Diese Studie stellt einen integrierten Visualisierungsworkflow vor, der standardisierte Probenahme und Aufbereitung von Bronchoalveolärflüssigkeit, ein siebenfarbiges Durchflusszytometrie-Panel, einen multiplex Zytokin-Assay mit 13 Analyten und eine einheitliche Analyse-Pipeline kombiniert.
Forschungsartikel
Integrierte Visualisierung der Neutrophilenrekrutierung und Profilierung inflammatorischer Zytokine in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) ist die am direktesten zugängliche Probenmatrix zur Untersuchung von Entzündungen der unteren Atemwege. Herkömmliche Analysen stützen sich jedoch auf Einzelmarkierungs-Durchflusszytometrie in Kombination mit analytspezifischen ELISA-Verfahren (enzyme-linked immunosorbent assay), einer Methode, die die Informationsdichte begrenzt und die Kopplung zwischen Zellen und Faktoren verschleiert. Diese Studie stellt einen integrierten Visualisierungsworkflow vor, der standardisierte Probennahme und Vorverarbeitung mit einem Sieben-Marker-Panel zur Durchflusszytometrie von Neutrophilen und Monozyten, einem Multiplex-Zytokinassay für 13 Analyten sowie einer einheitlichen Analyse-Pipeline verbindet, die auf uniformer Mannigfaltigkeitsapproximation und Projektion (UMAP), FlowSOM-Metaklusterung, hierarchischer Clusterung, Spearman-Korrelationsnetzwerken und Hauptkomponentenanalyse (PCA) basiert.
Der Workflow wurde auf eine single-center prospektive Kohorte von 112 Erwachsenen angewandt, die eine Bronchoskopie durchliefen, bestehend aus 64 Patienten mit mikrobiologisch bestätigter pulmonaler Infektion und 48 Nicht-Infektionskontrollen. Zytologische und durchflusszytometrische Auswertungen zeigten eine deutliche Verschiebung von einem makrophagen-dominierten zu einem neutrophilen-dominierten alveolären Profil während der Infektion, wobei der Neutrophilenanteil von einem Median von 3,2 % auf 68,4 % anstieg und die absolute Neutrophilenkonzentration sich etwa 50-fach erhöhte. Die multiplexbasierte Profilierung identifizierte eine koordinierte dreimodulare Zytokinantwort, bei der Chemokin-, proinflammatorische und regulatorische Module alle hochreguliert waren, wobei CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α und G-CSF innerhalb der Studienkohorte die stärkste Einzelmarkeraussagekraft aufwiesen (Fläche unter der Kurve [AUC] 0,89 bis 0,94). Eine integrative Visualisierung mittels PCA, einer Korrelationsmatrix und eines Netzwerkgraphen zeigte auf Teilnehmerebene eine eng gekoppelte Neutrophilen–Chemokin-Achse, wobei die Neutrophilenanzahl im BALF als zentraler Netzwerkknoten hervortrat.
Der Workflow nutzt ausschließlich Material, das routinemäßig aus klinisch indizierten BAL-Proben gewonnen wird, erfordert kein zusätzliches Probenvolumen und liefert ein informationsreiches Gerüst zur Aufklärung der Atemwegsentzündung bei respiratorischen Infektionen, das in Laboratorien der tertiären Versorgung mit Multiparameter-Durchflusszytometrie und Multiplex-Bead-Array-Plattformen umsetzbar sein könnte und sich für Längsschnitt-, Einzelzell- sowie Therapieevaluierungsstudien eignet. Eine breitere klinische Anwendung einzelner Analyten als Biomarker wird eine prospektive Validierung in unabhängigen multizentrischen Kohorten erfordern.
Einleitung
Infektiöse Todesfälle durch Atemwegsinfektionen der unteren Atemwege stellen weiterhin eine bedeutende Ursache für die weltweite Sterblichkeit dar, obwohl Fortschritte bei Impfstrategien und Behandlungsmodalitäten erzielt wurden; dies gilt dennoch besonders für pädiatrische und ältere Bevölkerungsgruppen1. Neutrophile sind die primären Zellen, die in den frühen Stadien einer angeborenen Immunantwort im betroffenen Respirationstrakt beschrieben werden – ein Prozess, der für die Eliminierung des eindringenden Erregers entscheidend ist; jedoch führt eine unkontrollierte neutrophile Entzündungsreaktion zum Zusammenbruch der alveolokapillären Barriere, zu oxidativem Gewebeschaden und zur Entstehung eines akuten Atemnotsyndroms (ARDS)2,3. Neutrophile im Lungengewebe weisen zudem Rekrutierungskinetiken, Retentionsmuster und Effektorverhalten auf, die sich von denen in anderen Geweben unterscheiden, und diese Unterschiede beeinflussen, ob die Infektion abklingt oder sich zu einer schweren Pneumonie entwickelt4.
Die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) ist eine wichtige Informationsquelle zum alveolären Mikromilieu und bietet die genaueste Darstellung der klinischen Immunität an dieser Stelle5. Der Chemokinrezeptor CXCL8 spielt eine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung von Neutrophilen in die Lunge über seine Rezeptoren CXCR1 und CXCR2, zusammen mit anderen Chemokinen wie CXCL1, CXCL2 und CXCL56. Die Zytokine IL-1β, IL-6 und TNF-α verstärken diesen Prozess weiter, während IL-10 als entgegenwirkendes Zytokin fungiert. Ihre Konzentrationen in der BALF korrelieren mit der Schwere von Lungeninfektionen und der Entwicklung von Lungenkomplikationen infolge bakterieller, viraler und atypischer Pneumonie7, und multiplexe Biomarkerprofile in der BALF werden zunehmend zur früheren Diagnose und Differenzierung von Erregern bei Infektionen der unteren Atemwege eingesetzt8.
Routinemäßige BALF-Tests erfassen gewöhnlich die zugrundeliegende Biologie des Tests nicht vollständig. Zellzahlen können durch manuelle Differenzierung der Zellen in Zytospin-Proben geschätzt werden, während lösliche Mediatoren mittels einzelner Enzym-gekoppelter Immunosorbens-Assays (ELISA) gemessen und als Balkendiagramm dargestellt werden. Chemokine, Zytokine und jede Zellart werden getrennt voneinander bewertet, ohne dass ein Zusammenhang zwischen einem bestimmten Chemokin-Konzentrationsgradienten und den Zellpopulationen hergestellt wird, auf die er in der Probe wirkt. Die Kombination aus Zytokin-Modulen, Chemokin-Neutrophilen-Dosis-Wirkungs-Beziehungen und Patientensubpopulationen mit individuellen Entzündungssignaturen wird häufig übersehen, wenn keine multivariate Analyse durchgeführt wird9.
Fortschritte in der Datenverarbeitung machen einen solchen ganzheitlichen Ansatz zunehmend realistisch. Die Kombination von multiparametrischer Durchflusszytometrie und spektraler Durchflusszytometrie mit Methoden zur Dimensionsreduktion, wie der t-verteilten stochastischen Nachbarn-Einbettung (t-SNE) oder der uniformen Mannigfaltigkeitsapproximation und Projektion (UMAP), ermöglicht die Abbildung hochdimensionaler Immunphänotypen in einen zweidimensionalen Raum, wobei sich UMAP bei Anwendung auf Zytometriedaten als überlegen hinsichtlich der Erhaltung der globalen Topologie und Reproduzierbarkeit erwiesen hat10. Mehrparametrige Zytokinspektren, gefolgt von hierarchischem Clustering und Korrelationsnetzwerken, helfen dabei, mit der Krankheitsschwere korrelierende Signaturen zu identifizieren, die mit Einzelzytokin-Ansätzen nicht erkennbar sind11. Trotz der Fortschritte in diesem Bereich existiert bisher kein Workflow, der diese Methoden kombiniert, um die Rekrutierung von Neutrophilen und Zytokinsignaturen an denselben BALF-Proben bei Atemwegsinfektionen zu untersuchen. Diese Studie beschreibt einen integrierten Visualisierungsworkflow zur Untersuchung der Neutrophilenrekrutierung mittels Zytologie und multiparametrischer Durchflusszytometrie, gefolgt von UMAP- und Zytokinsignaturanalysen mittels multiplexen Immunoassays, hierarchischem Clustering, Korrelationsmatrizen und Hauptkomponentenanalyse. Der Workflow liefert eine integrierte Visualisierung, die zelluläre und lösliche Immunparameter der Atemwege in einer einzigen Grafik zusammenfasst, basierend auf BALF-Proben, die routinemäßig im Rahmen klinisch indizierter Bronchoskopien bei Infektionen der unteren Atemwege gewonnen werden.
Protokoll
Studienpopulation und Ethik
Es handelte sich um eine einzentrische, prospektive Beobachtungsstudie, die zwischen Januar 2026 und April 2026 an einem universitären Lehrkrankenhaus durchgeführt wurde. Das Protokoll wurde unter der Genehmigungsnummer 2026HL-038 genehmigt, und von jedem Teilnehmer wurde vor jeder Studienprozedur eine schriftliche, informierte Einwilligung eingeholt.
