Freiwillige gruppenkompatible Kotprobenentnahme bei Mäusen mit einem maßgeschneiderten Käfigsystem

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein maßgeschneidertes Käfigsystem für freiwillige, wohlfahrtsfreundliche, gleichzeitige und individuelle Kotprobenentnahme aus gruppenuntergebrachten Mäusen.

Zusammenfassung

Eine zuverlässige Messung der fäkalen Corticosteronmetaboliten erfordert Kotproben, die einzelnen Tieren zugeordnet und innerhalb eines definierten Zeitfensters entnommen werden können. Dies ist bei Gruppenmäusen schwierig, da zusammengefasste Käfigproben keine individuelle Zuweisung ermöglichen und eine vorübergehende Trennung das Tierwohl und die Studienergebnisse beeinträchtigen kann. Ziel dieses Protokolls ist es, ein einfaches, kostengünstiges Käfigsystem zu präsentieren, das eine freiwillige, gleichzeitige und individuelle Kotprobenentnahme aus in Gruppe gehaltenen Mäusen ermöglicht. Das System besteht aus einem mit Draht versehenen Polycarbonat-Hauskäfig, der mit drei einzelnen Sammelboxen verbunden ist. Nach der Gewöhnung und dem Training betreten die Mäuse freiwillig die Boxen, um eine kleine Nahrungsbelohnung zu erhalten. Die Türen können dann ohne Verfolgung, Handhabung oder erzwungenen Transfer geschlossen werden. Kotpellets werden aus jeder Box separat entnommen, sodass Proben einzelnen Tieren zugeordnet werden können, während soziale Unterkünfte außerhalb des Probenahmezeitraums erhalten bleiben. Dieses Protokoll unterstützt nicht-invasive Längsprobenentnahme und eignet sich für Studien zur Messung von fäkalen Corticosteron-Metaboliten oder anderen fäkalen Biomarkern. Das Design lässt sich leicht aus Standard-Fassungsmaterial und Acrylglas bauen, kann zur Reinigung zerlegt werden und erlaubt es, mehrere Käfige parallel zu beproben. Durch die Reduzierung von handhabungsbedingten Störungen und die Verbesserung der Standardisierung des Probenahmefensters bietet die Methode eine praktische Verfeinerung der endokrinen Überwachung bei Gruppenmäusen.

Einleitung

Eine große Herausforderung bei der Beurteilung der Plasma-Corticosteronkonzentrationen besteht darin, dass das Probeverfahren selbst eine akute Corticosteronerhöhung auslösen kann, wodurch die Messung gestört und möglicherweise die Interpretation der Studienergebnisse ^1,2,3 beeinflusst wird. Die Messung der fäkalen Corticosteron-Metabolite (FCMs) bietet eine nicht-invasive Alternative, da die FCM-Konzentrationen die zirkulierenden Glukokortikoidwerte mehrere Stunden vor der Probenahme widerspiegeln, abhängig von Art, Stamm, Geschlecht und Darmdurchlaufzeit ^4,5. Eine zuverlässige FCM-Analyse bei Gruppenmäusen bleibt jedoch eine Herausforderung. Die gesammelten Kotproben, die aus dem Heimkäfig entnommen wurden, können nicht einzelnen Tieren zugeordnet werden und können aufgrund interindividueller Unterschiede in der Glukokortikoidsekretion und Unsicherheit im exakten Probezeitfenster eine hohe Variabilität aufweisen. Die längere Trennung von Tieren kann die Studienziele beeinträchtigen, während eine kurzfristige Trennung für die Einzelprobenentnahme arbeitsintensiv ist, den Durchsatz begrenzt und selbst Stress² auslösen kann.

Um eine individuelle Kotprobenentnahme von Gruppenmäusen mit minimaler Handhabung zu ermöglichen, wurde ein maßgeschneiderter Kotab-Sammelkorb entwickelt (Abbildung 1A-E). Das Design wurde von einem zuvor beschriebenen Kot-Sammelkäfig für Stachelmäuse⁶ adaptiert und für den Einsatz mit Labormäusen modifiziert. Das System besteht aus einem Standard-Polycarbonat-Typ-III-Käfig, der mit drei einzelnen Sammelboxen verbunden ist, die die Tiere freiwillig betreten und über Schiebetüren schließen können. Diese Einrichtung ermöglicht es, Kotproben von einzelnen Mäusen ohne direkte Handhabung während der Probenahme zu entnehmen, und ermöglicht die gleichzeitige Probenahme mehrerer Tiere. Der Käfig bietet daher einen praktischen Ansatz für nicht-invasive, individuell zugeordnete FCM-Probenahmen bei Gruppenmäusen.

Das folgende Protokoll beschreibt ein Stuhlprobensystem, das die Entnahme und Identifikation von Kotproben von einzelnen Mäusen ermöglicht, während eine Gruppenunterbringungsumgebung aufrechterhalten wird, wobei speziell angefertigte Käfige für kontaktlose Kotabproben verwendet werden.

