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Forschungsartikel

Liuwei Dihuang Wan hemmt die Osteoklastogenese und den durch die Ovariektomie induzierten Knochenverlust, indem er die NF-κB-Signalübertragung unterdrückt

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DOI:

10.3791/72270

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28. Juli 2026

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1School of Medicine, Nankai University, 2School of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 3Emergency Medical Center, Ningbo Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 4The Second People's Hospital of Changzhou, the Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie zeigte, dass Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) die Osteoklastendifferenzierung und durch die Ovariektomie induzierten Knochenverlust unterdrückt, indem er den NF-κB-Signalweg hemmt, wie durch LC-MS/MS-Analysen, Netzwerkpharmakologie sowie in vivo und in vitro Validierung gezeigt wurde.

Zusammenfassung

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW), eine klassische Formel der traditionellen chinesischen Medizin, wird häufig zur Behandlung verschiedener mit Nierenmangel assoziierter Erkrankungen eingesetzt und hat eine zufriedenstellende klinische Wirksamkeit bei postmenopausaler Osteoporose (PMOP) gezeigt. Seine pharmakologischen Mechanismen bleiben jedoch unklar. Um dies zu beheben, analysierten wir zunächst die chemischen Komponenten von LWDHW mit LC-MS/MS, die 1.615 Komponenten identifizierten. Die Netzwerkpharmakologie sagte dann voraus, dass Entzündung und der NF-κB-Signalweg potenzielle therapeutische Mechanismen sind, die den Auswirkungen von LWDHW auf PMOP zugrunde liegen. Anschließend wurden 27 weibliche C57BL/6J-Mäuse zufällig den Gruppen Sham, Model und LWDHW zugeteilt. Mäuse in den beiden letztgenannten Gruppen unterzogen sich einer bilateralen Ovariektomie (OVX), und die in der LWDHW-Gruppe erhielten orale LWDHW mit 9,75 g/kg/Tag für 8 Wochen. Serum- und Oberschenkelschnittproben wurden für den Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Mikro-Computertomographie (μCT), histologische Untersuchung und Immunhistochemie (IHC) entnommen. Primäre Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMMs) wurden mit LWDHW behandelt und anschließend einer TRAP-Färbung und qRT-PCR unterzogen. Bei OVX-Mäusen linderte LWDHW signifikant den Knochenabbau und den Verfall der Knochenmikroarchitektur, begleitet von reduzierten Serum-β-CTX-Spiegeln und verringerten Osteoklastenzahlen im Oberschenkelgewebe. Die IHC-Färbung zeigte eine deutlich geringere Expression von TNF-α, IL-1β und p-P65 im Oberschenkelgewebe von LWDHW-behandelten Mäusen im Vergleich zur Modellgruppe. In vitro zeigte die TRAP-Färbung, dass LWDHW die RANKL/M-CSF-induzierte Osteoklastendifferenzierung von BMMs hemmte und die Expression von Ctsk, MMP9 und Nfatc1 herunterregulierte. Die Western-Blot-Analyse zeigte außerdem, dass die Proteinwerte von P65, p-P65, IκBα und p-IκBα nach der LWDHW-Behandlung bei BMMs signifikant verringert waren. Insgesamt lindert LWDHW die postmenopausale Osteoporose, möglicherweise durch Unterdrückung der durch NF-κB-Signalvermittlung vermittelten Osteoklastogenese.

Einleitung

Postmenopausale Osteoporose (PMOP) ist eine verbreitete metabolische Knochenerkrankung, die durch den Verlust der Knochenmasse und den Verfall der Knochenmikrostrukturgekennzeichnet ist. Mit der wachsenden alternden Bevölkerung ist die zunehmende Häufigkeit von PMOP zu einem globalen Gesundheitsproblem geworden, das die Gesundheit postmenopausaler Frauen ernsthaft bedroht2. In China liegt die Gesamtprävalenz von PMOP bei bis zu 32,1 %. Betroffene Personen sind anfälliger für schwere Komplikationen wie chronische Rückenschmerzen, Wirbelsäulendeformitäten und Zerbrechlichkeitsfrakturen 4,5. Derzeit gehören zu den von der FDA zugelassenen Medikamenten gegen Osteoporose Bisphosphonaten6, Nebenschilddrüsenhormon 67 und Denosumab8, die in der klinischen Praxis weit verbreitet eingesetzt werden. Ihre langfristige Anwendung ist jedoch oft durch verschiedene Nebenwirkungen begrenzt9. Daher besteht ein dringender Bedarf, sicherere und wirksamere Therapeutika für PMOP zu entwickeln. Unter den potenziellen Alternativen haben chinesische Kräutermedizin aufgrund ihrer anerkannten Wirksamkeit und ihres günstigenSicherheitsprofils zunehmend Aufmerksamkeit erregt.