Erwachsene im Alter von 18 bis 75 Jahren, die im Rahmen der routinemäßigen klinischen Versorgung eine diagnostische flexible Bronchoskopie mit Bronchoalveolärer Lavage (BAL) erhielten, wurden nacheinander rekrutiert und basierend auf ihren endgültigen klinischen und mikrobiologischen Diagnosen einer Infektionsgruppe oder einer Nicht-Infektions-Kontrollgruppe zugewiesen. Ein Überblick über den integrierten Visualisierungsworkflow, von der Rekrutierung der Patienten bis hin zu den integrierten visuellen Ausgaben, ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Übersicht über den integrierten Visualisierungsworkflow zur Profilierung der Neutrophilenrekrutierung und entzündlichen Zytokinantworten basierend auf BALF. Die fünf Stufen fassen von links nach rechts die prospektive Rekrutierung der Infektions- und Kontrollgruppen mittels Bronchoskopie und BAL, die Vorverarbeitung des BALF in ein Zellpellet und eine Überstandfraktion, parallele zelluläre (Zytologie nach Wright–Giemsa und multiparametrische Durchflusszytometrie) und lösliche Messungen (13-plex bead-basiertes Immunoassay), die einheitliche Visualisierungspipeline (UMAP mit FlowSOM-Metaklusterung, hierarchische Heatmap, Hauptkomponentenanalyse und Spearman-Korrelationsnetzwerk) sowie die integrierte visuelle Ausgabe zusammen. Abkürzungen: BAL = bronchoalveoläre Lavage; BALF = BAL-Flüssigkeit; UMAP = uniform manifold approximation and projection. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Die Einbeziehungskriterien für die Infektionsgruppe waren wie folgt: (1) Patienten, bei denen gemäß den Leitlinien der Infectious Diseases Society of America (IDSA) und der American Thoracic Society (ATS) eine ambulant erworbene Pneumonie (CAP), eine nosokomiale Pneumonie (HAP) oder eine beatmungsassoziierte Pneumonie (VAP) diagnostiziert wurde; (2) Nachweis eines oder mehrerer Erreger mittels BALF-Kultur mit ≥104 koloniebildenden Einheiten (CFU)/mL, respiratorischer multiplexer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), metagenomischer Next-Generation-Sequenzierung von BALF oder spezifischer Antigen-/Antikörpertestung aus gepaarten Atemwegs-/Serumproben.
Die Kriterien für die Kontrollgruppe waren wie folgt: (1) nichtinfektiöse Gründe für eine Bronchoskopie, bestehend aus der Beurteilung eines unklaren Lungennoduls, abnormen radiologischen Befunden, die keine Infektion nahelegen, oder der Untersuchung einer chronischen Bronchitis; (2) kein akuter pulmonaler Infekt, belegt durch negative Ergebnisse mikrobiologischer Tests und das Fehlen jeglicher Anzeichen von Entzündung oder systemischer Infektion zum Zeitpunkt der Bronchoskopie; und (3) keine Einnahme von Antibiotika in den 30 Tagen vor der Teilnahme. Die Kontrollpersonen wurden aus Patienten rekrutiert, die aufgrund anderer klinisch indizierter pulmonaler Erkrankungen eine Bronchoskopie erhielten, und nicht aus gesunden Probanden, was der Population entspricht, aus der am Studienzentrum routinemäßig klinisch indizierte BAL-Proben gewonnen werden.
Ausschlusskriterien waren: (1) Malignität und/oder zytotoxische Chemotherapie in den letzten sechs Monaten; (2) HIV-Seropositivität; (3) Transplantation eines soliden Organs oder hämatopoetischer Stammzellen; (4) andauernde immunsuppressive Therapie mit einer täglichen Prednison-Äquivalentdosis > 0,3 mg/kg über mehr als 3 Wochen; (5) schwangere oder stillende Frauen; (6) Vorgeschichte einer Blutungsneigung oder jegliche Kontraindikationen zur flexiblen Bronchoskopie; (7) bereits bestehende schwere chronische Atemwegserkrankung (chronisch obstruktive Lungenerkrankung [COPD] Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD] Stadium III/IV, idiopathische Lungenfibrose, schwere persistierende Asthma, oder klinisch signifikante Bronchiektasen); (8) aktive Tuberkulose; (9) Teilnahme an einer anderen interventionellen Studie innerhalb der letzten 30 Tage. Die Bronchoalveoläre Lavage (BAL) wurde während der ersten Bronchoskopie durchgeführt, innerhalb von 72 Stunden nach der Aufnahme wegen Infektionen und innerhalb von 48 Stunden nach der Intubation bei beatmeten Patienten mit Infektionen.
Die Berechnung der Stichprobengröße konzentrierte sich auf das primäre zelluläre Ergebnis: die Anzahl der Neutrophilen in der BALF zwischen den Gruppen. Unter Berücksichtigung einer erwarteten Effektgröße von 0,6 SD zwischen infizierten und nicht infizierten Atemwegen sowie einer Drop-out-Rate von 15 % war eine minimale Stichprobengröße von 45 Probanden pro Gruppe erforderlich, um bei zweiseitigem α = 0,05 eine statistische Power von 80 % zu erreichen. Von 156 in Frage kommenden Kandidaten erfüllten 27 die Zulassungskriterien nicht (18 erfüllten hauptsächlich die Einschlusskriterien nicht, da innerhalb des vorgegebenen Zeitraums kein krankheitserregender Erreger identifiziert werden konnte oder keine Zustimmung zum Verfahren selbst vorlag; 9 verstießen primär gegen die Ausschlusskriterien aufgrund einer aktiven Malignität oder einer Chemotherapieanamnese, chronischer Kortikosteroidanwendung, schwerer vorbestehender chronischer Lungenerkrankung oder einer Blutungsneigung). Die verbleibenden 129 Teilnehmer unterzogen sich einer Bronchoskopie. Anschließend wurden 17 Probanden aus der Studie ausgeschlossen (7 aufgrund einer unzureichenden BALF-Ausbeute < 40 %; 4 aufgrund Widerrufs der Einwilligung während des Krankenhausaufenthalts; und 6 aufgrund einer Neuklassifizierung der Probanden nach abschließender mikrobiologischer Beurteilung – 4 Kontrollkandidaten, bei denen anhand von Kulturergebnissen eine okkulte Infektion diagnostiziert wurde; sowie 2 Infektionskandidaten, bei denen nach der Kulturanalyse kein Hinweis auf eine Infektion bestand). Der endgültige Pool der Studienteilnehmer umfasste 112 Probanden: 64 mit Infektion und 48 ohne Infektion.
Sammlung und Vorbearbeitung von BALF
Die Bronchoskopie wurde von erfahrenen Untersuchern gemäß dem standardisierten institutsinternen Protokoll durchgeführt, das den veröffentlichten technischen Empfehlungen für die Bronchoalveoläre Lavage entspricht.12. Lidocain wurde topisch angewendet, und die Patienten erhielten eine moderate intravenöse Sedierung, während Sauerstoff ergänzend zugeführt wurde, um die Sauerstoffsättigung (SpO₂) >92 %. Der flexible Bronchoskop wurde eingeführt und in dem bronchopulmonalen Segment mit radiologischen Auffälligkeiten positioniert. In Fällen, in denen die radiologischen Auffälligkeiten diffus oder nicht lokalisierbar waren, wurden das mittlere Lappensegment rechts oder das linguläre Segment links gewählt. Nach jeder Applikation wurde eine sanfte manuelle Absaugung mit Unterdruck durchgeführt. < 100 mmHg wurde durchgeführt. Insgesamt drei bis fünf Applikationen von steriler Kochsalzlösung mit 37 °C, jeweils 20–40 mL, mit einem Gesamtvolumen von 100–150 mL, verabreicht. Das Rückgewinnungsverhältnis wurde als das Verhältnis des zurückgewonnenen Volumens zum applizierten Volumen berechnet, und nur Proben mit einer Rückgewinnung von ≥40 % wurden zur Analyse herangezogen.
Die gesammelten Proben aus der zweiten und folgenden Spülungen wurden vereinigt, um eine Bronchialkontamination zu verringern und eine alveoläre Anreicherung der Probe zu erzielen. Der Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeits-(BALF-)Pool wurde auf Eis gehalten und innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme verarbeitet, wobei aktuelle Erkenntnisse über Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung und in den Differenzialzählungen nach längerer Lagerung und Erwärmung menschlicher BALF-Proben berücksichtigt wurden13. Nach einer Filtration durch ein steriles Nylonnetz mit einer Porengröße von 70 Mikrometern, um den Schleim zu entfernen, die ausschließlich mechanisch durchgeführt wurde, ohne Zusatz eines mukolytischen oder entklumpenden Wirkstoffs wie Dithiothreitol, da Vorversuche zeigten, dass dies ausreichte, um Schleimklumpen zu entfernen, ohne die Integrität der nachgeschalteten Oberflächenepitope messbar zu beeinträchtigen, wurde die Flüssigkeit bei 400 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und portionsweise in Kryoröhrchen mit geringer Proteinbindung für die Zytokanalyse abgefüllt, und die Zellen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,5 % Rinderserumalbumin und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) resuspendiert, wobei ein Teil für Zytologie und Durchflusszytometrie aufbewahrt wurde. Die Zytokproben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, bei –80 °C gelagert und vor der Verwendung keiner mehr als einer Auftau-Zyklus unterzogen.
Neutrophilen-Zytologie und Durchflusszytometrie zur Quantifizierung
Hinsichtlich der Zytologie wurden 100 µL der BAL-Zellsuspension mithilfe eines Zytospinzentrifuges (siehe Tabelle der Materialien) bei 300 ×g für 5 min auf einen Objektträger aufgetragen, luftgetrocknet und mit Wright-Giemsa angefärbt. Die Differenzialzählung wurde von einem Hämotechniker durchgeführt, der nicht über den medizinischen Hintergrund des Patienten informiert war; dabei wurden pro Objektträger mindestens 400 Zellen gezählt und die prozentualen Anteile von Makrophagen, Lymphozyten, Neutrophilen und Eosinophilen berechnet. Der prozentuale Anteil neutrophiler Granulozyten im BALF wurde als primäres zytologisches Outcome-Maß gewählt, da aktuelle Befunde auf dessen Nützlichkeit bei der Unterscheidung infektiöser von nichtinfektiösen Lungenerkrankungen bei Patienten mit pulmonalen Infiltraten hinweisen14.