Protokoll

Der zuständige Tierethikausschuss der Medizinischen Universität Wien wurde vor Durchführung der Studie konsultiert und wies darauf hin, dass keine formelle Tierversuchslizenz erforderlich sei; daher ist keine Genehmigung oder Protokollnummer verfügbar. Die Studie umfasste ausschließlich etablierte Zucht- und Pflegepraktiken sowie nicht-invasive Kotproben. Es wurden keine invasiven Eingriffe durchgeführt. Gemäß Richtlinie 2010/63/EU wurde die erwartete Belastung für die Tiere als unterhalb der Schwelle von Schmerz, Leid, Belastung oder dauerhaftem Schaden bewertet, der dem Einführen einer Nadel entspricht oder darüber liegt, gemäß guter tierärztlicher Praxis. Alle Tiere wurden nach institutionellen Tierschutzstandards gehalten und versorgt.

1. Bau der Käfige (siehe Materialliste)

1. Schneiden Sie die Teile 1-4 aus 5 mm Plexiglas/Acrylglas gemäß den in Abbildung 2A-C gezeigten Vorlagen zu.
   HINWEIS: Vorlagen mit exakten Maßen können im DIN A3-Format gedruckt werden (ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2).
2. Schneiden Sie den Boden des Polycarbonat-Typ-II-(PTII)-Käfigs ab, wie in Abbildung 2D gezeigt. Dieser Teil dient später als obere Abdeckung der Fäkaliensammlungsboxen.
3. Bohren Sie die Löcher und Schlitze in den ehemaligen Boden des PTII-Käfigs, wie in Abbildung 2D gezeigt.
   HINWEIS: Genaue Maße sind in ergänzender Abbildung 3 angegeben.
4. Bohren Sie Löcher in die vordere und kurze Seite des PTIII-Käfigs, wie in Abbildung 2E gezeigt.
   HINWEIS: Genaue Maße sind in ergänzender Abbildung 4 angegeben.
5. Verwenden Sie Teil 2 als Vorlage, um die entsprechenden Bohrlöcher auf der kurzen Seite des PTIII-Käfigs und auf der langen Seite des PTII-Käfigs zu markieren.
6. Bohren Sie die markierten Löcher und befestigen Sie den PTIII-Käfig, den PTII-Käfig und Teil 2 mit den Gewindeschrauben, wie in Abbildung 2F gezeigt.
7. Führe Teil 1 als Boden des PTII-Käfigs ein. Positioniere die Teile 4a und 4b so, dass sie Teil 1 an Ort und Stelle halten, und teile den Probekäfig in separate Sammelboxen. Benutze die Heißklebepistole, um sie an Ort und Stelle zu fixieren.
8. Schieben Sie die unteren Vorsprünge der Teile 4a und 4b in die Schlitze von Teil 1. Diese Vorsprünge bilden die Beine der Sammelboxen.
9. Schieben Sie die oberen Vorsprünge der Teile 4a und 4b durch die obere Abdeckung, den ehemaligen Boden des PTII-Käfigs, um ihn an Ort und Stelle zu halten.
10. Fädeln Sie die Holzessstäbchen oder -stäbe durch die Löcher in den Vorsprüngen, wobei Sie eine Stange oben und zwei unten verwenden, um die Konstruktion zu stabilisieren und zu fixieren.
    HINWEIS: Holzmaterialien sollten im Vivarium nur verwendet werden, wenn sie wegwerfbar sind, da sie nicht gereinigbar sind. Falls dies nicht der Fall ist, sollten Stäbe mit alternativer Zusammensetzung verwendet werden.
11. Schließen Sie verbleibende Lücken oder kleinere Ungenauigkeiten mit einer Heißkleberpistole. Verwenden Sie die Teile 3a, 3b und 3c (Abbildung 2B) als Schiebetüren zwischen dem Hauskäfig und den Sammelboxen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine scharfen Kanten, Klebstoffreste oder hervorstehendes Material für die Tiere zugänglich bleiben. Die in diesem Prototyp verwendeten Acrylglas-/Plexiglaskomponenten sind für die Dampfautoklav-Sterilisation nicht geeignet. Wenn das System daher in SPF-Einrichtungen verwendet wird, die sterilisiertes Käfigmaterial benötigen, sollte entweder ein institutionell genehmigtes, nicht-autoklavisches Desinfektionsverfahren verwendet werden oder die Acrylkomponenten durch autoklavierbares Material ersetzt werden, wobei die gleichen Maße erhalten bleiben.