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) ist eine klassische Formel der traditionellen chinesischen Medizin (TCM), die erstmals im alten Text Key to Therapeutics of Children's Diseases während der Song-Dynastie dokumentiert wurde. Seit Tausenden von Jahren wird LWDHW in der klinischen Praxis weit verbreitet zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt, die auf Nierenmangel zurückzuführen sind(11,12,13,14). Nach der TCM-Theorie der "nierensteuernden Knochen" werden Knochenmasseverlust und Knochenabbau bei PMOP-Patienten hauptsächlich durch unzureichende Ernährung aus Nierenessenz15 verursacht. Daher wird LWDHW häufig in der klinischen Behandlung von PMOP eingesetzt und hat eine eindeutige therapeutische Wirksamkeit16,17 nachgewiesen. Obwohl Tier- und klinische Studien gezeigt haben, dass LWDHW mehrere pharmakologische Wirkungen ausübt, darunter antioxidativ18, entzündungshemmend19 und antifibrotischeWirkung 14, bleibt sein zugrundeliegender Mechanismus gegen PMOP weitgehend unbekannt.

Die Knochenhomöostase basiert auf dem Gleichgewicht zwischen Knochenresorption durch Osteoklasten und Knochenbildung durch Osteoblasten20. Dieses Gleichgewicht wird gestört, da die Osteoklastendifferenzierung und -aktivität unter entzündlichen Bedingungen gesteigert werden, was zu einer beschleunigten Knochenresorptionführt. In diesem Prozess dient der NF-κB-Weg als Kernregulator. Entzündungsfaktoren wie TNF-α und IL-1β können die Phosphorylierung und den Abbau von IκBα induzieren, was die Kerntranslokation von phosphoryliertem p65 (p-P65)22 auslöst. Folglich werden nachgeschaltete osteoklastenspezifische Gene, darunter Ctsk, Mmp9 und Nfatc1, aktiviert, um die Osteoklastogenese23,24 zu fördern.

Netzwerkpharmakologie ist ein interdisziplinäres Fachgebiet, das Informatik, Pharmakologie und Bioinformatikintegriert 25. Sie zeigt deutliche Vorteile bei der umfassenden Untersuchung der pharmakologischen Mechanismen, die den therapeutischen Wirkungen chinesischer Kräuterzugrunde liegen. In der vorliegenden Studie wurde Netzwerkpharmakologie eingesetzt, um die potenziellen biologischen Prozesse und Signalwege vorherzusagen, die an den anti-osteoporotischen Effekten von LWDHW beteiligt sind. Gleichzeitig wurden die chemischen Komponenten von LWDHW mit LC-MS/MS analysiert. Darüber hinaus wurden in vivo Validierungen mit einem OVX-Mausmodell und in vitro-Experimente mit primären Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMMs) durchgeführt, um den pharmakologischen Mechanismus von LWDHW im Vergleich zu PMOP weiter zu untersuchen. Der Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Tierethikkomitee der Chinesischen Medizinischen Universität Zhejiang genehmigt (IACUC-202402-07).

Vorbereitung und LC-MS/MS-Analyse von LWDHW

Die LWDHW-Formel besteht aus sechs chinesischen Kräutern: Rehmannia glutinosa (Gaertn.), Cornus officinalis (Sieb.), Paeonia suffruticosa (Andr.), Dioscoreae opposite (Thunb.), Poria cocos (Schw.) und Alisma orientale (Sam.). Detaillierte Informationen zu diesen Kräutern sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alle rohen Kräuter wurden vom Ersten Angeschlossenen Krankenhaus der Chinesischen Medizinischen Universität Zhejiang (Hangzhou, China) geliefert und in gereinigtem Wasser mit einem Kräuter-Wasser-Verhältnis von 0,1 kg/L gekocht. Der daraus resultierende wässrige Extrakt wurde gefiltert und zu einer Arbeitslösung bei 0,5 g/ml konzentriert, um anschließend LC-MS/MS-Analysen und Tierversuche durchzuführen. Außerdem wurde die Arbeitslösung zu gefriergetrocknetem Pulver für Zellexperimente verarbeitet.