Das Durchflusszytometrie-Quantifizierungsprotokoll basierte auf einer kürzlichen Validierung des Vier-Farben-Protokolls zur Differenzierung von Leukozyten in Bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF)15 und beinhaltete zusätzliche Marker zur Identifizierung von Neutrophilen. Etwa 5 × 105 aus BALF isolierte Zellen wurden speziell für 10 min bei 4 °C mit einem humanen Fc-Rezeptor-blockierenden Reagenz (siehe Materialtabelle) blockiert und anschließend 20 min bei 4 °C mit Antikörpern gegen CD45 (Klon HI30), CD66b (Klon G10F5), CD15 (Klon HI98), CD16 (Klon 3G8), CD11b (Klon ICRF44), CD14 (Klon M5E2) und HLA-DR (Klon L243) sowie mit einem fixierbaren Vitalitätsfarbstoff (siehe Materialtabelle) gefärbt. Zur Erythrozytenlyse wurde 10 min bei Raumtemperatur eine kommerzielle Erythrozytenlyselösung verwendet (siehe Materialtabelle). Nach der Erythrozytenlyse wurden die Zellen zweimal mit PBS, ergänzt mit 2 % fetalem Kälberserum, gewaschen, in Durchflusspuffer resuspendiert und anschließend mit einem Mehrfarben-Durchflusszytometer analysiert (siehe Materialtabelle). Die Kompensation erfolgte mithilfe einfarbig gefärbter Kompensationskügelchen (siehe Materialtabelle), und für jedes Panel wurden Fluoreszenz-minus-eins- und ungefärbte Ansätze mitgeführt.
Für jede Probe wurden mindestens 1 × 105 CD45⁺-Ereignisse erfasst. Zunächst wurden Singuletts im FSC-A/FSC-H-Diagramm ausgewählt, gefolgt von lebenden (Viabilitätsfarbstoff⁻) CD45⁺-Leukozyten. Anschließend erfolgte die Ausschließung von CD14⁺HLA-DR⁺ Monocyten-Makrophagen, um CD66b⁺-Granulozyten mit hohem Seitenstreulichtsignal zu isolieren. Neutrophile wurden dann innerhalb der Granulozytenpopulation als CD15⁺CD16⁺CD11b⁺-Ereignisse definiert. Dieses primäre CD66b⁺-Granulozyten-Tor wurde breit um alle Ereignisse mit hohem Seitenstreulichtsignal gelegt, anstatt auf den Bereich der CD15⁺CD16⁺CD11b⁺-Grenze beschränkt zu sein, sodass CD16-schwach, CD11b-stark exprimierende aktivierte Neutrophile sowie andere weniger reife Granulozytenformen in der automatisierten Gesamtneutrophilenanzahl enthalten blieben; die strengere Definition mittels CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ wurde ausschließlich zur Charakterisierung der Untergruppe reifer Neutrophiler verwendet, die in den nachfolgenden Clusteranalysen separat berichtet wurde. Die Neutrophilenkonzentration in der Bronchoalveolären Lavage (BALF) (Zellen/µL) wurde basierend auf dem Neutrophilenanteil und der Gesamtanzahl kernhaltiger Zellen geschätzt, die mittels eines automatisierten Hämatologie-Analysators bestimmt wurde (siehe Tabelle der Materialien). Kompensationsmatrizen, die Gating-Strategie sowie individuelle Qualitätskontrollberichte wurden archiviert, und die Analysepersonen blieben während der Datenaufnahme und -auswertung unkenntlich bezüglich der Gruppenzugehörigkeit der Teilnehmer.
Multiplex-Analyse entzündlicher Zytokine
Die BALF-Überstände wurden einmalig auf nassem Eis aufgetaut, kurz vortexiert und durch Zentrifugation bei 10.000 × g 5 min bei 4 °C unmittelbar vor dem Assay. Die Messung von 13 Analyten in drei Funktionskategorien erfolgte mithilfe einer multiplex-basierten Immunoassay-Plattform mit magnetischen Beads und einem kundenspezifischen Bead-Panel (siehe Materialienübersicht). Die proinflammatorische Gruppe umfasste IL-1β, IL-6, IL-17A und TNF-α; die Chemokin-Gruppe umfasste CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 und CCL3/MIP-1α; und die regulatorische Gruppe bestand aus IL-10, IFN-γ, IL-1RA und G-CSF. Die Auswahl der Analyten basierte auf denjenigen, die in multiplexen Analysen von BALF- oder Serum-Zytokinen bei Pneumonie- bzw. schweren Atemwegsinfektionsstudien am häufigsten als aussagekräftig berichtet wurden.7,11Der Verdünnungsfaktor (1:2 im Assaypuffer) wurde anhand eines Vorversuchs mit einer repräsentativen Teilmenge sowohl infizierter als auch kontrollierter Proben bestimmt, um sicherzustellen, dass >90 % der Messungen lagen innerhalb der Standardkurve.
Die Standardkurven wurden mithilfe von siebenstufigen seriellen Verdünnungen der rekombinanten Standards des Herstellers bestimmt, die auf jeder Platte im Duplikat vorbereitet wurden, einschließlich eines Leerwertbrunnens zur Subtraktion des Hintergrunds. Die Kurvenanpassung erfolgte mittels einer fünfpunktigen logistischen Regression (5PL) durch die proprietäre Erfassungs- und Analyse-Software des Geräts (siehe Tabelle der Materialien). Die untere Quantifizierungsgrenze (LLOQ) wurde als die kleinste Menge an Standard definiert, die eine Rückrekonstitutionsrate zwischen 80 % und 120 % sowie einen intralaufenden Variationskoeffizienten (CV) ≤ 20 % ergab. Werte, die unterhalb der LLOQ lagen, wurden durch LLOQ/√2 ersetzt. Zwei gepoolte Qualitätskontrollproben aus bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF), jeweils von einem repräsentativen infizierten Patienten und einem nicht betroffenen Probanden, wurden aliquotiert und jeder Platte hinzugefügt, um die Langzeitstabilität zu überwachen. Die Qualitätsicherungsstandards basierten auf bewährten Empfehlungen aus einem zwölfjährigen, multizentrischen, multiplex-basierten Bead-Assay-Programm zur Leistungsüberprüfung16 und beinhalteten Anforderungen an den intra-assay-CV ≤ 10 % in Duplikatbrunnen, den inter-Platten-CV ≤ 20 % für die Qualitätskontrolle sowie eine Mindestbead-Anzahl von ≥ 50 pro Analyt pro Brunnen. Platten, die die oben genannten Kriterien nicht erfüllten, wurden erneut durchgeführt. Die Analyse erfolgte in einem einzigen Durchgang innerhalb von vier Wochen unter Verwendung einer einzigen Kit-Charge, wobei die Infektions- und Kontrollproben zufällig verteilt wurden.
Visualisierungspipeline zur Datenanalyse
Die Flow-Zytometrie-Standarddateien (FCS) wurden zunächst mit kommerzieller Flow-Zytometrie-Software (siehe Tabelle der Materialien) analysiert, um Live-CD45⁺-Einzelzellen zu kompensieren und zu selektieren, und anschließend für eine unvoreingenommene Analyse in R v4.4. exportiert. Für jede Probe wurden 10.000 CD45⁺-Ereignisse herunterprobeniert und zusammengeführt, und die Signalintensitäten wurden mithilfe der arcsinh-Funktion mit einem Cofaktor von 150 transformiert. Die Dimensionsreduktion und UMAP-Projektionen wurden mit dem uwot-Paket bei 15 nächsten Nachbarn und einer minimalen Distanz von 0,1 durchgeführt, ergänzt durch parallele t-SNE-Einbettungen mit dem Rtsne-Paket bei einer Perplexität von 3010. Phänotypische Cluster wurden mittels FlowSOM mit 100 Self-Organizing-Map-Knoten identifiziert und anschließend durch Meta-Clustering in 12–15 Cluster unterteilt, wobei ein optimierungsbasierter Ansatz verwendet wurde, der kürzlich für hochdimensionale Zytometriedaten validiert wurde17. Jedes Cluster wurde basierend auf dem medianen Expressionsniveau von Linien- und Aktivierungsmarkern annotiert und im Vergleich zu manuell gesetzten Toren überprüft.
Zur Analyse der multiplexen Zytokindaten wurden die Rohwerte zunächst log₁₀-transformiert und anschließend durch z-Transformation zwischen den Analyten standardisiert, bevor weitere Analysen durchgeführt wurden. Sowohl Analyten als auch Patienten wurden einer hierarchischen Clusterung unterzogen, wobei der euklidische Abstand und die Ward.D2-Verknüpfungsmethode verwendet wurden; die Ergebnisse wurden in einer zeilen- und spaltengeclusterten Heatmap dargestellt. Ein solcher Ansatz diente dem Nachweis koexprimierter Zytokinmodule und der Klassifizierung von Patientensubgruppen in multiplen entzündlichen Kohorten9. Für alle zellulären und löslichen Biomarker wurden Korrelationsmatrizen mithilfe paarweiser Spearman-Rangkorrelationen erstellt. Heatmaps der Korrelationsmatrizen wurden zusammen mit einem Netzwerk dargestellt, in dem Knoten für Biomarker stehen und Kanten Korrelationen anzeigen, die nach Mehrfachtestkorrektur mittels der Benjamini–Hochberg-(BH-)Methode signifikant blieben. Die Kantenbreite wurde entsprechend der Betragsgröße des Korrelationskoeffizienten |ρ| skaliert, und Kanten wurden nur eingezeichnet, wenn |ρ| ≥ 0,30 und p < 0,05 nach Korrektur erreicht wurde. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde auf der standardisierten Matrix, die Zellen und Zytokine enthielt, mithilfe der Funktion prcomp() mit Skalierung auf Einheitsvarianz durchgeführt. Die Probanden wurden auf die ersten beiden Hauptkomponenten projiziert, wobei Infektions- und Kontrollgruppen überlagert wurden. Eine konsistente Downsampling- und Standardisierung aller Analysen gewährleistete die Vergleichbarkeit der Messwerte für zelluläre und lösliche Biomarker über alle Visualisierungen hinweg.
