Funktionelle Rekonstitution mitochondrialer respiratorischer Superkomplexe

Zusammenfassung

Wir stellen ein einfaches Protokoll zur Rekonstitution funktioneller mitochondrialer respiratorischer Superkomplexe in gut definierte Proteoliposomen für die korrelierte strukturelle und funktionelle Charakterisierung vor.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind zentrale Knotenpunkte des bioenergetischen Stoffwechsels und die primäre Quelle für ATP. Die innere mitochondriale Membran beherbergt das System der oxidativen Phosphorylierung, das aus den Komplexen der Atmungskette (CI, CII, CIII₂ und CIV) sowie der ATP-Synthase (CV) besteht. Bei Säugetieren bilden CI, CIII₂ und CIV höhergeordnete Strukturen, sogenannte Superkomplexe (SCs), wie SC I+III₂+IV, SC I+III₂ und SC III₂+IV. Obwohl die physiologischen Faktoren, die die Bildung von Superkomplexen begünstigen, noch nicht vollständig geklärt sind, wird vermutet, dass diese Assemblierung die Elektronentransferraten zwischen den Komplexen erhöhen, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies verringern oder unspezifische Proteinaggregation in der dicht gepackten inneren mitochondrialen Membran verhindern könnte. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen respiratorischer Superkomplexe stützten sich bisher stark auf mit Detergenzien extrahierte Komplexe. Zwar haben diese Studien das Verständnis der Atmungskette verbessert, doch die fehlende geschlossene Membranbilayer beschränkt die Möglichkeit, die funktionellen Vorteile der Superkomplexbildung zu untersuchen. Neuere Fortschritte haben jedoch gezeigt, dass Membranproteine in rekonstituierten, native-ähnlichen Membranumgebungen strukturell charakterisiert werden können, was einen physiologischeren Kontext für solche Analysen bietet. Hier stellen wir ein einfaches, schnelles und reproduzierbares Protokoll zur Rekonstitution respiratorischer Superkomplexe in Liposomen vor. Diese Methode ermöglicht es, die Auswirkungen unterschiedlicher Lipidzusammensetzungen, Protein-konzentrationen und Membranpotentiale auf die Funktion respiratorischer Superkomplexe zu testen und stellt somit ein wertvolles Werkzeug für zukünftige mechanistische Studien dar.

Einleitung

Mitochondrien sind zentral für die eukaryotische Atmung. Die innere mitochondriale Membran (IMM) beherbergt das System der oxidativen Phosphorylierung, das aus den Komplexen der Atmungskette (CI–CIV) und der ATP-Synthase (CV)¹ besteht. CI und CII übertragen Elektronen von reduzierten Substraten auf Ubichinon (CoQ) und erzeugen dabei Ubichinol (CoQH₂), das die Elektronen über CIII₂ und Cytochrom c an CIV weitergibt, wo Sauerstoff zu Wasser reduziert wird. Das Protonenpumpen durch CI, CIII₂ und CIV erzeugt die Protonenkraft (PMF), die von CV genutzt wird, um ATP aus ADP und anorganischem Phosphat (P) zu synthetisieren¹.

Neben ihrer unabhängigen Funktion können CI, CIII₂ und CIV zu höhergeordneten Superkomplex-(SC-)Strukturen mit definierten Stöchiometrien zusammenlagern, wie beispielsweise SC I+III₂+IV (auch bekannt als Respirasom), SC I+III₂ und SC III₂+IV^2,3,4,5. Die funktionellen Vorteile dieser Assemblierungen sind weiterhin unklar⁶. Hypothesen zu ihrer Funktion reichen von Aufgaben bei der Assembly und Substratkanalisierung bis hin zu der Annahme, dass sie ein Nebenprodukt der hohen Proteindichte in der inneren mitochondrialen Membran (IMM) darstellen^{3,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Neuere Studien deuten darauf hin, dass Membraneigenschaften, einschließlich hydrophober Fehlanpassung-induzierter Membranspannung, Protein-Protein-Wechselwirkungen und Protein-Lipid-Wechselwirkungen, zur Bildung und Stabilität von SCs beitragen¹⁶.

Struktur- und Funktionsstudien von Membranproteinen stützten sich traditionell auf detergentgelöste Komplexe, die die nativen Membranumgebungen stören und die Untersuchung von Prozessen, die von Membranpotential und Iongradienten abhängen, einschränken. Im Gegensatz dazu zeigen neuere Fortschritte, dass Membranproteine in rekonstituierten^17,18,19 oder nativen Membranen^20,21,22,23 strukturell charakterisiert werden können, was unsere Fähigkeit erheblich verbessert, funktionelle Mechanismen von Membranproteinen, die auf Membranpotential und Iongradienten angewiesen sind, zu untersuchen.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und reproduzierbare Methode zur Rekonstitution mitochondrialer respiratorischer Superkomplexe (SCs) in definierte Proteoliposomen. Das resultierende System stellt eine leistungsfähige Plattform dar, um grundlegende Fragen zur Bildung, Stabilität und Funktion respiratorischer SCs in einer kontrollierten, native ähnlichen Membranumgebung zu untersuchen. Durch die Einbindung von CoQ₁₀ und Cytochrom c während der Rekonstitution zeigen wir, dass die in Proteoliposomen rekonstituierten SCs einen NADH-getriebenen Sauerstoffverbrauch unterstützen, was darauf hinweist, dass die Komplexe in der Lipiddoppelschicht funktionsfähig bleiben. Wir zeigen weiterhin, dass SCs in Proteoliposomen mithilfe der kryogenen Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) leicht sichtbar gemacht werden können, wodurch eine direkte Korrelation zwischen struktureller Organisation und biochemischer Aktivität ermöglicht wird.

Obwohl die Methode robust und leicht reproduzierbar ist, hängt eine erfolgreiche Rekonstitution von einer sorgfältigen Optimierung der Lipidzusammensetzung, der Detergenzkonzentration, des Protein-zu-Lipid-Verhältnisses und einer effizienten Membranversiegelung ab, um die Stabilität und Aktivität der Suprakomplexe zu bewahren.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, eine integrierte strukturelle und funktionelle Analyse respiratorischer SCs unter definierten Membranbedingungen zu ermöglichen. Dieser Ansatz überwindet wesentliche Einschränkungen detergentenbasierter Systeme, indem er die SCs in eine geschlossene Lipiddoppelschicht zurückführt, die die Bildung eines Membranpotentials sowie physiologisch relevante Protein-Lipid-Wechselwirkungen unterstützt. Zudem erlaubt das System eine präzise Kontrolle über die Lipidzusammensetzung, Cofaktoren und den Proteingehalt und eignet sich daher besonders gut für systematische Untersuchungen darüber, wie Membraneigenschaften die Stabilität und Aktivität der SCs beeinflussen. Im Vergleich zu detergentenlöslichen Präparationen oder in situ-Ansätzen bietet diese Methode den klaren Vorteil, funktionelle Assays – wie die NADH-getriebene Sauerstoffverbrauchsmessung – mit der strukturbasierten Analyse mittels Kryo-EM zu kombinieren, wodurch Struktur-Funktions-Korrelationen ermöglicht werden, die mit anderen Systemen nur schwer erreichbar sind.

Protokoll

Schweineherz-mitochondriale Membranen wurden aus kommerziell erworbenem Herzt gewebe isoliert, das von Tieren stammte, die zur menschlichen Ernährung geschlachtet wurden. Es wurden keine lebenden Tiere speziell für dieses Protokoll verwendet. Die Verwendung dieses Materials wurde als von der Tiethikgenehmigung ausgenommen eingestuft, da das Gewebe als Nebenprodukt von Tieren gewonnen wurde, die zur menschlichen Ernährung geschlachtet wurden.

