Freiwillige gruppenkompatible Kotprobenentnahme bei Mäusen mit einem maßgeschneiderten Käfigsystem

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein maßgeschneidertes Käfigsystem für freiwillige, wohlfahrtsfreundliche, gleichzeitige und individuelle Kotprobenentnahme aus gruppenuntergebrachten Mäusen.

Zusammenfassung

Eine zuverlässige Messung der fäkalen Corticosteronmetaboliten erfordert Kotproben, die einzelnen Tieren zugeordnet und innerhalb eines definierten Zeitfensters entnommen werden können. Dies ist bei Gruppenmäusen schwierig, da zusammengefasste Käfigproben keine individuelle Zuweisung ermöglichen und eine vorübergehende Trennung das Tierwohl und die Studienergebnisse beeinträchtigen kann. Ziel dieses Protokolls ist es, ein einfaches, kostengünstiges Käfigsystem zu präsentieren, das eine freiwillige, gleichzeitige und individuelle Kotprobenentnahme aus in Gruppe gehaltenen Mäusen ermöglicht. Das System besteht aus einem mit Draht versehenen Polycarbonat-Hauskäfig, der mit drei einzelnen Sammelboxen verbunden ist. Nach der Gewöhnung und dem Training betreten die Mäuse freiwillig die Boxen, um eine kleine Nahrungsbelohnung zu erhalten. Die Türen können dann ohne Verfolgung, Handhabung oder erzwungenen Transfer geschlossen werden. Kotpellets werden aus jeder Box separat entnommen, sodass Proben einzelnen Tieren zugeordnet werden können, während soziale Unterkünfte außerhalb des Probenahmezeitraums erhalten bleiben. Dieses Protokoll unterstützt nicht-invasive Längsprobenentnahme und eignet sich für Studien zur Messung von fäkalen Corticosteron-Metaboliten oder anderen fäkalen Biomarkern. Das Design lässt sich leicht aus Standard-Fassungsmaterial und Acrylglas bauen, kann zur Reinigung zerlegt werden und erlaubt es, mehrere Käfige parallel zu beproben. Durch die Reduzierung von handhabungsbedingten Störungen und die Verbesserung der Standardisierung des Probenahmefensters bietet die Methode eine praktische Verfeinerung der endokrinen Überwachung bei Gruppenmäusen.

Einleitung

Eine große Herausforderung bei der Beurteilung der Plasma-Corticosteronkonzentrationen besteht darin, dass das Probeverfahren selbst eine akute Corticosteronerhöhung auslösen kann, wodurch die Messung gestört und möglicherweise die Interpretation der Studienergebnisse ^1,2,3 beeinflusst wird. Die Messung der fäkalen Corticosteron-Metabolite (FCMs) bietet eine nicht-invasive Alternative, da die FCM-Konzentrationen die zirkulierenden Glukokortikoidwerte mehrere Stunden vor der Probenahme widerspiegeln, abhängig von Art, Stamm, Geschlecht und Darmdurchlaufzeit ^4,5. Eine zuverlässige FCM-Analyse bei Gruppenmäusen bleibt jedoch eine Herausforderung. Die gesammelten Kotproben, die aus dem Heimkäfig entnommen wurden, können nicht einzelnen Tieren zugeordnet werden und können aufgrund interindividueller Unterschiede in der Glukokortikoidsekretion und Unsicherheit im exakten Probezeitfenster eine hohe Variabilität aufweisen. Die längere Trennung von Tieren kann die Studienziele beeinträchtigen, während eine kurzfristige Trennung für die Einzelprobenentnahme arbeitsintensiv ist, den Durchsatz begrenzt und selbst Stress² auslösen kann.

