Diese Studie stellt einen integrierten Visualisierungsworkflow vor, der standardisierte Probenahme und Aufbereitung von Bronchoalveolärflüssigkeit, ein siebenfarbiges Durchflusszytometrie-Panel, einen multiplex Zytokin-Assay mit 13 Analyten und eine einheitliche Analyse-Pipeline kombiniert.
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Forschungsartikel
Integrierte Visualisierung der Neutrophilenrekrutierung und Profilierung inflammatorischer Zytokine in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) ist die am direktesten zugängliche Probenmatrix zur Untersuchung von Entzündungen der unteren Atemwege. Herkömmliche Analysen stützen sich jedoch auf Einzelmarkierungs-Durchflusszytometrie in Kombination mit analytspezifischen ELISA-Verfahren (enzyme-linked immunosorbent assay), einer Methode, die die Informationsdichte begrenzt und die Kopplung zwischen Zellen und Faktoren verschleiert. Diese Studie stellt einen integrierten Visualisierungsworkflow vor, der standardisierte Probennahme und Vorverarbeitung mit einem Sieben-Marker-Panel zur Durchflusszytometrie von Neutrophilen und Monozyten, einem Multiplex-Zytokinassay für 13 Analyten sowie einer einheitlichen Analyse-Pipeline verbindet, die auf uniformer Mannigfaltigkeitsapproximation und Projektion (UMAP), FlowSOM-Metaklusterung, hierarchischer Clusterung, Spearman-Korrelationsnetzwerken und Hauptkomponentenanalyse (PCA) basiert.
Der Workflow wurde auf eine single-center prospektive Kohorte von 112 Erwachsenen angewandt, die eine Bronchoskopie durchliefen, bestehend aus 64 Patienten mit mikrobiologisch bestätigter pulmonaler Infektion und 48 Nicht-Infektionskontrollen. Zytologische und durchflusszytometrische Auswertungen zeigten eine deutliche Verschiebung von einem makrophagen-dominierten zu einem neutrophilen-dominierten alveolären Profil während der Infektion, wobei der Neutrophilenanteil von einem Median von 3,2 % auf 68,4 % anstieg und die absolute Neutrophilenkonzentration sich etwa 50-fach erhöhte. Die multiplexbasierte Profilierung identifizierte eine koordinierte dreimodulare Zytokinantwort, bei der Chemokin-, proinflammatorische und regulatorische Module alle hochreguliert waren, wobei CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α und G-CSF innerhalb der Studienkohorte die stärkste Einzelmarkeraussagekraft aufwiesen (Fläche unter der Kurve [AUC] 0,89 bis 0,94). Eine integrative Visualisierung mittels PCA, einer Korrelationsmatrix und eines Netzwerkgraphen zeigte auf Teilnehmerebene eine eng gekoppelte Neutrophilen–Chemokin-Achse, wobei die Neutrophilenanzahl im BALF als zentraler Netzwerkknoten hervortrat.
Der Workflow nutzt ausschließlich Material, das routinemäßig aus klinisch indizierten BAL-Proben gewonnen wird, erfordert kein zusätzliches Probenvolumen und liefert ein informationsreiches Gerüst zur Aufklärung der Atemwegsentzündung bei respiratorischen Infektionen, das in Laboratorien der tertiären Versorgung mit Multiparameter-Durchflusszytometrie und Multiplex-Bead-Array-Plattformen umsetzbar sein könnte und sich für Längsschnitt-, Einzelzell- sowie Therapieevaluierungsstudien eignet. Eine breitere klinische Anwendung einzelner Analyten als Biomarker wird eine prospektive Validierung in unabhängigen multizentrischen Kohorten erfordern.
Einleitung
Infektiöse Todesfälle durch Atemwegsinfektionen der unteren Atemwege stellen weiterhin eine bedeutende Ursache für die weltweite Sterblichkeit dar, obwohl Fortschritte bei Impfstrategien und Behandlungsmodalitäten erzielt wurden; dies gilt dennoch besonders für pädiatrische und ältere Bevölkerungsgruppen1. Neutrophile sind die primären Zellen, die in den frühen Stadien einer angeborenen Immunantwort im betroffenen Respirationstrakt beschrieben werden – ein Prozess, der für die Eliminierung des eindringenden Erregers entscheidend ist; jedoch führt eine unkontrollierte neutrophile Entzündungsreaktion zum Zusammenbruch der alveolokapillären Barriere, zu oxidativem Gewebeschaden und zur Entstehung eines akuten Atemnotsyndroms (ARDS)2,3. Neutrophile im Lungengewebe weisen zudem Rekrutierungskinetiken, Retentionsmuster und Effektorverhalten auf, die sich von denen in anderen Geweben unterscheiden, und diese Unterschiede beeinflussen, ob die Infektion abklingt oder sich zu einer schweren Pneumonie entwickelt4.