2. Tiervorbereitung und Unterbringung

1. Erfassen Sie die erforderliche Anzahl von Mäusen des passenden Stamms für die Studie.
   HINWEIS: Die repräsentativen Daten stammen von 30 acht Wochen alten C57BL/6J-Mäusen, bestehend aus 20 Weibchen und 10 Männchen. Die Mäuse waren gemäß FELASA-Standards spezifisch pathogenfrei und stammten aus den Charles River Laboratories in Sulzfeld, Deutschland.
2. Haustiere werden unter konventionellen Bedingungen in angepassten Polycarbonat-Typ-III-Käfigen mit maximal drei erwachsenen Mäusen pro Käfig eingesetzt.
   HINWEIS: Getrennte Männchen wurden für diese Studie in Standard-Polycarbonat-Typ-II-Käfigen untergebracht.
3. Halten Sie den Tierraum bei 22 ± 2 °C und 55 ± 10 % relative Luftfeuchtigkeit unter einem 12-Stunden-Licht/Dunkelzyklus mit Lichteinschaltung um 6:00 Uhr morgens.
4. Bieten Sie eine standardmäßige Pflegediät und Wasser ad libitum an.
5. Fügen Sie Espenholz-Bettzeug, eine Papier-Toilettenrolle, ein rotes, transparentes Plastikhaus und Papiertücher als Nistmaterial zu jedem Käfig hinzu.
6. Man erkennt Mäuse hauptsächlich anhand natürlicher Schwanzmarkierungen. Verwenden Sie vorübergehend Stiftmarkierungen bei Tieren mit ähnlichen Schwanzmarkierungen während des Wiegens, falls erforderlich.

3. Gewöhnung und Ausbildung der Tiere

HINWEIS: Der fertige Käfig besteht aus einem Haus-Käfig, PTIII, der mit einem Probekäfig mit drei separaten Sammelboxen, PTII, verbunden ist. Die Hauskäfige können wie herkömmliche Käfige verwendet werden, mit Einstreu, Käfiganreicherung, einem Drahtdeckel ohne äußere Verschlüsse und der Bereitstellung von Futter und Wasser. Das System kann zum Waschen zerlegt werden und nur während der Probenahmewochen verwendet werden. Während Wochen ohne Probenahme können Tiere in Standard-PTIII-Käfigen untergebracht werden.

1. Setzen Sie die Tiere mindestens zwei Wochen vor der geplanten ersten geplanten Probenahme ins Käfigsystem.
2. Gewöhnen Sie die Tiere an die Sammelboxen, indem Sie für eine Nacht die Schiebetüren entfernen, sodass die Tiere die Kisten frei erkunden können.
3. Führen Sie drei Trainingseinheiten vor der ersten Probenahme durch. Führen Sie Training unter denselben Lichtverhältnissen und zur gleichen Tageszeit durch, die für spätere Probenahmen geplant sind, idealerweise unter rotem Licht kurz nach Beginn der Dunkelphase.
4. Tragen Sie eine kleine Belohnung aus, wie Haselnusscreme, Erdnussbutter, Malzpaste oder ein ähnliches schmackhaftes Lebensmittel, an die Wand gegenüber dem Eingang jeder Sammelbox.
5. Am ersten Trainingstag lassen Sie die Türen offen und lassen Sie die Tiere die Belohnung freiwillig entdecken und konsumieren.
6. Am zweiten Trainingstag warten Sie, bis ein Tier eine Sammelbox betritt und beginnt, die Belohnung zu lecken. Schließe vorsichtig die Schiebetür hinter dem Tier und öffne sie nach 10 Minuten.
7. Am dritten Trainingstag wiederholen Sie das Verfahren und verlängern allmählich die Zeit, in der die Tiere in den Sammelboxen bleiben.
   HINWEIS: Das Training sollte ruhig und beständig sein. Vermeiden Sie es, die Tiere in die Boxen zu jagen, da dies den Stress erhöhen und die freiwillige Teilnahme an späteren Probenahmesitzungen verringern kann.