Um eine individuelle Kotprobenentnahme von Gruppenmäusen mit minimaler Handhabung zu ermöglichen, wurde ein maßgeschneiderter Kotab-Sammelkorb entwickelt (Abbildung 1A-E). Das Design wurde von einem zuvor beschriebenen Kot-Sammelkäfig für Stachelmäuse⁶ adaptiert und für den Einsatz mit Labormäusen modifiziert. Das System besteht aus einem Standard-Polycarbonat-Typ-III-Käfig, der mit drei einzelnen Sammelboxen verbunden ist, die die Tiere freiwillig betreten und über Schiebetüren schließen können. Diese Einrichtung ermöglicht es, Kotproben von einzelnen Mäusen ohne direkte Handhabung während der Probenahme zu entnehmen, und ermöglicht die gleichzeitige Probenahme mehrerer Tiere. Der Käfig bietet daher einen praktischen Ansatz für nicht-invasive, individuell zugeordnete FCM-Probenahmen bei Gruppenmäusen.

Das folgende Protokoll beschreibt ein Stuhlprobensystem, das die Entnahme und Identifikation von Kotproben von einzelnen Mäusen ermöglicht, während eine Gruppenunterbringungsumgebung aufrechterhalten wird, wobei speziell angefertigte Käfige für kontaktlose Kotabproben verwendet werden.

Protokoll

Der zuständige Tierethikausschuss der Medizinischen Universität Wien wurde vor Durchführung der Studie konsultiert und wies darauf hin, dass keine formelle Tierversuchslizenz erforderlich sei; daher ist keine Genehmigung oder Protokollnummer verfügbar. Die Studie umfasste ausschließlich etablierte Zucht- und Pflegepraktiken sowie nicht-invasive Kotproben. Es wurden keine invasiven Eingriffe durchgeführt. Gemäß Richtlinie 2010/63/EU wurde die erwartete Belastung für die Tiere als unterhalb der Schwelle von Schmerz, Leid, Belastung oder dauerhaftem Schaden bewertet, der dem Einführen einer Nadel entspricht oder darüber liegt, gemäß guter tierärztlicher Praxis. Alle Tiere wurden nach institutionellen Tierschutzstandards gehalten und versorgt.

1. Bau der Käfige (siehe Materialliste)

1. Schneiden Sie die Teile 1-4 aus 5 mm Plexiglas/Acrylglas gemäß den in Abbildung 2A-C gezeigten Vorlagen zu.
   HINWEIS: Vorlagen mit exakten Maßen können im DIN A3-Format gedruckt werden (ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2).
2. Schneiden Sie den Boden des Polycarbonat-Typ-II-(PTII)-Käfigs ab, wie in Abbildung 2D gezeigt. Dieser Teil dient später als obere Abdeckung der Fäkaliensammlungsboxen.
3. Bohren Sie die Löcher und Schlitze in den ehemaligen Boden des PTII-Käfigs, wie in Abbildung 2D gezeigt.
   HINWEIS: Genaue Maße sind in ergänzender Abbildung 3 angegeben.
4. Bohren Sie Löcher in die vordere und kurze Seite des PTIII-Käfigs, wie in Abbildung 2E gezeigt.
   HINWEIS: Genaue Maße sind in ergänzender Abbildung 4 angegeben.
5. Verwenden Sie Teil 2 als Vorlage, um die entsprechenden Bohrlöcher auf der kurzen Seite des PTIII-Käfigs und auf der langen Seite des PTII-Käfigs zu markieren.
6. Bohren Sie die markierten Löcher und befestigen Sie den PTIII-Käfig, den PTII-Käfig und Teil 2 mit den Gewindeschrauben, wie in Abbildung 2F gezeigt.
7. Führe Teil 1 als Boden des PTII-Käfigs ein. Positioniere die Teile 4a und 4b so, dass sie Teil 1 an Ort und Stelle halten, und teile den Probekäfig in separate Sammelboxen. Benutze die Heißklebepistole, um sie an Ort und Stelle zu fixieren.
8. Schieben Sie die unteren Vorsprünge der Teile 4a und 4b in die Schlitze von Teil 1. Diese Vorsprünge bilden die Beine der Sammelboxen.
9. Schieben Sie die oberen Vorsprünge der Teile 4a und 4b durch die obere Abdeckung, den ehemaligen Boden des PTII-Käfigs, um ihn an Ort und Stelle zu halten.
10. Fädeln Sie die Holzessstäbchen oder -stäbe durch die Löcher in den Vorsprüngen, wobei Sie eine Stange oben und zwei unten verwenden, um die Konstruktion zu stabilisieren und zu fixieren.
    HINWEIS: Holzmaterialien sollten im Vivarium nur verwendet werden, wenn sie wegwerfbar sind, da sie nicht gereinigbar sind. Falls dies nicht der Fall ist, sollten Stäbe mit alternativer Zusammensetzung verwendet werden.
11. Schließen Sie verbleibende Lücken oder kleinere Ungenauigkeiten mit einer Heißkleberpistole. Verwenden Sie die Teile 3a, 3b und 3c (Abbildung 2B) als Schiebetüren zwischen dem Hauskäfig und den Sammelboxen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine scharfen Kanten, Klebstoffreste oder hervorstehendes Material für die Tiere zugänglich bleiben. Die in diesem Prototyp verwendeten Acrylglas-/Plexiglaskomponenten sind für die Dampfautoklav-Sterilisation nicht geeignet. Wenn das System daher in SPF-Einrichtungen verwendet wird, die sterilisiertes Käfigmaterial benötigen, sollte entweder ein institutionell genehmigtes, nicht-autoklavisches Desinfektionsverfahren verwendet werden oder die Acrylkomponenten durch autoklavierbares Material ersetzt werden, wobei die gleichen Maße erhalten bleiben.