Die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) ist eine wichtige Informationsquelle zum alveolären Mikromilieu und bietet die genaueste Darstellung der klinischen Immunität an dieser Stelle5. Der Chemokinrezeptor CXCL8 spielt eine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung von Neutrophilen in die Lunge über seine Rezeptoren CXCR1 und CXCR2, zusammen mit anderen Chemokinen wie CXCL1, CXCL2 und CXCL56. Die Zytokine IL-1β, IL-6 und TNF-α verstärken diesen Prozess weiter, während IL-10 als entgegenwirkendes Zytokin fungiert. Ihre Konzentrationen in der BALF korrelieren mit der Schwere von Lungeninfektionen und der Entwicklung von Lungenkomplikationen infolge bakterieller, viraler und atypischer Pneumonie7, und multiplexe Biomarkerprofile in der BALF werden zunehmend zur früheren Diagnose und Differenzierung von Erregern bei Infektionen der unteren Atemwege eingesetzt8.
Routinemäßige BALF-Tests erfassen gewöhnlich die zugrundeliegende Biologie des Tests nicht vollständig. Zellzahlen können durch manuelle Differenzierung der Zellen in Zytospin-Proben geschätzt werden, während lösliche Mediatoren mittels einzelner Enzym-gekoppelter Immunosorbens-Assays (ELISA) gemessen und als Balkendiagramm dargestellt werden. Chemokine, Zytokine und jede Zellart werden getrennt voneinander bewertet, ohne dass ein Zusammenhang zwischen einem bestimmten Chemokin-Konzentrationsgradienten und den Zellpopulationen hergestellt wird, auf die er in der Probe wirkt. Die Kombination aus Zytokin-Modulen, Chemokin-Neutrophilen-Dosis-Wirkungs-Beziehungen und Patientensubpopulationen mit individuellen Entzündungssignaturen wird häufig übersehen, wenn keine multivariate Analyse durchgeführt wird9.
Fortschritte in der Datenverarbeitung machen einen solchen ganzheitlichen Ansatz zunehmend realistisch. Die Kombination von multiparametrischer Durchflusszytometrie und spektraler Durchflusszytometrie mit Methoden zur Dimensionsreduktion, wie der t-verteilten stochastischen Nachbarn-Einbettung (t-SNE) oder der uniformen Mannigfaltigkeitsapproximation und Projektion (UMAP), ermöglicht die Abbildung hochdimensionaler Immunphänotypen in einen zweidimensionalen Raum, wobei sich UMAP bei Anwendung auf Zytometriedaten als überlegen hinsichtlich der Erhaltung der globalen Topologie und Reproduzierbarkeit erwiesen hat10. Mehrparametrige Zytokinspektren, gefolgt von hierarchischem Clustering und Korrelationsnetzwerken, helfen dabei, mit der Krankheitsschwere korrelierende Signaturen zu identifizieren, die mit Einzelzytokin-Ansätzen nicht erkennbar sind11. Trotz der Fortschritte in diesem Bereich existiert bisher kein Workflow, der diese Methoden kombiniert, um die Rekrutierung von Neutrophilen und Zytokinsignaturen an denselben BALF-Proben bei Atemwegsinfektionen zu untersuchen. Diese Studie beschreibt einen integrierten Visualisierungsworkflow zur Untersuchung der Neutrophilenrekrutierung mittels Zytologie und multiparametrischer Durchflusszytometrie, gefolgt von UMAP- und Zytokinsignaturanalysen mittels multiplexen Immunoassays, hierarchischem Clustering, Korrelationsmatrizen und Hauptkomponentenanalyse. Der Workflow liefert eine integrierte Visualisierung, die zelluläre und lösliche Immunparameter der Atemwege in einer einzigen Grafik zusammenfasst, basierend auf BALF-Proben, die routinemäßig im Rahmen klinisch indizierter Bronchoskopien bei Infektionen der unteren Atemwege gewonnen werden.
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Protokoll
Studienpopulation und Ethik
Es handelte sich um eine singlezentrische, prospektive Beobachtungsstudie, die zwischen Januar 2026 und April 2026 an einem tertiären Lehrkrankenhaus durchgeführt wurde. Das Protokoll wurde unter der Genehmigungsnummer 2026HL-038 genehmigt, und vor jeder Studienprozedur wurde von jedem Teilnehmer eine schriftliche, informierte Einwilligung eingeholt.