1. Reinigung des mitochondrialen Superkomplexes SC I+III₂/SC I+III₂+IV aus gewaschenen Membranen von Schweineherz-Mitochondrien

1. 40 mg (4 mL) gewaschene mitochondriale Membranen als Aliquote mit 10 mg/mL auftauen (die gewaschenen Membranen wurden wie zuvor beschrieben^24,25 hergestellt).
2. Die Membranen in 4 mL Puffer MX (30 mM HEPES, pH 7,7, 150 mM Kaliumacetat, 10 % Glycerin, 1 mM EDTA, 0,002 % (w/v) Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,1 % (w/v) CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat), 1 mM Kaliumferricyanid) verdünnen. 8 mL 2 %iger (w/v) Digitonin-Lösung in Puffer MX hinzufügen (160 mg Digitonin in 8 mL; Endverhältnis 4:1, mg Digitonin : mg Gesamtmembranprotein). Das Endvolumen beträgt 16 mL.
3. Manuell in einem Dounce-Homogenisator homogenisieren (50 Hub), dabei darauf achten, keine Blasen einzuschließen. 1 h bei 4 °C inkubieren (rotierend).
4. Das Homogenat 30 min bei 16.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Den Überstand sammeln.
5. Den Überstand mit einem Zentrifugalfilterkonzentrator mit einer Grenzgröße von 100 kDa bei 3.000 × g und 4 °C auf 1 mL konzentrieren. In Zyklen von jeweils 10 min konzentrieren, dabei zwischen den Zentrifugationsschritten gründlich mischen, bis das gewünschte Volumen erreicht ist (Proben neigen zur Aggregation, wenn sie zwischen den Zentrifugationsschritten nicht resuspendiert werden, da die lokale Konzentration des Detergens nahe der Filteroberfläche ansteigt).
6. Die konzentrierte Probe in vier Aliquote zu je 250 µL aufteilen. 
7. Die Größenausschlusschromatographiesäule (Säulenvolumen: 24 mL) mit Größenausschlusschromatographiepuffer (SEC-Puffer; 30 mM HEPES, pH 7,8, 150 mM Kaliumacetat, 1 mM EDTA, 0,005 % Glycosiddetergens) für 48 mL (2 Säulenvolumina) equilibrieren.
8. Das Chromatographieprogramm so einrichten, dass 1-mL-Fraktionen ab einem Elutionsvolumen von 6 mL gesammelt werden, bis ein Elutionsvolumen von 24 mL erreicht ist. Ein Aliquot von 250 µL (aus Schritt 1,6) auf eine 24 mL große Größenausschlusschromatographiesäule auftragen. Die zuvor mit Größenausschlusschromatographiepuffer equilibrierte Säule (aus Schritt 1,7) verwenden. Die Fraktionen vom Fraktionssammler sammeln, bevor der nächste Durchlauf beginnt.
9. Die Schritte 1,7 und 1,8 für die restlichen konzentrierten Aliquote aus Schritt 1,6 wiederholen.
10. Je 10 µL jeder Fraktion aus den SEC-Läufen zusammen mit 5 µL Blue-native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(BN-PAGE-)Ladepuffer auf einem 3–12 %igen Acrylamid-Gradienten laufen lassen und einen NADH/Nitrotetrazoliumblau-Chlorid-CI-In-Gel-Aktivitätsassay²⁶  durchführen, um die Fraktionen auf CI-Aktivität zu prüfen. 
    HINWEIS: Die respiratorischen SCs eluieren aus dem 24 mL großen vernetzten Agarose-Gelfiltrationsmedium bei einem Elutionsvolumen von etwa 11,5 mL.
11. Die Fraktionen, die im CI-In-Gel-Aktivitätsassay die maximale CI-Aktivität bei hohem Molekulargewicht zeigen, vereinigen. Die Probe wie in Schritt 1,5 beschrieben konzentrieren.
    HINWEIS: Die konzentrierten SCs in dem Glycosiddetergens Glyco-Diosgenin (GDN) können mit 30 % (v/v) Glycerin bei einer Endkonzentration von etwa 10 mg/mL in flüssigem N₂ gelagert werden. Aus 40 mg gewaschenem mitochondrialem Komplex ergaben sich 3,4 mg Gesamtprotein basierend auf einem BCA-Assay.

2. Herstellung der Lipidmischung

HINWEIS: Modifiziert aus zuvor veröffentlichten Protokollen^27,28. Chloroform ist toxisch, flüchtig und möglicherweise krebserregend. Nur in einer zugelassenen chemischen Abzugshaube unter Verwendung der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (PPE) handhaben. Pentan ist hochentzündlich. Von Zündquellen fernhalten. Nur in einer zugelassenen chemischen Abzugshaube unter Verwendung der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (PPE) handhaben. Entsorgen Sie organische Lösungsmittelabfälle gemäß den Vorschriften der institutionellen Arbeitssicherheit und Gesundheitsschutzrichtlinien (EH&S) in zugelassenen Behältern für halogenierte/nicht-halogenierte Lösungsmittelabfälle.

1. Bereiten Sie in einem Abzug getrennt Stammlösungen von 25 mg/mL POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin), POPE (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin) und CL (Kardiolipin: 1,3-Bis(sn-3’-phosphatidyl)-sn-glycerin; aus Rinderherzgewebe) in Chloroform vor. 
2. Bereiten Sie 10 mM CoQ₁₀ in Chloroform vor. Für 25 mg Gesamtlipidgemisch geben Sie 0,4 mL (10 mg) POPC, 0,4 mL (10 mg) POPE, 0,2 mL (5 mg) CL und 50 µL 10 mM CoQ₁₀ (endgültig 500 nmol CoQ₁₀ (20 nmol CoQ₁₀/mg Lipid)) aus den Stammlösungen in ein 13-mL-Glaskolben. Das endgültige Gewichtsverhältnis von POPC:POPE:CL beträgt 2:2:1.
3. Trocknen Sie das Gemisch unter einem Inertgasstrom (Argon oder Stickstoff) unter vorsichtigem Rotieren des Kolbens, um eine dünne Schicht des Lipidgemischs an den Wänden des Kolbens zu bilden, um das Chloroform zu entfernen. Trocknen Sie weitere 10 Minuten mit einem konstanten Strom von Inertgas.
4. Lösen Sie die getrocknete Lipidschicht erneut mit 1 mL Pentan auf und wiederholen Sie Schritt 2.3, um die Entfernung von restlichem Chloroform zu erleichtern.
5. Inkubieren Sie den getrockneten Lipidkolben über Nacht bei Raumtemperatur in einem Vakuum-Exsikkator, um die Lösungsmittel vollständig zu entfernen. 
6. Geben Sie 5 mL Proteoliposom-Puffer (PLB; 10 mM MOPS pH 7,4, 150 mM KCl) hinzu, um das Lipidgemisch erneut aufzuschlämmen, verschließen Sie den Kolben dicht, um Verschütten zu vermeiden, und wirbeln Sie vorsichtig, bis die Lipide vollständig solubilisiert sind (getrocknete Lipide sind nicht mehr auf der Oberfläche des Kolbens sichtbar).
7. Entfernen Sie die Versiegelung, füllen Sie den Kolben mit Inertgas (Argon oder Stickstoff), verschließen Sie ihn erneut und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur. Nach der 1-stündigen Inkubation portionieren Sie das Lipidgemisch in Aliquots zu je 300 µL und lagern Sie bei −20 °C. 
   HINWEIS: Die POPC:POPE:Kardiolipin-Mischung (2:2:1) wurde basierend auf empirischer Optimierung ausgewählt, da PE und Kardiolipin Hauptbestandteile der inneren mitochondrialen Membran sind; das Protokoll kann jedoch leicht angepasst werden, um alternative Lipidzusammensetzungen zu testen.

