Identifikation von Kandidaten-Biomarkern, die mit mitochondrialer Dysfunktion und SUMOylation bei Herzinsuffizienz verbunden sind, basierend auf bioinformatischen Ansätzen

Zusammenfassung

Mit Bioinformatik, maschinellem Lernen und qPCR-Validierung identifizierte diese Studie fünf potenzielle Biomarker, die mit SUMOylation und mitochondrialer Dysfunktion bei Herzinsuffizienz assoziiert sind. Diese Ergebnisse verbessern das Verständnis der Herzinsuffizienzmechanismen und deuten auf mögliche Wege für zukünftige diagnostische Forschung hin.

Zusammenfassung

Herzinsuffizienz (HF) stellt eine anhaltende klinische Herausforderung dar. Während SUMOylation und mitochondriale Funktion für die Gesundheit der Kardiomyozyten von entscheidender Bedeutung sind, bleibt ihr kombinierter Einfluss auf HF schwer fassbar. Zwei HF-bezogene Datensätze wurden von GEO heruntergeladen. Die überlappenden Gene stammen aus allen Genen im Trainingsset, SUMO-bezogenen Genen und mitochondrial-bezogenen Genen. Drei maschinelle Lernalgorithmen wurden angewandt, um diagnostische Schlüsselgene zu identifizieren. Anschließend wurden diagnostische Modelle auf Basis dieser Gene erstellt und bewertet. Außerdem wurde das Immunmikroumfeld bei HF im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen mit CIBERSORT, MCP-Counter und ssGSEA bewertet. Die Unterschiede in der Immuninfiltration zwischen HF und gesunden Kontrollpersonen wurden analysiert. Medikamentenvorhersagen und molekulare Andockungen wurden durchgeführt, um potenzielle Wirkstoffkandidaten zu identifizieren, die diese Gene anvisieren. Schließlich wurde qPCR eingesetzt, um Genexpressionsniveaus in klinischen Proben zu validieren. Insgesamt wurden 113 gemeinsame Gene mit bemerkenswerter Anreicherung der mitochondrialen Regulation identifiziert. Fünf Schlüsselgene, nämlich NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 und FKBP4, wurden von drei maschinellen Lernalgorithmen identifiziert. Funktionelle Anreicherungsanalysen verknüpften diese Gene mit der Immunantwort, RNA-Verarbeitung und der Regulation des Zellzyklus. Darüber hinaus zeigte die Immuninfiltrationsprofilierung, dass Neutrophilleninfiltration zu dysregulierten Immunantworten bei HF beiträgt. Das molekulare Docking zeigte, dass das Kleinmolekül-Medikament IMX-942 eine günstige Bindungsaffinität zu SQSTM1 (-5,8 kcal/mol) aufweist. qPCR-Validierung unterstützte die bioinformatischen Ergebnisse. NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 und FKBP4 wurden als Schlüsselgene identifiziert, die SUMOylation und mitochondriale Funktion bei HF verknüpfen. Diese Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse zur HF-Pathophysiologie und könnten zur Entwicklung neuartiger diagnostischer und therapeutischer Strategien beitragen.

Einleitung

Herzinsuffizienz (HF), das Endstadium verschiedener Herz-Kreislauf-Erkrankungen, ist gekennzeichnet durch eine beeinträchtigte Herzfunktion, die die Stoffwechselanforderungen des Körpers nicht erfüllt¹. Diese schwächende Erkrankung stellt erhebliche Risiken für die Gesundheit der Patienten dar, führt zu einer verminderten Lebensqualität und erhöhten Sterblichkeitsraten². Aktuelle diagnostische Verfahren für HF umfassen hauptsächlich biochemische Markerdetektion ^3,4, Echokardiographie und radiologische Bildgebung⁵. Obwohl verfügbare Behandlungen pharmakologische Wirkstoffe, gerätebasierte Interventionen und chirurgische Eingriffe umfassen, bleiben klinische Ergebnisse unbefriedigend⁶. Einschränkungen wie unerwünschte Arzneimittelwirkungen, eingeschränkte Anwendbarkeit von Geräten, Immunabstoßung und andere Komplikationen behindern häufig die therapeutische Wirksamkeit 7,8,9,10,11. Daher besteht ein dringender Bedarf, die zugrunde liegenden Mechanismen von HF aufzuklären, frühe und präzise diagnostische Biomarker zu identifizieren und wirksamere sowie sicherere therapeutische Strategien zu entwickeln.