Erwachsene im Alter von 18 bis 75 Jahren, die sich im Rahmen der routinemäßigen klinischen Versorgung einer diagnostischen flexiblen Bronchoskopie mit Bronchoalveolärer Lavage (BAL) unterzogen, wurden nacheinander rekrutiert und basierend auf ihren endgültigen klinischen und mikrobiologischen Diagnosen einer Infektionsgruppe oder einer Nicht-Infektions-Kontrollgruppe zugewiesen. Eine Übersicht über den integrierten Visualisierungsworkflow, von der Rekrutierung der Patienten bis hin zu den integrierten visuellen Ausgaben, ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Übersicht über den integrierten Visualisierungsworkflow zur BALF-basierten Profilierung der Neutrophilen-Rekrutierung und entzündlicher Zytokinantworten. Die fünf Stufen fassen von links nach rechts die prospektive Rekrutierung der Infektions- und Kontrollgruppen mittels Bronchoskopie und BAL, die Vorverarbeitung des BALF in ein Zellpräparat und eine Überstandfraktion, parallele zelluläre (Wright–Giemsa-Zytologie und multiparametrige Durchflusszytometrie) und lösliche (13-plex beadbasiertes Immunoassay) Messungen, die einheitliche Visualisierungspipeline (UMAP mit FlowSOM-Metaklusterung, hierarchische Heatmap, Hauptkomponentenanalyse und Spearman-Korrelationsnetzwerk) sowie die integrierte visuelle Ausgabe zusammen. Abkürzungen: BAL = Bronchoalveoläre Lavage; BALF = BAL-Flüssigkeit; UMAP = Uniform Manifold Approximation and Projection. Klicken Sie bitte hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Die Einchlusskriterien für die Infektionsgruppe waren wie folgt: (1) Patienten, bei denen gemäß den Leitlinien der Infectious Diseases Society of America (IDSA) und der American Thoracic Society (ATS) eine ambulant erworbene Pneumonie (CAP), eine nosokomiale Pneumonie (HAP) oder eine beatmungsassoziierte Pneumonie (VAP) diagnostiziert wurde; (2) Nachweis eines oder mehrerer Erreger mittels BALF-Kultur mit ≥104 koloniebildenden Einheiten (CFU)/mL, multiplex Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus Atemwegsproben, metagenomischer Next-Generation-Sequenzierung von BALF oder spezifischer Antigen-/Antikörpertestung aus gepaarten Atemwegs-/Serumproben.
Die Kriterien für die Kontrollgruppe waren wie folgt: (1) nichtinfektiöse Gründe für eine Bronchoskopie, bestehend aus der Beurteilung eines unklaren Lungennoduls, abnormen radiologischen Befunden, die keine Infektion nahelegen, oder der Untersuchung einer chronischen Bronchitis; (2) kein akuter pulmonaler Infekt, belegt durch negative Ergebnisse mikrobiologischer Tests und das Fehlen jeglicher Anzeichen von Entzündung oder systemischer Infektion zum Zeitpunkt der Bronchoskopie; sowie (3) keine Einnahme von Antibiotika in den 30 Tagen vor der Teilnahme. Die Kontrollpersonen wurden aus Patienten rekrutiert, die aufgrund anderer klinisch indizierter pulmonaler Erkrankungen eine Bronchoskopie erhielten, und nicht aus gesunden Probanden, was der Population entspricht, aus der am Studienzentrum routinemäßig klinisch indizierte BAL-Proben gewonnen werden.
Ausschlusskriterien waren: (1) Malignität und/oder zytotoxische Chemotherapie in den letzten sechs Monaten; (2) HIV-Seropositivität; (3) Transplantation eines soliden Organs oder hämatopoetischer Stammzellen; (4) andauernde immunsuppressive Therapie mit einer täglichen Prednison-Äquivalentdosis von > 0,3 mg/kg über mehr als 3 Wochen; (5) schwangere oder stillende Frauen; (6) Vorgeschichte einer Blutungsneigung oder jegliche Kontraindikationen zur flexiblen Bronchoskopie; (7) vorbestehende schwere chronische Atemwegserkrankung (chronisch obstruktive Lungenerkrankung [COPD] nach Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD] Stadium III/IV, idiopathische Lungenfibrose, schwere persistierende Asthma, oder klinisch signifikante Bronchiektasen); (8) aktive Tuberkulose; (9) Teilnahme an einer anderen interventionellen Studie innerhalb der letzten 30 Tage. Die Bronchoalveoläre Lavage (BAL) wurde während der ersten Bronchoskopie durchgeführt, innerhalb von 72 Stunden nach der Aufnahme wegen Infektionen und innerhalb von 48 Stunden nach der Intubation bei beatmeten Patienten mit Infektionen.
Die Berechnung der Stichprobengröße konzentrierte sich auf das primäre zelluläre Ergebnis: die Anzahl der Neutrophilen in der BALF zwischen den Gruppen. Unter Berücksichtigung einer erwarteten Effektgröße von 0,6 SD zwischen infizierten und nicht infizierten Atemwegen sowie einer Drop-out-Rate von 15 % war eine minimale Stichprobengröße von 45 Probanden pro Gruppe erforderlich, um bei zweiseitigem α = 0,05 eine statistische Power von 80 % zu erreichen. Von 156 in Frage kommenden Kandidaten erfüllten 27 die Einschlusskriterien nicht (18 erfüllten hauptsächlich die Einschlusskriterien nicht, da innerhalb des vorgegebenen Zeitraums kein pathogener Erreger identifiziert werden konnte oder keine Zustimmung zum Verfahren selbst vorlag; 9 verstießen primär aufgrund einer aktiven Malignität oder einer Chemotherapie-Anamnese, chronischer Kortikosteroidanwendung, schwerer vorbestehender chronischer Lungenerkrankung oder einer Blutungsneigung gegen die Ausschlusskriterien). Die verbleibenden 129 Teilnehmer unterzogen sich einer Bronchoskopie. Anschließend wurden 17 Probanden aus der Studie ausgeschlossen (7 aufgrund einer unzureichenden BALF-Ausbeute < 40 %; 4 aufgrund Widerrufs der Einwilligung während des Krankenhausaufenthalts; und 6 aufgrund einer Neuklassifizierung der Probanden nach abschließender mikrobiologischer Beurteilung – 4 Kontrollkandidaten, bei denen anhand der Kulturergebnisse eine okkulte Infektion diagnostiziert wurde; sowie 2 Infektionskandidaten, bei denen nach der Kulturanalyse kein Hinweis auf eine Infektion bestand). Der endgültige Pool der Studienteilnehmer umfasste 112 Probanden: 64 mit Infektion und 48 ohne Infektion.