Statistische Analyse
Stetige Variablen wurden als Median (Interquartilsabstand, IQR) beschrieben, wenn sie gemäß Shapiro-Wilk-Test nicht normalverteilt waren, andernfalls als Mittelwert (Standardabweichung, SD). Kategoriale Variablen wurden mittels Häufigkeiten und Anteilen beschrieben. Gruppenvergleiche wurden mit dem Mann-Whitney-Test durchgeführt. U Test, wenn kontinuierliche Variablen keine normalen Verteilungen aufwiesen, der Welch t-t-Test bei normalverteilten stetigen Variablen sowie Chi-Quadrat-Test bzw. Fishers exakter Test bei kategorialen Variablen, wenn zutreffend. Die Zusammenhänge zwischen stetigen Variablen wurden mittels des Spearman-Rangkorrelationskoeffizienten untersucht. Um die Fehlentdeckungsrate (FDR) bei multiplexen Zytokin- und Korrelationsanalysen zu berücksichtigen, wurden die p-Werte mit der Benjamini-Hochberg-Methode angepasst, wobei eine Grenze von q < 0,05. Zweiseitig p < Ein p-Wert von 0,05 wurde in allen primären Analysen als statistisch signifikant angesehen. Wo möglich, wurden Fälle mit fehlenden Daten für einzelne Variablen beibehalten und mittels Complete-Case-Analyse für die betroffene Variable ausgewertet, während zur Durchführung von Sensitivitätsanalysen multiple Imputationen unter Verwendung verketteter Gleichungen (m = 20) durchgeführt wurden. Receiver-Operating-Characteristic-Kurven und die entsprechende Fläche unter der Kurve (AUC) wurden für einzelne Zytokine mithilfe des pROC-Pakets innerhalb der gesamten Studienkohorte erstellt; eine separate externe Validierungskohorte wurde nicht verwendet. Vorab festgelegte Sensitivitätsanalysen wiederholten die primären Gruppenvergleiche, nachdem Teilnehmer ausgeschlossen wurden, die innerhalb von 72 Stunden vor der Bronchoskopie Antibiotika erhalten hatten, sowie nach einer Stratifikation der Infektionsgruppe nach Beatmungsstatus und nach Pneumonie-Subtyp (ambulant erworben, nosokomial erworben oder beatmungsassoziiert). Die Analysen wurden mit den R-Paketen rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC und mice in R v4.4 durchgeführt. Die Abbildungen wurden mit kommerzieller wissenschaftlicher Grafiksoftware erstellt (siehe Materialienübersicht).
Ergebnisse
Studienpopulation und Probenmerkmale
Die endgültige Analysegruppe umfasste 112 Probanden, darunter 64 Probanden in der Infektionsgruppe und 48 Probanden in der Nicht-Infektions-Kontrollgruppe. Die baseline-demografischen Merkmale waren zwischen den Gruppen vergleichbar, während laborchemische Parameter im Zusammenhang mit Infektionen in der Infektionsgruppe höher lagen, wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Infektionen wurden hauptsächlich durch gramnegative Bakterien verursacht, wobei die wichtigsten bakteriellen Erreger Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii waren. Weitere Erreger waren Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, atypische Erreger, Viren und Mischinfektionen.
Die BALF-Rückgewinnungsraten erfüllten für alle verbliebenen Proben die vorgegebene Schwelle von ≥40 %, wobei die Raten in der Infektionsgruppe leicht niedriger lagen als in der Kontrollgruppe (Median 48,3 % vs. 53,3 %, p = 0,03), was mit einer stärkeren Entzündung der Atemwege und einer vermehrten Schleimhautkongestion in den infizierten Atemwegen übereinstimmt. Da sich auch das rückgewonnene Volumen zwischen den Gruppen unterschied (58 mL vs. 64 mL, p = 0,04), könnten alle berichteten Zytokinkonzentrationen von einem geringfügigen Unterschied im Verdünnungsfaktor zwischen den Gruppen betroffen sein; eine vorab festgelegte Sensitivitätsanalyse, beschränkt auf Proben mit einer Rückgewinnungsrate von ≥50 % (n = 42 Infektion, n = 34 Kontrolle), bestätigte Richtung und Ausmaß jedes Gruppenvergleichs (größte Änderung der Effektgröße < 8 %), was darauf hindeutet, dass eine Verdünnungsverzerrung die beobachteten Unterschiede kaum erklären kann. Die Zeit zwischen Probennahme und Verarbeitung betrug 65 Minuten für die Infektionsgruppe und 62 Minuten für die Kontrollgruppe und lag damit innerhalb des 2-Stunden-Fensters. Qualitätskontrollkriterien (QC) auf Proben-Ebene zeigten Ergebnisse von hoher Qualität. Zytologische Differenzialzählungen wurden basierend auf ≥400 gezählten Zellen in allen 112/112 Proben (100 %) durchgeführt. Die Durchflusszytometrie-Analysen erfüllten das vorgegebene Kriterium von ≥1 × 105 CD45⁺-Ereignissen in allen 112/112 Proben (100 %), mit einer medianen Lebendzell-Vitalität von 89,4 % (IQR 85,6–92,8 %). Alle Multiplex-Zytokinplatten erfüllten nach einem einzigen Wiederholungsdurchlauf die QC-Kriterien. Für alle 13 Analyten betrug der intra-assay-Koeffizient der Variation (CV) 4,7 % (2,1–9,3 %, alle <10 %), der inter-Platten-CV der gepoolten QC-Proben betrug 11,2 % (6,8–18,4 %, alle <20 %) und die mediane Anzahl an Beads lag bei 78 Ereignissen/Analyt/Vertiefung (53–142, alle ≥ 50).
| Variable | Infektion (n = 64) | Kontrolle (n = 48) | p-Wert |
| Alter, Jahre, Median [IQR] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| Männlich, n (%) | 38 (59,4) | 26 (54,2) | 0,59 |
| BMI, kg/m2, Median [IQR] | 23,8 [21,4–26,2] | 23,5 [21,6–25,7] | 0,66 |
| Raucheranamnese, n (%) | 0,52 | ||
| Nie | 28 (43,8) | 25 (52,1) | |
| Ex-Raucher | 22 (34,4) | 16 (33,3) | |
| Aktueller Raucher | 14 (21,9) | 7 (14,6) | |
| Arterielle Hypertonie, n (%) | 27 (42,2) | 18 (37,5) | 0,62 |
| Diabetes mellitus, n (%) | 17 (26,6) | 10 (20,8) | 0,49 |
| Koronare Herzkrankheit, n (%) | 11 (17,2) | 6 (12,5) | 0,51 |
| Chronische Nierenerkrankung, n (%) | 5 (7,8) | 3 (6,3) | 0,76 |
| Indikation zur Bronchoskopie, n (%) | — | ||
| Community-erworbene Pneumonie | 35 (54,7) | — | |
| Krankenhaus-erworbene Pneumonie | 19 (29,7) | — | |
| Beatmungsassoziierte Pneumonie | 10 (15,6) | — | |
| Unbestimmter pulmonaler Knoten | — | 23 (47,9) | |
| Persistierende radiologische Auffälligkeit | — | 15 (31,3) | |
| Auswertung chronischer Husten | — | 10 (20,8) | |
| Verursachender Erreger, n (%) | — | ||
| Gramnegative Bakterien | 28 (43,8) | ||
| Grampositive Bakterien | 16 (25,0) | ||
| Atypische Erreger | 7 (10,9) | ||
| Respiratorische Viren | 8 (12,5) | ||
| Mischinfektion | 5 (7,8) | ||
| Mechanische Beatmung bei BAL, n (%) | 14 (21,9) | 0 (0) | <0,001 |
| Antibiotika-Exposition innerhalb von 72 h vor BAL, n (%) | 41 (64,1) | 0 (0) | <0,001 |
| Instilliertes Volumen, mL, Median [IQR] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0,84 |
| Rekuperiertes Volumen, mL, Median [IQR] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0,04 |
| BALF-Rekuperationsrate, %, Median [IQR] | 48,3 [42,5–55,6] | 53,3 [46,2–60,5] | 0,03 |
| Zeit bis zur Probenaufbereitung, min, Median [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0,55 |
| Leukozyten im Blut, × 10⁹/L, Median [IQR] | 11,8 [8,6–14,5] | 6,4 [5,3–7,8] | <0,001 |
| Neutrophile im Blut, %, Median [IQR] | 78,5 [70,2–86,4] | 60,3 [54,6–66,8] | <0,001 |
| C-reaktives Protein, mg/L, Median [IQR] | 78,5 [42,6–128,4] | 4,2 [1,8–8,6] | <0,001 |
| Procalcitonin, ng/mL, Median [IQR] | 0,86 [0,32–2,45] | 0,05 [0,03–0,08] | <0,001 |
Tabelle 1: Demografische, klinische und BALF-Verarbeitungsmerkmale der Studienkohorte. Die basaalen demografischen Merkmale, Komorbiditäten, Bronchoskopieindikationen, kausativen Erreger, interventionsbezogenen Parameter und laborchemischen Werte im peripheren Blut werden zwischen den 64 Teilnehmern der Infektionsgruppe und den 48 Teilnehmern der Nicht-Infektions-Kontrollgruppe verglichen. Stetige Variablen werden als Median [Interquartilsabstand] angegeben und mit dem Mann-Whitney-Test verglichen. U Test; kategoriale Variablen werden als n (%) angegeben und gegebenenfalls mit dem Chi-Quadrat-Test oder dem exakten Fisher-Test verglichen. Abkürzungen: BAL = Bronchoalveoläre Lavage; BALF = Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit; BMI = Body-Mass-Index; IQR = Interquartilsabstand; WBC = Leukozytenzahl.
