MiR-93-5p zielt direkt auf den Toll-ähnlichen Rezeptor 4 (TLR4) bei pädiatrischer Mycoplasma pneumoniae-Pneumonie (MPP) ab. Seine Herunterregulation könnte zum Fortschreiten der Erkrankung und zu damit verbundenen Verletzungen des Verdauungssystems beitragen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-93-5p als potenzieller diagnostischer Biomarker für MPP und MPP mit Verletzungen des Verdauungssystems dienen könnte.
Forschungsartikel
Beurteilung der Rolle von miR-93-5p bei Kindern, die mit Mycoplasma pneumoniae infiziert sind und eine Verletzung des Verdauungssystems aufweisen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
MiR-93-5p ist an der Modulation von akuten Lungenverletzungen beteiligt, doch seine Rolle und sein diagnostischer Wert bei pädiatrischer Mycoplasma pneumoniae-Pneumonie (MPP) mit Verletzungen des Verdauungssystems sind weiterhin unklar. In dieser Studie wurde die Rolle von MiR-93-5p als potenzieller diagnostischer Biomarker für MPP und assoziierte Verdauungskomplikationen bei Kindern untersucht. Klinische Proben wurden von pädiatrischen Patienten mit MPP und gesunden Kontrollpersonen gesammelt. Die Expression von MiR-93-5p wurde mittels reverser Transkription und quantitativer PCR bestimmt. Mit Mycoplasma pneumoniae (MP)-infizierte A549-Zellen wurden verwendet, um ein zelluläres MPP-Modell aufzubauen, um Veränderungen der Zellviabilität und proinflammatorischer Zytokine zu bewerten. Die gezielte Regulation des Toll-ähnlichen Rezeptors 4 (TLR4) durch MiR-93-5p wurde mittels Luciferase-Reportergen-Assay untersucht. Die diagnostische Leistungsfähigkeit wurde mittels ROC-Kurvenanalyse (Receiver Operating Characteristic) bewertet. Die MiR-93-5p-Spiegel waren bei Patienten mit MPP im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant vermindert (P < 0,001) und zeigten sich noch stärker erniedrigt bei Patienten mit MPP und Verletzungen des Verdauungssystems im Vergleich zu Patienten mit alleiniger MPP. Eine MP-Infektion verringerte die Zellviabilität und erhöhte die Spiegel von IL-6 und TNF-α, wohingegen eine Überexpression von MiR-93-5p diese Effekte abschwächte. Die Expression von TLR4 stieg nach MP-Infektion an und wurde negativ durch MiR-93-5p reguliert. Klinisch war eine Verletzung des Verdauungssystems bei Patienten mit MPP mit niedrigeren MiR-93-5p-Spiegeln assoziiert. ROC-Kurvenanalysen zeigten eine gute diagnostische Trennschärfe zur Unterscheidung von Patienten mit MPP von gesunden Kontrollen sowie von Patienten mit MPP und Verdauungssystemverletzung von solchen mit alleiniger MPP. MiR-93-5p bindet direkt an TLR4 bei pädiatrischer MPP, und seine Herunterregulation könnte zum Fortschreiten der Erkrankung und den assoziierten Verletzungen des Verdauungssystems beitragen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass MiR-93-5p als potenzieller diagnostischer Biomarker für MPP und MPP mit Verdauungssystemverletzung dienen könnte.
Einleitung
Mycoplasma pneumoniae (MP) ist ein vorherrschender Erreger, der für Pneumonie bei Kindern verantwortlich ist1, die weltweit häufig zu erheblichen respiratorischen Erkrankungen führen. Obwohl MP primär eine pulmonale Infektion verursacht, kann es auch extrapulmonale Komplikationen hervorrufen, die mehrere Organsysteme betreffen.2Während einer M. pneumoniae-Infektion gehören Übelkeit, Erbrechen, Durchfall und Bauchschmerzen zu den am häufigsten berichteten gastrointestinalen Symptomen.3. Ein Spektrum gastrointestineller Erkrankungen und Manifestationen wurde ebenfalls als Teil M. pneumoniae-assoziierte extrapulmonale Erkrankungen (MPEPDs)2. Pädiatrische Patienten mit M. pneumoniae-Pneumonie (MPP), kompliziert durch Verletzungen des Verdauungssystems, stellen klinische Herausforderungen dar, die die Schwere der Erkrankung verschärfen und das Management erschweren können4Neuere Erkenntnisse deuten auf eine Wechselwirkung zwischen pulmonaler Infektion und intestinalem Dysfunktion hin, die dieser Assoziation zugrunde liegen könnte.5,6Eine Fehlregulation der Immunantwort während einer MP-Infektion kann ebenfalls mit einer Schädigung des Verdauungssystems assoziiert sein.7.
Trotz Fortschritten bei diagnostischen Verfahren8 bleibt die frühe und genaue Identifizierung von MPP aufgrund überlappender klinischer Manifestationen mit anderen Atemwegsinfektionen und variabler extrapulmonaler Beteiligung herausfordernd9. Die Lunge und der Darm sind zentrale Bestandteile des gemeinsamen Schleimhaut-Immunsystems, und diese Organe können die Funktion des jeweils anderen beeinflussen, wie sich in Darmstörungen während Lungenerkrankungen und umgekehrten Effekten widerspiegelt – ein Phänomen, das als Lungen-Darm-Kommunikation (lung-gut crosstalk) bekannt ist10. Darüber hinaus konzentriert sich die pädiatrische Pflege hauptsächlich auf das Management respiratorischer Symptome11, während gastrointestinale Manifestationen möglicherweise nicht ausreichend erkannt werden oder auf Nebenwirkungen der Therapie zurückgeführt werden. Diese Lücke verdeutlicht die Notwendigkeit einer umfassenden Beurteilung, die sowohl die pulmonale als auch die gastrointestinale Evaluation integriert, um unterstützende pflegerische Maßnahmen zu optimieren12. Neuere molekulare Studien haben Regulatoren entzündlicher Signalwege hervorgehoben, die sowohl an der Lungenerkrankung als auch an der intestinalen Entzündung bei MPP beteiligt sind12,13.