Sammlung und Vorbearbeitung der BALF
Die Bronchoskopie wurde von erfahrenen Untersuchern gemäß dem standardisierten institutsinternen Protokoll durchgeführt, das den veröffentlichten technischen Empfehlungen für die Bronchoalveolärlavage entspricht12. Lokal wurde Lidocain angewendet, und die Patienten erhielten eine moderate intravenöse Sedierung, während zusätzlich Sauerstoff verabreicht wurde, um die Sauerstoffsättigung (SpO₂) >92 % aufrechtzuerhalten. Das flexible Bronchoskop wurde eingeführt und in dem bronchopulmonalen Segment positioniert, in dem radiologische Auffälligkeiten vorlagen. Falls die radiologischen Veränderungen diffus oder nicht lokalisierbar waren, wurden das rechte mittlere Lappen- oder das linke Lingulasegment gewählt. Nach jeder Spülung wurde vorsichtig manuell mit einem Unterdruck <100 mmHg abgesaugt. Insgesamt drei bis fünf Spülungen mit jeweils 20–40 mL steriler Kochsalzlösung bei 37 °C, insgesamt 100–150 mL, wurden durchgeführt. Das Rückgewinnungsverhältnis wurde als das Verhältnis des zurückgewonnenen Volumens zum applizierten Volumen berechnet; nur Proben mit einer Rückgewinnung von ≥40 % wurden zur Analyse herangezogen.
Die gesammelten Proben aus der zweiten und folgenden Spülungen wurden vereinigt, um eine Bronchialkontamination zu verringern und eine alveoläre Anreicherung zu erzielen. Der Bronchoalveoläre-Lavage-Flüssigkeits-(BALF-)Pools wurde auf Eis gehalten und innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme verarbeitet, wobei aktuelle Erkenntnisse über Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung und Differenzialzählungen nach längerer Lagerung und Erwärmung menschlicher BALF-Proben berücksichtigt wurden13. Nach einer Filtration durch ein steriles Nylonnetz mit einer Porengröße von 70 Mikrometern, um den Schleim zu entfernen, die ausschließlich mechanisch durchgeführt wurde, ohne Zusatz eines mukolytischen oder entagglomerierenden Wirkstoffs wie Dithiothreitol, da Vorversuche zeigten, dass dies ausreichte, um Schleimklumpen zu entfernen, ohne die Integrität der nachgeschalteten Oberflächenepitope messbar zu beeinträchtigen, wurde die Flüssigkeit bei 400 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und in mehrere Portionen in kryovials mit geringer Proteinbindung für die Zytokanalyse aufgeteilt; die Zellen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,5 % Rinderserumalbumin und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) resuspendiert, wobei ein Teil für Zytologie und Durchflusszytometrie aufbewahrt wurde. Die Zytokproben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, bei –80 °C gelagert und vor der Verwendung keiner mehr als einer Auftau-Zyklus unterzogen.
Neutrophilen-Zytologie und Durchflusszytometrie zur quantitativen Bestimmung
Hinsichtlich der Zytologie wurden 100 µL der BALF-Zellsuspension mittels eines Zytospinns (siehe Materialtabelle) bei 300 ×g für 5 min auf einen Objektträger aufgetragen, luftgetrocknet und mit Wright-Giemsa gefärbt. Die Differenzialzählung wurde von einem medizinisch-technischen Assistenten für Hämologie ohne Kenntnis der medizinischen Vorgeschichte des Patienten durchgeführt, der jeweils mindestens 400 Zellen pro Objektträger zählte und die Anteile an Makrophagen, Lymphozyten, Neutrophilen und Eosinophilen bestimmte. Der prozentuale Anteil neutrophiler Granulozyten im BALF galt als primäres Outcome-Maß der zytologischen Untersuchung, da aktuelle Befunde auf dessen Nützlichkeit bei der Unterscheidung infektiöser von nichtinfektiösen Lungenerkrankungen bei Patienten mit pulmonalen Infiltraten hinweisen14.
