAPDH normalisiert. Für jede biologische Probe wurden technische Triplicate im qPCR-Ansatz verwendet. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (SD). Statistische Symbole kennzeichnen Bonferroni-korrigierte Vergleiche. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 6. Proteinexpression in Western-Blot. Die Darstellungen zeigen repräsentative Immunoblots für EphB4, EphrinB2, RhoA, ALP und die Beladungskontrolle GAPDH, ausgewählt aus unabhängigen biologischen Proben. Die Densitometrie wurde mit ImageJ auf GAPDH normalisiert. Beobachtete molekulare Massen: EphB4, 110 kDa; EphrinB2, 36 kDa; RhoA, 22 kDa; ALP, 39 kDa; GAPDH, 37 kDa (siehe Ergänzende Tabelle 1). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
| Faktor zur Stärkung des Yins (I) | ||||
| I₁ (0 g) | I₂ (27 g) | I₃ (54 g) | ||
| Yang-aktivierender Faktor (A) | A₁ (0 g) | I₁A₁ (Modell) | I₂A₁ (Yin) | I₃A₁ (Hi-Yin) |
| A₂ (8 g) | I₁A₂ (Yang) | I₂A₂ (ZGP†) | I₃A₂ (Hi-Yin+Yang) | |
| A₃ (16 g) | I₁A₃ (Hi-Yang) | I₂A₃ (Yin+Hoher Yang) | I₃A₃ (Full-Hi) | |
Tabelle 1: Dreifach-dreifacher Faktorieller Versuchsplan und experimentelle Gruppen. Die Tabelle zeigt die 13 experimentellen Gruppen, angeordnet gemäß einem dreifach-dreifachen faktoriellen Design der Yin-nährenden (I) und Yang-stärkenden (A) Dosierungsstufen, zusätzlich zu 4 Referenzgruppen. †I₂A₂ = volle Zuogui-Pille-Formulierung in klinisch äquivalenter Dosis. Dosisumrechnung mittels Körperoberflächenmethode (Ratte : Mensch = 6,25).
| Gruppe | Faktorielle Zelle | BMD (mg/cm³, x̄ ± SD) | vs. Modell |
| Leer-Kontrolle | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| Scham-operiert | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| Modell (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| Yang-stärkend | I₁A₂ | 0.258 ± 0.011 | ** |
| Hoch Yang-stärkend | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| Yin-stärkend | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| Hoch Yin-stärkend | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| Yin + Hoch-Yang | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| Hoch-Yin + Yang | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| Voll-Hoch | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| Vollrezeptur ZGP | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| TCM-Positivkontrolle | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| Westliche Medizin-Kontrolle | — | 0.307 ± 0.009 | **** |
Tabelle 2: Femorale BMD in allen Gruppen (n=10/Gruppe, Mittelwert ± SD). * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p<0,001, **** = p<0,0001 im Vergleich zum Modell (Bonferroni-korrigiert).
| Gruppe | Zelle | P1NP (pg/mL, x̄ ± SD) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± SD) |
| Leer-Kontrolle | — | 1388.8 ± 29.7****#### | 33.4 ± 6.8****#### |
| Scham-operation | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| Modell (OVX) | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| Yang-stärkend | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| Stark yang-stärkend | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| Yin-stärkend | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 88.2 ± 7.6** |
| Stark yin-stärkend | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| Yin + Hoch-Yang | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| Hoch-Yin + Yang | I₃A₂ | 990.2 ± 116.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| Voll-Hoch | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| Vollrezeptur ZGP | I₂A₂ | 794.8 ± 66.0**** | 88.2 ± 6.0**** |
| TCM-Positivkontrolle | — | 967.7 ± 49.9****# | 66.3 ± 6.1****#### |
| Westliche Medizin-Kontrolle | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
Tabelle 3: Serum-P1NP und CTX-1 in allen Gruppen (n=10/Gruppe, Mittelwert ± SD). ** = p <0,01, **** = p <0,0001 im Vergleich zum Modell; # = p <0,05, ## = p <0,01, ### = p <0,001, #### = p <0,0001 im Vergleich zu ZGP (Bonferroni). 95 % KI für ZGP P1NP im Vergleich zum Modell: 210,3–327,5 pg/mL.
