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Methodenartikel

Ein Mausmodell der durch das schwere akute respiratorische Syndrom-Coronavirus 2 und Lipopolysaccharid induzierten, mit der Coronavirus-Krankheit 2019 assoziierten Lungenschädigung

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11. September 2026

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1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Sichuan Center for Disease Control and Prevention

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell für eine durch das Coronavirus-bedingte Lungenschädigung 2019, die durch die kombinierte intranasale Verabreichung von schwerem akutem respiratorischem Syndrom-Coronavirus 2 und Lipopolysaccharid induziert wird. Das Modell ermöglicht die Untersuchung pulmonaler entzündlicher Reaktionen, beeinträchtigter Typ-I-Interferon-Antworten sowie potenzieller therapeutischer Interventionen.

Zusammenfassung

Trotz der weiten Verbreitung von Impfungen und antiviralen Therapien verursacht die SARS-CoV-2-Infektion weiterhin erhebliche Morbidität und Mortalität in anfälligen Bevölkerungsgruppen, was die dringende Notwendigkeit zuverlässiger experimenteller Modelle unterstreicht, um die Pathogenese von COVID-19 zu untersuchen, die Wirkmechanismen von Arzneimitteln aufzuklären und potenzielle therapeutische Strategien zu bewerten. Die SARS-CoV-2-Infektion kann schwere Lungenverletzungen hervorrufen, die durch übermäßige entzündliche Reaktionen und beeinträchtigte antivirale Immunität, vermittelt durch Typ-I-Interferone (IFN-I), gekennzeichnet sind; gegenwärtige Tiermodelle sind jedoch begrenzt, was die Nachbildung der dysregulierten immun-entzündlichen Reaktionen betrifft, die mit COVID-19 assoziiert sind. Ein Mausmodell der COVID-19-assoziierten Lungenverletzung, induziert durch SARS-CoV-2 und LPS, wurde entwickelt, um zentrale immunopathologische Merkmale von COVID-19 nachzubilden. Dieses Modell induziert ausgeprägte pathologische Veränderungen im Lungengewebe, einschließlich Infiltration entzündlicher Zellen, Zerstörung der alveolären Struktur und erhöhte Expression proinflammatorischer Zytokine, begleitet von beeinträchtigten IFN-I-Antworten. Diese Studie liefert eine detaillierte Beschreibung der Verfahren, die zur Etablierung des SARS-CoV-2- und LPS-induzierten Mausmodells der Lungenverletzung verwendet wurden, und charakterisiert das Modell systematisch durch Analysen histopathologischer Veränderungen in der Lunge, Viruslast, entzündlicher Zytokine und IFN-I-Spiegel. Dieses Modell bietet eine experimentelle Plattform, um die immun-entzündlichen Mechanismen zu erforschen, die der COVID-19-assoziierten Lungenverletzung zugrunde liegen, sowie die Prozesse, die an der Reparatur des Lungengewebes beteiligt sind, und schafft gleichzeitig eine Grundlage zur Bewertung therapeutischer Strategien, die darauf abzielen, die immun-entzündliche Dysregulation zu mildern und die Wiederherstellung der Lungenfunktion zu fördern.

Einleitung

Seit seinem Auftreten Ende 2019 hat SARS-CoV-2 eine globale Herausforderung für die öffentliche Gesundheit verursacht, und die andauernde virale Evolution stellt weiterhin eine Herausforderung für bestehende Impfstoffe und therapeutische Strategien dar1,2,3. Daher ist eine weitere Untersuchung der mit COVID-19 assoziierten Lungenschädigung unerlässlich, um Krankheitsmechanismen aufzuklären und therapeutische Ansätze voranzubringen.