Das Durchflusszytometrie-Quantifizierungsprotokoll basierte auf einer kürzlichen Validierung des Vier-Farben-Protokolls zur Differenzierung von Leukozyten in Bronchoalveolärem Lavagefluid (BALF)15 und beinhaltete zusätzliche Marker zur Identifizierung von Neutrophilen. Etwa 5 × 105 aus BALF isolierte Zellen wurden speziell mit einem humanen Fc-Rezeptor-blockierenden Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) 10 min bei 4 °C blockiert und anschließend 20 min bei 4 °C mit Antikörpern gegen CD45 (Klon HI30), CD66b (Klon G10F5), CD15 (Klon HI98), CD16 (Klon 3G8), CD11b (Klon ICRF44), CD14 (Klon M5E2) und HLA-DR (Klon L243) sowie einer fixierbaren Vitalitätsfarbe (siehe Tabelle der Materialien) gefärbt. Zur Erythrozytenlyse wurde 10 min bei Raumtemperatur eine kommerzielle Erythrozytenlyselösung verwendet (siehe Tabelle der Materialien). Nach der Erythrozytenlyse wurden die Zellen zweimal mit PBS, ergänzt mit 2 % fetalem Kälberserum, gewaschen, in Durchflusspuffer resuspendiert und anschließend mit einem Mehrfarben-Durchflusszytometer analysiert (siehe Tabelle der Materialien). Die Kompensation erfolgte mithilfe einfarbig gefärbter Kompensationsperlen (siehe Tabelle der Materialien), und für jedes Panel wurden Fluoreszenz-minus-eins- und ungefärbte Ansätze mitgeführt.
Für jede Probe wurden mindestens 1 × 105 CD45⁺-Ereignisse erfasst. Zunächst wurden Singuletts im FSC-A/FSC-H-Diagramm ausgewählt, gefolgt von lebenden (Viabilitätsfarbstoff⁻) CD45⁺-Leukozyten. Anschließend erfolgte der Ausschluss von CD14⁺HLA-DR⁺ Monocyten-Makrophagen, um CD66b⁺ Granulozyten mit hohem Seitenstreulichtsignal zu isolieren. Neutrophile wurden innerhalb der Granulozytenpopulation als CD15⁺CD16⁺CD11b⁺-Ereignisse definiert. Das primäre CD66b⁺-Granulozyten-Gate wurde dabei großzügig um alle Ereignisse mit hohem Seitenstreulichtsignal gelegt, anstatt sich auf den Bereich der CD15⁺CD16⁺CD11b⁺-Grenze zu beschränken, sodass auch CD16-schwach exprimierende, CD11b-stark exprimierende aktivierte Neutrophile sowie andere weniger reife Granulozytenformen in die gesamte automatisierte Neutrophilen-Zählung einbezogen blieben; die strengere Definition mittels CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ wurde erst separat für die Charakterisierung des reifen Neutrophilen-Subsets in den nachfolgenden Clusteranalysen verwendet. Die Neutrophilenkonzentration im BALF (Zellen/µL) wurde anhand des prozentualen Neutrophilenanteils und der Gesamtanzahl kernhaltiger Zellen, die mit einem automatischen Hämatologieanalysator bestimmt wurde, berechnet (siehe Tabelle der Materialien). Kompensationsmatrizen, die Gating-Strategie sowie individuelle Qualitätskontrollberichte wurden archiviert, und die Analysepersonen blieben während Erfassung und Auswertung für die Gruppenzugehörigkeit der Teilnehmer verblindet.
Multiplex-Analyse entzündlicher Zytokine
BALF-Überstände wurden einmal auf nassem Eis aufgetaut, kurz vortexiert und unmittelbar vor dem Assay durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 5 min bei 4 °C geklärt. Die Messung von 13 Analyten in drei Funktionskategorien erfolgte mithilfe einer multiplex-basierten, beadgekoppelten Immunoassay-Plattform mit einem kundenspezifischen magnetischen Bead-Panel (siehe Tabelle der Materialien). Die proinflammatorische Gruppe umfasste IL-1β, IL-6, IL-17A und TNF-α; die Chemokin-Gruppe umfasste CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 und CCL3/MIP-1α; und die regulatorische Gruppe umfasste IL-10, IFN-γ, IL-1RA und G-CSF. Die Auswahl der Analyten basierte auf denjenigen, die in multiplexbasierten Analysen von BALF- oder Serum-Zytokinen bei Studien zu Pneumonie bzw. schweren Atemwegsinfektionen am häufigsten als aussagekräftig berichtet wurden7,11. Der Verdünnungsfaktor (1:2 in Assaypuffer) wurde anhand eines Vorversuchs mit einem repräsentativen Teilsatz sowohl infizierter als auch kontrollierter Proben festgelegt, um sicherzustellen, dass >90 % der Messwerte innerhalb der Standardkurve lagen.