Es wurde gezeigt, dass miR-93-5p an der Pathogenese einer akuten Lungenschädigung beteiligt ist, wobei seine Herunterregulation mit einer beeinträchtigten Lungenfunktion und verstärkten entzündlichen Reaktionen korreliert14,15. Aufgrund dieser Befunde wurde die Hypothese aufgestellt, dass miR-93-5p auch im Serum von Kindern mit MPP herunterreguliert ist. Eine bioinformatische Analyse unter Verwendung der TargetScan-Datenbank identifizierte Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) als potenzielles direktes Zielgen von miR-93-5p. Es wurde berichtet, dass TLR4 eine wichtige Rolle bei der Modulation der Lunge-Darm-Achse spielt16,17 und wurde daher als möglicherweise mit gastrointestinalen Komplikationen bei MPP assoziiert betrachtet. Entsprechend untersuchte diese Studie die Beteiligung von miR-93-5p bei pädiatrischen Patienten mit MPP, die durch eine Verletzung des Verdauungssystems kompliziert ist.
Protokoll
Diese Studie wurde vom Ethikkomitee des Angegliederten Krankenhauses der Yangzhou-Universität geprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer: 2023-YKL01-(16); 17. Januar 2023). Von jedem Teilnehmer wurden periphere venöse Blutproben für die entsprechenden Labortests entnommen. Vor der Teilnahme wurde die informierte Einwilligung der gesetzlichen Vertreter aller Teilnehmer eingeholt. Die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, Geräte und Werkzeuge sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
1. Sammlung klinischer Proben
Insgesamt wurden 108 Kinder im Alter von 2 bis 14 Jahren zwischen Februar 2023 und Dezember 2024 an der An der Yangzhou-Universität angeschlossenen Klinik rekrutiert. Alle 108 Kinder erhielten eine Diagnose von MPP, die mittels Brustbildgebung und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von MP-DNA in nasopharyngealen Proben bestätigt wurde. Der Nachweis von MP-DNA in nasopharyngealen Abstrichen erfolgte mittels quantitativer Echtzeit-PCR, die auf das MP-spezifische P1-Adhäsin-Gen abzielte.
Die Patienten wurden entsprechend ihrem Krankheitsstatus in zwei Gruppen eingeteilt: MPP ohne DSI (n = 60) und MPP mit DSI (n = 48). DSI wurde definiert durch das Vorhandensein mindestens eines gastrointestinalen Symptoms, einschließlich Durchfall (≥3 lockere oder wässrige Stühle pro Tag über einen Zeitraum von >24 h), Übelkeit, Erbrechen oder anhaltende Bauchschmerzen mit oder ohne Reboundschmerz, begleitet von mindestens einem abnormalen Laborparameter und/oder bildgebenden Befunden im Abdomen. Zu den abnormalen Laborparametern zählten erhöhte Serumtransaminasen, Amylase oder Lipase und/oder erhöhte Marker für intestinale Permeabilität wie D-Laktat und Endotoxin. Bestätigende bildgebende Befunde im Abdomen umfassten Darmwandverdickung, vergrößerte mesenteriale Lymphknoten oder Peritonealerguss, die mittels Ultraschall oder Computertomographie nachgewiesen wurden. Zusätzlich dienten 60 gesunde Kinder, die sich routinemäßigen Untersuchungen unterzogen, als Kontrollgruppe.
- Einschlusskriterien
Patienten mit gastrointestinalen Symptomen in Kombination mit laborchemischen oder bildgebenden Auffälligkeiten wurden der DSI-Gruppe zugeordnet. - Ausschlusskriterien
Zu den Ausschlusskriterien gehörten virale oder bakterielle Pneumonie, Tuberkulose, Vorerkrankung einer Medikamentenallergie gegenüber den Studienmedikamenten, Immunerkrankungen, Mangelernährung, Nierenfunktionsstörungen, gastrointestinale Fehlbildungen sowie eine vorherige antibiotische Behandlung vor der Aufnahme.
2. Zellkultur und MPP-Modell
Mycoplasma pneumoniae Stamm ATCC 15531 wurde in PPLO-Brühe kultiviert. Menschliche alveoläre epitheliale A549-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium mit 10 % fetalem Kälberserum unter befeuchteten Bedingungen bei 37 °C mit 5 % CO₂ kultiviert.
Zur Erstellung eines In-vitro-Modells der MPP wurden A549-Zellen mit M. pneumoniae-Suspensionen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 1:100 infiziert.18Nach der Infektion wurden nicht gebundene Bakterien durch Ersetzen des Kulturmediums entfernt. Die Infektionseffizienz wurde mittels qPCR-Nachweis von MP-DNA in Kulturüberständen nach der Infektion bestätigt.
3. Plasmidkonstruktion und Transfektion
MiR-93-5p-Mimics, TLR4-Überexpressions-(oe-TLR4-)Plasmide und die entsprechenden negativen Kontrollen wurden kommerziell synthetisiert. Mit MP infizierte A549-Zellen wurden mittels eines lipidbasierten Transfektionsreagenzes transfiziert. Die Transfektionseffizienz wurde 48 h nach der Transfektion durch quantitative PCR nach reverser Transkription (RT-qPCR) überprüft.