Visualisierung der Neutrophilenrekrutierung in der BALF
Bei den infizierten Probanden wurde eine deutliche Verschiebung des Verhältnisses von einer makrophagen-dominierten zu einer neutrophilen-dominierten Population beobachtet, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Zytospin-Präparationen wurden nach der Wright-Giemsa-Methode gefärbt, wobei ein klarer Unterschied zwischen den beiden Gruppen sichtbar wurde: Die Kontrollgruppe wies mehr alveoläre Makrophagen, einige Lymphozyten und nur wenige Neutrophile auf, während die infizierte Gruppe überwiegend aus Neutrophilen mit häufig intrazellulären Bakterien, degenerierten Kernen und toxischen Granulationen bestand. Differenzialzählungen, basierend auf mindestens 400 ausgewerteten Zellen, bestätigten die Unterschiede. Dabei stieg der Anteil der Neutrophilen von einem Medianwert von 3,2 % (IQR: 1,8–5,6 %) in der Kontrollgruppe auf 68,4 % (IQR: 49,2–82,5 %) in der infizierten Gruppe (p < 0,001), während der Anteil der alveolären Makrophagen von 88,2 % (IQR: 82,4–92,5 %) auf 22,6 % (IQR: 12,3–38,5 %) abnahm (p < 0,001). Die Lymphozytenanteile waren zwischen den Gruppen vergleichbar (7,4 % [4,8–11,3 %] vs. 6,5 % [3,4–11,2 %], p = 0,42).
Die Gating- und Dimensionsreduktionsanalysen bestätigten und erweiterten die mittels Mikroskopie beobachteten zellulären Phänotypen. Nach Ausschluss von Zelltrümmern, Doppelzellen und toten Zellen machten CD45⁺CD66b⁺ Granulozyten im Infektionskollektiv einen Median von 65,8 % (IQR: 46,2–79,4 %) der CD45⁺ Leukozyten aus, verglichen mit 4,1 % (IQR: 2,3–6,8 %) in der Kontrollgruppe (p < 0,001). Innerhalb der Granulozytenpopulation entfielen CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ reife Neutrophile auf 92,4 % (IQR: 87,5–95,8 %) aller Granulozyten im Infektionskollektiv gegenüber 88,6 % (IQR: 82,3–93,5 %) in der Kontrollgruppe, was darauf hindeutet, dass der rekrutierte Neutrophilenpool überwiegend aus reifen, vollständig differenzierten Zellen und nicht aus frühen Vorläufern bestand. Die UMAP- und t-SNE-Projektionen basierend auf der arcsinh-transformierten Oberflächenproteinmatrix zeigten nahezu identische Topologien, bei denen Infektionsfälle eine deutlich ausgeprägte Insel aus CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ reifen Neutrophilen bildeten, die in Kontrollproben nur spärlich besetzt war, während die Insel der HLA-DR⁺CD14⁺ alveolären Makrophagen das entgegengesetzte Muster aufwies – dicht besetzt in den Kontrollen und spärlich in den Infektionsproben. Die Meta-Clustering-Analyse mittels FlowSOM identifizierte 13 Teilpopulationen, von denen eine Subpopulation reifer Neutrophiler (38,4 % [22,6–56,2 %] vs. 2,8 % [1,5–4,6 %], p < 0,001) und ein Cluster aktivierter CD16-dim CD11b-hoch Neutrophiler (22,6 % [11,4–32,5 %] vs. 0,4 % [0,1–1,2 %], p < 0,001) die stärksten zellzahlmäßigen Zunahmen zwischen den Gruppen zeigten.
Hinsichtlich der absoluten Neutrophilenanzahl zeigte sich eine etwa 50-fache Zunahme der Neutrophilen im BALF in der Infektionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Gesamtanzahl der kernhaltigen Zellen pro µL BALF stieg von 156 Zellen/µL (IQR 88–232) in der Kontrollgruppe auf 384 Zellen/µL (IQR 180–712) in der Infektionsgruppe (p < 0,001), und die Neutrophilenanzahl erhöhte sich von 5 Zellen/µL (IQR 2–13) in der Kontrollgruppe auf 262 Zellen/µL (IQR 89–578) in der Infektionsgruppe (p < 0,001). Paarweise Unterschiede im Neutrophilenanteil und in der absoluten Anzahl zwischen den Gruppen blieben nach Anpassung nach Benjamini–Hochberg (BH) hochsignifikant (q < 0,001).
Abbildung 2: Darstellung der Rekrutierung von Neutrophilen im BALF. Repräsentative nach Wright-Giemsa gefärbte Zytospin-Präparate von einem Kontrollteilnehmer und einem infizierten Teilnehmer veranschaulichen den Wandel vom makrophagenreichen zum neutrophilenreichen zellulären Profil der BALF. Eine vierschrittige Durchflusszytometrie-Gating-Strategie (FSC-Einzelzellen → lebende CD45⁺-Leukozyten → CD66b⁺-Granulozyten nach Ausschluss von CD14⁺HLA-DR⁺-Zellen → reife CD15⁺CD16⁺CD11b⁺-Neutrophile), eine UMAP-Einbettung arcsinh-transformierter Durchflusszytometriedaten mit FlowSOM-13-Metakluster-Überlagerung, farblich gekennzeichnet nach biologischer Annotation, sowie Boxplots des prozentualen Anteils und der absoluten Konzentration von Neutrophilen im BALF (Zellen/µL, logarithmische Skala) werden nebeneinander dargestellt, um einen direkten Vergleich der zellulären Phänotypen zwischen Infektions- und Kontrollgruppe zu ermöglichen. Abkürzungen: BALF = bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit; FSC = Vorwärtsstreuung; UMAP = uniforme Mannigfaltigkeitsapproximation und -projektion. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Darstellung der inflammatorischen Zytokinger im BALF
Ein Muster koordinierter Reaktionen über mehrere Zytokinachsen hinweg unterschied die Infektionsgruppe von der Kontrollgruppe, und die Zytokine wurden in drei konsistente funktionelle Module eingeteilt, wie in Abbildung 3 dargestellt. Die Clusterung der log₁₀-transformierten und normalisierten Zytokinkonzentrationen mittels der Ward.D2-Methode ergab ein klares zweigliedriges Dendrogramm der Proben, bei dem die Infektionsproben und Kontrollen an entgegengesetzten Enden des Dendrogramms lagen; lediglich sieben Teilnehmer wurden falsch klassifiziert (sechs Kontrollen gruppierten sich mit den Infektionsproben, hauptsächlich chronische Hustenfälle mit leichter neutrophiler Atemwegsentzündung, und eine Infektionsprobe gruppierte sich mit den Kontrollen, was einer frühen atypischen Pneumonie entsprach). Das Dendrogramm der Analyten definierte drei Zytokincluster. Der Chemokincluster, bestehend aus CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 und CCL3, zeigte den stärksten Anstieg zwischen Infektions- und Kontrollgruppe sowie die höchste intra-modulare Korrelation. Der proinflammatorische Cluster, der IL-1β, IL-6, IL-17A und TNF-α enthielt, wies ähnliche Richtungsänderungen nach oben auf, wenn auch etwas weniger ausgeprägt. Der regulatorische Cluster, bestehend aus IL-10, IL-1RA, IFN-γ und G-CSF, war ebenfalls in den Infektionsproben erhöht, was darauf hindeutet, dass die Reaktion nicht ausschließlich proinflammatorisch war, sondern parallel auch gegenregulatorische und antivirale Komponenten aktiviert wurden.
Die Mediane (IQRs) aller getesteten Analyten waren in der Infektionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe höher, und der adjustierte p-Wert lag nach Korrektur der falschen Entdeckungsrate basierend auf der Methode von Benjamini-Hochberg (BH-FDR) für alle 13 Analyten unter 0,001. Unter den Analyten wies CXCL8/IL-8 die höchste Konzentration und die stärkste Fold-Änderung auf (von 68 [32–142] pg/mL in der Kontrollgruppe auf 2.485 [842–6.520] pg/mL in der Infektionsgruppe, eine etwa 36-fache Erhöhung). Ein paralleles Muster zeigte sich für CXCL1/GRO-α mit einer etwa 21-fachen Erhöhung (78 [36–148] vs. 1.672 [524–3.890] pg/mL). IL-1β zeigte eine etwa 13-fache Erhöhung (5,8 [2,6–11,4] vs. 78 [29–184] pg/mL). IL-6, IL-1RA und G-CSF zeigten 13- bis 16-fache Erhöhungen (16,4 [7,8–30,5] vs. 248 [82–612] pg/mL; 112 [48–258] vs. 1.748 [658–3.964] pg/mL; 24 [10–52] vs. 384 [125–912] pg/mL, jeweils). Weitere geringere Erhöhungen umfassten TNF-α (~8-fach), CXCL10/IP-10 (~9-fach), CCL2/MCP-1 (~8-fach), CCL3/MIP-1α (~10-fach), IL-10 (~10-fach), IFN-γ (~6-fach) und IL-17A (~4-fach).
Die ROC-Analyse innerhalb der Kohorte identifizierte IL-8 (AUC 0,94), IL-1β (AUC 0,92), IL-6 (AUC 0,91), CXCL1 (AUC 0,91) und G-CSF (AUC 0,89) als Analyten mit der stärksten Einzelmarkeraussagekraft zur Unterscheidung zwischen Infektions- und Kontrollgruppe; diese AUC-Werte fassen die Trennschärfe innerhalb der Analysekohorte zusammen, ohne einen separaten externen Validierungssatz zu verwenden. Eine Sensitivitätsanalyse mittels multipler Imputation durch verkettete Gleichungen (m = 20) ergab Schätzungen, die innerhalb von 5 % der kompletten Fall-Mediane für jeden Analyten lagen, und veränderte die Rangfolge der Effektgrößen nicht.