In der LC-MS/MS-Analyse waren die Bedingungen der Flüssigkeitschromatographie wie folgt: mobile Phase A (wässrig) und mobile Phase B (organisch) bestanden aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser bzw. Acetonitril für positiven Ionenmodus oder 5 mM Ammoniumformiat in Wasser bzw. Acetonitril für negativen Ionenmodus. Die Gesamtlaufzeit betrug 8 Minuten, mit einer Durchflussrate von 0,3 mL/min, einer Säulentemperatur von 40 °C und einem Einspritzvolumen von 2 μL. Für die Massenspektrometrie wurden die Daten im vollen MS-ddMS2-Modus erhoben, mit Sprühspannungen auf +3,50 kV (positiv) und –2,50 kV (negativ).

Vorhersage von bioaktiven Inhaltsstoffen und Zielvorhersagen von LWDHW

Die einzelnen Namen von sechs Bestandteilen wurden in die TCMSP-Datenbank des Traditional Chinese Medicine System Pharmacology (TCMSP) eingetragen, um die vollständige Zutatenliste für LWDHW zu erhalten. Bioaktive Inhaltsstoffe wurden anschließend anhand der pharmakokinetischen Parameter orale Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30 % und Arzneimittelähnlichkeit (DL) ≥ 0,18 27,28,29,30 getestet. Die entsprechenden Proteine der bioaktiven Inhaltsstoffe wurden identifiziert und UniProt eingereicht, um ihre standardisierten Gennamen zu ermitteln, die als endgültige Genziele von LWDHW definiert wurden.

Überlappende Ziele zwischen LWDHW und PMOP

Genziele, die mit PMOP assoziiert sind, wurden am 2. Oktober 2024 durch die Suche nach dem Schlüsselwort "postmenopausale Osteoporose" sowohl in den Datenbanken GeneCards als auch in DisGeNET gefunden. Ziele wurden mit Score-Schwellenwerten von >0,1 in DisGeNET und >10 in GeneCards gefiltert, und doppelte Einträge wurden entfernt, um einen nicht-redundanten Satz PMOP-bezogener Gene zu erhalten. Anschließend wurden die von Kräutern abgeleiteten Ziele von LWDHW und die PMOP-assoziierten Ziele in das Venny-Online-Tool importiert, um ein Venn-Diagramm zu erstellen, das die sich überlappenden Ziele zwischen LWDHW und PMOP darstellt.

Genontologie (GO) und Analyse der Anreicherung der Signalwege

Die sich überlappenden Ziele zwischen LWDHW und PMOP wurden der GO-Anreicherungsanalyse mittels der DAVID-Datenbank unterzogen. Die abgerufenen GO-Begriffe wurden in drei Kategorien eingeteilt, darunter zelluläre Komponente, molekulare Funktion und biologischer Prozess (BP). Nach der Filterung von FDR < 0,01 wurden die 30 besten BP-Terme in einem Blasendiagramm in absteigender Reihenfolge der Faltanreicherung aufgeführt.

Anschließend wurden die sich überlappenden Ziele in die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) und Metascape-Datenbanken zur Analyse der Anreicherung der Signalwege eingetragen. Die angereicherten Pfade aus den KEGG- und Metascape-Datenbanken wurden nach der Anzahl der entsprechenden Ziele in absteigender Reihenfolge gerankt, und die 25 obersten Pfade aus jeder Datenbank wurden als Balkendiagramme dargestellt.

Netzwerkbau

Die Netzwerke "Formula-Herbs-Ingredients-Targets-Disease" und "Targets-Pathways" wurden in Cytoscape konstruiert, um die Wechselwirkungen zwischen den Komponenten zu visualisieren. Ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) wurde erzeugt, indem die überlappenden Ziele in die STRING-Datenbank eingegeben wurden. Hub-Ziele im Netzwerk wurden durch Screening basierend auf topologischen Merkmalen identifiziert, darunter Gradzentralität (DC), Zwischenzentralität (BC) und Nähezentralität (CC).