3. Rekonstitution von mitochondrialen SCs in Liposomen

1. SC-Aliquote, die in flüssigem N₂ gelagert wurden, auftauen  (Schritt 1.12) auf Eis. Führen Sie einen Pufferaustausch durch, um Glycerin aus der Probe zu entfernen, indem Sie die Probe in SEC-Puffer resuspendieren. Konzentrieren Sie die Probe mithilfe von Zentrifugalfiltern mit einer Grenzgröße von 100 kDa bei 3000 × g bei 4 °C. Zwischen den Konzentrationszentrifugationsschritten (alle ca. 5 min) weiterhin einen Pufferaustausch durchführen, indem die Probe in SEC-Puffer resuspendiert wird.
2. Überprüfen Sie die Endkonzentration des SC mithilfe eines BCA-Assays (ein Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit).
3. Tauen Sie eine 300 µeine Aliquot der in Schritt 2,7 hergestellten Lipidmischung und extrudieren Sie diese sechs Zyklen lang bei Raumtemperatur durch einen Extruder mit einer 100-nm-Polycarbonatmembran (ein Zyklus besteht aus dem Hin- und Zurückführen der Lipidmischung von der linken Spritze zur rechten und zurück). Nach Abschluss der Extrusionszyklen sammeln Sie die resultierenden 100-nm-Liposomen aus der Spritze gegenüber der Startseite. Alternativ können Liposomen durch Beschallung hergestellt werden. 
4. Geben Sie 9 hinzu µL von 20 % (w/v) Detergens (endgültige Konzentration 0,6 % w/v) zu 250 µL der extrudierten Lipidmischung in einem separaten Reagenzglas.
   HINWEIS: Es können verschiedene Detergenzien getestet werden. Natriumcholat, ein anionisches Gallensalz-Detergens, erwies sich für diese Experimente als am besten geeignet.
5. Durch Inversion mischen und bei 4 °C inkubieren °C für 30 min. 
6. Fügen Sie 120 hinzu µg (oder mehr) an mitochondrialem SC und 3 µL von 10 mM Cytochrom c (endgültige Konzentration von 100 µM) zur Mischung. Den Gesamtvolumen auf 300 µL mit PLB. Das endgültige Lipid:Protein-Verhältnis beträgt ungefähr 10:1 (w:w). Als zusätzliche Kontrolle werden parallel leere Liposomen erzeugt, indem anstelle von mitochondrialen SCs und Cytochrom SEC-Puffer (30 mM HEPES, pH 7,8, 150 mM Kaliumacetat, 1 mM EDTA, 0,005 % eines Glycosid-Detergens) zur Lipid-Detergens-Mischung gegeben wird. c. 
7. Durch Inversion mischen und bei 4 °C inkubieren °C für 30 min. 
8. Eine vorgefüllte Desalzierungsspin-Säule mit G-25-Harz viermal mittels Schwerkraftfluss mit PLB-Puffer waschen. Anschließend die Säule bei 1.000 × g für 2 min.
9. Geben Sie die Proteoliposom-Probe zur gewaschenen vorgepackten G-25-Resin-Desalzierungsspin-Säule hinzu und zentrifugieren Sie die Säule bei 1.000 × g bei 4 °C für 2 min, um das Detergens zu entfernen. Sammeln Sie das Eluat.
   HINWEIS: Liposomen, die durch Extrusion hergestellt wurden, wiesen eine gleichmäßigere Größenverteilung auf als solche, die durch Sonikation erzeugt wurden. Drehen Sie die vorgefüllte Desalzierungsspin-Säule nicht länger als vom Hersteller empfohlen, um eine Kontamination der Probe mit Detergens zu vermeiden. Proteoliposomen wurden bei 4 °C gelagert. °C und typischerweise innerhalb von 36 h verwendet, um einen potenziellen Aktivitätsverlust zu minimieren und die Integrität der Superkomplexe zu bewahren.

4. Lipid-Flotation-Assay²⁹

1. Stellen Sie Lösungen aus 27 % und 7 % (w/v) Saccharose in PLB her. Bereiten Sie ein Stufengradienten vor, indem Sie 1,5 mL der 27-%-Saccharoselösung und 0,9 mL der 7-%-Saccharoselösung in ein 3,5-mL-Zentrifugenröhrchen schichten.
2. Schichten Sie vorsichtig 300 µL Proteoliposomen (aus Schritt 3.9), die SC enthalten, auf das Saccharosegradienten. Zentrifugieren Sie die Gradienten bei 100.000 × g in einem Festwinkelrotor 2 h bei 4 °C.
3. Sammlen Sie sorgfältig neun Fraktionen à 300 µL (bzw. zehn Fraktionen à 270 µL) von oben nach unten (versuchen Sie, eine Vermischung zu vermeiden). Wird ein Pellet sichtbar, resuspendieren Sie es in der letzten Fraktion und sammeln es als Fraktion 9 oder 10. Nicht rekonstituiertes SC sollte sich in Fraktion 9 oder 10 anreichern.
   HINWEIS: Der Flotationstest dient dazu, rekonstituierte Proteoliposomen von leeren Liposomen und nicht rekonstituierten Proteinkomplexen zu trennen. Er wird zur Optimierung der Rekonstitution verwendet.

5. Spektroskopischer Ferricyanid-Aktivitätsassay für Komplex I und Komplex-I-In-Gel-Aktivitätsassay

1. Bereiten Sie die erforderliche Menge an Ferricyanid-Reaktionspuffer (FRB; 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,1 % w/v 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS), 1 mM Kaliumferricyanid) vor.
2. Pipettieren Sie 990 µL Reaktionspuffer in eine 1-mL-Küvette. Geben Sie 5 µL der Probe (aus jeder Gradientenfraktion) in die Küvette und fügen Sie anschließend 5 µL 20 mM NADH (endgültige Konzentration 100 µM) zur Reaktion hinzu. Verschließen Sie die Küvette mit durchsichtiger Folie und mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen.
3. Überwachen Sie die Abnahme der Extinktion bei 340 nm bei 25 °C in einem Spektrometer. Der Abfall der Extinktion bei 340 nm zeigt die Oxidation von NADH an. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Fraktionen im Dreifachansatz. Verwenden Sie 5 µL PLB anstelle der Probe, um die Blindprobe aufzunehmen.
4. Berechnen Sie die Rate der NADH-Oxidation nach Subtraktion der Blindprobe und tragen Sie die Gesamtaktivität jeder Fraktion grafisch dar.
   HINWEIS: Alternativ kann das Experiment in einer 96-Well-Platte durchgeführt werden.
5. Sammeln Sie die Fraktionen mit der maximalen Gesamtaktivität (vermeiden Sie Fraktionen am Röhrchenboden, die Aktivität aufweisen, da diese nicht rekonstituiertes Protein enthalten). Verdünnen Sie die gesammelten Fraktionen mit PLB auf ein Gesamtvolumen von 20 mL, um Saccharose zu verdünnen.
6. Zentrifugieren Sie die Proben bei 150.000 × g, 4 °C, 1 h in einem Festwinkelrotor. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 µL PLB.
7. Mischen Sie 25 µL des resuspendierten Pellets aus dem vorherigen Schritt mit 25 µL 2 %iger Digitonin-Lösung (w/v) in PLB und inkubieren Sie (unter Schütteln) bei 4 °C für 1 h.
8. Zentrifugieren Sie die nicht extrahierten Proteine bei 16.000 × g für 20 min. Sammeln Sie den Überstand.
9. Geben Sie 10 µL BN-PAGE-Ladefarbstoff zu 30 µL des Überstands und laden Sie die Probe auf ein 3–12 %iges Gradienten-BN-PAGE-Gel. Führen Sie zwei Gele durch, um die in-Gel-Aktivitätsassays für CI und CIV durchzuführen²⁶.
10. Führen Sie das Gel 30 min bei 150 V mit dunklem BN-PAGE-Puffer (25 mM Tris, 0,192 g Glycin, 200 mg Coomassieblau) durch. Wechseln Sie den dunkelblauen Puffer zu einem hellblauen Puffer (25 mM Tris, pH 8,3, 0,192 g Glycin, 20 mg Coomassieblau) und laufen Sie weitere 2 h bei 200 V.
11. Nach Beendigung des Laufs übertragen Sie die Gele in einen geeigneten Behälter und führen Sie die in-Gel-Aktivitätsassays für CI und CIV durch²⁶.
    HINWEIS: Für strukturelle und funktionelle Untersuchungen von in Liposomen rekonstituierten Komplexen verwenden Sie die verbleibenden resuspendierten Proteoliposomen aus Schritt 5,6. Sobald die Rekonstitution vollständig optimiert ist, können Schritte 4 und 5 übersprungen und die rekonstituierten Proteoliposomen direkt aus Schritt 3 verwendet werden.