4. RT-qPCR-Analyse
Gesamt-RNA wurde aus A549-Zellen gewonnen, die am Ende der Experimente geerntet wurden. Die Zellen wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) lysiert und homogenisiert. Die Gesamt-RNA wurde mithilfe eines auf Phenol basierenden RNA-Extraktionsreagenz gereinigt. Für die Reverse Transkription von miR-93-5p kam ein Reverse-Transkriptions-Kit zum Einsatz, während die komplementäre DNA für die mRNA-Analyse mit einem im Handel erhältlichen Reverse-Transkriptionsreagenz synthetisiert wurde. Die RT-qPCR-Analyse wurde unter Verwendung der SYBR-Green-Chemie durchgeführt.
5. MTT-Assay
Transfizierte A549-Zellen jeder experimentellen Gruppe wurden geerntet und in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 103 Zellen pro Well ausgesät. Anschließend wurden 20 µL Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid (MTT)-Reagenz zu jedem Well hinzugefügt. Nach einer zusätzlichen Inkubation von 2 h bei 37 °C wurden die Überstände vorsichtig entfernt. Die durch metabolisch aktive Zellen gebildeten Formazankristalle wurden gemäß den Anweisungen des Assays aufgelöst. Die Zellviabilität wurde indirekt durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 490 nm mit einem Mikroplattenreader quantifiziert.
6. Enzymgebundener Immunosorbens-Assay
Zur Messung der Konzentrationen von Interleukin-6 (IL-6) und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) wurden kommerzielle enzymgekoppelte Immunosorbens-Assays (ELISA) verwendet. Die Assays wurden gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Die Messungen wurden in dreifacher Ausführung über zwei unabhängige experimentelle Wiederholungen hinweg durchgeführt, um Genauigkeit und Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
7. Dual-Luciferase-Reporter-Assay
MiR-93-5p-Bindungsstellen innerhalb der 3′-unübersetzten Region (UTR) von TLR4 wurden mithilfe der TargetScan-Datenbank vorhergesagt. Fragmente, die die Wildtyp-(WT)- oder mutierte (MUT)-Sequenzen enthielten, wurden in einen Luciferase-Reportervektor kloniert. A549-Zellen wurden gemeinsam mit 500 ng entweder dem WT- oder dem MUT-Konstrukt sowie miR-93-5p-Mimetika oder Kontrollen unter Verwendung eines lipidbasierten Transfektionsreagenzes transfiziert. Nach 48 h wurde die Luciferase-Aktivität mittels eines Dual-Luciferase-Reportergen-Assays gemessen. Die Firefly-Luciferase-Aktivität wurde anhand der Renilla-Luciferase-Aktivität normalisiert, um die Transfektionseffizienz zu berücksichtigen.
8. Western-Blot-Analyse
Für die Western-Blot-Analyse wurden Zelllysate mit Puffer für die Probeladung versetzt und bei 10.000 × g 3 min zentrifugiert. Die Überstände wurden einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, und die Proteine wurden auf Polyvinylidenfluorid-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und Inhibitor-kappa-B-alpha (IκBα) in einer Verdünnung von 1:1000 in Tris-gepuffertem Salzlösung mit Tween 20 und 5 % BSA inkubiert. Nach drei Waschschritten wurden die Membranen für 1 h bei Raumtemperatur mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Kanin-IgG (1:500) inkubiert. Nach weiteren Waschschritten wurden die Proteinbanden mithilfe eines verbesserten Chemilumineszenz-Substrats sichtbar gemacht und mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem aufgezeichnet. Die Bandenintensitäten der Zielproteine und von GAPDH wurden aus drei unabhängigen Experimenten mittels Bildanalyse-Software quantifiziert.
9. Statistische Analyse
Die statistischen Analysen wurden mit statistischer Analyse-Software durchgeführt. Die Normalverteilung der Messdaten wurde mittels des Shapiro-Wilk-Tests überprüft. Normalverteilte Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben und für zwei Gruppen mittels t-Tests für unabhängige Stichproben oder für mehrere Gruppen mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) verglichen. Zeigte die ANOVA einen signifikanten Gesamtunterschied, wurde der Tukey-Test als Post-hoc-Verfahren für paarweise Vergleiche verwendet. Nicht normalverteilte Daten wurden mittels des Mann-Whitney-U-Tests analysiert. Kategoriale Variablen wurden als Häufigkeiten und Prozentsätze dargestellt und mittels Chi-Quadrat-Tests verglichen. Die Analyse der Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurve diente zur Beurteilung des diagnostischen Potenzials von miR-93-5p hinsichtlich der Vorhersage von MPP oder MPP mit DSI. Um prädiktive Faktoren für MPP mit DSI zu identifizieren, wurde eine multivariable logistische Regression durchgeführt. In das Modell eingeschlossene Variablen waren Alter, Geschlecht, Fiebertage, Dauer der Antibiotikabehandlung sowie die mediangeteilte Expression von miR-93-5p. Ein zweiseitiger P-Wert <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnisse
miR-93-5p ist bei pädiatrischem MPP vermindert
Die diagnostische Aussagekraft von miR-93-5p wurde hinsichtlich seines Potenzials als Biomarker beim pädiatrischen MPP untersucht. Wie in Abbildung 1A dargestellt, war die Expression von miR-93-5p bei pädiatrischen Patienten mit MPP im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant vermindert. Die demografischen und hämatologischen Merkmale der beiden Gruppen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Hinsichtlich Alter und Geschlechtsverteilung zeigten sich zwischen den Gruppen keine statistisch signifikanten Unterschiede (P > 0,05). Die peripheren Leukozytenzahlen (WBC), der Neutrophilenanteil (Net %) sowie die Konzentrationen von C-reaktivem Protein (CRP) waren jedoch in der MPP-Gruppe im Vergleich zu den gesunden Kontrollen signifikant erhöht (P < 0,001).