Kleine ubiquitinähnliche Modifikatorproteine (SUMO) sind kovalent mit den Lysinresten von Substratproteinen durch einen dynamischen und reversiblen Prozess konjugiert, der die Struktur und Funktion der Substratproteine^{reguliert 12}. SUMOylation, eine entscheidende posttranslationale Modifikation, dient als Schlüsselregulator verschiedener zellulärer^Prozesse. Mitochondrien sind als Energiestoffwechselzentrum der Zellen entscheidend an der Pathogenese der HF beteiligt. Im pathologischen Prozess der HF trägt mitochondriale Dysfunktion wie unzureichende ATP-Produktion, ein Platzen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und ein^Ca-2+-Homöostase-Ungleichgewicht signifikant zur Progression^{bei 15,16,17,18}. Bemerkenswert ist, dass aufkommende Evidenz auf ein mögliches Zusammenspiel zwischen SUMOylation und mitochondrialer Funktion hindeutet. Mitochondrialer Stress kann SUMOylationsbezogene Signalwege auslösen, während SUMO-Proteine und ihre spezifischen Proteasen für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Homöostase^{unerlässlich sind.} Jüngste Studien haben zudem die Bedeutung der mitochondrialen Qualitätskontrolle und mitochondrialer Dynamik bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und HF-Progression^{hervorgehoben 22,23}. Der synergistische Effekt der SUMOylation und mitochondrialen Regulation auf die HF-Entwicklung bleibt jedoch unklar, insbesondere auf Genebene.

In dieser Studie untersuchten wir systematisch Gene an der Schnittstelle von SUMOylation und mitochondrialer Dysfunktion bei HF, zwei zentrale biologische Prozesse, die einzeln in HF impliziert, aber noch nicht umfassend integriert wurden. Überlappende Gene wurden durch überschneidende HF-bezogene, differenziell exprimierte Gene, SUMOylationsbezogene Gene und mitochondrienbezogene Gene identifiziert. Schlüsselgene wurden anschließend mit maschinellen Lernalgorithmen gescreent und zur Erstellung eines diagnostischen Modells verwendet. Funktionelle Anreicherungs- und Immuninfiltrationsanalysen wurden weiter durchgeführt, um ihre potenziellen biologischen Rollen bei HF zu untersuchen. Dieser integrierte Ansatz könnte einen systematischen Rahmen bieten, um das Übersprechen zwischen SUMOylation und mitochondrialer Dysfunktion bei HF zu untersuchen.

Protokoll

Die Studie wurde gemäß der Erklärung von Helsinki durchgeführt, und das Protokoll wurde im November 2024 vom Ethikausschuss des Dritten Krankenhauses der Hebei Medizinischen Universität (W2025-065-1) genehmigt. Von allen an der Studie beteiligten Probanden wurde eine informierte Zustimmung eingeholt.

Datenquelle und Vorverarbeitung

RNA-Seq-Daten, die mit HF assoziiert sind, wurden gewonnen, darunter zwei Mikroarray-Datensätze aus dem Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Es wurden zwei periphere Blutmikroarray-Datensätze ausgewählt: GSE59867 (34 HF-Proben und 30 Kontrollen) wurde als Trainingsdatensatz verwendet; GSE57338 (177 HF-Proben und 136 Kontrollgruppen) wurde als Validierungsdatensatz verwendet. Klinische Informationen, die für GSE57338 verfügbar sind, einschließlich Alter, Geschlecht und Krankheitsstatus, wurden aus GEO entnommen und sind in ergänzender Tabelle 1 zusammengefasst. Zusätzlich wurden insgesamt 3.893 SUMOylationsbezogene Gene (SRGs) aus der dbPTM-Datenbank (https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php) gewonnen (Ergänzende Tabelle 2), während 2.030 mitochondrienbezogene Gene (MRGs) auf Basis einer früheren Studie²⁴ (Ergänzende Tabelle 3) gesammelt wurden. Anschließend wurde das R-Paket GEOquery (v 2.72.0)²⁵ verwendet, um Datensätze aus der GEO-Datenbank herunterzuladen, die Ausdrucksmatrix zu extrahieren und die Beispielphänotypinformationen zu erhalten. Die Annotation erfolgte, indem die Annotationsdatei abgebildet und die Gen-IDs abgeglichen wurden. Ungültige Gen-IDs wurden entfernt, und die am stärksten exprimierten Sonden wurden beibehalten.

Wichtige Genselektion mittels maschinellem Lernen

Ein mehrstufiger Ansatz wurde verwendet, um die Gene zu selektieren, die mit der HF, SUMOylation und Mitochondrien verwandt sind. Erstens wurden die gemeinsamen Gene zwischen dem Trainingsdatensatz, den SRGs und den MRGs mittels Schnittanalyse identifiziert. Die potenzielle Funktion gemeinsamer Gene wurde durch die Gene Ontology (GO) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalyse mit dem R-Paket ClusterProfiler (v 4.12.6)²⁶ identifiziert. Anschließend wurden drei Machine-Learning-Ansätze eingesetzt, nämlich LASSO-Regression, XGBoost und Random Forest (RF), um die Gene weiter zu filtern. Bei der LASSO-Regression wurde der optimale Regularisierungsparameter λ mittels Kreuzvalidierung ausgewählt, um die genetischen Merkmale mit dem höchsten Prädiktionswert zu identifizieren. Die nicht null liegenden Koeffizientengene wurden für die nachfolgende Analyse ausgewählt. Anschließend wurden XGBoost- und RF-Algorithmen verwendet, um die Feature-Importance Scores zu berechnen und die Top 20 Gene zu screenen.