| Ergebnis | Faktor | df | F | p-Wert | Partielles η² |
| P1NP (pg/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 17,84 | <0,001 | 0,31 |
| Yang (A) | 2, 81 | 6,22 | 0,003 | 0,13 | |
| I × A | 4, 81 | 57,21 | <0,001 | 0,74 | |
| BMD (mg/cm³) | Yin (I) | 2, 81 | 31,90 | <0,0001 | 0,44 |
| Yang (A) | 2, 81 | 28,70 | <0,0001 | 0,41 | |
| I × A | 4, 81 | 24,60 | <0,0001 | 0,55 | |
| CTX-1 (ng/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 14,22 | <0,001 | 0,26 |
| Yang (A) | 2, 81 | 5,88 | 0,004 | 0,13 | |
| I × A | 4, 81 | 19,43 | <0,001 | 0,49 |
Tabelle 4: Dreifaktorielle ANOVA mit Haupteffekten und Interaktionstermen sowie Bonferroni-korrigierten post-hoc-Vergleichen. Partial-Eta-Quadrat wird als Effektgröße angegeben. df steht für Freiheitsgrade.
Zusatz-Tabelle 1. Informationen zu den Antikörpern für die Western-Blot-Analyse. Die Tabelle enthält die Zielproteine, beobachteten molekularen Massen, Anbieter, Katalognummern, Wirtsspezies und verwendeten Verdünnungen der primären und sekundären Antikörper, die in dieser Studie verwendet wurden.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusätzliche Codierungsdatei 1. Rohexperimentaldaten zur Unterstützung der Studie. Dieses Archiv enthält die ursprünglichen Datendateien, die zur Erstellung der in der Manuskriptversion präsentierten Ergebnisse verwendet wurden, einschließlich individueller BMD-Messwerte, Rohdaten von ELISA-Tests, Ct-Werte von RT-qPCR mit Verstärkungs- und Schmelzkurvenausgaben, ursprüngliche Western-Blot-Bilder und Densitometrie-Analysedateien, repräsentative histologische Mikroskopiebilder sowie gerätegenerierte Ausgabedateien, die mit diesen Experimenten verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Der faktorielle Interaktionsterm unterstützt eine nichtadditive Beziehung zwischen den Yin-nährenden und Yang-stärkenden Komponenten von ZGP. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem traditionellen Prinzip, Yang innerhalb von Yin zu suchen, wonach erwartet wird, dass Yang-stärkende Bestandteile die Yin-nährende Basis aktivieren oder potenzieren15. Der Befund sollte als pharmakologische Synergie auf Formulierungsebene interpretiert werden. Er identifiziert nicht die einzelnen wirksamen Inhaltsstoffe, die für die Wirkung verantwortlich sind.
EphB4 und EphrinB2 sind biologisch plausible Vermittler der Osteoblasten-Osteoklasten-Kopplung3,4, aber die vorliegenden Belege sind korrelativ. Der beobachtete Anstieg von EphB4, EphrinB2 und ALP bei vermindertem RhoA ist vereinbar mit einer verbesserten Kopplung, beweist jedoch nicht, dass dieser Signalweg für die Wirkung von ZGP notwendig oder ausreichend ist. Um eine kausale Abhängigkeit zu prüfen, sind Hemmstoffe des Signalwegs, Ansätze zur Blockade von anti-EphB4 oder EphrinB2, Modulation von RhoA/ROCK16, Gen-Knockdown sowie Ko-Kultur-Experimente von Osteoblasten und Osteoklasten erforderlich.