Tiergruppierung, OVX-induzierte Osteoporosemodell und Arzneimittelintervention

Insgesamt wurden 27 weibliche C57BL/6J-Mäuse (2 Monate alt, 22 ± 2 g) vom Tierversuchszentrum der Chinesischen Medizinischen Universität Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang) bereitgestellt. Alle Tiere wurden unter spezifischen krankheitserregerfreien Bedingungen (SPF) gehalten, mit einem 12-Stunden-Licht/Dunkelzyklus, einer Umgebungstemperatur von 25 °C und einer Luftfeuchtigkeit zwischen 40 % und 60 %, mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Nach einer Woche adaptiver Fütterung wurden die Mäuse zufällig mit einer Zufallszahlentabelle in drei Gruppen (n = 9 pro Gruppe) eingeteilt: Sham, Model und LWDHW. Die Mäuse in den Modell- und LWDHW-Gruppen unterzogen sich einer bilateralen Ovariektomie (OVX), um das PMOP-Modell zu etablieren, während die Sham-Gruppe ein Scheinverfahren mit der Resektion eines äquivalenten Volumens periovarialen Fettgewebes durchführte. Ab zwei Tagen nach der Operation erhielten die Mäuse der LWDHW-Gruppe täglich orale Gabe der LWDHW-Arbeitslösung in einer Dosis von 9,75 g/kg/Tag (entsprechend der menschlichen Äquivalentdosis basierend auf der Körperoberfläche), während die Modell- und Sham-Gruppen ein gleiches Volumen Kochsalzlösung erhielten. Biologische Proben, einschließlich Serum- und Oberschenkelgewebe, wurden 8 Wochen nach der Verabreichung zur nachfolgenden Analyse entnommen. Während der experimentellen Zeit trat in keiner der Gruppen unerwarteter Tod oder Sterblichkeit auf.

Serumenzymgebundener Immunsorbent-Test (ELISA)

Vollblut wurde aus dem retro-orbitalen Plexus entnommen und bei 1000 x g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um Serum zu erhalten. Serumkonzentrationen von Osteocalcin (OCN) und β-C-terminalem Teloptid des Typ-I-Kollagens (β-CTX) wurden mit den entsprechenden ELISA-Kits gemäß den Protokollen des Herstellers gemessen.

μCT und biomechanische Analyse

Femurproben wurden mit einer hochauflösenden Mikro-Computertomographie (μCT) mit einer isotropen Auflösung von 10 μm gescannt. Die dreidimensionale (3D) Mikrostruktur des distalen Oberschenkelknochens wurde anhand der aufgenommenen Bilder mit der NRecon-Software rekonstruiert. Anschließend wurden folgende Knochenmikroarchitekturparameter, darunter Knochenmineraldichte (BMD, g/mm3), Knochenvolumenfraktion (BV/TV, %), Trabekuläre Dicke (Tb.Th, mm) und Trabekulärzahl (Tb.N, 1/mm), innerhalb des Interessensbereichs (ROI) des distalen Oberschenkelknochens quantifiziert.

Die biomechanischen Eigenschaften von Oberschenkelproben (n = 3 pro Gruppe) wurden mittels eines Dreipunkt-Biegetests mit einem Axialtorsions-Ermüdungstestsystem bewertet. Auf die Mitteldiaphyse wurde eine Drucklast mit einer konstanten Verschiebungsrate von 2 mm/min bis zum strukturellen Versagen ausgeübt. Die maximale Last (N) wurde automatisch von der Systemsoftware erfasst.

Histomorphologie, Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenzfärbung (IF)

Nach der Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd, Entkalkung in einer 14 % EDTA-Lösung und der Dehydrierung durch eine graduierte Ethanolserie wurden Oberschenkelproben zu Paraffinabschnitten von 3 μm Dicke verarbeitet, wie zuvorbeschrieben 31. Die Schnitte wurden zur morphologischen Untersuchung mit Alcian Blue Hematoxylin (ABH)/Orange G gefärbt. Eine quantitative Analyse des trabekulären Knochenraumbereichs in der distalen Femurmetaphyse wurde mit der Software OsteoMetrics durchgeführt.