Die Standardkurven wurden mithilfe von siebenstufigen seriellen Verdünnungen der rekombinanten Standards des Herstellers ermittelt, die auf jeder Platte in doppelter Ausführung vorbereitet wurden, einschließlich eines Blank-Well zur Subtraktion der Hintergrundsignalisierung. Die Kurvenanpassung erfolgte mittels einer fünfgliedrigen logistischen Regression (5PL) durch die proprietäre Erfassungs- und Analyse-Software des Geräts (siehe Tabelle der Materialien). Die untere Quantifizierungsgrenze (LLOQ) wurde als die kleinste Menge des Standards definiert, die eine Rückrekonstitution (back-fit) mit einer Wiederfindungsrate zwischen 80 % und 120 % sowie einen intralaufenden Variationskoeffizienten (CV) ≤ 20 % ergab. Werte unterhalb der LLOQ wurden durch LLOQ/√2 ersetzt. Zwei gepoolte Qualitätskontrollproben aus bronchoalveolärem Lavagefluid (BALF), jeweils von einem repräsentativen infizierten Patienten und einem nicht betroffenen Probanden, wurden aliquotiert und jeder Platte hinzugefügt, um die Langzeitstabilität der Messungen zu überwachen. Die Qualitätsicherungsstandards basierten auf bewährten Empfehlungen, die aus einem zwölfjährigen, multizentrischen, multiplex-basierten Bead-Assay-Programm zur Leistungskontrolle abgeleitet wurden16, einschließlich der Anforderungen, dass der intra-assay-CV in Doppelbestimmungen ≤ 10 %, der inter-Platten-CV für die Qualitätskontrolle ≤ 20 % betragen muss und mindestens 50 Beads pro Analyt und pro Well gemessen werden müssen. Platten, die diese Kriterien nicht erfüllten, wurden erneut analysiert. Die Analyse erfolgte in einem einzigen Durchgang innerhalb von vier Wochen unter Verwendung einer einzigen Kit-Charge, wobei die Proben von infizierten und kontrollierten Probanden zufällig verteilt wurden.
Visualisierungspipeline zur Datenanalyse
Die Flow-Cytometry-Standard-(FCS-)Dateien wurden zunächst mithilfe einer kommerziellen Software für die Durchflusszytometrie analysiert (siehe Tabelle der Materialien), um Kompensation durchzuführen und lebende CD45⁺-Einfachzellen auszuwählen; anschließend wurden sie für eine unvoreingenommene Analyse in R v4.4. exportiert. Für jede Probe wurden 10.000 CD45⁺-Ereignisse heruntergerechnet und zusammengefügt, und die Signalintensitäten wurden mittels der arcsinh-Funktion mit einem Kofaktor von 150 transformiert. Die Dimensionsreduktion und UMAP-Projektionen wurden mit dem uwot-Paket bei 15 nächsten Nachbarn und einer minimalen Distanz von 0,1 durchgeführt, ergänzt durch parallele t-SNE-Embeddings mit dem Rtsne-Paket und einer Perplexität von 3010. Phänotyp-Cluster wurden mittels FlowSOM mit 100 Self-Organizing-Map-Knoten identifiziert und anschließend durch eine Meta-Clustering-Methode in 12–15 Cluster unterteilt, die auf einem optimierungsbasierten Ansatz beruht, der kürzlich für hochdimensionale Zytometriedaten validiert wurde17. Jeder Cluster wurde basierend auf dem medianen Expressionsniveau von Linien- und Aktivierungsmarkern annotiert und im Vergleich zu manuell gesetzten Toren überprüft.
Für die Analyse von multiplexen Zytokindaten wurden die Rohwerte zunächst log₁₀-transformiert und anschließend durch Z-Standardisierung zwischen den Analyten standardisiert, bevor weitere Analysen durchgeführt wurden. Sowohl Analyten als auch Patienten wurden einer hierarchischen Clusterung unterzogen, wobei der euklidische Abstand und die Ward.D2-Verknüpfungsmethode verwendet wurden; die Ergebnisse wurden in einer zeilen- und spaltengeclusterten Heatmap dargestellt. Ein solcher Ansatz diente der Identifizierung koexprimierter Zytokinmodule und der Klassifizierung von Patientensubgruppen in multiplexen entzündlichen Kohorten9. Für alle zellulären und löslichen Biomarker wurden Korrelationsmatrizen mithilfe paarweiser Spearman-Rangkorrelationen erstellt. Heatmaps der Korrelationsmatrizen wurden zusammen mit einem Netzwerk dargestellt, in dem Knoten für Biomarker stehen und Kanten Korrelationen anzeigen, die nach Mehrfachtestkorrektur mittels der Benjamini–Hochberg-Methode (BH) signifikant blieben. Die Kantenbreite wurde entsprechend der Betragsgröße des Korrelationskoeffizienten |ρ| skaliert, und Kanten wurden nur eingezeichnet, wenn |ρ| ≥ 0,30 und p < 0,05 nach Korrektur erreicht wurde. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde auf der standardisierten Matrix, die Zellen und Zytokine enthielt, mithilfe der Funktion prcomp() unter Anwendung einer Einheitsvarianz-Skalierung durchgeführt. Die Probanden wurden auf die ersten beiden Hauptkomponenten projiziert, wobei Infektions- und Kontrollgruppen überlagert wurden. Eine konsistente Downsampling- und Standardisierung aller Analysen gewährleistete die Vergleichbarkeit der Messwerte für zelluläre und lösliche Biomarker über alle Visualisierungen hinweg.