6. ACMA-Fluoreszenzlöschungs-Assay zur Bestimmung der Membranintegrität der rekonstituierten Proteoliposomen²⁹

1. Bereiten Sie die erforderliche Menge an ACMA-(9-Amino-6-chlor-2-methoxyacridin-)Reaktionspuffer vor (10 mM MOPS pH 7,4, 15 mM KCl, 4 µM ACMA, 0,5 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA), 2 mM 2-Mercaptoethanol). 
2. Pipettieren Sie 930 µL Reaktionspuffer in eine 1-mL-Küvette. Geben Sie 50 µL der rekonstituierten Proteoliposomen in die Küvette, verschließen Sie die Küvette und mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen. Inkubieren Sie 8 min im Dunkeln.
3. Stellen Sie die Spektrometer-Parameter ein auf: Anregungswellenlänge 410 nm, Emissionswellenlänge 490 nm. 
4. Nach der Inkubation mischen Sie die Küvette erneut durch Umstülpen und messen Sie die Fluoreszenz bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 8 min am Spektrometer.
5. Geben Sie 4 µL von 20 µM Valinomycin (endgültige Konzentration 80 nM) zur Küvette hinzu, mischen Sie durch Umstülpen und messen Sie 8 min lang.
6. Geben Sie 6 µL von 1 mM CCCP (Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon) (endgültige Konzentration 6 µM) zur Küvette hinzu, mischen Sie durch Umstülpen und messen Sie 8 min lang.
7. Um eine Kontrolle mit leeren Vesikeln durchzuführen, wiederholen Sie die Schritte 6,2–6,6, ersetzen Sie dabei die rekonstituierten Proteoliposomen durch „leere Liposomen“. Leere Liposomen werden durch die gleichen Schritte wie die rekonstituierten Proteoliposomen hergestellt, wobei jedoch SEC-Puffer anstelle der Zugabe von SCs während der Rekonstitution (Schritt 3,6) verwendet wird.
8. Wiederholen Sie die Messung jeweils im Dreifachansatz sowohl für die rekonstituierten Proteoliposomen als auch für die leeren Liposomen und tragen Sie deren relative Fluoreszenz über der Zeit auf.
   HINWEIS: Die Daten von entweder rekonstituierten Proteoliposomen oder leeren Liposomen werden nach dem Faktor (F_i − F_min)/(F_max−F_min) skaliert, wobei F_max der Ausgangsbasislinien-Fluoreszenzwert dieser Probe und F_min der niedrigste Basislinienwert dieser Probe nach Zugabe von CCCP ist.
   WARNUNG: CCCP ist ein toxischer mitochondrieller Entkoppler und muss unter Verwendung von Handschuhen in einem Abzug gehandhabt werden.

7. Respirometrische Messungen des Sauerstoffverbrauchs zur Beurteilung der Funktion rekonstituierter SCs³⁰.

HINWEIS: Die Sauerstoffverbrauchsrate wird mithilfe eines Sauerstoffelektrodensystems vom Clark-Typ gemessen. Die Funktionsanalysen der rekonstituierten SCs werden direkt am Eluat aus der Entsalzungssäule durchgeführt (Schritt 3.9).

1. Richten Sie das Sauerstoffelektrodensystem gemäß den Herstelleranweisungen ein und öffnen Sie die Instrumentensteuerungssoftware. Geben Sie 2 mL ultrareines Wasser in die Messkammer.
2. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit so ein, dass die Sauerstoffkonzentrationskurve konstant bleibt, wenn die Rührgeschwindigkeit erhöht wird (beginnen Sie bei 10, erhöhen Sie in Schritten von 10). Entfernen Sie das MQ-Wasser und fügen Sie mit Sauerstoff angereichertes Wasser hinzu (MQ-Wasser in einer Flasche, kräftig geschüttelt).
3. Klicken Sie auf Kalibrieren > Flüssigphasenkalibrierung > luftgesättigtes Wasser und warten Sie, bis die Kalibrierung stabil ist (Rate 0 nmol pro Minute). Geben Sie mit einem kleinen Spatel einige (4–6) Kristalle Natriumdithionit in das Reaktionsgefäß, um einen Sauerstoffgehalt von null in der Kammer zu erreichen.
4. Warten Sie, bis das Signal einen Plateauwert erreicht hat, bevor Sie fortfahren. Speichern Sie die Kalibrierung und reinigen Sie die Reaktionskammer mit 5 × 1 mL 70 %igem Ethanol, mit 5 × 1 mL 0,1 mM EDTA, mit 5 × 1 mL MQ-Wasser und mit 5 × 1 mL Oxygraph-Reaktionspuffer (ORB; 150 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7,4, 5 mM MgCl₂, 5 mM KH₂PO₄, 0,02 mM EGTA, 0,5 mg/mL BSA).
5. Geben Sie 2 mL ORB hinzu, klicken Sie in der Software auf „Messung starten“ und warten Sie, bis die Kurve stabil ist. Während Sie Proteoliposomen (Probe) in die Reaktionskammer geben, kennzeichnen Sie die Kurve in der Software, um die Zugabe der Probe anzuzeigen.
   HINWEIS: Die Proteinmenge in der Proteoliposomprobe wird anhand der Gesamtmenge an Protein geschätzt, die den Liposomen zugesetzt wurde. Ein Protein:Lipid-Verhältnis von 1:12 und eine Endkonzentration von 50 µg/mL Protein in der Kammer des Sauerstoffelektrodensystems (2 mL) erwies sich als am besten geeignet. Die genaue Ausbeute an Proteoliposomen wurde nicht gemessen.
6. Nachdem die Messung des Sauerstoffelektrodensystems stabil ist, geben Sie NADH in die Reaktionskammer und kennzeichnen Sie gleichzeitig die Zugabe in der Software. Fahren Sie 5 Minuten lang mit der Messung fort.
7. Geben Sie CCCP hinzu, markieren Sie die Zugabe in der Software und fahren Sie 5 Minuten lang mit der Messung fort.
8. Geben Sie einen Inhibitor (z. B. CI-Inhibitor (Piericidin A) oder CIII₂-Inhibitor (Myxothiazol) oder CIV-Inhibitor (NaN₃)) hinzu, kennzeichnen Sie dies in der Software, messen Sie weitere 2 Minuten lang und beenden Sie dann die Aufzeichnung. 
9. Speichern Sie die Kurve und reinigen Sie die Reaktionskammer mit 5 × 1 mL 70 %igem Ethanol, 5 × 1 mL 0,1 mM EDTA, 7 × 1 mL MQ-Wasser und 5 × 1 mL ORB, bevor Sie eine weitere Messung durchführen.
10. Um die Daten auf die Hintergrundrate zu korrigieren, berechnen Sie die Hintergrundrate, d. h. die Steigung der Kurve vor der Zugabe von NADH, und extrapolieren Sie diese linear über den gesamten Messzeitraum, um für jeden Zeitpunkt eine erwartete Hintergrund-[O₂] zu berechnen. Subtrahieren Sie anschließend die extrapolierte Hintergrund-[O₂] von den gemessenen [O₂]-Werten für jeden Zeitpunkt.
11. Berechnen Sie die Sauerstoffverbrauchsraten (OCRs) als Steigung der auf die Hintergrundrate korrigierten [O₂]-Konzentrationsmessungen nach der Zugabe jedes Reagenz.
12. Um die Raten relativ zur OCR nach Zugabe von NADH zu berechnen, dividieren Sie für jede einzelne Kurve jede gemessene OCR (z. B. OCR nach Zugabe von NADH, CCCP bzw. Inhibitor) durch die OCR, die nach Zugabe von NADH gemessen wurde.     
    HINWEIS: VORSICHT: Natriumdithionit ist ein starkes Reduktionsmittel und kann heftig mit Oxidationsmitteln oder Feuchtigkeit reagieren. Verwenden Sie Handschuhe. Entsorgen Sie Abfälle, die Inhibitoren enthalten, gemäß den institutionellen Richtlinien als gefährlicher chemischer Abfall.