Leber- und Nierenproben wurden fixiert, in Paraffin eingebettet und in 4-μm-Abschnitte geschnitten. Nach routinemäßiger Deparaffinisierung und Rehydrierung wurden die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die histologische Untersuchung erfolgte unter einem Lichtmikroskop.

IHC- und IF-Tests wurden an paraffinbeschichteten Schnitten gemäß den festgelegten Verfahren durchgeführt. Kurz gesagt wurde die Antigenentnahme durchgeführt, indem Schnitte in einem 0,01 m Citratpuffer bei 60 °C für 4 Stunden inkubiert wurden. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert, darunter ALP (1:300), IL-1β (1:500), TNF-α (1:500) und p-P65 (1:300). Nach der 20-minütigen Inkubation mit entsprechenden sekundären Antikörpern wurden Schnitte mit Diaminobenzidin (DAB)-Lösung und Hämatoxylin-Gegenfärbung für IHC unterzogen oder mit DAPI für die nukleare Markierung bei IF. Für die Quantifizierung positiver Färbungen wurden aus jedem von drei Gewebeschnitten pro Probe vier zufällig ausgewählte Felder erfasst. Bei der IHC-Färbung wurde die mittlere optische Dichte als das Verhältnis der integrierten optischen Dichte (IOD) zum entsprechenden Hohlraumbereich definiert, wie es mit der Software Image-Pro Plus bestimmt wurde. Bei der IF-Färbung wurde die positive Färbungsfläche auf die Feldfläche normalisiert und als Prozentsatz ausgedrückt, und die Quantifizierung erfolgte mit derselben Software.

Primäre Knochenmarkmakrophagen (BMMs) Kultur und Zellzählung

Knochenmarkzellen wurden aus den Oberschenkeln und Schienbeinen von zwei Monate alten C57BL/6-Mäusen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ausgespült. Die resultierende Zellsuspension wurde durch ein 70-μm-Sieb gefiltert und mit 200 x g für 5 Minuten zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in einem α-MEM-Komplettmedium mit 10 % fetalem Rinderserum resuspendiert. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre wurden nicht haftende Zellen entfernt. Um die Makrophagendifferenzierung zu induzieren, wurden adhärente Zellen in einem Medium kultiviert, das 50 ng/mL Makrophagekolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und 40 ng/mL RANKL für 5–7 Tage enthielt, bis reife BMMs beobachtet wurden.

BMMs wurden mit 3 x 104 Zellen /Brunnen in 96-Well-Platten plattiert. Nach 24 Stunden Behandlung mit Gradientenkonzentrationen von LWDHW wurden BMMs mit 10% Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Arbeitslösung bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert. Die Absorption jedes Bohrlochs wurde mit einem Mikroplattenleser bei 450 nm gemessen.

Quantitative Genexpressionsanalyse an primären BMMs

BMMs wurden in 6 cm dicke Schalen mit einer Dichte von 3 x 106 Zellen pro Schale eingesät. Nach der Behandlung mit 500 und 1.000 μg/mL LWDHW für 24 Stunden wurde die gesamte RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem RNA-Quick Purification Kit aus BMMs extrahiert. Nach der Quantifizierung durch Spektrophotometrie wurden 500 ng Gesamt-RNA rückwärts in cDNA transkribiert. Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) wurde mit genspezifischen Primern durchgeführt (Tabelle 2), und die PCR-Zyklusbedingungen waren wie folgt: Anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 5 Sekunden und 60 °C für 30 Sekunden. Die Genexpressionswerte wurden mit der2-ΔΔCt-Methode analysiert, wobei GAPDH das interne Referenzgen war.