Die klinische Übertragung erfordert Vorsicht. Die umgerechnete menschliche Dosis auf Basis der Ratte unterstützt die erste Skalierung, doch die Dosierung beim Menschen erfordert zusätzlich pharmakokinetische, pharmakodynamische und langfristige Sicherheitsstudien. Ein standardisiertes ZGP-Produkt würde eine chemische Profilierung mittels HPLC oder LC-MS, Grenzwerte für Markerinhaltsstoffe, Vergleichbarkeit von Charge zu Charge, Kontaminationstests sowie eine Dokumentation der Herkunft der Kräuter, der Extraktion, Konzentration und Herstellungsverfahren benötigen17. Die regulatorische Übertragung muss außerdem Wechselwirkungen zwischen den Inhaltsstoffen, die Verträglichkeit mit bestehenden antiosteoporotischen Arzneimitteln sowie vergleichende klinische Ergebnisse wie die Reduktion von Frakturen – und nicht allein die Knochendichte (BMD) – berücksichtigen.
Diese Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Das OVX-Rattenmodell führt zu einem plötzlichen Östrogenentzug und kann die menschliche Menopause, das Altern, die Immunregulation, die Lebensdauer, Komorbiditäten oder die langfristigen Knochenumbaudynamiken nicht vollständig reproduzieren18,19. Systemische endokrine Effekte könnten zu den beobachteten Ergebnissen beitragen, weshalb keine direkte Signalübertragung in Knochenzellen angenommen werden sollte. Das Fehlen einer Hemmung von Signalwegen oder eines Gens knockdowns schließt kausale Aussagen über Mechanismen aus. Die fehlende HPLC- oder LC-MS-Profilierung beeinträchtigt die Reproduzierbarkeit und verhindert die Zuordnung von Wirkungen zu spezifischen Inhaltsstoffen. Eine quantitative Beurteilung der trabekulären Knochenmikroarchitektur wurde nicht durchgeführt. Zukünftige Studien sollten die Mikro-CT oder quantitative histomorphometrische Analysen einschließlich BV/TV, Tb.N, Tb.Th und Tb.Sp integrieren, um eine umfassendere Bewertung der knöchernen Strukturveränderungen zu ermöglichen20. Die Variabilität zwischen Chargen von Heilpflanzen, Extraktionsverfahren und Anforderungen an die Qualitätskontrolle bleiben wichtige Hindernisse für die Übertragung in die klinische Anwendung.
Bei OVX-induzierten PMOP-Ratten war die Ganzformel der Zuogui-Pille mit einer verbesserten BMD, günstigen serumbezogenen Markern des Knochenumsatzes und koordinierten Veränderungen der Marker des EphB4/EphrinB2/RhoA/ALP-Signalwegs assoziiert. Die dreifach faktorielle Analyse unterstützt eine synergistische Wechselwirkung zwischen yin-nährenden und yang-stärkenden Komponenten, was mit der traditionellen Theorie zur Formelverträglichkeit übereinstimmt. Diese Daten sprechen für weitere Untersuchungen von ZGP als mehrfach angreifenden Kandidaten bei PMOP; inhibitorische Studien, Gen-Silencing-Experimente, Ko-Kulturen von Osteoblasten und Osteoklasten, chemische Profilierung, quantitative Analyse der Knochenmikroarchitektur, Pharmakokinetik, Langzeit-Sicherheitsprüfungen und klinische Studien sind jedoch erforderlich, bevor mechanistische oder translationsrelevante Aussagen endgültig getroffen werden können.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Natural Science Foundation von Innere Mongolei (Förderkennzeichen Nr. 2025LHMS08047), dem Generalprojekt der Medizinischen Universität Innere Mongolei (Förderkennzeichen Nr. YKD2025MS015) und dem Doktoranden-Startfonds der Medizinischen Universität Innere Mongolei (Förderkennzeichen Nr. YKD2023BSQD007). Die Fördergeber hatten keinerlei Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung, die Analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Vorbereitung des Manuskripts.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1% Ammoniaklösung | N/A | N/A | Färbungslösung nach der Hämatoxylin-Differenzierung. |