Die Analyse der Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurve wurde durchgeführt, um die diagnostische Leistung von miR-93-5p bei der Unterscheidung von Patienten mit MPP und gesunden Kindern weiter zu bewerten (Abbildung 1B). Die Fläche unter der Kurve (AUC) betrug 0,9009 [95 % Konfidenzintervall (KI): 0,8537–0,9482] bei einer Sensitivität von 80,56 % und einer Spezifität von 88,33 %. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass verringerte Serumspiegel von miR-93-5p mit der pädiatrischen MPP assoziiert sind.
Wirkung von miR-93-5p auf MPP-Zellmodelle
Es wurden eine Reihe von In-vitro-Experimenten durchgeführt, um die Wirkung von miR-93-5p im MPP-Zellmodell zu untersuchen. Im Vergleich zu Kontrollzellen war die Expression von miR-93-5p im MPP-Zellmodell herunterreguliert (Abbildung 2A). Die MP-Infektion war ebenfalls mit einer verminderten Vitalität von A549-Zellen verbunden (Abbildung 2B). Außerdem waren die Spiegel der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und TNF-α im MPP-Modell im Vergleich zu den Kontrollen erhöht (Abbildung 2C).
Um die funktionelle Wirkung von miR-93-5p weiter zu untersuchen, wurde ein Überexpression-Modell von miR-93-5p in mit MP infizierten A549-Zellen etabliert (Abbildung 2D). Die Überexpression von miR-93-5p führte im Vergleich zum MPP-Modell ohne miR-93-5p-Überexpression zu einer signifikanten Zunahme der Zellviabilität (Abbildung 2E). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen ging eine erhöhte Expression von miR-93-5p mit einer verminderten Produktion von IL-6 und TNF-α einher (Abbildung 2F). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine verminderte Expression von miR-93-5p mit einer verringerten Zellviabilität und einer verstärkten Entzündungsreaktion während der MP-Infektion assoziiert war, während die Überexpression von miR-93-5p diese Veränderungen abschwächte.
miR-93-5p bindet an TLR4
Um die regulatorische Beziehung zwischen miR-93-5p und TLR4 aufzuklären, identifizierte eine bioinformatische Analyse eine vorhergesagte Bindungsstelle für miR-93-5p innerhalb der 3′-unübersetzten Region (UTR) der TLR4-mRNA (Abbildung 3A). Die Expression von TLR4 war im MP-Zellmodell im Vergleich zu den Kontrollen erhöht (Abbildung 3B). Die vorhergesagte Interaktion wurde anschließend mittels eines Luciferase-Reporter-Assays überprüft. Die Cotransfektion mit miR-93-5p-Mimetika verringerte die Luciferase-Aktivität des Wildtyp-Konstrukts, was auf eine spezifische Bindung an die vorhergesagte Stelle hinweist (Abbildung 3C).
Die Überexpression von miR-93-5p in mit MP infizierten Zellen verringerte die TLR4-Expression im Vergleich zu infizierten Kontrollen ohne Mimic-Behandlung (Abbildung 3D). Um weitere downstream-Effekte, die mit der Modulation von TLR4 assoziiert sind, zu untersuchen, wurden A549-Zellmodelle mit TLR4-Überexpression etabliert (Abbildung 3E). Die Western-Blot-Analyse zeigte erhöhte IκBα-Spiegel nach TLR4-Überexpression (Abbildung 3F).
Die Überexpression von TLR4 verringerte die Zellviabilität nach MP-Infektion im Vergleich zu Kontrollzellen deutlich, während eine gleichzeitige Überexpression von miR-93-5p diese Verringerung umkehrte (Abbildung 3G). Die Messung entzündungsfördernder Zytokine zeigte zudem, dass die Überexpression von TLR4 die Spiegel proinflammatorischer Mediatoren erhöhte, während die Überexpression von miR-93-5p diese Veränderungen sogar bei gleichzeitiger TLR4-Überexpression abschwächte (Abbildung 3H). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass miR-93-5p die Expression von TLR4 negativ reguliert und zelluläre Veränderungen, die mit einer MP-Infektion assoziiert sind, abschwächt.
Diagnostischer Wert von miR-93-5p bei MPP und MPP mit DSI
Frühere Berichte beschrieben die Beteiligung von TLR4 in Lungengewebe und Dickdarmgewebe16. Die mögliche Assoziation zwischen miR-93-5p und Verletzungen des Verdauungssystems bei MPP wurde daher klinisch untersucht. Wie in Abbildung 4A dargestellt, war die Expression von miR-93-5p in der MPP+DSI-Gruppe im Vergleich zur MPP-Gruppe verringert.
Die demografischen und hämatologischen Merkmale sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Zwischen den Gruppen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich Alter oder Geschlecht. Die Dauer von Fieber und Antibiotikaeinsatz war jedoch bei Patienten mit gleichzeitiger DSI signifikant länger (P < 0,05).