4. Entnahme von Fäkalienproben

1. Zeitpunkt der Probenentnahme
   1. Plane die Probezeit entsprechend der biologischen Frage und der erwarteten Verzögerung zwischen der Ausscheidung von Plasma-Corticosteron und fäkalem Corticosteron-Metaboliten. Bei Mäusen spiegeln die Metaboliten des fäkalen Corticosterons typischerweise die zirkulierenden Glukokortikoidspiegel etwa 8–10 Stunden vor der Probenahme wider.
      HINWEIS: Wenn das genaue Timing entscheidend ist, führen Sie eine Pilotstudie durch, um den Zeitverlauf der FCM-Ausscheidung unter den spezifischen Stämmen, dem Geschlecht und den experimentellen Bedingungen zu bestimmen. Dieser Pilot kann mit den Trainingseinheiten kombiniert werden.
   2. Planen Sie die Probenahme während einer Phase hoher Stuhlproduktion. Die Probenahme ist meist am effizientesten zu Beginn der dunklen und aktiven Phase.
   3. Führen Sie alle Probenahmesitzungen während der gesamten Studie zur gleichen Tageszeit durch, um die durch den täglichen Rhythmus der FCM-Werte verursachte Variation zu verringern.
      HINWEIS: Nach unserer Erfahrung spiegeln sich Ereignisse, die morgens gegen 10:00 Uhr stattfinden, gut wider, wenn die Probenahmen zwischen 18:00 und 20:00 Uhr geplant sind, abhängig vom Lichtplan des Tierraums.
2. Probenahmeverfahren und praktische Beratung
   1. Markiere die Tiere einzeln vor der Probenahme. Verwenden Sie Ohrabdrücke oder einzelne Schwanzmarkierungen.
      HINWEIS: Zehenmarkierungen und Farbcodes können unter rotem Licht in den Boxen schwer zu erkennen sein.
   2. Bereite die Sammelboxen während der Lichtphase vor, indem du die Belohnung auf die Rückwand jeder Kiste anwendest.
      HINWEIS: Die Vorbereitung der Kisten während des Tages verbessert die Sicht für den Versuchsleiter und ermöglicht es den Tieren, die Belohnung vor der Probenahme zu riechen.
   3. Zur geplanten Probenzeit öffnen Sie die Sammelboxen und warten, bis die Tiere freiwillig eintreten.
   4. Sobald eine Maus eine Sammelbox betreten hat, schließen Sie vorsichtig die Schiebetür dahinter.
   5. Nachdem alle Tiere eine Box betreten haben, notieren Sie die Identität und Position jeder Maus in einem vorbereiteten Probeblatt.
   6. Wenn in einer Sitzung mehr als 10 Käfige beprobt werden, sollte ein zweiter Versuchsleiter zur Unterstützung der Tierbestimmung, Türführung und Dokumentation einbezogen werden.
   7. Halten Sie die Tiere während der geplanten Probenahmezeit in den Sammelboxen, typischerweise 30 Minuten bis 2 Stunden, abhängig vom erwarteten Stuhlergebnis und dem Studiendesign.
      HINWEIS: Proben werden ausgeschlossen, wenn die individuelle Identität nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann, wenn Kotpellets mit Urin, Einstreu oder Kot eines anderen Tieres kontaminiert sind, wenn die Probenahme erheblich vom geplanten Zeitfenster abweicht oder die Menge an Kotmaterial für die FCM-Analyse unzureichend ist.
      HINWEIS: Die Verwendung von 50 mg ist unser Standardprotokoll, und diese Menge wurde in allen Validierungen und allen anderen Artikeln ^5,7,8 verwendet. Normalerweise ist es leicht erhältlich.
   8. Am Ende der Probenahme öffnen Sie die Schiebetüren und lassen Sie die Mäuse in den Hauskäfig zurückkehren.
   9. Schließen Sie die Sammelboxen sofort nach dem Weggang der Mäuse, um ein Wiedereintritt und eine Kreuzkontamination der Proben zu verhindern.
   10. Entfernen Sie die Fäkalpellets aus jeder Sammelbox mit langer Pinzette und übertragen Sie sie in einzeln beschriftete Sammelröhrchen.
   11. Lagern Sie Proben bei -20 °C bis zur weiteren Vorbereitung des FCM-Tests.
       HINWEIS: Wenn die Boxen sicher verschlossen sind und von den Mäusen nicht wieder betreten werden können, kann die Entnahme von Kotpellets bis zur folgenden Lichtphase verschoben werden. Dies sollte jedoch innerhalb einer Studie konsequent erfolgen.
   12. Halten Sie die Tiere bis zum nächsten Käfigwechsel im Häuskäfig (PTIII). Dann können sie auseinandergebaut und in einer normalen Käfigwaschmaschine gewaschen werden.

Ergebnisse

Fäkale Corticosteron-Metaboliten (FCMs) wurden erfolgreich aus Proben quantifiziert, die mit den maßgefertigten Kotprobenkäfigen in einer Längsschnittstudie entnommen wurden, in der dauerhaft und intermittierend gezüchtete Mäuse verglichen. Die repräsentative FCM-Analyse umfasste 30 Tiere: dauerhaft gezüchtete Gruppe, n = 15 Tiere in 5 Käfigen; Intermittierend gezüchtete Gruppe, n = 10 Tiere in 5 Käfigen, mit 5 Männchen, die eingeteilt wurden, außer bei 3 Zuchtveranstaltungen, bei denen sie gemeinsam mit den Weibchen untergebracht wurden. Die Proben wurden an 19 zweiwöchentlichen Zeitpunkten an Tagen des Käfigwechsels sowie an Wochenenden entnommen. Die durchschnittliche Zeit, bis die meisten Tiere die Box betreten hatten, betrug 7,5 Minuten (SD = 3,07), wobei die meisten Tiere durchschnittlich 27,6 (SD = 1,44) Mäuse mit insgesamt 30 Mäusen umfassten. Alle Mäuse waren nach einem Durchschnitt von 11,69 Minuten (SD = 3,29) in die Box eingetreten. Die mittlere Dauer der Einsperrung bei allen Mäusen betrug 24,56 Minuten (SD = 15,51), und die mittlere Zeit vom Betreten der ersten Maus bis zum Beginn der Freisetzung betrug 43,14 Minuten (SD = 8,51). Die mittlere Freisetzungsdauer betrug 14,86 Minuten (SD = 22,82), die durchschnittliche Dauer des gesamten Eingriffs 68,00 Minuten (SD = 11,87). Von 19 Proben (3 Versuch + 16 reguläre), die 480 Proben erwarteten, fehlten zwei Proben, weil die Mäuse während der Einsperrung nicht defäkierten, drei Proben konnten nicht entnommen werden, weil die Mäuse entweder hochträchtig oder kurz nach der Geburt waren, und 5 Mäuse benötigten sanfte Unterstützung zum Eintreten. Das mittlere Gewicht der Proben aus den ersten drei Proben betrug 51,16 mg (SD = 25,39). Von allen gesammelten Proben (475) konnten 473 analysiert werden und Ergebnisse ergaben.