Vorab festgelegte Sensitivitätsanalysen wurden verwendet, um den Einfluss einer vorherigen Antibiotika-Exposition und der Pneumonie-Subtypen auf die beobachteten Zytokinunterschiede zu bewerten. Als die primären Gruppenvergleiche wiederholt wurden, nachdem die 41 Teilnehmer der Infektionsgruppe (64,1 %), die innerhalb von 72 h vor der BAL Antibiotika erhalten hatten, ausgeschlossen worden waren, blieben alle 13 Analyten bei den verbleibenden 23 Infektionsfällen im Vergleich zu den Kontrollen nach Korrektur mittels BH-FDR signifikant erhöht (angepasstes p < 0,001 für die fünf führenden Diskriminatoren), mit Punktschätzungen, die leicht höher als niedriger waren als die Medianwerte der Gesamtkohorte (beispielsweise CXCL8/IL-8 2.860 [980–7.110] pg/mL und IL-1β 92 [34–210] pg/mL), was mit einer teilweisen Dämpfung der Atemwegszytokine durch die Antibiotikagabe vor der BAL übereinstimmt. Die Aufteilung der Infektionsgruppe nach Pneumonie-Subtypen zeigte dieselbe Rangfolge von Chemokinen und proinflammatorischen Zytokinen über die ambulant erworbene Pneumonie (n = 35), nosokomiale Pneumonie (n = 19) und beatmungsassoziierte Pneumonie (n = 10) hinweg, wobei die Subgruppe der beatmungsassoziierten Pneumonie die höchsten Medianwerte für CXCL8, CXCL1, IL-6 und G-CSF aufwies, und der Zustand der mechanischen Beatmung veränderte die Richtung keines der Gruppenvergleiche.
Abbildung 3: Visualisierung der inflammatorischen Zytokingprofile in BALF. Hierarchische Cluster-Heatmap der log₁₀-transformierten und z-score-normalisierten Konzentrationen der 13 gemessenen Analyten über alle 112 Teilnehmer hinweg, mit farbigen Anmerkungsleisten oberhalb der Heatmap, die die Gruppenzugehörigkeit (Kontrolle, Infektion), die Pneumonie-Subtypen (CAP, HAP oder VAP) sowie die Kategorie der verursachenden Pathogene (gramnegativ, grampositiv, atypisch, viral oder Mischinfektion) anzeigen. Boxplots der am stärksten differenziell exprimierten Zytokine (CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF und TNF-α; log₁₀-Skala, pg/mL) vergleichen die Infektions- und Kontrollgruppen. *** p < 0,001 nach Korrektur der Fehlentdeckungsrate nach Benjamini–Hochberg (BH). Abkürzungen: BALF = bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = ambulant erworbene Pneumonie; HAP = nosokomial erworbene Pneumonie; VAP = beatmungsassoziierte Pneumonie. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Gekoppelte Visualisierung der Neutrophilenrekrutierung und Zytokinprofile
Die Kopplung der zellulären und löslichen Kompartimente zeigte eine starke biologische Verbindung zwischen der Rekrutierung von Neutrophilen und dem Chemokin-System, wie in Abbildung 4 dargestellt. Eine zweidimensionale Darstellung wurde aus der Hauptkomponentenanalyse (PCA) der standardisierten zellulären und Zytokin-Matrix abgeleitet, wobei PC1 51,1 % der gesamten Varianz und PC2 weitere 12,7 % erklärte, was insgesamt 63,8 % ergab. PC1 trennte die Infektionsgruppe von den Kontrollen, gekennzeichnet durch hohe positive Ladungen für BALF-Neutrophile, CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β und G-CSF sowie hohe negative Ladungen für Makrophagen. PC2 unterschied zwischen einer chemokinreichen Trajektorie (hohe positive Ladungen für CXCL8 und CXCL1) und einer regulatorreichen Trajektorie (positive Ladungen für IL-10, IL-1RA und IFN-γ), sodass sich innerhalb der Infektionsgruppe die Probanden entsprechend der Schwere einteilten, wobei Fälle von maschinell beatmeten, beatmungsassoziierten Pneumonien im chemokinreichen Quadranten lagen.
Paarweise Spearman-Rangkorrelationen zwischen 17 zellulären und löslichen Merkmalen ergaben eine starke positive Korrelation zwischen der BALF-Neutrophilenanzahl und der gesamten Chemokinachse (CXCL8 ρ = 0,78; CXCL1 ρ = 0,74; CCL3 ρ = 0,69; CCL2 ρ = 0,61; CXCL10 ρ = 0,54; alle angepassten p < 0,001). Die zweite Stufe signifikanter Korrelationen zeigte sich zwischen den Neutrophilenanzahlen und der proinflammatorischen Achse (G-CSF ρ = 0,65; IL-1β ρ = 0,62; IL-6 ρ = 0,58; TNF-α ρ = 0,51), gefolgt von moderaten positiven Korrelationen mit der regulatorischen Achse (IL-10 ρ = 0,45; IL-1RA ρ = 0,48). Der Prozentsatz der Makrophagen wies eine gespiegelt negative Korrelation mit sowohl der Chemokin- als auch der proinflammatorischen Achse ähnlicher Stärke auf. Innerhalb der Achsen waren die Korrelationen deutlich stärker als zwischen den Achsen (Median |ρ| innerhalb der Achse = 0,68 vs. Median |ρ| zwischen den Achsen = 0,33), was das Konzept gemeinsamer upstream-regulatorischer Signalwege unterstützt, die die Chemokin-, proinflammatorische und regulatorische Achse steuern.
Das Korrelationsnetzwerk bildete diese Kopplung in einem Graphen ab, bei dem die neutrophilen Zellen im BALF den zentralsten Hub-Knoten darstellten, wobei alle 13 Verbindungen zu Zytokinen nach der BH-Korrektur für Mehrfachvergleiche signifikant blieben. Von den 136 möglichen paarweisen Verbindungen zwischen den 17 Merkmalen erfüllten 99 das gemeinsame Kriterium von |ρ| ≥ 0,30 und BH-angepasstem p < 0,05 und wurden beibehalten. Der Korrelationsnetzwerk-Graph zeigte eine klare dreiblockige modulare Architektur, die die aus der hierarchischen Clusterung erhaltenen Gruppen widerspiegelte: Die dichtesten und stärksten Verbindungen bestanden zwischen dem Chemokin-Modul und der Anzahl beziehungsweise dem Anteil neutrophiler Zellen im BALF; verbindungen mittlerer Stärke verknüpften das proinflammatorische Modul sowohl mit den Neutrophilen als auch mit dem Chemokin-Modul; dünne Verbindungen des regulatorischen Moduls verbanden das Chemokin- und das proinflammatorische Modul. Der Knoten für den Makrophagenanteil befand sich gegenüber dem Neutrophilen–Chemokin-Block und war über einen Fächer negativ gewichteter Kanten damit verbunden. Insgesamt zeigten die Hauptkomponentenanalyse (PCA), die Korrelationsmatrix und der Netzwerkgraph ein kohärentes Muster, bei dem die Infiltration neutrophiler Zellen in das BALF und die Chemokinantwort auf individueller Teilnehmerebene stark assoziiert sind, während die proinflammatorischen und regulatorischen Signalwege als klar definierte, jedoch miteinander verbundene Module um diese Neutrophilen–Chemokin-Achse angeordnet sind.
Abbildung 4: Gekoppelte Visualisierung der Rekrutierung von Neutrophilen und der Profile entzündlicher Zytokine. Biplot der Hauptkomponentenanalyse der standardisierten Matrix aus zellulären Parametern und Zytokinen, mit Probanden farbkodiert nach Gruppe, Spearman-Korrelations-Heatmap sowie Netzwerkgraph aller 17 zellulären und löslichen Merkmale (Knoten nach Grad gewichtet, Kanten nach |ρ| skaliert und gefiltert nach BH-adjustiertem p < 0,05 sowie |ρ| ≥ 0,30), wobei der Neutrophilen-Chemokin-Hub hervorgehoben ist. Abkürzungen: BH = Benjamini–Hochberg; PC = Hauptkomponente. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
VERFÜGBARKEIT VON DATEN:
Der anonymisierte Datensatz auf Teilnehmerebene und der verwendete R-Analysecode dieser Studie sind als Zusätzliche Tabelle S1 und Zusätzliche Datei 1 verfügbar. Weitere Daten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, können auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor angefordert werden.
Ergänzungstabelle S1: BALF-Datensatz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzdatei 1: Eine ZIP-Datei mit Analysecode. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Die Robustheit dieses Protokolls hängt von einigen Entscheidungen ab, die vor und während der Analyse getroffen werden. Die Festlegung der unteren Grenze der Wiederfindungsrate bei 40 % und die Kombination der zweiten und nachfolgenden Aliquots erfolgte gezielt, da der erste Aliquot eine stärkere Anreicherung bronchialer Atemwegsmaterialien enthält, während die Wiederfindungsrate systematisch mit Alter, Geschlecht, Rauchgeschichte und dem Zielbronchus variiert18. Das Blockieren von Fc-Rezeptoren und das Titrieren von Antikörpern gegen einzelne Klone, um korrekte Gating-Grenzen zwischen reifen CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ Neutrophilen und CD14⁺HLA-DR⁺ alveolären Makrophagen (die dominierenden Zellen in der BALF-Probe mit der höchsten unspezifischen Färbung und Autofluoreszenz-Untergrund) sicherzustellen, ist entscheidend, um die Konsistenz zwischen den beiden Gruppen aufrechtzuerhalten19,20. Auch die Beschränkung durch Einfrieren–Auftauen und der Zeitrahmen von 2 Stunden für die Multiplex-Analyse sind nicht willkürlich. Daten an menschlichem BALF zeigten eine signifikante Abnahme der Neutrophilenanteile zwischen 6 und 24 Stunden, selbst bei Lagerung bei 4 °C, während die Anteile von Makrophagen und Lymphozyten konstant blieben13. Die Parameter für die t-SNE- und UMAP-Algorithmen sowie die Parameter für das FlowSOM-100-Knoten-Raster und für 12–15 Metacluster wurden bereits vor der Analyse der Gruppen festgelegt, um nachträgliche Anpassungen zu vermeiden, die eine bekannte Ursache für die Irreproduzierbarkeit von Zytometrie-Pipelines darstellen16. Operatoren- und Platten/Lauf-Identifikation können weiterhin pro Zellereignis beibehalten werden, um in zukünftigen groß angelegten Analysen Batch-Korrekturmethoden anzuwenden21.