Der diagnostische Wert von miR-93-5p zur Unterscheidung von MPP-Fällen mit DSI von solchen ohne DSI wurde mittels ROC-Kurvenanalyse bewertet. Die AUC betrug 0,7866 (95 % KI: 0,6889–0,8843) (Abbildung 4B), mit einer Sensitivität von 85,71 % und einer Spezifität von 57,45 %.
Die multivariable logistische Regressionsanalyse identifizierte eine niedrige Expression von miR-93-5p, eine verlängerte Fiebeldauer und eine verlängerte Antibiotikabehandlung als Faktoren, die mit einer Verletzung des Verdauungssystems während einer MP-Infektion assoziiert sind (Tabelle 3; P < 0,05).
Abbildung 1: Expression und diagnostischer Wert von miR-93-5p bei gesunden Kontrollpersonen (n = 60) und Patienten mit MPP (n = 108). (A) Die Expression von miR-93-5p war bei Patienten mit MPP vermindert. (B) ROC-Kurvenanalyse von miR-93-5p. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2: Funktionelle Effekte von miR-93-5p im MP-infizierten Zellmodell. (A) Die Expression von miR-93-5p war im MP-infizierten Modell verringert. (B) Die Zellviabilität war im MP-infizierten Modell verringert. (C) Die Konzentrationen von TNF-α und IL-6 waren im MP-infizierten Modell erhöht. (D) Transfektionseffizienz des miR-93-5p-Mimikums. (E) Die Zellviabilität stieg nach Überexpression von miR-93-5p an. (F) Die Konzentrationen von TNF-α und IL-6 verringerten sich nach Überexpression von miR-93-5p. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: MiR-93-5p bindet direkt an TLR4. (A) Vorhergesetzte Bindungsstelle zwischen miR-93-5p und TLR4. (B) TLR4-Expression im MP-infizierten Modell. (C) Dual-Luciferase-Reporter-Assay. (D) Negative Regulation von TLR4 durch miR-93-5p. (E) Effizienz der TLR4-Überexpression. (F) Western-Blot-Analyse von IκBα. (G) Zellviabilität. (H) Spiegel von TNF-α und IL-6. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4: Expression und diagnostischer Wert von miR-93-5p bei Patienten mit MPP (n = 60) und Patienten mit MPP mit DSI (n = 48). (A) Expression von miR-93-5p in der MPP+DSI-Gruppe. (B) ROC-Kurvenanalyse von miR-93-5p. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
| Variable | Gesund (n = 60) | MPP (n = 108) | P |
| Alter (Jahre) | 6,81 ± 3,14 | 7,12 ± 3,55 | 0,559 |
| Geschlecht (männlich/weiblich) | 28/32 | 49/59 | 0,872 |
| WBC (× 109/L) | 7,27 ± 0,89 | 9,86 ± 1,36 | <0,001 |
| CRP (mg/L) | 2,35 ± 0,17 | 11,53 ± 2,01 | <0,001 |
| Net % | 42,55 ± 5,62 | 56,51 ± 15,40 | <0,001 |
Tabelle 1: Vergleich der demografischen Merkmale und routinemäßigen Blutparameter zwischen gesunden Kontrollpersonen und Patienten mit MPP. Diese Tabelle fasst die demografischen Merkmale und routinemäßigen hämatologischen Parameter von gesunden Kontrollpersonen und Patienten mit MPP zusammen, einschließlich Alter, Geschlecht, Leukozytenzahl (WBC), Neutrophilenanteil, Eosinophilenanteil, Basophilenanteil und CRP. Gruppenvergleiche und entsprechende P-Werte sind angegeben.
| Variable | MPP (n = 60) | MPP+DSI (n = 48) | P |
| Alter (Jahre) | 6,88 ± 3,87 | 7,42 ± 3,11 | 0,441 |
| Geschlecht (männlich/weiblich) | 31/29 | 28/20 | 0,494 |
| WBC ( × 109/L) | 8,9 ± 0,89 | 11,05 ± 0,76 | <0,001 |
| CRP (mg/L) | 10,94 ± 1,62 | 12,27 ± 2,22 | <0,001 |
| Net % | 55,87 ± 14,75 | 57,32 ± 16,29 | 0,629 |
| Dauer des Fiebers (Tag) | 4,60 ± 1,83 | 7,26 ± 1,04 | <0,001 |
| Dauer der Antibiotikabehandlung (Tag) | 4,65 ± 1,147 | 6,29 ± 0,771 | <0,001 |
Tabelle 2: Vergleich der demografischen Merkmale und routinemäßigen Blutparameter zwischen Patienten mit MPP und Patienten mit MPP+DSI. Diese Tabelle vergleicht demografische Merkmale, routinemäßige hämatologische Parameter und relevante klinische Befunde zwischen Patienten mit alleinigem MPP und solchen mit MPP, kompliziert durch DSI. Zwischengruppenvergleiche und entsprechende P-Werte sind angegeben.
| Variable | OR | 95 % KI | P-Wert | |
| untere | obere | |||
| miR-93-5p (niedrig vs. hoch) | 6,702 | 1,487 | 30,211 | 0,013 |
| Alter | 1,126 | 0,286 | 4,437 | 0,866 |
| Geschlecht | 1,071 | 0,27 | 4,248 | 0,923 |
| Dauer des Fiebers | 73,416 | 15,018 | 358,895 | <0,001 |
| Dauer der Antibiotikabehandlung | 7,921 | 1,877 | 33,421 | 0,005 |
Tabelle 3: Ergebnisse der logistischen Regressionsanalyse von Kindern mit MP-Infektion, kompliziert durch Verletzung des Verdauungssystems. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse einer logistischen Regressionsanalyse zur Bewertung der mit einer Verletzung des Verdauungssystems assoziierten Faktoren bei Kindern mit MP-Infektion. Die Analyse umfasst die OR, das 95 %-Konfidenzintervall und den P-Wert für jede Variable.