Einzelne Tiere galten als biologische Replikate. Wiederholte Kotproben, die während des achtwöchigen Studienzeitraums von denselben Tieren entnommen wurden, wurden als longitudinale wiederholte Messungen und nicht als unabhängige biologische Replikate behandelt. Die Analyse erfolgte mit einem linearen Mixed-Effects-Modell mit Geschlecht, Zuchtgruppe, Stichprobentag und Anzahl der Mäuse pro Käfig als festen Effekten sowie dem Käfig als zufälliger Intercept. Wechselwirkungen zwischen Geschlecht, Zuchtgruppe und Stichprobentag wurden im Modell einbezogen. Die Anzahl der Mäuse pro Käfig wurde als zusätzlicher fester Effekt berücksichtigt, aber nicht in Interaktionsbegriffen getestet, da diese Variable teilweise mit dem experimentellen Design, insbesondere bei intermittierend gezüchteten Männchen, übereinstimmte.

Das Modell zeigte einen klaren Effekt des Geschlechts auf die FCM-Konzentrationen (Abbildung 3A-D). Weibchen hatten höhere FCM-Konzentrationen als Männchen über Fortpflanzungsbedingungen und Probentage, Schätzung = 28,30, SE = 2,58, t = 10,98, P < 0,0001. Post-hoc-Vergleiche bestätigten diesen Geschlechtsunterschied innerhalb beider Zuchtgruppen und an beiden Stichprobentagen. Bei dauerhaft gezüchteten Tieren hatten die Weibchen sonntags höhere FCM-Konzentrationen als Männchen, Schätzung = 53,41, SE = 8,28, P < 0,0001, und am Mittwoch Schätzung = 55,27, SE = 8,37, P < 0,0001. Das gleiche Muster wurde bei intermittierend gezüchteten Tieren an Sonntagen beobachtet, Schätzung = 58,04, SE = 12,00, P < 0,0001 und mittwochs Schätzung = 59,68, SE = 9,88, P < 0,0001.

Das Modell zeigte außerdem einen signifikanten Haupteffekt der Zuchtgruppe: Schätzung = 11,59, SE = 4,65, t = 2,49, P = 0,0227. Allerdings zeigten Tukey-adjustierte Post-hoc-Vergleiche keine signifikanten Unterschiede zwischen dauerhaft und intermittierend gezüchteten Tieren innerhalb der einzelnen Geschlecht-Tag-Kombinationen. Bei Weibchen unterschieden sich dauerhaft und intermittierend gezüchtete Tiere sonntags nicht signifikant, Schätzung = 24,51, SE = 12,20, P = 0,2085 oder an Mittwoch mit Schätzung = 17,31, SE = 12,20, P = 0,4950. Ähnlich wurde bei Männchen kein signifikanter Unterschied in der Brutgruppe an Sonntagen festgestellt, Schätzung = 29,14, SE = 14,00, P = 0,1708, oder mittwochs Schätzung = 21,72, SE = 13,30, P = 0,3682. Der signifikante Haupteffekt der Zuchtgruppe sollte daher als Gesamteffekt auf Modellebene interpretiert werden, während die spezifischeren Tukey-adjustierten Post-hoc-Vergleiche innerhalb von Geschlecht und Stichprobentag keinen robusten paarweisen Gruppenunterschied identifizierten.

Das Fehlen eines signifikanten Unterschieds in der Zuchtgruppe bei den Männchen ist besonders wichtig, da die Männchen sonntags immer als Einhaus untergebracht waren. Der Sonntagsvergleich bei Männchen zeigt also, dass die Probenahme selbst die FCM-Konzentrationen zumindest bei männlichen Mäusen nicht erhöht. Die Kotprobenkäfige wurden auch für eine weitere Studie verwendet, die FCMs bei verschmutzten Wuchsmäusen mit Kontrollgruppen^{verglich 9}.