2. Tiervorbereitung und Unterbringung

1. Erfassen Sie die erforderliche Anzahl von Mäusen des passenden Stamms für die Studie.
   HINWEIS: Die repräsentativen Daten stammen von 30 acht Wochen alten C57BL/6J-Mäusen, bestehend aus 20 Weibchen und 10 Männchen. Die Mäuse waren gemäß FELASA-Standards spezifisch pathogenfrei und stammten aus den Charles River Laboratories in Sulzfeld, Deutschland.
2. Haustiere werden unter konventionellen Bedingungen in angepassten Polycarbonat-Typ-III-Käfigen mit maximal drei erwachsenen Mäusen pro Käfig eingesetzt.
   HINWEIS: Getrennte Männchen wurden für diese Studie in Standard-Polycarbonat-Typ-II-Käfigen untergebracht.
3. Halten Sie den Tierraum bei 22 ± 2 °C und 55 ± 10 % relative Luftfeuchtigkeit unter einem 12-Stunden-Licht/Dunkelzyklus mit Lichteinschaltung um 6:00 Uhr morgens.
4. Bieten Sie eine standardmäßige Pflegediät und Wasser ad libitum an.
5. Fügen Sie Espenholz-Bettzeug, eine Papier-Toilettenrolle, ein rotes, transparentes Plastikhaus und Papiertücher als Nistmaterial zu jedem Käfig hinzu.
6. Man erkennt Mäuse hauptsächlich anhand natürlicher Schwanzmarkierungen. Verwenden Sie vorübergehend Stiftmarkierungen bei Tieren mit ähnlichen Schwanzmarkierungen während des Wiegens, falls erforderlich.

3. Gewöhnung und Ausbildung der Tiere

HINWEIS: Der fertige Käfig besteht aus einem Haus-Käfig, PTIII, der mit einem Probekäfig mit drei separaten Sammelboxen, PTII, verbunden ist. Die Hauskäfige können wie herkömmliche Käfige verwendet werden, mit Einstreu, Käfiganreicherung, einem Drahtdeckel ohne äußere Verschlüsse und der Bereitstellung von Futter und Wasser. Das System kann zum Waschen zerlegt werden und nur während der Probenahmewochen verwendet werden. Während Wochen ohne Probenahme können Tiere in Standard-PTIII-Käfigen untergebracht werden.