Abkürzungen: Baso%, Basophilie-Prozentsatz; CI, Konfidenzintervall; CRP, C-reaktives Protein; DSI, Verletzung des Verdauungssystems; Eos%, Eosinophilie-Prozentsatz; IκBα, Inhibitor kappa B alpha; IL-6, Interleukin-6; MP, Mycoplasma pneumoniae; MPP, Mycoplasma-pneumoniae-Pneumonie; NC, negativer Kontrollwert; Net%, Neutrophilie-Prozentsatz; oe-TLR4, TLR4-Überexpression; OR, Odds Ratio; ROC, Empfänger-Operations-Charakteristik; TLR4, Toll-ähnlicher Rezeptor 4; TNF-α, Tumornekrosefaktor-α; WBC, Leukozytenzahl.
DATENVERFÜGBARKEIT:
Die den Abbildungen und Tabellen zugrunde liegenden Rohzahldaten sind als Zusatz-Tabelle 1 verfügbar.
Ergänzende Tabelle 1: Rohzahldaten für die Abbildungen und Tabellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Obwohl MP hauptsächlich als pulmonaler Erreger angesehen wird, kann die Infektion vielfältige extrapulmonale Komplikationen verursachen, die mehrere Organsysteme jenseits der Lunge betreffen19,20. Neuere Erkenntnisse deuten auf eine Interaktion entlang der Lungen-Darm-Achse hin, bei der während der pulmonalen Erkrankung freigesetzte inflammatorische Mediatoren das Gleichgewicht der Darmflora21 und die Darmfunktion22 stören. Dieses bidirektionale Wechselspiel unterstreicht die Bedeutung einer umfassenden Patientenbeurteilung, die sowohl respiratorische Symptome als auch die gastrointestinale Gesundheit berücksichtigt. Zirkulierende serumgebundene Biomarker haben daher zunehmend Aufmerksamkeit als minimalinvasive Werkzeuge mit potenziellem diagnostischem oder prognostischem Wert erhalten23,24. Mikro-RNAs (MiRNAs) haben sich aufgrund ihrer Stabilität und ihrer Rolle bei der Regulation inflammationsrelevanter Signalwege, die an der MP-Pathogenese beteiligt sind, als vielversprechende Kandidaten erwiesen25,26,27. Diese Studie untersuchte systematisch die Rolle und klinische Bedeutung von miR-93-5p bei pädiatrischer MPP, insbesondere bei Komplikationen durch Verletzungen des Verdauungssystems. Die Konzentrationen von miR-93-5p waren bei Kindern mit MPP im Vergleich zu gesunden Kontrollen vermindert und zeigten sich noch stärker reduziert bei Betroffenen mit Verletzungen des Verdauungssystems. Diese Befunde deuten auf eine mögliche Rolle der Dysregulation von miR-93-5p bei pulmonalen Erkrankungen sowie als potenziellen Biomarker für extrapulmonale Manifestationen hin.
miRNAs haben bei schwerer Pneumonie einen diagnostischen Nutzen gezeigt, mit vielversprechender Sensitivität, Spezifität und Gesamtdiagnosesicherheit28,29. Klinisch zeigten Kinder mit MPP, die durch DSI kompliziert waren, eine verlängerte Fiebeldauer und eine längere antibiotische Behandlung im Vergleich zu Kindern ohne gastrointestinale Komplikationen. Niedrigere Spiegel von miR-93-5p waren unabhängig von diesen klinischen Parametern mit einer Beteiligung des Verdauungssystems assoziiert, wie eine multivariable logistische Regressionsanalyse ergab. Darüber hinaus zeigte die ROC-Kurvenanalyse eine günstige diagnostische Leistung von serumgebundenem miR-93-5p zur Unterscheidung von Patienten mit MPP mit DSI von solchen ohne DSI. Daher könnte die Bestimmung von miR-93-5p einen zusätzlichen Nutzen für die frühe Identifizierung und Risikostratifizierung bei pädiatrischen MP-Infektionen bieten.
Hinsichtlich der diagnostischen Leistung von zirkulierendem miR-93-5p im Vergleich zu routinemäßigen klinischen Entzündungsmarkern deuten die Ergebnisse darauf hin, dass miR-93-5p einen ergänzenden Wert bieten könnte, anstatt herkömmliche Indikatoren zu ersetzen. CRP und Procalcitonin (PCT) werden in der klinischen Praxis weiterhin häufig als Biomarker zur Beurteilung der Schwere einer Infektion und zur Steuerung der Antibiotikatherapie verwendet, wobei Metaanalysen gezeigt haben, dass PCT im Vergleich zu CRP bei bakterieller Pneumonie eine leicht überlegene diagnostische Genauigkeit aufweist30. Diese Akute-Phase-Reaktanten sind jedoch weitgehend unspezifisch, da sie auf unterschiedliche entzündliche Reize ansprechen und nicht zuverlässig eine Mycoplasma-pneumoniae-(MP-)Infektion von anderen Atemwegserregern unterscheiden oder das Risiko extrapulmonaler Komplikationen spezifisch widerspiegeln können. Im Gegensatz dazu könnte miR-93-5p als regulatorisches Molekül, das mit der TLR4/Nuclear-Factor-kappa-B-(NF-κB)-Signalübertragung assoziiert ist, spezifische pathophysiologische Informationen liefern, die herkömmliche Marker ergänzen. Es wurde berichtet, dass die Korrelation zwischen miR-93-5p und CRP relativ schwach ist (Pearson r = 0.2698), was darauf hindeutet, dass miR-93-5p möglicherweise einen anderen Aspekt der entzündlichen Reaktion widerspiegelt als die systemische Akute-Phase-Reaktion.