| 1% Salzsäurealkohol | N/A | N/A | Differenzierungslösung für die Hämatoxylin-Färbung. |
| 2x qPCR-Mix | N/A | N/A | Master-Mix für quantitative PCR. Reaktionsvolumen pro Ansatz: 12,5 µL. |
| 4% Paraformaldehydlösung | N/A | N/A | Fixierung der linken Femur- und Tibiaproben für die histologische Analyse. |
| 5x Lade-Puffer | N/A | N/A | Denaturierung der Proben vor der Elektrophorese. |
| ALP-Primärantikörper | Affinity Biosciences | N/A | Western-Blot-Antikörper. Verdünnung: 1:2000. RRID und Chargennummer sind für JoVE erforderlich. |
| ALP-Primerpaar | N/A | N/A | Die ALP-mRNA wurde mittels qRT-PCR gemessen, jedoch liefert die übergeordnete Primer-Tabelle keine ALP-Primersequenzen. Bestätigung durch den Autor erforderlich. |
| Biotin-Antikörper-Reagenz | Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei | Kit-Komponente | Wird während des ELISA in die Proben-Wells gegeben. |
| Gelatine aus Hirschgeweih von Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Yang-stärkende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4. Die Gelatine wurde in die Dekoktion eingeschmolzen. |
| Gelatine aus Plastron von Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4. Die Gelatine wurde in die Dekoktion eingeschmolzen. |
| Chloroform | N/A | N/A | Phasentrennung während der RNA-Extraktion. |
| Kühlstufe | Leica | 1150 | Kryo- oder Kühlunterstützung für den Schnittprozess. |
| Cornus officinalis, Shan Zhu Yu | Beijing Tongrentang | N/A | Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4. |
| Cuscuta australis, Tu Si Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Yang-stärkende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4. |
| Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi | Beijing Tongrentang | N/A | Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 9 g, Verhältnis 3. |
| DEPC-behandeltes PBS | N/A | N/A | Spülen der Lendenwirbel L4 bis L5 vor der Sofortgefrierung in flüssigem Stickstoff. |
| Diethylstilbestrol | N/A | N/A | Positivkontrolle mit westlichem Medikament. Dosis: 0,04 mg/kg/Tag, 1 mL/100 g/Tag. Im übergeordneten Dokument liegt eine inkonsistente chinesische Nomenklatur vor, die als Diethylstilbestrol harmonisiert werden sollte. |
| Dioscorea opposita, Huai Shan Yao | Beijing Tongrentang | N/A | Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4. |
| dNTP-Gemisch | N/A | N/A | Bestandteil der Reversen Transkription. |
| ECL-Chemilumineszenzreagenz | N/A | N/A | Nachweismittel für Western Blot. |
| ELISA-Färbreagenz A | Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei | Kit-Komponente | Färbentwicklungsreagenz für ELISA. |
| ELISA-Färbreagenz B | Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei | Kit-Komponente | Färbentwicklungsreagenz für ELISA. |
| ELISA-Stopp-Lösung | Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei | Kit-Komponente | Wird verwendet, um die Farbreaktion im ELISA zu beenden. |
| Enzymmarkiertes ELISA-Reagenz | Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei | Kit-Komponente | Wird in nicht leere Wells im ELISA gegeben. |
| EphB4-Primärantikörper | Proteintech | N/A | Western-Blot-Antikörper. Verdünnung: 1:2000. RRID und Chargennummer sind für JoVE erforderlich. |
| EphB4-Primerpaar | N/A | PCR-Produkt 232 bp | Forward: CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Reverse: GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Tippfehler in der übergeordneten Tabelle: „Rat RphB4“ sollte „Rat EphB4“ lauten. |