Eine SARS-CoV-2-Infektion kann schwere Lungenverletzungen verursachen und sich möglicherweise sogar zu einem akuten Atemnotsyndrom (ARDS) und einem Multiorganversagenssyndrom entwickeln4,5. Eine zunehmende Zahl von Belegen deutet darauf hin, dass die Pathogenese der mit COVID-19 assoziierten Lungenverletzung äußerst komplex ist, wobei ein zentrales Merkmal die Fehlregulation der Immun- und Entzündungsreaktionen darstellt6,7,8,9. Einerseits kann die SARS-CoV-2-Infektion eine übermäßige Entzündungsreaktion hervorrufen, die zur massiven Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1β (IL-1β) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) führt und dadurch einen sogenannten „Zytokinsturm“ auslöst10,11, der als wesentlicher Treiber von Lungenverletzungen und Krankheitsprogression gilt. Andererseits kann SARS-CoV-2 im frühen Stadium der Infektion die Wirt-Antwort durch Typ-I-Interferone (IFN-I) über mehrere Mechanismen unterdrücken, was zu einer beeinträchtigten, durch IFN-I vermittelten antiviralen Immunität führt12,13,14. Demnach wird eine verzögerte Interferonantwort, begleitet von erhöhten Spiegeln proinflammatorischer Zytokine, als charakteristisches Merkmal von COVID-19 angesehen6,15.

Die derzeit verfügbaren Tiermodelle für COVID-19 beruhen weitgehend auf hACE2-transgenen Mäusen, auf Mäusen angepassten Virusstämmen oder anderen Spezies wie Frettchen und nichtmenschlichen Primaten16,17. Konventionelle SARS-CoV-2-Infektionsmodelle bei Mäusen können jedoch häufig die hyperinflammatorischen Merkmale von COVID-19 nicht vollständig nachbilden18,19,20. LPS, ein TLR4-Agonist, löst starke entzündliche Reaktionen aus und wird häufig in Modellen der akuten Lungenschädigung eingesetzt21. Daher wurde das in dieser Studie beschriebene SARS-CoV-2- und LPS-induzierte Modell für Untersuchungen entwickelt, die sich auf die lungenspezifischen Schäden bei COVID-19 konzentrieren, insbesondere auf die Mechanismen, die einer übermäßigen Entzündungsaktivierung und gestörten antiviralen Immunantwort zugrunde liegen. Im Vergleich zu Modellen, die ausschließlich auf SARS-CoV-2 basieren, hebt dieser Ansatz die immuninflammatorischen Merkmale hervor, behält dabei aber den Kontext der Virusinfektion bei. Dieses Modell bietet ein erhebliches Potenzial für die Erforschung immuninflammatorischer Mechanismen, ohne die virale Übertragung oder den vollständigen natürlichen Verlauf der SARS-CoV-2-Infektion abzubilden.

Dieses Protokoll beschreibt die methodische Erstellung eines auf SARS-CoV-2 und LPS basierenden Mausmodells für eine mit COVID-19 assoziierte Lungenverletzung. Angesichts der Einschränkungen bestehender Modelle bei der Nachbildung der mit COVID-19 assoziierten immuninflammatorischen Dysregulation bietet dieser Ansatz eine praktische Plattform zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und zur Bewertung potenzieller therapeutischer Strategien. Das Modell wurde systematisch mittels Lungenhistopathologie, Viruslast, entzündlichen Zytokinen und IFN-I-Antworten evaluiert.

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Protokoll

Diese Studie etablierte ein Mausmodell für eine mit COVID-19 assoziierte Lungenschädigung mittels intranasaler Applikation von SARS-CoV-2 und LPS und bietet damit eine stabile und kostengünstige Alternative zu transgenen Mausmodellen. Das experimentelle Protokoll wurde vom Sichuan Center for Disease Control and Prevention genehmigt und erhielt die Tierversuchsethik-Genehmigung [Sichuan CDC (Animal Ethics) Approval No. 005 (2025)]. Alle Verfahren wurden streng gemäß den entsprechenden Leitlinien und Biosicherheitsvorschriften durchgeführt.

Detaillierte Informationen zu den primären Reagenzien und Geräten sind in der Tabelle der Materialien enthalten.

1. Studienprotokoll-Design

  1. Weisen Sie Mäuse der Stammeslinie BALB/c zufällig der Kontrollgruppe oder der Modellgruppe zu.
  2. Verabreichen Sie SARS-CoV-2 am Tag 0 intranasal an die Mäuse der Modellgruppe.
  3. Verabreichen Sie LPS am Tag 2 intranasal an die Mäuse der Modellgruppe.
  4. Verabreichen Sie ein gleiches Volumen an physiologischer Kochsalzlösung zu den entsprechenden Zeitpunkten intranasal an die Kontrollmäuse.
  5. Töten Sie alle Mäuse am Tag 3 nach der SARS-CoV-2-Infektion und entnehmen Sie das Lungengewebe zur Validierung des Modells.
    HINWEIS: Der experimentelle Arbeitsablauf ist in Abbildung 1A dargestellt.