8. Abschätzung der Größe der rekonstituierten Liposomen mittels dynamischer Lichtstreuung

1. Schalten Sie das Gerät für die dynamische Lichtstreuung (DLS) ein und warten Sie ca. 30 Minuten, bis der Laser stabilisiert ist.
2. Starten Sie die Software zur Datenaufnahme und schließen Sie alle vorherigen Dateien.
3. Filtrieren Sie die Proteoliposomen (0,2 μm), um Partikel zu entfernen.
4. Geben Sie 70 µL der Proteoliposomen in eine saubere Küvette, wobei Fingerabdrücke oder Verschmierungen vermieden werden sollten.
5. Platzieren Sie die Küvette im Gerät und schließen Sie den Deckel sicher.
6. Erstellen Sie eine neue Datei und wählen Sie Manuelle Messung > Größe.
7. Stellen Sie die Temperatur auf 25 °C ein und lassen Sie den Dämpfungsindex auf Automatik.
8. Definieren Sie die Eigenschaften des Dispersionsmittels (Viskosität und Brechungsindex; z. B. RI = 1,330 für Wasser/Puffer).
9. Legen Sie die Aufnahmeparameter fest (automatische Dauer, ca. 3 Messungen, Verarbeitung für allgemeine Anwendungen).
10. Starten Sie die Messung und überwachen Sie Größe, Polydispersitätsindex (PDI) und Zählrate (Ziel: ca. 100–500 kcps).
11. Analysieren Sie die Ergebnisse: Überprüfen Sie die Größenverteilung (Intensität/Volumen), den PDI (akzeptabel: <0,3) und die Qualität der Autokorrelation (glatter Abfall, stabile Basislinie); speichern Sie die Daten.

9. Vorbereitung und Untersuchung von Gittern für die Kryoelektronenmikroskopie

1. Verwenden Sie die Proteoliposom-Probe aus Schritt 5.11 (oder Schritt 3.9, wenn die Schritte 4 und 5 übersprungen werden), um die EM-Gitter vorzubereiten. Konzentrieren Sie die Proteoliposomen gegebenenfalls, indem Sie Schritt 5.6 wiederholen und in einem kleineren Volumen PLB resuspendieren.
2. Plasma-Behandeln Sie mit Löchern versehene, mit Kohle beschichtete Kupfergitter (300 mesh) 90 s bei 20 mA im Plasma-Reinigungssystem unter Verwendung von Luft.
3. Richten Sie ein automatisiertes Tauchgefriermikroskop-System für das Eintauchgefrieren bei 95 % Luftfeuchtigkeit und 15 °C mit folgenden Parametern ein: Abblotzeit 10 s, Abblotkraft −8, Wartezeit 10 s und Abtropfzeit 0.
4. Befestigen Sie die Pinzette mit dem plasmabehandelten Gitter am Tauchgefriermikroskop-System.
5. Geben Sie 4,0 µL der Proteoliposom-Probe auf das plasmabehandelte Gitter eines automatischen Tauchgefriermikroskops.
6. Inkubieren Sie die Gitter 10 s, bevor Sie 10 s abgeblottet und in flüssigem Ethan schockgefroren werden. Überführen Sie die Gitter vorsichtig in die Gitterbox in der flüssigen N₂-Kammer und anschließend in den flüssigen N₂-Lagertank.
7. Laden Sie die gefrorenen Gitter und führen Sie eine Untersuchung an einem Transmissionselektronenmikroskop mit kryogener Probenaufnahme durch. Es wurde ein Transmissionselektronenmikroskop mit Direktdetektor für Elektronen verwendet.
8. Richten Sie das Mikroskop gemäß den Herstelleranweisungen ein und untersuchen Sie die Gitter auf rekonstituierte Proteoliposomen. Speichern Sie die Aufnahmen.
   HINWEIS: VORSICHT: Flüssiges Ethan ist hochentzündlich und kryogen; handhaben Sie es mit geeigneter PSA und fern von Zündquellen, um Brand- und Kälteverletzungen zu vermeiden. Flüssiger Stickstoff ist kryogen und kann schwere Kälteverbrennungen sowie Sauerstoffverdrängung verursachen. Handhaben Sie ihn mit geeigneter kryogener PSA und verwenden Sie ihn nur in gut belüfteten Bereichen.

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll bestimmten wir die optimalen Rekonstitutionsbedingungen für mitochondriale Superkomplexe (SCs), die aus Schweineherz-Mitochondrien isoliert wurden (Abbildung 1A,B). Das Protokoll mit dem sukzessiven Saccharose-Gradienten trennt effektiv rekonstituierte Proteoliposomen von leeren Vesikeln und nicht eingebauten Proteinen und ermöglicht eine schnelle Testung sowie Optimierung der Bedingungen. Die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 2 zeigen einen Gradienten mit der aufgetragenen Probe vor und nach der Zentrifugation. Zusätzlich optimierten wir das zur Rekonstitution der respiratorischen SCs in Liposomen verwendete Detergens. Vier verschiedene Detergentien – ein anionisches Gallensalz-Detergens, CHAPS, Digitonin und ein Glycosid-Detergens – wurden separat für die Rekonstitution mit den SCs verwendet. Die gesamte CI-Aktivität in den Fraktionen wurde mittels NADH-Ferricyanid-Oxidoreduktions-Assay für jedes getestete Detergens gemessen (Abbildung 3A–D). Bei erfolgreichen Rekonstitutionen wurde die maximale Aktivität von CI in Fraktionen an der Grenzfläche der beiden Saccharosekonzentrationen (27 % w/v Saccharose und 7 % w/v Saccharose) beobachtet. Auffällig ist, dass bei anionischem Gallensalz-Detergens und CHAPS nur minimale Aktivität in Fraktion ^#10 nachweisbar ist, während Fraktion ^#10 sowohl bei Digitonin als auch bei Glycosid-Detergens eine beträchtliche Aktivität aufweist, was darauf hindeutet, dass Digitonin und ein Glycosid-Detergens die Superkomplexe nicht effektiv in die Liposomen einbauen. Für alle nachfolgenden Rekonstitutionen wurde ein anionisches Gallensalz-Detergens verwendet.