Es gibt mehrere häufige Fehlerquellen, die keine Änderungen am Protokoll erfordern. Eine geringe Rückgewinnung (<40 %) resultiert typischerweise aus unzureichender Keilpositionierung oder übermäßiger Absaugung; dieses Problem lässt sich beheben, indem die Position des Bronchoskops angepasst und die Absaugung vor dem Ansaugen einer weiteren Aliquoten auf <100 mmHg reduziert wird. Starke Autofluoreszenz von alveolären Makrophagen, die den wichtigsten Störfaktor bei der Durchflusszytometrie von Lungenzellen darstellt, kann durch die Mitführung von unbehandelten Lungenzellkontrollen in jeder Probecharge sowie durch eine klare Definition des Gates für Makrophagen mit hohem Seitenstreulichtsignal gemildert werden, anstatt sich ausschließlich auf Vitalitätsfarbstoffe zu verlassen19. Multiplex-Panels sind häufig durch niedrige Bead-Zahlen und ausreißerhafte hohe Werte beeinträchtigt. Das Durchführen einer vorläufigen Verdünnungskurve für eine Teilmenge infizierter und Kontrollproben vor Festlegung einer 1:2-Verdünnung verhindert Signalüberlastung von CXCL8, CXCL1 und G-CSF, die sich im oberen Bereich der Standardkurve für Pneumonieproben befinden, aufgrund des zuvor beschriebenen Matrixeffekts in BALF-Proben22. Das Protokoll kann zusätzlich an spezifische Kohortenmerkmale angepasst werden. Wenn Proben vorwiegend einen einzigen Pathogentyp enthalten, ist es sinnvoll, das Kernpanel auf Chemokine und proinflammatorische Mediatoren zu beschränken, um ausreichende statistische Aussagekraft zu bewahren. Bei einer gemischten Population aus Bakterien, Viren und atypischen Pathogenen ist es dennoch vorteilhaft, auch regulatorische Mediatoren zu messen, da kürzlich nachgewiesen wurde, dass eine pathogen-spezifische Signatur in alveolären Neutrophilen und Makrophagen existiert23, und eine Kombination aus proinflammatorischen und regulatorischen BALF-Zytokinen als Spiegelbild der Krankheitsschwere bei ambulant erworbenen Pneumonien gezeigt wurde24.
Der Beitrag des vorliegenden Arbeitsablaufs liegt nicht in der einzeln betrachteten Beobachtung des neutrophilen Einwanderungseffekts oder der Erhöhung von Chemokinen und proinflammatorischen Zytokinen bei Atemwegsinfektionen – beides ist umfassend dokumentiert –, sondern in der Kopplung eines siebenmarkerbasierten Durchflusszytometrie-Panels für Neutrophile und Monozyten mit einem 13-Analyten-Multiplex-Immunoassay an eine gemeinsame Visualisierungspipeline, die auf derselben BALF-Probe angewendet wird. Die Anwendung eines Sieben-Marker-Panels, das auf Neutrophile und Monozyten abzielt, zusammen mit einem 13-Analyten-Multiplex-Immunoassay, erfasst die phänotypische und zytokinäre Komplexität; ohne diese Kombination wäre die Analyse auf mehrere unabhängige Tests angewiesen, die ein weitaus größeres Volumen an BALF erfordern würden, als bei einer normalen Bronchoskopieprobe erhältlich ist. Ersteres steht im Einklang mit früheren Arbeiten, die zeigen, dass die mehrfarbige Durchflusszytometrie bezüglich der Identifizierung von Zelltypen in BALF-Proben genauso zuverlässig ist wie die manuelle Mikroskopie15, während die Akzeptanzkriterien für Letzteres bewährte Verfahren aus einem anerkannten multizentrischen Eignungsprogramm für multiplex-basierte Bead-Assays widerspiegeln16. Insbesondere die kombinierte Heatmap, Netzwerkdarstellung und PCA, die anhand identischer standardisierter Eingabedaten erstellt wurden, offenbaren Zusammenhänge zwischen Zelltypen und ihren assoziierten Faktoren, die zuvor nur durch die Summierung unabhängiger Balkendiagramme indirekt erschlossen werden konnten. Dies ist von Bedeutung, da aus BALF stammende Chemokine wie CXCL8, CCL2 und CCL3 gemeinsam wirken, um Neutrophile und Monozyten aus einem gemeinsamen Blutbett zu rekrutieren, und ihre gemeinsame Struktur Informationen enthält, die nicht aus einzelnen, unabhängigen Einzelanalyten hervorgehen9,10. Da BALF bereits routinemäßig zu klinischen Zwecken gewonnen wird und kein zusätzliches Volumen benötigt, kann der Arbeitsablauf als translationsorientierte Erweiterung bestehender Bronchoskopiedienste positioniert werden, anstatt als eigenständiges diagnostisches Verfahren.
Die praktische Durchlaufzeit des gesamten Workflows, der den Probentransport, die Färbung, den Durchflusszytometrie-Erwerb, die Inkubation und Auswertung des Multiplex-Assays sowie die nachgeschaltete rechnergestützte Analyse umfasst, liegt unter Laborbedingungen in der Größenordnung von 24 Stunden. Der Workflow ist daher als tiefgreifendes Phänotypisierungswerkzeug für die mechanistische Charakterisierung und die Überwachung der Behandlungsreaktion konzipiert und nicht als akutes bettseitiges Triagemittel für zeitkritische Entscheidungen, wie die unmittelbare Unterscheidung zwischen einer ventilatorassoziierten Pneumonie und einem sterilen akuten respiratorischen Distresssyndrom, für die schnellere mikrobiologische und Einzelmarker-Biomarker-Assays weiterhin den Standard der Versorgung darstellen.
Es gibt mehrere Einschränkungen, die erwähnt werden müssen. BALF wird aus dem Luftraum gewonnen und spiegelt die unmittelbaren Oberflächenwechselwirkungen des Luftraums wider, enthält jedoch keine Zellen, die in der alveolären Wand und im Septum lokalisiert sind, wo sich viele aktivierte Makrophagen und gewebe-residente Lymphozyten befinden. Daher besteht kein eindeutiges Verhältnis zwischen dem Immunstatus des Luftraums und dem des Parenchyms, was mit zuvor veröffentlichten Daten übereinstimmt25. Die multiplex-basierte Nachweismethode mittels Mikrokügelchen leidet unter Antikörper-Kreuzreaktivität sowie Matrixeffekten, die im Vergleich zum Blutserum besonders im mukin- und surfactanthaltigen Milieu des BALF ausgeprägt sind; außerdem lässt sich die Verdünnung der epithelialen Auskleidungsflüssigkeit mit Kochsalzlösung durch keine der endogenen Marker wie Harnstoff nicht überwinden, was mit kürzlich veröffentlichten Kritiken übereinstimmt26. Das zurückgewonnene Lavagevolumen war in der Infektionsgruppe im Durchschnitt um 6 mL niedriger als in der Kontrollgruppe, sodass die hier berichteten absoluten Konzentrationen einer moderaten Gruppenunterschiede im Verdünnungsfaktor unterliegen, und es wurde kein endogener Verdünnungsmarker angewendet. Eine vorherige antibiotische Therapie bei 41 der 64 Teilnehmer der Infektionsgruppe (64,1 %) könnte die Konzentrationen von Atemwegszytokinen und die Erregerisolierung abschwächen. Wichtig ist, dass das Protokoll lediglich eine Momentaufnahme zu einem einzigen Zeitpunkt während einer klinisch indizierten Bronchoskopie darstellt, wodurch eine Analyse der Kinetik der Neutrophilenrekrutierung, der maximalen Chemokinsekretion und deren Rückbildung bei einzelnen Patienten ausgeschlossen ist. Die AUC-Werte für Einzelanalyten wurden aus derselben Kohorte abgeleitet, die zur Biomarker-Identifizierung verwendet wurde, ohne eine unabhängige Validierungskohorte, und sollten daher als Maß für die Diskriminierung innerhalb der Kohorte und nicht als extern validierte diagnostische Leistung interpretiert werden; die Übernahme eines beliebigen Einzelmarker-Schwellenwerts in die klinische Praxis würde eine prospektive Validierung in einer unabhängigen multizentrischen Kohorte erfordern. Vorgegebene Sensitivitätsanalysen, beschränkt auf Proben mit höherer Rückgewinnung, auf antibiotikanaive Teilnehmer sowie stratifiziert nach Beatmungsstatus und nach Pneumonie-Subtyp (ambulant erworben, nosokomial erworben oder beatmungsassoziiert) änderten die Richtung der Gruppenvergleiche nicht.