Abbildung 1: Überblick über den maßgefertigten Kotprobenkäfig. Das Käfigsystem ermöglicht es, Kotproben von einzelnen Mäusen in einem Gruppenkäfig zu entnehmen, ohne dass sie während der Probenahme direkt behandelt werden müssen. (A) Vollständig zusammengebautes Käfigsystem bestehend aus einem Haus-Käfig und einem angeschlossenen Kot-Probe-Käfig. (B) Seitenansicht des angeschlossenen Probekäfigs. (C) Draufsicht mit den drei separaten Eingängen zu den einzelnen Sammelboxen. (D) Blick aus dem Inneren des Hauskäfigs zu den Eingängen der Probenahmeboxen. (E) Geöffneter Probekäfig, der Zugang zu den Sammelboxen zur Entfernung und Reinigung von Kotpellets ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Bauplan und Montage des Stuhlprobenkäfigs. (A-C) Acrylglasteile werden verwendet, um den Boden, die Seitenwände, Schiebetüren und Trennwände des Probekäfigs zu errichten. (D) Modifikation des Polycarbonat-Typ-II-Käfigs durch Entfernen des Bodens und das Bohren von Löchern und Schlitzen für die Abdeckung der Sammelbox. (E) Modifikation des Polycarbonat-Typ-III-Hauskäfigs durch das Bohren von drei Eingangslöchern in die Vorderseite. (F) Schematische Seitenansicht des zusammengebauten Käfigsystems, der den Polycarbonat-Typ-III-Hauskäfig zeigt, der mit dem modifizierten Polycarbonat-Typ-II-Probekäfig verbunden ist, sowie die Positionierung der Teile 1, 2 und 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Repräsentative FCM-Daten, die nach der Kotprobenentnahme mit dem maßgefertigten Käfig gewonnen wurden. Fäkale Kortikosteronmetaboliten (FCMs) wurden in Fäkalproben gemessen, die einzeln von gruppenbehausten Mäusen mit dem maßgefertigten Kotprobenkäfig entnommen wurden. Die Werte werden über acht wöchentliche Probenahmezeiten für dauerhaft und intermittierend gezüchtete Mäuse angezeigt. Die Proben wurden entweder an den Tagen des Käfigwechsels oder an Wochenenden entnommen. Punkte und Verbindungslinien repräsentieren Gruppenmittel an jedem Zeitpunkt. Fehlerbalken und schattierte Bänder zeigen mittlere ± Standardabweichung (SD) an. (A) Weibchen wurden an Käfigwechseltagen beprobt. (B) Weibchen wurden am Wochenende beprobt. (C) Männchen wurden an Käfigwechseltagen beprobt. (D) Männer wurden am Wochenende beprobt. Die Abbildung zeigt, dass die Methode messbare FCM-Konzentrationen über alle Gruppen und Zeitpunkte hinweg erzeugte. Weibchen zeigten im Allgemeinen höhere FCM-Konzentrationen als Männchen, während die Unterschiede zwischen Zuchtgruppen weniger konsistent waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Schablonen für Acrylglaskomponenten 1–3. Templates zum Ausschneiden der Teile 1, 2 und 3a-c aus 5 mm Acrylglas/Plexiglas für den Bau des Fäkal-Probe-Käfigs. Teil 1 dient als unterer Einsatz des modifizierten Polycarbonat-Typ-II-Käfigs. Teil 2 wird verwendet, um den Polycarbonat-Typ-III-Käfig mit dem Polycarbonat-Typ-II-Käfig zu verbinden und entsprechende Bohrlöcher zu markieren. Die Teile 3a-c bilden interne Trennwände/strukturelle Elemente des Sammlungssystems. Weiße kreisförmige Markierungen zeigen Luftlöcher an, kleinere Markierungen Schraublöcher. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Vorlagen für die Acrylglaskomponenten 4a und 4b. Templates zum Schneiden der Teile 4a und 4b aus 5 mm Acrylglas/Plexiglas. Diese Teile werden in Teil 1 eingesetzt, um den unteren Einsatz zu halten und den Probekäfig in separate Kotabsammlungsboxen zu unterteilen. Die unteren Vorsprünge bilden die Beine der Sammelboxen, während die oberen Vorsprünge durch die obere Abdeckung gehen und mit Holzstangen oder Essstäbchen zur Stabilisierung der Konstruktion befestigt werden. Weiße Kreise zeigen Öffnungen für die Stäbe oder Luftlöcher an. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Modifikation des Polycarbonat-Typ-II-Käfigs. Schematische Vorlage zur Modifikation des Polycarbonat-Typ-II-Käfigs. Der Boden des Käfigs wird wie angegeben abgeschnitten und später als obere Abdeckung der Kotabsammlungsboxen verwendet. Löcher und Schlitze werden in den entfernten unteren Abschnitt gebohrt, um das Einsetzen und Fixieren der Teile 4a und 4b zu ermöglichen. Schraublöcher werden verwendet, um den Polycarbonat-Typ-II-Käfig, den Polycarbonat-Typ-III-Käfig und Teil 2 zu befestigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Modifikation der Polycarbonat-Typ-III-Fassade des Käfigs. Schematische Vorlage zum Bohren der Vorderseite des Polycarbonat-Typ-III-Käfigs. In die kurze Seite des Käfigs sind drei kreisförmige Öffnungen gebohrt, um den Zugang zwischen dem Haus-Käfig und dem Kotprobenkäfig zu ermöglichen. Zusätzliche Schraublöcher werden für die Befestigung an Teil 2 und dem Polycarbonat-Typ-II-Käfig verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Käfigsystem zur Entnahme einzeln zugeordneter Kotproben von in Gruppe gehaltenen Mäusen. Der Hauptvorteil der Methode besteht darin, dass sie die individuelle Probenzuordnung mit der Erhaltung wichtiger Aspekte des sozialen Wohnens kombiniert, insbesondere des visuellen und olfaktorischen Kontakts mit Käfiggenossen. Dies ist relevant, da Gruppenunterkünfte oft für das Tierschutz erforderlich sind und auch Teil des experimentellen Designs¹⁰ sein können. Im Gegensatz zur zusammengefassten Heim-Käfigprobennahme erlaubt das System, den einzelnen Tieren FCM-Werte zuzuweisen, wobei eine längere individuelle Unterhaltung vor oder während der Probenentnahme vermieden wird.