Western-Blot-Analyse an primären BMMs

Nachdem sie mit 3 x 10 x6 Zellen pro Schale in 6 cm großen Schalen angelegt wurden, wurden BMMs mit verschiedenen Interventionen behandelt und anschließend mit RIPA-Lysepuffer auf Eis gelysiert. Das Gesamtprotein wurde mit einem BCA-Protein-Assay-Kit gesammelt und quantifiziert. Proteinproben (30 μg pro Lane) wurden durch SDS-PAGE auf 12,5 % Polyacrylamid-Gelen getrennt und auf 0,2 μm PVDF-Membranen übertragen. Nach 20 Minuten Blockierung wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit folgenden primären Antikörpern inkubiert: P65 (1:1000), p-P65 (1:1000), IκBα (1:1000), p-IκBα (1:1000) und β-Aktin (1:1000). Am nächsten Tag wurden die Membranen mit sekundärem Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteinbänder wurden mit einem ECL Chemiluminescence Detection Kit visualisiert und mit einem automatischen Chemiluminescence Image Analysis System erfasst.

TRAP-Färbung von Oberschenkelgeweben und BMM

Femoralgewebeschnitte und BMMs, die in 24-Well-Platten mit 1 x 105 Zellen /Bohrloch plattiert wurden, wurden mit einem Tartrat-Resistant Acid Phosphatase (TRAP)-Färbungsset nach dem Protokoll des Herstellers gefärbt. Die von Osteoklasten bedeckte Trabekelknochenoberfläche (Oc.S/BS) in Gewebeschnitten und der Osteoklastbildungsbereich in BMM-Kulturen wurden mit der Software Image-Pro Plus quantifiziert.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert. Eine Einweg-ANOVA, gefolgt vom Dunnett-Test, wurde für die statistische Analyse in SPSS verwendet. *p < 0,05 und **p < 0,01 wurden als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

Chemische Komponenten von LWDHW analysiert mit LC-MS/MS

Das chemische Profil der wässrigen LWDHW-Lösung wurde durch eine LC-MS/MS-Analyse charakterisiert. Insgesamt wurden 1615 Komponenten identifiziert, davon 968 im positiven Ionisationsmodus und 647 im negativen Ionisationsmodus (Abbildung 2A). Die Details der Top 10 Komponenten jedes Ionisationsmodus sind in Abbildung 2B,C...

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Diskussion

Mit dem alternden globalen Bevölkerungswachstum ist PMOP zu einem ernsthaften weltweiten Gesundheitsproblem geworden, das jährlich Millionen von Frauen betrifft. Angesichts der Nebenwirkungen, die mit aktuellen antiporotischen Medikamenten verbunden sind, ist es unerlässlich, sicherere und wirksamere therapeutische Strategien zu entwickeln. LWDHW ist eine klassische, nierenstärkende Formel in der TCM und dient als alternative Medizin zur Behandlung verschiedener K...