Aufbau und Bewertung diagnostischer Modelle

Ein diagnostisches Modell wurde mit logistischer Regression auf Basis des GSE59867 Datensatzes erstellt. Das Modell wurde dann angewendet, um den Krankheitsstatus vorherzusagen und Wahrscheinlichkeitswerte zu berechnen. Zur Validierung des Modells wurden dieselben Schlüsselgene aus dem GSE57338-Datensatz extrahiert, an den Trainingsdatensatz angepasst und für externe Vorhersagen verwendet. Die Modellleistung wurde anhand von Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurven, Confusion Matrix, Calibration Curve und Decision Curve Analysis (DCA) bewertet.

Gen-Satz-Anreicherungsanalyse (GSEA) und subzelluläre Lokalisierung

Die Spearman-Korrelationsanalyse wurde verwendet, um korrelierte Gene für jedes Schlüsselgen zu identifizieren. Die GSEA-Analyse wurde mit dem R-Paket ClusterProfiler (v 4.12.6) an den verwandten Genen der Schlüsselgene durchgeführt. Um die genaue subzelluläre Lokalisierung der Schlüsselgene innerhalb der Zelle zu bestimmen, wurde ihre subzelluläre Lokalisierung mithilfe der GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org/) bestimmt.

Gen-Krankheits-Assoziation und Arzneimittelvorhersage

Um die klinische Relevanz der identifizierten Schlüsselgene zu bewerten, wurden systematische Krankheitsassoziations- und Arzneimittel-Interaktionsanalysen durchgeführt. Krankheits-Gen-Assoziationen wurden mit der Comparative Toxicogenomics Database (CTD; https://ctdbase.org/) untersucht, wobei die Ergebnisse sowohl nach Inferenzwerten als auch nach Referenzzählungen (die 10 berichteten Assoziationen) bewertet wurden. Gen-Arzneimittel-Interaktionsdaten für Schlüsselgene wurden aus der Drug-Gene Interaction Datenbank (DGIdb) gewonnen, und Medikamente wurden aufgrund eines Wechselwirkungsscores < 0,5 ausgeschlossen. Anschließend luden wir die 3D-Strukturen von Proteinen, die den Schlüsselgenen entsprechen, aus der PDB-Datenbank (https://www.rcsb.org/) und die molekularen Strukturen potenzieller Medikamente aus PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) herunter. Anschließend wurde die molekulare Andockungsanalyse mit CB-Dock2²⁷ (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php) durchgeführt, um die Bindungswerte zwischen den potenziellen Medikamenten und Proteinen zu berechnen. Eine geringere freie Bindungsenergie deutet auf eine stabilere Wechselwirkung hin, was darauf hindeutet, dass die Verbindung ein größeres Zielpotenzial haben könnte.

Immuninfiltrationsanalyse

Die Infiltration von Immunzellen wurde mit drei komplementären Methoden bewertet: Microenvironment Cell Populations-counter (MCP-counter)²⁸, Zelltyp-Identifikation durch Schätzung relativer Teilmengen von RNA-Transkripten (CIBERSORT)²⁹ und Einzelprobenanreicherungsanalyse (ssGSEA)³⁰. MCP-Zähler und CIBERSORT-Analysen wurden mit dem R-Paket IOBR (v 0.99.0)³¹ durchgeführt. Der MCP-Zähler wurde verwendet, um die Häufigkeit von Immun- und Stromenzellen zu schätzen, während CIBERSORT verwendet wurde, um die relativen Anteile von 22 Immunzelltypen zu quantifizieren. ssGSEA wurde mit dem GSVA-Paket (v1.52.3)³² durchgeführt, um die probennahe Anreicherung von Immunzell-Subtypen zu evaluieren.