Neuere Erkenntnisse aus tierexperimentellen Modellen haben gezeigt, dass eine Infektion mit Mycoplasma pneumoniae nicht nur Atemwegspathologien, sondern auch Verletzungen des Verdauungssystems über die Lunge-Darm-Achse, vermittelt durch die Darmflora, hervorrufen kann31. Bei mit MP infizierten Mäusen wurden pathologische Schädigungen sowohl in der Lunge als auch im Kolon beobachtet, zusammen mit Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota, einschließlich einer verminderten Häufigkeit nützlicher Bakterien wie Corynebacterium glutamicum und einer erhöhten Häufigkeit potenzieller Pathogene wie Lachnospiraceae NK4A136 group und Escherichia-Shigella, begleitet von erhöhten Lipopolysaccharid (LPS)-Spiegeln im Koloninhalt und im Blut32. Es wurde außerdem berichtet, dass Baicalin die pulmonale Entzündung lindert und die Darmflora bei MPP-Mäusen über den TLR4/NF-κB-Weg reguliert, was die Beteiligung dieser Signaltransduktionskaskade am Lunge-Darm-Austausch unterstützt33. Diese Befunde stimmen mit einer möglichen Beteiligung des NF-κB-Signalwegs an der in der vorliegenden Studie untersuchten miR-93-5p/TLR4-Achse überein.
Auf mechanistischer Ebene wurde TLR4, ein zentraler Vermittler der angeborenen Immunität, der mit proinflammatorischen Reaktionen assoziiert ist34,35,36,37, während einer MP-Infektion hochreguliert. Eine erhöhte TLR4-Expression ging mit gesteigerten Spiegeln der entzündungsfördernden Zytokine IL-6 und TNF-α sowie mit einer verminderten Vitalität der Epithelzellen einher. Eine Überexpression von miR-93-5p unterdrückte die TLR4-Expression, verringerte die Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine und verbesserte das Zellüberleben unter infektiösen Bedingungen. Daher könnte eine Herunterregulation von miR-93-5p bei Patienten mit MPP, insbesondere bei solchen mit Verletzungen des Verdauungssystems, mit einer verstärkten, TLR4-vermittelten entzündlichen Signalübertragung und umfassenderen systemischen Entzündungsreaktionen assoziiert sein. Die vorliegenden Ergebnisse belegen keine Aktivierung des downstream gelegenen NF-κB-Signalwegs, da phosphoryliertes IκBα und p65 nicht untersucht wurden.
Mehrere Einschränkungen dieser Studie sollten anerkannt werden. Erstens handelte es sich um eine Einzelzentrenstudie mit einer vergleichsweise kleinen Stichprobengröße, insbesondere für die DSI-Untergruppe, was die statistische Aussagekraft und Übertragbarkeit beeinträchtigen könnte. Eine externe Validierung in größeren, multizentrischen Kohorten ist erforderlich, um diese Ergebnisse zu bestätigen und zuverlässige klinische Cut-off-Werte zu etablieren. Zweitens wurde zwar IκBα mittels Western Blot nachgewiesen, jedoch erfolgte keine umfassende Validierung weiterer downstream liegender Komponenten des TLR4/NF-κB-Signalwegs, einschließlich MyD88, p-IκBα und p65. Eine Validierung dieser Signalbestandteile auf Proteinebene würde die mechanistische Interpretation stärken. Drittens schließt das Beobachtungsdesign kausale Schlussfolgerungen aus; Verlust- und Gewinn-an-Funktionsexperimente, einschließlich miRNA-Mimics oder Inhibitoren in vitro oder in vivo, sind erforderlich, um zu bestimmen, ob miR-93-5p direkt zu der mit MPP assoziierten Verdauungsverletzung beiträgt. Viertens wurden die in-vitro-Experimente in A549-Lungenepithelzellen durchgeführt. Obwohl dieses Modell geeignet ist, um die antiinflammatorischen Effekte von miR-93-5p im pulmonalen Kontext zu bewerten, kann es die gastrointestinale Pathologie nicht direkt abbilden. Die vorgeschlagene Assoziation zwischen pulmonaler miR-93-5p/TLR4-Signalübertragung und Verdauungssymptomen, die möglicherweise über die Lunge-Darm-Achse vermittelt wird, bedarf einer direkten Validierung in Modellen von Darmepithelzellen, wie beispielsweise Caco-2-Zellen, sowie in vivo-Tiermodellen der MP-Infektion. Schließlich bleiben technische Herausforderungen im Zusammenhang mit dem Nachweis von miRNAs, einschließlich der RNA-Stabilität und der Strategien zur Normalisierung, Hindernisse für eine routinemäßige klinische Anwendung. Trotz dieser Einschränkungen liefern die Ergebnisse eine Grundlage für zukünftige mechanistische Studien und groß angelegte Validierungsbemühungen.
Zusammenfassend führte die Hochregulation von miR-93-5p zu einer Abschwächung der MP-induzierten Entzündung in Lungenepithelzellen durch Hemmung von TLR4. Klinisch waren verringerte zirkulierende Spiegel von miR-93-5p mit Verletzungen des Verdauungssystems bei Kindern mit MPP assoziiert, was auf eine mögliche Eignung als zusätzlicher Biomarker zur Identifizierung von Patienten mit Risiko für gastrointestinale Komplikationen hindeutet.