| ephrinB2-Primärantikörper | Affinity Biosciences | N/A | Western-Blot-Antikörper. Verdünnung: 1:2000. RRID und Chargennummer sind für JoVE erforderlich. |
| ephrinB2-Primerpaar | N/A | PCR-Produkt 172 bp | Forward: CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Reverse: ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| Ethanol, absolut und abgestuft 95 %, 85 %, 75 % | N/A | N/A | Gradienten-Dehydrierung und -Rehydrierung während der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. |
| Weibliche Sprague-Dawley-Ratten | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Im Quellartikel nicht angegeben: Tierzertifikat und Lizenznummer | Spezifisch pathogenfrei, 6 Monate alt, gesunde nicht trächtige Weibchen. In der chinesischen Quelle: 230 bis 270 g; in einem früheren englischen Entwurf: 220 bis 250 g. Endgültigen Wertebereich vor Einreichung verifizieren. |
| GAPDH-Primärantikörper | Servicebio | N/A | Ladekontroll-Antikörper. Verdünnung: 1:2000. RRID und Chargennummer sind für JoVE erforderlich. |
| GAPDH-Primerpaar | N/A | PCR-Produkt 253 bp | Forward: ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Reverse: TTTGAGGGTGCAGCGAACTT. |
| GraphPad Prism-Software | GraphPad Software | Version 9.4.1; RRID:SCR_002798 | Statistische Analyse und Erstellung von Diagrammen. Normalverteilung, Varianzhomogenität, ANOVA, Bonferroni-Korrektur und Effektstärken müssen in den Ausgabedateien enthalten sein. |
| Gusukang-Granulat | Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | Positivkontrolle mit traditioneller chinesischer Medizin. Dosis: 1,8 g/kg/Tag oder 0,5 mL/100 g/Tag. |
| Hämatoxylin-Färbelösung | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Histologische Färbung. In der Quellprozedur: 5-minütige Hämatoxylin-Färbung. |
| Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge | N/A | TG16W | Zentrifugation für Serum- und Nukleinsäureverfahren. |
| Hologic Dual-Energy-Röntgenabsorptiometer | Hologic | N/A | Analyse der Knochendichte. In der Quelle werden in-vivo- und ex-vivo-Scans des Femurs berichtet. |
| ImageJ-Software | National Institutes of Health | RRID:SCR_003070 | Densitometrische Quantifizierung von Western-Blot-Banden. Version im Quellartikel nicht angegeben. |
| Induktionsherd | Midea | N/A | In der chinesischen Instrumententabelle aufgeführt. |
| Isfluran | N/A | N/A | Anästhesie für bilaterale Ovariiektomie und Positionierung für DXA. Der überarbeitete Protokollteil sollte Induktion, Aufrechterhaltung, Applikationsweg und Kriterien für die Anästhesietiefe spezifizieren. |
| Isopropanol | N/A | N/A | RNA-Präzipitation während der Extraktion. |
| Flüssiger Stickstoff | N/A | N/A | Sofortgefrierung der Lendenwirbelproben. |
| Lycium barbarum, Gou Qi Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 12 g, Verhältnis 4. |
| Mikroplattenreader | N/A | AMR-100 | Detektion der ELISA-Absorption bei 450 nm. |
| Mikroplattenwascher | N/A | APW-200 | Waschschritt für ELISA-Platten. |
| MMLV-Reversetranskriptase | N/A | N/A | Enzym für die Reverse Transkription. |
| Neutrales Einbettungsgummi | Sinopharm Group | N/A | Einbettmedium für Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Objektträger. |
| Physiologische Kochsalzlösung | N/A | N/A | Fahrzeug-Gavage für die Leerkontrolle, die Scheinoperation und die Modellgruppen. |
| Oligo(dT)18-Primer | N/A | N/A | Wird für die Reverse Transkription verwendet. |
| Penicillin | N/A | N/A | Postoperative Infektionsprophylaxe. Dosis: 20.000 U/kg intramuskulär über 3 Tage. |
| Druckkochtopf | Xinfei | N/A | In der chinesischen Instrumententabelle aufgeführt. |