Aufbau des konkurrierenden endogenen RNA-(ceRNA)-Regulationsnetzwerks

Um die potenziellen regulatorischen Rollen von miRNA–lncRNA im Zusammenhang mit zuvor identifizierten Schlüsselgenen zu untersuchen, wurde ein ceRNA-Regulationsnetzwerk aufgebaut. Das R-Paket multiMiR (v 1.26.0)³³ wurde verwendet, um potenzielle microRNA (miRNA)–mRNA-Interaktionen für Schlüsselgene vorherzusagen, wobei Daten aus PITA (https://omictools.com/pita-tool/) und der miRDB-Datenbank (https://mirdb.org/) integriert wurden. miRNA–mRNA-Paare mit hoher Zuverlässigkeit und Konsistenz wurden ausgewählt. Anschließend wurden lncRNA–miRNA-Interaktionen aus der StarBase-Datenbank (https://rnasysu.com/encori/) abgerufen und auf Interaktionen gefiltert, die von ≥ 10 CLIP-seq-Experimenten unterstützt und als lincRNAs kategorisiert wurden. Ein ceRNA-Netzwerk wurde durch Integration von lncRNA-miRNA-mRNA-Interaktionen aufgebaut.

qPCR-Validierung

Zur Validierung der Expression wichtiger Gene wurden Blutproben von Patienten mit HF und gesunden Kontrollgruppen aus der klinischen Kohorte (n = 6 pro Gruppe) im Dritten Krankenhaus der Hebei Medical University (W2025-065-1) unter genehmigten Protokollen und informierter Zustimmung entnommen. Die Gesamt-RNA wurde mithilfe des TRIzol-Reagens in Kombination mit Chloroform und Isopropanol isoliert. Nach der Extraktion wurde RNA in DEPC-behandeltem Wasser gelöst, und ihre Konzentration sowie Reinheit wurden mit einem NanoDrop-Spektrophotometer bewertet. Für die transkriptionelle Analyse wurde RNA rückwärts in cDNA mit dem Fast First-Strand cDNA Synthesis Mix for RT (mit dsDNase) transkribiert. Anschließend wurde quantitative PCR mit dem Fast Taq qPCR SYBR Green Mix durchgeführt. Die spezifischen Primer-Sequenzen sind in der Materialtabelle detailliert dargestellt. Die relativen Genexpressionsniveaus wurden mit der ^{2-ΔΔCT-Methode} mit entsprechender Normalisierung berechnet.

Statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden mit R-Software und GraphPad Prism durchgeführt. Statistische Vergleiche zwischen zwei unabhängigen Gruppen wurden je nach Datenverteilung entweder mit dem Student's t-Test oder dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistische Signifikanz betrachtet.

Ergebnisse

Identifikation und funktionelle Anreicherung sich schneidender Gene

Um Gene zu identifizieren, die an der SUMOylation und mitochondrialen Funktion bei HF beteiligt sind, wurde zunächst eine Qualitätskontrolle am Trainingsset GSE59867 durchgeführt (ergänzende Abbildung 1A). Eine dreifache Schnittanalyse wurde unter allen Genen im Trainingsset, SRGs und MRGs durchgeführt, wobei 113 überlappende Gene identifiziert wurden (

Diskussion

HF, ein fortschreitendes und terminales Stadium verschiedener Herz-Kreislauf-Erkrankungen, ist durch hochkomplexe und multifaktorielle pathophysiologische Mechanismen gekennzeichnet^17,34. Obwohl sowohl SUMOylation als auch mitochondriale Dysfunktion einzeln mit HF in Verbindung gebracht werden, sind ihre potenziellen synergistischen Rollen insbesondere auf Genebene noch nicht ausreichend erforscht. In der vorliegenden Studie iden...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chloroform-Ersatz	Servicebio	G3014-02	qPCR-Reagenz
DEPC-behandeltes Wasser	Biosharp	BL510A	qPCR-Reagenz
Fast First-Strand cDNA Synthese-Mix für RT (mit dsDNase)	Albatross Biology	500-101	qPCR-Reagenz
Fast Taq qPCR SYBR Green Mix	Albatross Biology	500-102	qPCR-Reagenz
FKBP4-Primer	Tsingke	N/A	Vorwärts: 5’-GAAGGCGTGCTGAAGGTCAT-3’ Rückwärts: 5’-TGCCATCTAATAGCCAGCCAG-3’
Isopropanol	Hushi	80109218	qPCR-Reagenz
MYEF2-Primer	Tsingke	N/A	Vorwärts: 5’-CAGCTCCAATGGCGTTAAAATG-3’ Rückwärts: 5’-TGGCCTTCTTACTTCCTGTAGAT-3’
NanoDrop-Spektrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000C	qPCR-Reagenz
NFKB1-Primer	Tsingke	N/A	Vorwärts: 5’-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3’ Rückwärts: 5’-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’
NSUN2-Primer	Tsingke	N/A	Vorwärts: 5’-GAACTTGCCTGGCACACAAAT-3’ Rückwärts: 5’-TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA-3’
SQSTM1-Primer	Tsingke	N/A	Vorwärts: 5’-GCACCCCAATGTGATCTGC-3’ Rückwärts: 5’-CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG-3’
TRIzol-Reagenz	Vazyme	R401-01	qPCR-Reagenz
β-Aktin-Primer	Tsingke	N/A	Vorwärts: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’ Rückwärts: 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’