Statistische Analyse
Stetige Variablen wurden – je nach Ergebnis des Shapiro-Wilk-Tests auf Nicht-Normalverteilung – entweder als Median (interquartiler Bereich, IQR) oder als Mittelwert (Standardabweichung, SD) angegeben. Kategoriale Variablen wurden mittels Häufigkeiten und Anteilen beschrieben. Gruppenvergleiche erfolgten mit dem Mann-Whitney-Test. U Test, wenn kontinuierliche Variablen keine Normalverteilung aufwiesen, der Welch t-t-Test bei normalverteilten stetigen Variablen sowie Chi-Quadrat-Test bzw. Fishers exakter Test bei kategorialen Variablen, wenn anwendbar. Die Zusammenhänge zwischen stetigen Variablen wurden mittels des Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman bewertet. Um die Fehlentdeckungsrate (FDR) bei multiplexen Zytokin- und Korrelationsanalysen zu berücksichtigen, wurden die p-Werte mit der Methode von Benjamini–Hochberg korrigiert, wobei ein Grenzwert von q < 0,05. Zweiseitig p < Ein p-Wert von 0,05 wurde in allen primären Analysen als statistisch signifikant angesehen. Soweit möglich, wurden Fälle mit fehlenden Daten für einzelne Variablen beibehalten und mittels Complete-Case-Analyse für die betroffene Variable ausgewertet, während zur Durchführung von Sensitivitätsanalysen multiple Imputationen unter Verwendung verketteter Gleichungen (m = 20) durchgeführt wurden. Receiver-Operating-Characteristic-Kurven und die entsprechende Fläche unter der Kurve (AUC) wurden für einzelne Zytokine mithilfe des pROC-Pakets innerhalb der gesamten Studienkohorte erstellt; eine separate externe Validierungskohorte wurde nicht verwendet. Vorab festgelegte Sensitivitätsanalysen wiederholten die primären Gruppenvergleiche, nachdem Teilnehmer ausgeschlossen wurden, die innerhalb von 72 Stunden vor der Bronchoskopie Antibiotika erhalten hatten, sowie nach einer Stratifikation der Infektionsgruppe nach Beatmungsstatus und nach Pneumonie-Subtyp (ambulant erworben, nosokomial erworben oder beatmungsassoziiert). Die Analysen wurden mit den R-Paketen rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC und mice in R v4.4 durchgeführt. Die Abbildungen wurden mit kommerzieller wissenschaftlicher Grafiksoftware erstellt (siehe Materialienübersicht).
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Ergebnisse
Studienpopulation und Probenmerkmale
Die endgültige Analysestichprobe umfasste 112 Probanden, darunter 64 Probanden in der Infektionsgruppe und 48 Probanden in der Nichtinfektions-Kontrollgruppe. Die basislinienbezogenen demografischen Merkmale waren zwischen den Gruppen vergleichbar, während laborchemische Parameter im Zusammenhang mit Infektionen in der Infektionsgruppe höher lagen, wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Infektionen wurden hauptsächlich durch gra...
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Diskussion
Die Robustheit dieses Protokolls hängt von einigen Entscheidungen ab, die vor und während der Analyse getroffen werden. Die Festlegung der unteren Grenze der Wiederfindungsrate bei 40 % und die Kombination der zweiten und nachfolgenden Aliquots erfolgte gezielt, da der erste Aliquot eine stärkere Anreicherung bronchialer Atemwegsmaterialien enthält, während die Wiederfindungsrate systematisch mit Alter, Geschlecht, Rauchgeschichte und dem Zielbronchus variiert18. Das Blockieren von Fc-Rezeptoren u...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Danksagungen
Wir danken allen Patienten und Freiwilligen, die an dieser Studie teilgenommen haben, ausdrücklich für ihre wertvolle Mitarbeit. Wir danken dem Ethikkomitee für die ethische Genehmigung (Genehmigungsnummer 2026HL-038) sowie für die normative Begleitung während des gesamten Forschungsprozesses.
Wir danken dem medizinischen Personal der Abteilung für Pneumologie, des Bronchoskopiezentrums und des klinischen Labors für ihre Unterstützung bei der Sammlung klinischer Proben, der Aufbereitung von Bronchoalveolärflüssigkeit und der mikrobiologischen Detektion. Wir danken auch der technischen Plattform des zentralen Krankenhauslabors für die Unterstützung bei Experimenten zur hochdimensionalen Durchflusszytometrie und zur multiplexen Zytokine-Profilanalyse.
Diese Forschung erhielt keine spezifische Förderung durch Finanzierungsagenturen in öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Bereichen.