| Proteaseinhibitor | N/A | N/A | Wird während der Proteingewinnung hinzugefügt. |
| Protein-Lysepuffer | N/A | N/A | Proteingewinnung aus Knochengewebe für Western Blot. |
| PVDF-Membran | N/A | N/A | Transfermembran für Western Blot, aktiviert durch Methanol. |
| qRT-PCR-Gerät | N/A | N/A | Quantitative reverse Transkription-PCR für EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP und GAPDH. |
| Rat CTX-1 ELISA-Kit | Jiyinmei | JYM0026Ra | Sandwich-ELISA für das C-terminale Telopeptid des Typ-I-Kollagens im Serum. Detektion bei 450 nm. |
| Rat P1NP ELISA-Kit | Jiyinmei | JYM0030Ra | Sandwich-ELISA für das N-terminale Propeptid des Prokollagens vom Typ I im Serum. Detektion bei 450 nm. |
| Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang | Beijing Tongrentang | N/A | Yin-nährende Komponente. Gesamtdosis in der Rezeptur: 24 g, Verhältnis 8. |
| RhoA-Primärantikörper | Proteintech | N/A | Western-Blot-Antikörper. Verdünnung: 1:2000. RRID und Chargennummer sind für JoVE erforderlich. |
| RhoA-Primerpaar | N/A | PCR-Produkt 177 bp | Forward: GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Reverse: ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminologie wurde von RHoA auf RhoA harmonisiert. |
| RNase-Inhibitor | N/A | N/A | Bestandteil der Reversen Transkription. |
| RNase-freies Wasser | N/A | N/A | Auflösung der RNA nach dem Trocknen. |
| Rotationsmikrotom | Leica | 2245 | Histologisches Schneiden. |
| Sekundärantikörper für Western Blot | N/A | N/A | Verdünnung: 1:15000. Wirtsreaktivität und RRID sind für JoVE erforderlich. |
| Magermilchpulver, 5% | N/A | N/A | Blockiermittel für Western Blot, 2 h bei Raumtemperatur. |
| Objektträger-Auftrags- und Backmaschine | Jinhua Yidi | N/A | Objektträgerpräparation für die Histologie. |
| Natriumpentobarbital, 3% | N/A | N/A | Letale Anästhesie vor der Blutentnahme aus der Bauchaorta im chinesischen Originaldokument. Endgültiges Euthanasieverfahren und Bestätigungsmethode müssen verifiziert werden. |
| Standardprobenverdünnungsmittel | Im ELISA-Kit enthalten, Jiyinmei | Kit-Komponente | Wird für serielle Verdünnungen der Standards im ELISA-Verfahren verwendet. |
| TBST-Puffer | N/A | N/A | Waschpuffer für Western Blot. |
| Thermostatischer Schüttelinkubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | N/A | Laborinkubation und Schütteln. |
| TRIzol-Reagenz | N/A | N/A | RNA-Extraktion aus 100 mg Knochengewebe. |
| Aufrechter Mikroskop | Leica | DM1000 | Histologische Hämatoxylin- und Eosin-Bildgebung bei 200facher Vergrößerung. |
| Wasserbad-Thermostatin kubator | N/A | GNP-9080 | Inkubation für Assay-Verfahren. |
| Wasserlösliche Eosin-Färbelösung | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Histologische Gegenfärbung. In der Quellprozedur: 3-minütige Eosin-Färbung. |
| Elektrophorese-System für Western Blot | N/A | N/A | Proteintrennung. Elektrophorese im Quellprotokoll: zunächst 80 V, dann 120 V. |
| Bildgebungssystem für Western Blot | N/A | N/A | Chemilumineszenz-Aufnahme der Membran. Für die Einreichung sind ungekürzte Membranbilder erforderlich. |
| Übertragungssystem für Western Blot | N/A | N/A | Proteinübertragung auf PVDF-Membran. Übertragungsbedingungen: 400 mA, 90 min, Eisbad. |
| Xylol | N/A | N/A | Entwachsen und Gewebeklärung während der Histologie. |
| Komponentenkräuter der Zuogui-Pille | Beijing Tongrentang | N/A | Acht-Kräuter-Formulierung: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, Gelatine aus Plastron von Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis und Gelatine aus Hirschgeweih von Cervus elaphus. |
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