Der CI- und CIV-In-Gel-Aktivitätsnachweis, durchgeführt an einem Blue-Native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel von mit Digitonin extrahierten POPC:POPE:CL-(2:2:1)-Proteoliposomen, zeigt die relativen Mengenverhältnisse der SCs und einzelner ETC-Komplexe nach Rekonstitution (Abbildung 4). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen CI und CIII₂ in den Proteoliposomen nach erneuter Extraktion mit Digitonin und BN-PAGE weitgehend erhalten bleibt. Obwohl eine gewisse CIV-Aktivität im Superkomplex-Band vorhanden ist, wird zusätzlich ein starkes Signal bei niedrigerem Molekulargewicht beobachtet, das mit CIV allein übereinstimmt und auf eine Dissoziation hindeutet. Die Membranleckage der rekonstituierten Liposomen wurde mittels ACMA-Fluoreszenzlöschungs-Assay gemessen und zeigte, dass die Proteoliposomen für Protonen nicht signifikant durchlässig waren (Abbildung 5A,B). Die Größe der rekonstituierten Liposomen wurde mittels DLS abgeschätzt und ergab, dass die Extrusion vor der Rekonstitution zu einer endgültigen Größenverteilung der Proteoliposomen von 82,9 ± 0,8 nm Durchmesser für leere Vesikel und 110,6 ± 0,4 nm für rekonstituierte Superkomplex-Proteoliposomen (RSPs) führt (Abbildung 6). Der Sauerstoffverbrauch der Proteoliposomen wurde zur Beurteilung der SC-Funktion herangezogen und zeigte einen deutlichen, inhibitor-sensitiven, NADH-getriebenen Sauerstoffverbrauch (Abbildung 7A). Die Auftragung der OCRs relativ zur OCR nach Zugabe von NADH gibt Aufschluss über den Grad der Kopplung innerhalb der RSPs, d. h., die OCR steigt nach Zugabe von CCCP im Vergleich zur alleinigen Zugabe von NADH um einen Faktor von etwa 1,5 an (Abbildung 7B). Die untersuchten Kryo-EM-Gitter ermöglichten die Visualisierung der SCs in der Proteoliposomenmembran und bestätigten somit die erfolgreiche Rekonstitution (Abbildung 8A–I).

Abbildung 1: Isolierung und Charakterisierung von detergentenlöslichen Suprakomplexen aus Schweineherz-Mitochondrien. (A) Repräsentatives Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Reinigung von mit Digitonin extrahierten membranständigen mitochondrialen Komplexen aus Schweineherz. (B)  Blue-native PAGE (BN-PAGE) von Fraktionen aus A, visualisiert durch CI-In-Gel-Aktivitätsfärbung. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Sucrose-Stufengradienten mit Proteoliposomen. Vor der Zentrifugation (links), nach der Zentrifugation (rechts) bei 100.000 × g für 2 h in einem Ultrazentrifugen. Die auf den Gradienten aufgetragene Proteoliposomenprobe wird in leere Vesikel, Proteoliposomen und am Boden aggregiertes Protein getrennt. Anschließend wird dieser Gradient wie beschrieben fraktioniert. Der ungefähre Bereich jeder Fraktion ist angegeben und beschriftet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Schwimmtest zur Beurteilung der Rekonstitutions-Effizienz in verschiedenen Detergenzien. CI-NADH-Ferricyanid-Aktivität in den Fraktionen des sukzessiven Saccharose-Gradienten nach Rekonstitution mit (A) anionischem Gallensalz-Detergens, (B) 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) (0,6 % (w/v)), (C) Digitonin (0,6 % w/v), (D) Glykosid-Detergens (GDN) (0,6 % (w/v)). Fraktion ^#10 wird durch Resuspendierung eventuell vorhandenen Pellets der letzten Fraktion erhalten. Aktivität in Fraktion ^#10 weist darauf hin, dass die Proteine nicht rekonstituiert wurden. n = 3; die Fehlerbalken zeigen die SD = Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: In-Gel-Aktivitätsanalyse an mit Digitonin extrahierten Proteoliposomen, die auf 3 %–12 % BN-Page aufgetrennt wurden. CI (links) und CIV (rechts) In-Gel-Aktivitätsanalyse. R = Respirasom (SC I+III₂+IV), SC_1,3 (SC I+III₂), IGA CI = (CI In-Gel-Aktivitätsanalyse); IGA = In-Gel-Aktivitätsanalyse CIV = (CIV In-Gel-Aktivitätsanalyse). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: ACMA-Fluoreszenzlöschungs-Assay zum Nachweis von Protonenleckage in rekonstituierten Proteoliposomen. Mit einem pH-sensitiven Farbstoff (ACMA) wurde der innere pH-Wert von rekonstituierten Proteoliposomen (cyan) mit dem von leeren Liposomen (orange) nach schrittweiser Zugabe von Valinomycin und CCCP verglichen. Dargestellt sind repräsentative ACMA-Fluoreszenzverläufe, die aus verschiedenen Proteoliposomen-Präparationen zur Gegenüberstellung gewonnen wurden. (A) Rekonstituierte Liposomen mit geschädigter Membran (leckend). (B) Rekonstituierte Liposomen mit intakter Membran. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: DLS-Messungen von leeren Liposomen und rekonstituierten SC-Proteoliposomen. Die durchschnittlichen volumengewichteten Größenverteilungen von extrudierten leeren Liposomen (orange) und SC-rekonstituierten Proteoliposomen (cyan) sind dargestellt. Die Messungen wurden als drei technische Wiederholungen durchgeführt. Leere Liposomen weisen einen durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von 82,9 ± 0,8 nm auf, während RSPs einen durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von 110,6 ± 0,4 nm aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Sauerstoffverbrauchs-Assays zur Beurteilung der Kopplung rekonstituierter SCs in Liposomen. Der Sauerstoffverbrauch wurde gemessen, um die respiratorische Aktivität und die Kopplung der ETC-Komplexe nach Rekonstitution in durch Extrusion hergestellte Liposomen zu bewerten. (A) Repräsentativer, hintergrundkorrigierter Sauerstoffelektroden-Trace, der die Änderungen der Sauerstoffkonzentration nach sequentieller Zugabe von NADH zur Initiierung der CI-getriebenen Atmung, CCCP zur Aufhebung des Protonengradienten und Messung der maximalen entkoppelten Sauerstoffverbrauchsrate (OCR), Piericidin A zur Hemmung von CI, Antimycin A zur Hemmung von CIII₂ oder NaN₃ (Azid) zur Hemmung von CIV zeigt. (B) Quantifizierung der OCR unter den angegebenen Bedingungen, korrigiert gemäß Schritt 7.10. Es werden Datenpunkte relativ zur OCR nach Zugabe von NADH für jeden Trace zusammen mit dem Mittelwert ± SD (Fehlerbalken) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: Kryo-EM-Visualisierung rekonstituierter SCs in Proteoliposomenmembranen. (A–C) Repräsentative Elektronenmikrografien von untersuchten Gittern, die rekonstituierte SCs in Assoziation mit Proteoliposomenmembranen zeigen. Rekonstituierte SCs sind mit gelben Pfeilen markiert. Maßstabsbalken = 50 nm. (D–I) Repräsentative SC-Partikel, die in höherer Vergrößerung auf den Proteoliposomenmembranen betrachtet wurden. Maßstabsbalken = 10 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Es wird eine einfache und reproduzierbare Methode zur Rekonstitution mitochondrialer respiratorischer Superkomplexe (SCs) in definierte Proteoliposomen vorgestellt, die eine kontrollierte Untersuchung ihrer Struktur und Funktion ermöglicht. Mehrere Schritte in diesem Protokoll sind entscheidend für eine erfolgreiche Rekonstitution. Nach unseren Erfahrungen weisen durch Extrusion hergestellte Liposomen eine gleichmäßigere Größenverteilung (bewertet mittels dynamischer Lichtstreuung) auf als solche, die durch Beschallung erzeugt wurden. Eine effiziente Entfernung des Detergens mithilfe einer vorgepackten Desalzierungsspinnsäule ist entscheidend, um die Membranversiegelung und die korrekte Einlagerung der SCs in eine Lipiddoppelschicht zu fördern; unvollständige Entfernung kann zu undichten oder instabilen Proteoliposomen führen. Die Optimierung der Lipidzusammensetzung, des Protein-zu-Lipid-Verhältnisses und der Wahl des Detergens ist ebenso wichtig, da diese Parameter die Rekonstitutionseffizienz und die Stabilität der SCs stark beeinflussen. Der Saccharosegradienten-Schwimmtest eignet sich zur ersten Optimierung; sobald jedoch geeignete Bedingungen etabliert sind, ist es vorzuziehen, die Proteoliposomen direkt nach der vorgepackten Desalzierungsspinnsäule für nachgeschaltete strukturelle und funktionelle Analysen zu verwenden, um Probenvolumenverlust und Störungen während der Gradientenfraktionierung zu vermeiden. Das zur Beobachtung der Aktivität erforderliche Probenvolumen variiert zwischen verschiedenen Präparationen. Passen Sie das Volumen entsprechend für unterschiedliche Präparationen an, das der Reaktionsmischung zugegeben wird. Die Orientierung des respiratorischen SC in der Proteoliposomenmembran kann die respiratorischen Messungen erheblich beeinflussen. Das Rekonstitutionsverfahren wurde nicht dahingehend optimiert, eine einheitliche Topologie sicherzustellen; daher ist zwar eine gemischte Population an Orientierungen zu erwarten, aber CI-Ferricyanid-Zugänglichkeitsassays deuten auf eine deutliche Vorzugsorientierung der peripheren CI-Arme nach außen hin.