Häufig verwendete Ansätze zur Kotprobenentnahme bei Labormäusen sind gesammelte Haus-Käfigproben, temporäre Einzelunterbringung in sauberen Käfigen, Stoffwechselkäfige und direkte Entnahme nach Handhabung oder Transfer. Gesammelte Häuskäfigproben sind leicht zu gewinnen, nicht invasiv, kostengünstig und mit parallelen Probenahmen vieler Käfige kompatibel, aber sie erlauben keine individuelle Zuordnung bei Gruppentieren. Vorübergehende Einzelunterbringung oder Umstellung in saubere Käfige ermöglicht die Zuweisung einzelner Proben, entfernt jedoch die Tiere aus ihrer sozialen Gruppe und kann durch Handhabung, Neuheit oder soziale Trennung akuten Stress verursachen. Dies ist besonders relevant für die FCM-Analyse, da corticosteronbezogene Messungen empfindlich auf den durch das Probenahme verursachten Stress^{reagieren 11}. Stoffwechselkäfige ermöglichen eine kontrollierte Probenentnahme und ermöglichen die Trennung von Kot und Urin, benötigen jedoch spezielle Ausrüstung, sind weniger kompatibel mit der routinemäßigen Haltung und beinhalten meist individuelle Unterkünfte. Die direkte handhabungsbasierte Entnahme kann auch individuell zugeordnete Proben liefern, erfordert jedoch wiederholtes Handling oder Manipulation der Tiere und kann daher stressbedingte Anzeigen beeinflussen.

Im Vergleich zu diesen bestehenden Ansätzen wurde das heutige System als gruppenkompatible Verfeinerung für wiederholte, nicht-invasive, individuelle Stuhlproben entwickelt. Nach der Gewöhnung und dem Training betreten die Mäuse freiwillig die Probenboxen als Reaktion auf eine kleine Futterbelohnung. Proben können daher ohne Verfolgung, Handhabung oder erzwungenes Überführen in einen separaten Käfig entnommen werden. Das System sollte nicht als nachweislich bewiesen interpretiert werden, um das Wohlbefinden zu verbessern oder Stress im strengen experimentellen Sinne zu reduzieren, da direkte Wohlfahrtsmaßnahmen in der vorliegenden Studie nicht enthalten waren. Sie wurde jedoch entwickelt, um das Ausmaß der sozialen Trennung während der Probenentnahme zu verringern und ist daher möglicherweise weniger störend als herkömmliche Einzelentnahmemethoden. Außerdem können mehrere Tiere und mehrere Käfige parallel beprobt werden, was hilft, das Probenahmefenster zu standardisieren, was wichtig ist, da FCM-Konzentrationen vom zirkadianen Rhythmus abhängen und die Glukokortikoidsekretion mehrere Stunden vor der Probenahme^{widerspiegeln.}

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass das System für die Entnahme von Fäkalienproben geeignet ist, die auf FCM-Konzentrationen analysiert werden können. Messbare FCM-Konzentrationen wurden über Gruppen und Zeitpunkte hinweg ermittelt, und die Methode erkannte den erwarteten klaren Geschlechtsunterschied mit höheren FCM-Konzentrationen bei Frauen als bei Männern. Die Studie beinhaltete außerdem einen internen Vergleich mit herkömmlichen Einfamilienhäusern bei Männern. An Sonntagen wurden die Männchen der intermittierenden Zuchtgruppe einheimisch gehalten, während dauerhaft gezüchtete Männchen mit dem neu entwickelten Sammelsystem beprobt wurden. Die FCM-Konzentrationen unterschieden sich sonntags zwischen diesen Gruppen nicht signifikant. Dies deutet darauf hin, dass das freiwillige Eintritt in den Probekäfig und der kurzfristige Aufenthalt in der Sammelbox die FCM-Konzentrationen im Vergleich zur herkömmlichen Einzelaufnahme nicht signifikant erhöht haben. Dennoch beschränkte sich dieser Vergleich auf Männer und war nicht als dedizierte Äquivalenz- oder Crossover-Validierungsstudie konzipiert. Weitere Studien sollten das System daher mit etablierten Individual-Housing- oder metabolischen Käfigansätzen unter ausgewogenen experimentellen Bedingungen vergleichen und Verhaltensindikatoren für akuten Stress während der Probenahme einbeziehen.