1. Setzen Sie die Tiere mindestens zwei Wochen vor der geplanten ersten geplanten Probenahme ins Käfigsystem.
2. Gewöhnen Sie die Tiere an die Sammelboxen, indem Sie für eine Nacht die Schiebetüren entfernen, sodass die Tiere die Kisten frei erkunden können.
3. Führen Sie drei Trainingseinheiten vor der ersten Probenahme durch. Führen Sie Training unter denselben Lichtverhältnissen und zur gleichen Tageszeit durch, die für spätere Probenahmen geplant sind, idealerweise unter rotem Licht kurz nach Beginn der Dunkelphase.
4. Tragen Sie eine kleine Belohnung aus, wie Haselnusscreme, Erdnussbutter, Malzpaste oder ein ähnliches schmackhaftes Lebensmittel, an die Wand gegenüber dem Eingang jeder Sammelbox.
5. Am ersten Trainingstag lassen Sie die Türen offen und lassen Sie die Tiere die Belohnung freiwillig entdecken und konsumieren.
6. Am zweiten Trainingstag warten Sie, bis ein Tier eine Sammelbox betritt und beginnt, die Belohnung zu lecken. Schließe vorsichtig die Schiebetür hinter dem Tier und öffne sie nach 10 Minuten.
7. Am dritten Trainingstag wiederholen Sie das Verfahren und verlängern allmählich die Zeit, in der die Tiere in den Sammelboxen bleiben.
   HINWEIS: Das Training sollte ruhig und beständig sein. Vermeiden Sie es, die Tiere in die Boxen zu jagen, da dies den Stress erhöhen und die freiwillige Teilnahme an späteren Probenahmesitzungen verringern kann.

4. Entnahme von Fäkalienproben

1. Zeitpunkt der Probenentnahme
   1. Plane die Probezeit entsprechend der biologischen Frage und der erwarteten Verzögerung zwischen der Ausscheidung von Plasma-Corticosteron und fäkalem Corticosteron-Metaboliten. Bei Mäusen spiegeln die Metaboliten des fäkalen Corticosterons typischerweise die zirkulierenden Glukokortikoidspiegel etwa 8–10 Stunden vor der Probenahme wider.
      HINWEIS: Wenn das genaue Timing entscheidend ist, führen Sie eine Pilotstudie durch, um den Zeitverlauf der FCM-Ausscheidung unter den spezifischen Stämmen, dem Geschlecht und den experimentellen Bedingungen zu bestimmen. Dieser Pilot kann mit den Trainingseinheiten kombiniert werden.
   2. Planen Sie die Probenahme während einer Phase hoher Stuhlproduktion. Die Probenahme ist meist am effizientesten zu Beginn der dunklen und aktiven Phase.
   3. Führen Sie alle Probenahmesitzungen während der gesamten Studie zur gleichen Tageszeit durch, um die durch den täglichen Rhythmus der FCM-Werte verursachte Variation zu verringern.
      HINWEIS: Nach unserer Erfahrung spiegeln sich Ereignisse, die morgens gegen 10:00 Uhr stattfinden, gut wider, wenn die Probenahmen zwischen 18:00 und 20:00 Uhr geplant sind, abhängig vom Lichtplan des Tierraums.
2. Probenahmeverfahren und praktische Beratung
   1. Markiere die Tiere einzeln vor der Probenahme. Verwenden Sie Ohrabdrücke oder einzelne Schwanzmarkierungen.
      HINWEIS: Zehenmarkierungen und Farbcodes können unter rotem Licht in den Boxen schwer zu erkennen sein.
   2. Bereite die Sammelboxen während der Lichtphase vor, indem du die Belohnung auf die Rückwand jeder Kiste anwendest.
      HINWEIS: Die Vorbereitung der Kisten während des Tages verbessert die Sicht für den Versuchsleiter und ermöglicht es den Tieren, die Belohnung vor der Probenahme zu riechen.
   3. Zur geplanten Probenzeit öffnen Sie die Sammelboxen und warten, bis die Tiere freiwillig eintreten.
   4. Sobald eine Maus eine Sammelbox betreten hat, schließen Sie vorsichtig die Schiebetür dahinter.
   5. Nachdem alle Tiere eine Box betreten haben, notieren Sie die Identität und Position jeder Maus in einem vorbereiteten Probeblatt.
   6. Wenn in einer Sitzung mehr als 10 Käfige beprobt werden, sollte ein zweiter Versuchsleiter zur Unterstützung der Tierbestimmung, Türführung und Dokumentation einbezogen werden.
   7. Halten Sie die Tiere während der geplanten Probenahmezeit in den Sammelboxen, typischerweise 30 Minuten bis 2 Stunden, abhängig vom erwarteten Stuhlergebnis und dem Studiendesign.
      HINWEIS: Proben werden ausgeschlossen, wenn die individuelle Identität nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann, wenn Kotpellets mit Urin, Einstreu oder Kot eines anderen Tieres kontaminiert sind, wenn die Probenahme erheblich vom geplanten Zeitfenster abweicht oder die Menge an Kotmaterial für die FCM-Analyse unzureichend ist.
      HINWEIS: Die Verwendung von 50 mg ist unser Standardprotokoll, und diese Menge wurde in allen Validierungen und allen anderen Artikeln ^5,7,8 verwendet. Normalerweise ist es leicht erhältlich.
   8. Am Ende der Probenahme öffnen Sie die Schiebetüren und lassen Sie die Mäuse in den Hauskäfig zurückkehren.
   9. Schließen Sie die Sammelboxen sofort nach dem Weggang der Mäuse, um ein Wiedereintritt und eine Kreuzkontamination der Proben zu verhindern.
   10. Entfernen Sie die Fäkalpellets aus jeder Sammelbox mit langer Pinzette und übertragen Sie sie in einzeln beschriftete Sammelröhrchen.
   11. Lagern Sie Proben bei -20 °C bis zur weiteren Vorbereitung des FCM-Tests.
       HINWEIS: Wenn die Boxen sicher verschlossen sind und von den Mäusen nicht wieder betreten werden können, kann die Entnahme von Kotpellets bis zur folgenden Lichtphase verschoben werden. Dies sollte jedoch innerhalb einer Studie konsequent erfolgen.
   12. Halten Sie die Tiere bis zum nächsten Käfigwechsel im Häuskäfig (PTIII). Dann können sie auseinandergebaut und in einer normalen Käfigwaschmaschine gewaschen werden.