In Zukunft könnten diese Einschränkungen behoben werden, indem Einzelzell-RNA-Sequenzierung oder CITE-seq an denselben BALF-Pellets durchgeführt werden, die bereits für die Protein- und Zellquantifizierung verwendet wurden und die in großen Kohorten bakterieller Pneumonien sowie pädiatrischer Mycoplasma-pneumoniae-Pneumonien erfolgreich angewendet wurden, um alveoläre Neutrophile und Makrophagensubtypen sichtbar zu machen, die mittels traditioneller Durchflusszytometrie nicht unterscheidbar sind27,28. Die Integration der aus den Atemwegsanalysen gewonnenen Daten mit Informationen aus der bildgebenden Massenzytometrie oder der räumlichen Transkriptomik passender Biopsien oder sogar Obduktionsmaterial würde diesen Befunden einen Kontext verleihen29. Die Verknüpfung longitudinaler BALF-Probenahmen mit der Evaluierung von CXCR1/CXCR2-Antagonisten und der Blockade des IL-6-Rezeptors, die beide in schweren Pneumonien und beim akuten respiratorischen Distress-Syndrom (ARDS) Überlebens- oder organsupportive Vorteile gezeigt haben, würde es zudem ermöglichen, die durch diesen Workflow in den Vordergrund gerückte Neutrophilen-Chemokin-Achse als Entscheidungshilfe für therapeutische Maßnahmen zu testen30,31.
Zusammenfassend beschreibt diese Studie einen integrierten Visualisierungsworkflow, der standardisierte Verfahren zur Gewinnung und Aufbereitung von Bronchoalveolärflüssigkeit (BALF), ein siebenfarbiges Durchflusszytometrie-Panel zur Quantifizierung der Neutrophilen-Monocyten-Zusammensetzung, einen multiplexen Zytokin-Assay zur Messung von 13 Zytokinen sowie eine gemeinsame Visualisierungsplattform umfasst, die UMAP-, hierarchische Cluster-, Korrelationsnetzwerk- und PCA-Analysen beinhaltet. Durch Anwendung des Workflows auf eine prospektive Kohorte von 112 erwachsenen Patienten, die eine klinisch indizierte Bronchoskopie erhielten, identifizierte die Analyse einen auffälligen Übergang in der Zusammensetzung der alveolären Immunzellen von Makrophagen zu Neutrophilen bei infizierten Patienten, detektierte ein dreimodulares Zytokin-Antwortmuster und enthüllte eine stark gekoppelte Neutrophilen-Chemokin-Achse, die mit keiner Einzelmarkermessung nachweisbar ist. Das Verfahren basiert ausschließlich auf Material, das während der klinischen Diagnostik gewonnen wird, benötigt kein zusätzliches Probenvolumen und könnte in Laboratorien der tertiären Versorgung durchführbar sein, die für multiparametrische Durchflusszytometrie und multiplexe Bead-Array-Analysen ausgestattet sind. Eine breitere Anwendung sowie die Nutzung einzelner Analyten als diagnostische Biomarker erfordern eine prospektive Validierung in unabhängigen multizentrischen Kohorten. Die Studie stellt somit eine reproduzierbare und datenreiche Methodik zur Charakterisierung der Atemwegsentzündung bei respiratorischen Infektionen vor und bietet eine Grundlage für deren weitere Entwicklung hin zu longitudinalen Studien, Einzelzell- und räumlichen Analysen sowie zur therapeutischen Bewertung einer Immunmodulation, die auf die Neutrophilen-Chemokin-Achse abzielt.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Danksagungen
Wir danken allen Patienten und Freiwilligen, die an dieser Studie teilgenommen haben, ausdrücklich für ihre wertvolle Mitarbeit. Wir danken dem Ethikkomitee für die ethische Genehmigung (Genehmigungsnummer 2026HL-038) sowie für die normative Begleitung während des gesamten Forschungsprozesses.
Wir danken dem medizinischen Personal der Abteilung für Pneumologie, des Bronchoskopiezentrums und des klinischen Labors für ihre Unterstützung bei der Sammlung klinischer Proben, der Aufbereitung von Bronchoalveolärflüssigkeit und der mikrobiologischen Detektion. Wir danken auch der technischen Plattform des zentralen Krankenhauslabors für die Unterstützung bei Experimenten zur hochdimensionalen Durchflusszytometrie und zur multiplexen Zytokine-Profilanalyse.
Diese Forschung erhielt keine spezifische Förderung durch Finanzierungsagenturen in öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Bereichen.
Wir danken allen beteiligten Forschern, Technikern und Pflegekräften für ihre Bemühungen bei der Patientenscreening, Probenverwaltung, experimentellen Durchführung und Datenorganisation.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-human CD11b Antikörper, Brilliant Violet 421, Klon ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | Marker für Neutrophilenaktivierung; violetter Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD14 Antikörper, APC/Cyanine7, Klon M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | Marker zur Ausschlussbestimmung von Monozyten-Makrophagen; roter Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD15 Antikörper, PE, Klon HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | Marker für die Neutrophilenlinie; blauer Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD16 Antikörper, Brilliant Violet 510, Klon 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | Marker für Neutrophilenreifung und NK-Zellen; violetter Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD45 Antikörper, PerCP, Klon HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | Pan-Leukozyten-Marker; blauer Laserkanal URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Anti-human CD66b Antikörper, FITC, Klon G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | Granulozyten-Marker; blauer Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human HLA-DR Antikörper, PerCP/Cyanine5.5, Klon L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | Marker für antigenpräsentierende Zellen; blauer Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Automatischer Hämatologieanalysator (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | Gerät (Modell XN-1000) | Wird zur Bestimmung der Gesamtanzahl kernhaltiger Zellen zur Berechnung absoluter Neutrophilen verwendet URL: https://www.sysmex.com |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | Wird im Durchflusszytometrie-Färbepuffer verwendet (0,5 % m/V in PBS mit 2 mM EDTA) URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| ComplexHeatmap-Paket (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.20 (Open-Source) | Wird zur Erstellung von Hierarchischen Clustering-Heatmaps multiplexer Zytokindaten verwendet URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Zentrifugenspinner (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | Wird zur Herstellung von Zytologiescheiben aus BALF-Zellsuspension verwendet URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| Erythrozytenlyselösung (BD FACS Lysing Solution, 10× Konzentrat) | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | Wird zur Lyse von Erythrozyten nach Oberflächenfärbung verwendet URL: https://www.bdbiosciences.com |
| Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | Wird im Durchflusszytometrie-Färbepuffer bei 2 mM verwendet URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| Fixierbarer Vitalitätsfarbstoff (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat. No. 423105 | Ausschluss von toten Zellen vor der Gating-Analyse; roter Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Flexibler Video-Bronchoskop | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Gerät (Modell BF-1TQ290) | Wird für die BAL unter mittlerer Sedierung verwendet URL: https://www.olympus-global.com |
| Multifarbiger Durchflusszytometer (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Gerät (Modell CytoFLEX LX, Sechs-Laser-Konfiguration) | Wird zur Erfassung des Sieben-Marker-Neutrophilen/Monozyten-Durchflusspanels verwendet URL: https://www.beckman.com |
| Software zur Durchflusszytometrie-Analyse (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Wird zur Kompensation und manuellen Gating-Analyse von FCS-Dateien verwendet URL: https://www.flowjo.com |
| FlowSOM-Paket (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.12 (Open-Source) | Wird für Self-Organizing-Map-Clustering und Meta-Clustering von Durchflusszytometriedaten verwendet URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (statistische Grafiksoftware) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | Wird zur Erstellung der endgültigen Abbildungen verwendet URL: https://www.graphpad.com |
| Humaner Fc-Rezeptor-Blockierreagenz (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | Blockierung von Fc-Rezeptoren vor der Antikörperfärbung URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| igraph-Paket (R) | CRAN | v2.0 (Open-Source) | Wird zur Konstruktion und Visualisierung des Korrelationsnetzwerkdiagramms verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Kryoröhrchen mit geringer Proteinbindung, 2,0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | Wird für Aliquots des BALF-Überstandes zur Zytokinanalyse verwendet URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Multiplex-Bead-basierte Immunoassay-Plattform (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Gerät (Modell MAGPIX) | Wird zur Erfassung des multiplexen Zytokinassays verwendet URL: https://www.luminexcorp.com |
| May-Grünwald-Giemsa-Färbelösung | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | Wird für die Differenzialzellzählung an Zytospin-Präparaten verwendet URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| mice-Paket (R) | CRAN | v3.16 (Open-Source) | Wird für multiple Imputation durch verkettete Gleichungen in der Sensitivitätsanalyse verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| Multiplex-magnetische Bead-Zytokin/Chemokin-Panels (13-Plex, kundenspezifisch; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | Kundenspezifisches Panel zur Messung der 13 Analyten, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben URL: https://www.merckmillipore.com |
| Nylon-Mesh-Zellsieb, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | Wird zur mechanischen Filtration von BALF zur Entfernung von Schleimklumpen verwendet URL: https://www.corning.com |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | Grundpuffer zur Zellresuspension und -färbung URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| pROC-Paket (R) | CRAN | v1.18 (Open-Source) | Wird zur Erstellung von ROC-Kurven und AUC-Werten verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (statistische Berechnungsumgebung) | R Core Team | v4.4 (Open-Source) | Plattform für statistische Analysen und Visualisierungen URL: https://www.r-project.org |
| rstatix-Paket (R) | CRAN | v0.7 (Open-Source) | Wird für Gruppenvergleiche und Korrelationsstatistiken verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Rtsne-Paket (R) | CRAN | v0.17 (Open-Source) | Wird für t-SNE-Embeddings verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Einfachgefärbte Kompensationsperlen (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | Wird für Einzelfarben-Kompensationskontrollen verwendet URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| Natriumchloridlösung zur Injektion, 0,9 % (sterile Kochsalzlösung) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | Wird für die BAL-Instillation verwendet (100–150 mL, 20–40 mL Aliquots bei 37 °C) URL: https://www.baxter.com |
| uwot-Paket (R) | CRAN | v0.2 (Open-Source) | Wird für die UMAP-Dimensionalitätsreduktion verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (Software zur Erfassung und Kurvenanpassung von Multiplex-Assays) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Gerätespezifische Software für die 5PL-Standardkurvenanpassung URL: https://www.luminexcorp.com |
Referenzen
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