Wir danken allen beteiligten Forschern, Technikern und Pflegekräften für ihre Bemühungen bei der Patientenscreening, Probenverwaltung, experimentellen Durchführung und Datenorganisation.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-human CD11b Antikörper, Brilliant Violet 421, Klon ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | Marker für Neutrophilenaktivierung; violetter Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD14 Antikörper, APC/Cyanine7, Klon M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | Marker zur Ausschlussbestimmung von Monozyten-Makrophagen; roter Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD15 Antikörper, PE, Klon HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | Marker für die Neutrophilenlinie; blauer Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD16 Antikörper, Brilliant Violet 510, Klon 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | Marker für Neutrophilenreifung und NK-Zellen; violetter Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD45 Antikörper, PerCP, Klon HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | Pan-Leukozyten-Marker; blauer Laserkanal URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Anti-human CD66b Antikörper, FITC, Klon G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | Granulozyten-Marker; blauer Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Anti-human HLA-DR Antikörper, PerCP/Cyanine5.5, Klon L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | Marker für antigenpräsentierende Zellen; blauer Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Automatischer Hämatologieanalysator (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | Gerät (Modell XN-1000) | Wird zur Bestimmung der Gesamtanzahl kernhaltiger Zellen zur Berechnung absoluter Neutrophilen verwendet URL: https://www.sysmex.com |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | Wird im Durchflusszytometrie-Färbepuffer verwendet (0,5 % m/V in PBS mit 2 mM EDTA) URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| ComplexHeatmap-Paket (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.20 (Open-Source) | Wird zur Erstellung von Hierarchischen Clustering-Heatmaps multiplexer Zytokindaten verwendet URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Zentrifugenspinner (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | Wird zur Herstellung von Zytologiescheiben aus BALF-Zellsuspension verwendet URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| Erythrozytenlyselösung (BD FACS Lysing Solution, 10× Konzentrat) | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | Wird zur Lyse von Erythrozyten nach Oberflächenfärbung verwendet URL: https://www.bdbiosciences.com |
| Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | Wird im Durchflusszytometrie-Färbepuffer bei 2 mM verwendet URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| Fixierbarer Vitalitätsfarbstoff (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat. No. 423105 | Ausschluss von toten Zellen vor der Gating-Analyse; roter Laserkanal URL: https://www.biolegend.com |
| Flexibler Video-Bronchoskop | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Gerät (Modell BF-1TQ290) | Wird für die BAL unter mittlerer Sedierung verwendet URL: https://www.olympus-global.com |
| Multifarbiger Durchflusszytometer (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Gerät (Modell CytoFLEX LX, Sechs-Laser-Konfiguration) | Wird zur Erfassung des Sieben-Marker-Neutrophilen/Monozyten-Durchflusspanels verwendet URL: https://www.beckman.com |
| Software zur Durchflusszytometrie-Analyse (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Wird zur Kompensation und manuellen Gating-Analyse von FCS-Dateien verwendet URL: https://www.flowjo.com |
| FlowSOM-Paket (R/Bioconductor) | Bioconductor Project | v2.12 (Open-Source) | Wird für Self-Organizing-Map-Clustering und Meta-Clustering von Durchflusszytometriedaten verwendet URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (statistische Grafiksoftware) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | Wird zur Erstellung der endgültigen Abbildungen verwendet URL: https://www.graphpad.com |
| Humaner Fc-Rezeptor-Blockierreagenz (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | Blockierung von Fc-Rezeptoren vor der Antikörperfärbung URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| igraph-Paket (R) | CRAN | v2.0 (Open-Source) | Wird zur Konstruktion und Visualisierung des Korrelationsnetzwerkdiagramms verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Kryoröhrchen mit geringer Proteinbindung, 2,0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | Wird für Aliquots des BALF-Überstandes zur Zytokinanalyse verwendet URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Multiplex-Bead-basierte Immunoassay-Plattform (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Gerät (Modell MAGPIX) | Wird zur Erfassung des multiplexen Zytokinassays verwendet URL: https://www.luminexcorp.com |
| May-Grünwald-Giemsa-Färbelösung | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | Wird für die Differenzialzellzählung an Zytospin-Präparaten verwendet URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| mice-Paket (R) | CRAN | v3.16 (Open-Source) | Wird für multiple Imputation durch verkettete Gleichungen in der Sensitivitätsanalyse verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| Multiplex-magnetische Bead-Zytokin/Chemokin-Panels (13-Plex, kundenspezifisch; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | Kundenspezifisches Panel zur Messung der 13 Analyten, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben URL: https://www.merckmillipore.com |
| Nylon-Mesh-Zellsieb, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | Wird zur mechanischen Filtration von BALF zur Entfernung von Schleimklumpen verwendet URL: https://www.corning.com |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | Grundpuffer zur Zellresuspension und -färbung URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| pROC-Paket (R) | CRAN | v1.18 (Open-Source) | Wird zur Erstellung von ROC-Kurven und AUC-Werten verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (statistische Berechnungsumgebung) | R Core Team | v4.4 (Open-Source) | Plattform für statistische Analysen und Visualisierungen URL: https://www.r-project.org |
| rstatix-Paket (R) | CRAN | v0.7 (Open-Source) | Wird für Gruppenvergleiche und Korrelationsstatistiken verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Rtsne-Paket (R) | CRAN | v0.17 (Open-Source) | Wird für t-SNE-Embeddings verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Einfachgefärbte Kompensationsperlen (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | Wird für Einzelfarben-Kompensationskontrollen verwendet URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| Natriumchloridlösung zur Injektion, 0,9 % (sterile Kochsalzlösung) | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | Wird für die BAL-Instillation verwendet (100–150 mL, 20–40 mL Aliquots bei 37 °C) URL: https://www.baxter.com |
| uwot-Paket (R) | CRAN | v0.2 (Open-Source) | Wird für die UMAP-Dimensionalitätsreduktion verwendet URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (Software zur Erfassung und Kurvenanpassung von Multiplex-Assays) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Gerätespezifische Software für die 5PL-Standardkurvenanpassung URL: https://www.luminexcorp.com |
Referenzen
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