Über die Bewertung der Stoffwechsel von fäkalen Corticosteron-Metaboliten hinaus kann das System auch für andere Anwendungen nützlich sein, die eine kurzfristige Entnahme einzelner Stuhlproben erfordern. Mögliche Anwendungen umfassen parasitologische Untersuchungen, Mikrobiota-Analysen, Verdauungsstudien oder andere Fäkal-Biomarker-Analysen. Mit geringfügigen technischen Änderungen könnte das System potenziell auch für die Urinentnahme angepasst werden, zum Beispiel durch die Einführung eines perforierten Bodens und eines geeigneten Sammelbeckens unter dem Tier. Für diese Anwendungen kann die Möglichkeit, während der Probenentnahme in der Nähe zu Käfiggenossen zu bleiben, im Vergleich zu herkömmlichen individuellen Unterbringungs- oder Stoffwechselkäfigansätzen vorteilhaft sein. Die Eignung des Systems müsste jedoch für jeden spezifischen Probentyp und nachgelagerte Analyse validiert werden, insbesondere bei Kontamination, Probenvolumen, Sammelzeit oder Lagerbedingungen.

Im Allgemeinen sollten Tiere vor der ersten Probenahme an die Boxen gewöhnt sein, einzelne Markierungen müssen unter den verwendeten Lichtverhältnissen deutlich sichtbar sein, und die Probenahme sollte während der gesamten Studie zur gleichen Tageszeit erfolgen. Proben sollten ausgeschlossen werden, wenn die individuelle Identität unsicher ist, Pellets kontaminiert sind, die Probenahmedauer erheblich vom geplanten Zeitfenster abweicht oder das Fäkalmaterial für die Analyse unzureichend^ist. Mehrere praktische Faktoren können die Anwendbarkeit des Stichprobensystems beeinflussen, darunter Dominanzhierarchien, aggressive Interaktionen, Variabilität der Nahrungsmotivation, Spannungsunterschiede sowie verminderte Mobilität oder verändertes Verhalten bei fettleibigen, älteren, trächtigen, postpartalen oder anderweitig beeinträchtigten Tieren. In der aktuellen Kohorte waren die Erfolge bei der freiwilligen Teilnahme und der Stichprobe jedoch hoch. Von den 480 erwarteten regelmäßigen Proben fehlten zwei, weil die Mäuse während der Einsperrung nicht defäkierten, und drei konnten nicht entnommen werden, da die Tiere entweder hochträchtig oder kurz nach der Geburt waren. Daher wurden 475 Proben entnommen, von denen 473 analysierbare Ergebnisse lieferten. Diese Daten zeigen, dass die Weigerung, die Boxen zu betreten, und das Versäumnis, Proben zu entnehmen, unter den in dieser Studie verwendeten Bedingungen selten waren. Dennoch können zusätzliche Gewöhnungs- oder Protokollanpassungen für andere Stämme, größere Gruppen oder Tiere mit veränderter Mobilität, Körperzustand, Gesundheitszustand oder sozialem Verhalten erforderlich sein. Weitere Einschränkungen sind, dass die Methode Schulung erfordert und derzeit für kleine Gruppen von drei Mäusen konzipiert ist, sowie dass Acrylglas-/Plexiglaskomponenten nicht dampfautoklavierbar sind.

Der Käfig ist kostengünstig, leicht aus Standard-Fassungsmaterial und Acrylglas zu bauen und benötigt keine elektronischen Bauteile. Sein Design ermöglicht die Demontage, Reinigung und Integration in regelmäßige Käfigwechselroutinen, was es für wiederholte Längsprobenproben geeignet macht. Insgesamt stellt das System einen praktischen, gruppenbeherbergungskompatiblen Ansatz für nicht-invasive, individuell zugeordnete Stuhlproben bei Mäusen dar.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bohrer 5 mm	Craftomat	22380487	5mm Durchmesser; Menge 1
Bohrer 60 mm	Bosch	32064647	60 mm Durchmesser; Menge 1
Bohrer 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm Durchmesser; Menge 1
Bohrmaschine	Makita	25730054	Standard Hand- oder Tischbohrmaschine; Menge 1
Heißklebepistole	Einhell	29051207	Für Käfigmontage; Menge 1
Heißklebestifte	Einhell	29049664	Kompatibel mit Heißklebepistole; Menge 5-10
Makrolon-Käfig	Animalab	31200129	Standard Typ II Käfig; Menge 1
Makrolon-Käfig	Animalab	31200256	Standard Typ III Käfig; Menge 1
Plexiglas / Acrylglas	Bauhaus	29122352	Ca. 0,25 m² gesamt; 5 mm Dicke; Menge  2 DIN A3-Platten
Säge oder Fräsvorrichtung	Scheppach	32079641	Kleine Bandsäge, Stichsäge oder CNC-Fräse; Menge 1
Gewindeschrauben	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Menge 4
Holzspieße / -stangen	Ikea	903.429.71	Runder Holzstab; Menge 3