Ergebnisse

Fäkale Corticosteron-Metaboliten (FCMs) wurden erfolgreich aus Proben quantifiziert, die mit den maßgefertigten Kotprobenkäfigen in einer Längsschnittstudie entnommen wurden, in der dauerhaft und intermittierend gezüchtete Mäuse verglichen. Die repräsentative FCM-Analyse umfasste 30 Tiere: dauerhaft gezüchtete Gruppe, n = 15 Tiere in 5 Käfigen; Intermittierend gezüchtete Gruppe, n = 10 Tiere in 5 Käfigen, mit 5 Männchen, die eingeteilt wurden, außer bei 3 Zuchtveranstaltungen, bei denen ...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Käfigsystem zur Entnahme einzeln zugeordneter Kotproben von in Gruppe gehaltenen Mäusen. Der Hauptvorteil der Methode besteht darin, dass sie die individuelle Probenzuordnung mit der Erhaltung wichtiger Aspekte des sozialen Wohnens kombiniert, insbesondere des visuellen und olfaktorischen Kontakts mit Käfiggenossen. Dies ist relevant, da Gruppenunterkünfte oft für das Tierschutz erforderlich sind und auch Teil des experimentellen Designs

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bohrer 5 mm	Craftomat	22380487	5mm Durchmesser; Menge 1
Bohrer 60 mm	Bosch	32064647	60 mm Durchmesser; Menge 1
Bohrer 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm Durchmesser; Menge 1
Bohrmaschine	Makita	25730054	Standard Hand- oder Tischbohrmaschine; Menge 1
Heißklebepistole	Einhell	29051207	Für Käfigmontage; Menge 1
Heißklebestifte	Einhell	29049664	Kompatibel mit Heißklebepistole; Menge 5-10
Makrolon-Käfig	Animalab	31200129	Standard Typ II Käfig; Menge 1
Makrolon-Käfig	Animalab	31200256	Standard Typ III Käfig; Menge 1
Plexiglas / Acrylglas	Bauhaus	29122352	Ca. 0,25 m² gesamt; 5 mm Dicke; Menge  2 DIN A3-Platten
Säge oder Fräsvorrichtung	Scheppach	32079641	Kleine Bandsäge, Stichsäge oder CNC-Fräse; Menge 1
Gewindeschrauben	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Menge 4
Holzspieße / -stangen	Ikea	903.429.71	Runder Holzstab; Menge 3