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Offenlegungen

Alle Autoren geben keine konkurrierenden finanziellen oder nicht-finanziellen Interessen an.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Zhejiang (ZCLQN25H2701) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,01 M CitratpufferSolarbioC1010Für die Antigenrückgewinnung von Femurabschnitten für IHC- und IF-Färbungen im Protokoll Schritt 10
0,2 μm PVDF-Membranen BioRad1620177Für den Elektrotransfer von Proteinen von SDS-PAGE auf Membran im Protokoll Schritt 13
12,5% Polyacrylamid-GeleEpizyme BiotechPG113Für SDS-PAGE-Trennung von Proteinen im Protokoll Schritt 13
ALP-Antikörper ARIGOARG57422Für IHC-Nachweis in Femurabschnitten im Protokoll Schritt 10
Automatisches Chemilumineszenz-Bildanalysesystem Tanon 5200Für Western-Blot-Bandvisualisierung im Protokoll Schritt 13
Axial-Torsions-Ermüdungsprüfsystem InstronModell 5569R1412Für biomechanische Tests von Femurproben im Protokoll Schritt 9
BCA-Protein-Assay-KitBeyotimeP0010SFür Proteinquantifizierung vor Western-Blot im Protokoll Schritt 13
CCK-8BeyotimeC0039Für Zelllebensfähigkeitsmessung von BMMs im Protokoll Schritt 11
CytoscapeNicht anwendbarNicht anwendbarVersion 3.8.0
DAVID-DatenbankNicht anwendbarNicht anwendbarVersion 6.8; https://david.ncifcrf.gov/home.jsp
DisGeNET-DatenbankNicht anwendbarNicht anwendbarhttps://www.disgenet.org/
ECL-Chemilumineszenz-NachweiskitVazymeE411-04Für chemilumineszenten Nachweis von Western-Blot-Signalen im Protokoll Schritt 13
ELISA-Kit von OCNMEIMIANMM-0551M1Für die Messung von Serum-Osteocalcin-Spiegeln im Protokoll Schritt 8
ELISA-Kit von β-CTXMEIMIANMM-44858M1Für die Messung von Serum-β-CTX-Spiegeln im Protokoll Schritt 8
GeneCards-DatenbankNicht anwendbarNicht anwendbarhttps://www.genecards.org/
Green Premix Ex Taq II FASTTakaraCN830AFür qRT-PCR-Amplifikation im Protokoll Schritt 12
Hochauflösende Mikro-Computertomographie (μCT) AusrüstungBrukerSkyscan 1176Für hochauflösende μCT-Bildgebung der Femurknochenmikrostruktur im Protokoll Schritt 9
IL-1β-Antikörper BIOSSbs6319RFür IHC-Nachweis in Femurabschnitten im Protokoll Schritt 10
IκBα-AntikörperCST4812Für Western-Blot-Nachweis im Protokoll Schritt 13
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Datenbank Nicht anwendbarNicht anwendbarhttps://www.kegg.jp/
M-CSFAMIZONAAMK1001-S1Zur Induktion der BMMs-Differenzierung im Protokoll Schritt 11
Metascape-DatenbankNicht anwendbarNicht anwendbarhttps://metascape.org/
Orbitrap Exploris 120 Thermo Fisher ScientificBRE725531Für LC-MS/MS-Analyse von LWDHW im Protokoll Schritt 2
P65-AntikörperCST8242Für Western-Blot-Nachweis im Protokoll Schritt 13
p-IκBα-AntikörperCST2859Für Western-Blot-Nachweis im Protokoll Schritt 13
p-P65-AntikörperCST3033SFür Western-Blot-Nachweis im Protokoll Schritt 13
p-P65-AntikörperSuzhou Ruiying RLP0187Für IHC-Nachweis in Femurabschnitten im Protokoll Schritt 10
PrimeScript RT-Reagenz-Kit TakaraRR047AFür die reverse Transkription von Gesamt-RNA in BMMs für qRT-PCR-Analyse im Protokoll Schritt 12
QuantStudio 5-SystemApplied BiosystemsA28573Für qRT-PCR-Analyse von Osteoklastmarkergenen im Protokoll Schritt 12
RANKLAMIZONAAMK1001-S1Zur Induktion der BMMs-Differenzierung im Protokoll Schritt 11
RIPA-Lyse-PufferEpizyme BiotechPC101Für Gesamtproteinextraktion aus BMMs im Protokoll Schritt 13
RNA-Quick-Reinigungs-Kit TransGen BiotechER501-01-V2Für die Extraktion von Gesamt-RNA in BMMs im Protokoll Schritt 12
SPSS-Software IBMVersion 26Für statistische Analyse von experimentellen Daten im Protokoll Schritt 15
STRING-Datenbank Nicht anwendbarNicht anwendbarhttps://string-db.org/
Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) Färbe-KitAMIZONAAMK1001-S1Für TRAP-Färbung zur Identifizierung und Quantifizierung von Osteoklasten im Protokoll Schritt 14
Thermo Vanquish UPLC-SystemThermo Fisher ScientificTSLC-002Für LC-MS/MS-Analyse von LWDHW im Protokoll Schritt 2
TNF-α-AntikörperSuzhou Ruiying RLM3472Für IHC-Nachweis in Femurabschnitten im Protokoll Schritt 10
Traditional Chinese Medicine System Pharmacology (TCMSP) Datenbank Nicht anwendbarNicht anwendbarhttp://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
UniProt-Datenbank Nicht anwendbarNicht anwendbarhttps://www.uniprot.org/
UPLC-SäuleWatersACQUITY HSS T3Für LC-MS/MS-Analyse von LWDHW im Protokoll Schritt 2
Venny Online-Tool Nicht anwendbarNicht anwendbarhttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html
β-Aktin-AntikörperAbcamab8227Für Western-Blot-Nachweis im Protokoll Schritt 13

Referenzen

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BiologieAusgabe 233Postmenopausale OsteoporoseNF-κB-SignalwegEntzündung
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