Die Orientierung der rekonstituierten Superkomplexe wurde experimentell überprüft, und die CI-Ferricyanid-Aktivität wurde in Gegenwart und Abwesenheit des Detergens gemessen. In intakten RSPs kann extern zugegebenes NADH nur auf CI-Moleküle zugreifen, deren peripherer Arm dem äußeren Medium zugewandt ist, während die Detergens-Permeabilisierung den Zugang von NADH zu allen Komplexen ermöglicht. Daher schätzt dieser Test den Anteil funktionell zugänglicher CI-peripherer Arme, die dem äußeren Medium zugewandt sind, und liefert keine vollständige strukturelle Bestimmung der Proteoliposom-Topologie. Der Vergleich der unter diesen Bedingungen gemessenen Aktivitäten zeigte, dass 83,1 % ± 0,04 % der Respirasomen (der SC) mit dem CI-peripheren Arm nach außen orientiert waren, was eine signifikante Orientierungsneigung während der Rekonstitution aufzeigt.

Mehrere Modifikationen und Fehlerbehebungsstrategien können die Reproduzierbarkeit und Stabilität verbessern. In-Gel-Aktivitätsassays für CI und CIV, die an mit Digitonin extrahierten gepoolten Fraktionen aus Saccharosegradienten durchgeführt wurden, zeigen Banden für SC, was darauf hinweist, dass SC während der Rekonstitution nicht vollständig dissoziiert. Die SC-Bande ist jedoch im Aktivitätsgele für CI stärker ausgeprägt als im Aktivitätsgele für CIV, was darauf hindeutet, dass sich CIV nach der Rekonstitution teilweise von CI und CIII₂ lösen könnte (Abbildung 4). Eine Anpassung der Lipidzusammensetzung könnte die Stabilität des SC verbessern. Eine teilweise Dissoziation von CIV könnte auch auf die Wahl des Detergens oder eine zu schnelle Entfernung des Detergens während der Rekonstitution zurückzuführen sein, was schwächere Protein-Protein-Interaktionen innerhalb des Suprakomplexes destabilisieren könnte. Eine weitere Optimierung der Bedingungen für den Detergensaustausch könnte die Retention von CIV verbessern. Darüber hinaus kann die Minimierung mechanischer Belastung, das Vermeiden unnötiger Reinigungsschritte und eine sorgfältige Handhabung der Proben dazu beitragen, die Integrität der Proteoliposomen zu bewahren. Bei funktionellen Assays ist es entscheidend, dass die Proteoliposomen vollständig versiegelt sind, da eine durchlässige Membran die Kopplung an den transmembranären Protonengradienten verhindert. Für die Probenvorbereitung in der Kryo-EM ist die Verwendung von kontinuierlich karbonbedampften Gittern wichtig, da sich dadurch die Partikelverteilung innerhalb der Gitterlöcher verbessert¹⁹.

Trotz seiner Vorteile weist dieser Ansatz Grenzen auf. Proteoliposomen rekapitulieren die Zusammensetzung und dynamische Komplexität der nativen inneren mitochondrialen Membran nicht vollständig, und die partielle Dissoziation von SC-Komponenten, insbesondere CIV, bleibt eine Herausforderung. Funktionelle Messgrößen können ebenfalls durch unvollständige Kopplung oder Heterogenität in der Rekonstitutions-Effizienz beeinflusst werden. Dennoch erhält diese Methode im Vergleich zu detergentenlöslichen Systemen Lipid-Protein-Interaktionen bei und bietet eine membranähnliche Umgebung, während sie eine größere experimentelle Kontrolle als in situ-Ansätze ermöglicht. Als solche stellt sie eine wertvolle Plattform für die systematische Untersuchung dar, wie die Lipidzusammensetzung und Membraneigenschaften die Stabilität und Aktivität des SC regulieren.

Das Verständnis dieser Beziehungen ist besonders wichtig, da eine Störung der Organisation respiratorischer Superkomplexe mit einer Vielzahl von mitochondrialen und Stoffwechselstörungen in Verbindung gebracht wurde^{31,32,33,34,35,36,37,38,39,40}. Defekte in der Zusammenlagerung der ETC-Komplexe, der Kardiolipin-Synthese oder der Lipid-Umbildung, wie sie bei Erkrankungen wie dem Leigh-Syndrom^{41,42,43,44,45,46,47}, dem Barth-Syndrom^{48,49,50,51,52,53,54} und dem Sengers-Syndrom⁴⁸ beobachtet werden, können Superkomplexe destabilisieren, den Elektronentransfer beeinträchtigen, die ATP-Produktion verringern und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies erhöhen. Diese bioenergetischen Defekte betreffen überproportional gewebe mit hohem Energiebedarf wie Herz, Skelettmuskel und Gehirn und führen zu Phänotypen wie Kardiomyopathie, Belastungsintoleranz und Neurodegeneration^36,37,38. Umgekehrt legen neuere Erkenntnisse nahe, dass die Bildung von Superkomplexen unter Stress kompensatorische und schützende Funktionen übernehmen kann, indem sie die ETC-Komplexe stabilisieren und die pathologische ROS-Produktion begrenzen^55,56. Die hier beschriebene rekonstituierte Proteoliposom-Plattform bietet ein kontrolliertes System, um direkt zu untersuchen, wie krankheitsassoziierte Lipid-Umbildungen, Mutationen oder pharmakologische Eingriffe die Zusammensetzung und Funktion von Superkomplexen verändern, wodurch mechanistische Studien zur mitochondrialen Dysfunktion ermöglicht und zukünftige therapeutische Strategien unterstützt werden.