Offenlegungen
Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Menschliche alveoläre Epithelzellen A549 | ATCC, USA | Cat# CCL-185; RRID: CVCL_0023 | Menschliche alveoläre Epithelzelllinie, verwendet für das in-vitro-MPP-Modell |
| Anti-GAPDH-Antikörper | Hangzhou XianZhi Biological Technology, China | Cat# AB-P-R001; RRID: AB_3096355 | Primärantikörper zur Detektion von GAPDH als Ladekontrolle in der Westernblot-Analyse |
| Anti-IκBα-Antikörper | Beyotime, China | Cat# AG2741; RRID: AB_3731391 | Primärantikörper zur Detektion von IκBα mittels Westernblot |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Solarbio, China | Cat# A8012 | Blockierendes Reagenz, verwendet während der Westernblot-Analyse |
| Zentrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | Multifuge X4 Pro; Cat# 75016066; RRID: SCR_020726 | Zentrifuge, verwendet während der Zellkultur und Probenvorbereitung |
| Chemilumineszenz-Bildgebungssystem | Tanon, China | 5200Multi; RRID: SCR_027114 | Bildgebungssystem zur Visualisierung chemilumineszenter Westernblot-Signale |
| Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System | Promega, USA | Cat# E1910 | Wird zur Messung der Aktivität von Feuerfly- und Renilla-Luciferase verwendet |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco, USA | Cat# A5256701 | Serumzusatz für das Zellkulturmedium |
| Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, HRP-konjugiert | Cell Signaling Technology, USA | Cat# 7074; RRID: AB_2099233 | HRP-konjugierter sekundärer Antikörper, verwendet für die Westernblot-Analyse |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 10.1.2; URL: https://www.graphpad.com | Software zur statistischen Analyse und grafischen Darstellung |
| Interleukin-6 (IL-6)-ELISA-Kit | Elabscience, China | Cat# E-EL-H6156; RRID: AB_3665145 | ELISA-Kit zur Quantifizierung von IL-6 |
| Lipofectamin-3000-Transfektionsreagenz | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | Lipidbasiertes Reagenz zur Transfektion von A549-Zellen |
| Mikroplattenreader | Tecan, Schweiz | Infinite M Plex; RRID: SCR_026522 | Mikroplattenreader zur Messung der optischen Dichte bei 490 nm |
| miR-93-5p-Mimics | Ribobio, China | Cat# miR10000093-1-5 | Synthetischer miR-93-5p-Mimetikum zur Überexpression von miR-93-5p |
| miR-93-5p-Negativkontrolle | Ribobio, China | Cat# miR1N0000001-1-5 | Negativkontrolle für die Transfektion mit miR-93-5p-Mimetikum |
| MTT-Zellproliferations- und Zytotoxizitäts-Assay-Kit | Beyotime, China | Cat# C0009S | Wird zur Beurteilung der Zellviabilität verwendet |
| Standardstamm Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531 | ATCC, USA | Cat# 15531 | Standardstamm von M. pneumoniae, verwendet zur Erstellung des Infektionsmodells |
| pGL3-Basic-Luciferase-Reporter-Vektor | Promega, USA | Cat# E1751 | Reporter-Vektor für den Dual-Luciferase-Reporter-Assay |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Solarbio, China | Cat# IP9212 | Puffer zur Zellwäsche und Probenvorbereitung |
| Pierce ECL Western-Substrat | Thermo Scientific, USA | Cat# 32209 | Chemilumineszentes Substrat zur Detektion in der Westernblot-Analyse |
| Pleuropneumonie-ähnliches Organismus-(PPLO-)Medium | BD, USA | Cat# 255420 | Kulturmedium für M. pneumoniae |
| Polyvinylidenfluorid-(PVDF-)Membran | Bio-Rad | Cat# 1620177 | Membran zur Proteinübertragung während der Westernblot-Analyse |
| PrimeScript RT-Mastermix (Perfect Real Time) | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR036A | Mastermix für die Reverse Transkription zur cDNA-Synthese |
| PrimeScript RT-Reagenzkit | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR037A | Reagenzkit zur Reverse Transkription |
| Echtzeit-PCR-System | Applied Biosystems, USA | QuantStudio 3 Echtzeit-PCR-System; RRID: SCR_020238 | Echtzeit-PCR-Gerät für qPCR-Analysen |
| RPMI-1640-Medium | Gibco, USA | Cat# 11875135 | Zellkulturmedium für A549-Zellen |
| SPSS | IBM | Version 27.0; RRID: SCR_016479 | Software zur statistischen Analyse |
| TLR4-Überexpressions-Negativkontrolle | Ribobio, China | NA | Negativkontrolle für TLR4-Überexpressions-Experimente |
| TLR4-Überexpressionsplasmid (oe-TLR4) | Ribobio, China | NA | Plasmid zur TLR4-Überexpression |
| TRIzol-Reagenz | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 15596026 | Reagenz zur Gesamt-RNA-Extraktion |
| Tumor-Nekrose-Faktor-α-(TNF-α)-ELISA-Kit | Elabscience, China | Cat# E-EL-H0109; RRID: AB_3665144 | ELISA-Kit zur Quantifizierung von TNF-α |
| Universal-SYBR-qPCR-Mastermix | Takara Bio Inc., Japan | Cat# BL697A | Mastermix für die quantitative PCR |
| Westernblot-Gel-Elektrophorese-System | Bio-Rad, USA | Mini-PROTEAN Tetra Cell; Cat# 1658004 | Elektrophorese-System zur Proteinseparation |
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