Niedrige Sauerstoffverbrauchsraten können auf eine schlechte Einbindung in Suprakomplexe, eine partielle Dissoziation von CIV, Reste von Detergens, unzureichende Konzentrationen an CoQ₁₀ oder Cytochrom c, degradiertes NADH oder eine geringe Protein­konzentration in der Oxygraph-Kammer zurückzuführen sein. Bestätigen Sie die Rekonstitution durch einen Flotationstest oder BN-PAGE, überprüfen Sie die Integrität der Membran mittels ACMA-Quenching, stellen Sie frisches NADH her und optimieren Sie das Protein-zu-Lipid-Verhältnis, die Cofaktor­konzentration, die Detergensentfernung und die Probenkonzentration. Undichte Proteoliposomen können durch unvollständige Detergensentfernung, zu hohe Detergenskonzentration, grobe Handhabung, wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen oder beschädigte Lipide entstehen. Wenn im ACMA-Test ein Protonenleck beobachtet wird, wiederholen Sie die Detergensentfernung unter Verwendung einer frisch equilibrierten Desalz­spalte, vermeiden Sie ein Überdrehen der Säule, stellen Sie frische Liposomen her, minimieren Sie mechanische Belastungen und verwenden Sie die Proteoliposomen unmittelbar nach der Rekonstitution. Eine Aggregation während der Konzentrations­schritte kann durch hohe lokale Protein- oder Detergenskonzentrationen an der Konzentrationsmembran verursacht werden. Konzentrieren Sie die Proben in kurzen (10 min) Zentrifugationszyklen, resuspendieren Sie die Probe zwischen den Zentrifugationsschritten vorsichtig, vermeiden Sie eine Überkonzentration, lagern Sie die Proben bei 4 °C und entfernen Sie sichtbare Aggregate durch Klärung bei niedriger Zentrifugationsgeschwindigkeit vor der Weiterverwendung. Inkonsistentes Flotationsverhalten kann auf variable Liposomengröße, unvollständige Detergensentfernung, Aggregation, falsche Sucroseschichtung oder eine Störung des Gradienten während der Probenauftragung oder Fraktionssammlung hinweisen. Stellen Sie frische Sucroselösungen her, schichten Sie die Gradienten langsam ohne Vermischung der Phasen auf, verwenden Sie einheitlich extrudierte Liposomen, halten Sie die Zentrifugationsbedingungen konstant und sammeln Sie die Fraktionen vorsichtig von oben nach unten. Eine schlechte Partikelverteilung in der Kryo-EM kann durch niedrige Proteoliposomkonzentration, Aggregation, bevorzugte Adsorption an Kohlenstoff, schlechtes Benetzen des Gitters, zu dickes Eis oder übermäßiges Abtupfen verursacht werden. Optimieren Sie die Proteoliposomkonzentration, entfernen Sie Aggregate vor der Gitterpräparation, passen Sie die Bedingungen der Glühentladung an, testen Sie Abtupfzeit und -druck, untersuchen Sie verschiedene Gittertypen oder Kohlenstoffträger und verwenden Sie nach Möglichkeit frisch hergestellte Proben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC)	Avanti Research	860320
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (POPE)	Avanti Research	850757
1,3-Bis(sn-3’-phosphatidyl)-sn-glycerol (Kardiolipin, aus Rinderherzgewebe)	Avanti Research	840012
2-[4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure --- HEPES	Sigma-Aldrich	H23830
3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure (MOPS)	Sigma-Aldrich	M12545
3,3′-Diaminobenzidin ---- DABB	Sigma-Aldrich	D4293
Carbonylcyanid-m-chlorophenylhydrazon ---- CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
CHAPS	Sigma-Aldrich	220201
Chloroform	Sigma-Aldrich	650948
Coenzym Q10	Sigma-Aldrich	C9538
Cytochrom c aus Pferdeherz	Sigma-Aldrich	C2506
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Ethylenglycol-bis(2-aminoethyläther)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure --- EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Ethylenediamintetraessigsäure -- EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Glycerin	Sigma-Aldrich	G7893
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	Tensid
Lauryl-Maltose-Neopentylglykol ---- LMNG	Sigma-Aldrich	NG310
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266
Myxothiazol	Sigma-Aldrich	T5580
NADH, Dinatriumsalz	Sigma-Aldrich	481913
Nitrotetrazoliumblau-Chlorid	Sigma-Aldrich	N6876
Piericidin A	Sigma-Aldrich	96861
Kaliumacetat	Sigma-Aldrich	P5708
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P3911
Kaliumferricyanid	Sigma-Aldrich	702587
Monobasisches Kaliumphosphat ---- KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002
Natriumcholathydrat	Sigma-Aldrich	C1254
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S9888
Natriumdithionit	Sigma-Aldrich	71699
Saccharose	Sigma-Aldrich	S9378
TRIS	Sigma-Aldrich	T1503
ACMA (9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridin)	Sigma-Aldrich	SML4162
Geräte und Kits
Amicon® Ultra Zentrifugalfilter, 100 kDa MWCO 0,5 mL	Millipore	UFC5100
Amicon® Ultra Zentrifugalfilter, 100 kDa MWCO 15 mL	Millipore	UFC9100
Beckman Optima TLX Ultrazentrifuge	Beckman Coulter
BN-PAGE-Gel			Blue-native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel
Beckman Optima XE Ultrazentrifuge	Beckman Coulter
Plasmareinigungssystem			Plasmareinigungssystem
Glacios 2 Kryo-TEM mit Gatan K3 Detektor	Thermo Fisher Scientific		das Transmissionselektronenmikroskop
KIMBLE Dounce-Gewebemörser-Set	Sigma-Aldrich	D9188
Leica Automatischer GP2 Plunger	Leica
Microfuge 16	Beckman Coulter	A46474
NGC Discover 10 Chromatographiesystem	Bio-Rad	7880009
Oxygraph+			das Sauerstoffelektrodensystem
PD-10 Desalzierungssäule	Cytiva	28918007	Größenausschluss-Spinsäule
Pierce BCA Proteinkit	Thermo Fisher Scientific	23225	Bicinchoninsäure-Proteinkit
Q-125 Sonikator	Q-sonica	Q125-110
Sephadex G-25 M Säule			vorgepackte G-25 Harz-Desalzierungsspinsäule
SpectraMax M2 Mikroplattenreader	Molecular Devices
Superose 6 increase 10/300 GL	Cytiva	29091596	vernetztes Agarose-Gelfiltrationsmedium
TLA-100.3 Festwinkelrotor-Set	Beckman Coulter	349490
Type 50.2 Ti Festwinkelrotor	Beckman Coulter	337901
Milli-Q (MQ)-Wasser			ultrareines Wasser
Malvern Zetasizer ZS Dynamische Lichtstreuung (DLS)	Malvern Paranytical
Hansatech Oxygraph+ System	Hansatech Instruments
PELCO easiGlow Plasmareinigungssystem	TED PELLA, INC
Vitrobot Mark IV System	Thermo Fisher Scientific		die Tauchgefriermaschine
Quantifoil R 1.2/1.3 300-Maschen-Kupfergitter mit 2 nm Kohlenstoff	TED PELLA, INC	668-300-Cu-100	löchrige, kohlenstoffbeschichtete
Avanti Mini-Extruder	Avanti Lipids	610000