2. Vorbereitung

  1. Tierpräparation
    1. Verwenden Sie spezifisch pathogenfreie (SPF) weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 6–8 Monaten mit einem Gewicht von etwa 25–30 g.
    2. Weisen Sie die Mäuse mithilfe einer Zufallszahltabelle zufällig einer Kontrollgruppe oder einer Modellgruppe zu, wobei jeweils vier Tiere pro Gruppe verwendet werden.
    3. Halten Sie die Mäuse unter standardisierten Laborbedingungen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
      HINWEIS: Frühere Studien haben gezeigt, dass ältere Mäuse anfälliger für eine intranasale SARS-CoV-2-Infektion sind als jüngere Mäuse18,22. Daher wurden in dieser Studie ältere BALB/c-Mäuse ausgewählt, um die Erstellung eines SARS-CoV-2-assoziierten Lungenverletzungsmodells zu erleichtern.
    4. Inokulieren Sie jedes Maus intranasal mit 100 µL viraler Suspension, was einer endgültigen infektiösen Dosis von 4,5 × 105 TCID₅₀ pro Maus entspricht.
      HINWEIS: SARS-CoV-2 wurde vom Sichuan Center for Disease Control and Prevention bereitgestellt. Der in dieser Studie verwendete Stamm war die SARS-CoV-2-Omicron-Variante mit einer Virusstammtiter von 4,5 × 106 TCID₅₀/mL.
      ACHTUNG: Da SARS-CoV-2 ein hochpathogenes Mikroorganismus ist, müssen alle virusbezogenen Arbeiten in einer Einrichtung der tierischen Biosicherheitsstufe 3 (ABSL-3) durchgeführt werden. Optimieren Sie die infektiöse Dosis anhand vorläufiger Experimente, wenn unterschiedliche Virusvarianten oder Tiermodelle verwendet werden.
  2. Herstellung der Arbeitslösung
    1. Herstellung der LPS-Stammlösung: Wiegen Sie 3 mg LPS-Pulver ab und lösen Sie es in 1 mL physiologischer Kochsalzlösung auf. Mischen Sie vorsichtig oder setzen Sie einen kontinuierlichen Vortex ein, bis die Substanz vollständig gelöst ist, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 3 mg/mL zu erhalten. Verdünnen Sie die Stammlösung vor der Applikation entsprechend dem Körpergewicht der Mäuse mit physiologischer Kochsalzlösung auf die gewünschte Arbeitskonzentration.
    2. Herstellung der Anästhetikalösung: Lösen Sie das Pulver mit dem im Zoletil-Set enthaltenen sterilen Wasser für die Injektion auf, um eine Lösung im erforderlichen Massen-Volumen-Verhältnis für die spätere Verwendung herzustellen.
    3. Herstellung der viralen Arbeitslösung: Tauchen Sie 1 mL SARS-CoV-2-Virussuspension vor der Verwendung langsam im Eis in einem Sicherheitswerkbank auf.
      HINWEIS: Befolgen Sie die jeweiligen Herstelleranweisungen bei der Herstellung und Anwendung aller Arbeitslösungen.

3. Intranasale Verabreichung bei Mäusen

  1. Wiegen Sie jede Maus vor der Verabreichung und notieren Sie das Körpergewicht.
  2. Berechnen Sie die Dosen von Zoletil und LPS basierend auf dem Körpergewicht jeder Maus.
  3. Bereiten Sie die entsprechenden Arbeitslösungen vor und entnehmen Sie die erforderlichen Volumina mit einer geeigneten Spritze für die anschließende Verabreichung.
  4. Fixierung der Maus: Fassen Sie die Maus vorsichtig am Nackenfell mit Daumen und Zeigefinger der linken Hand, wobei Sie die Haut hinter den Ohren und am Hals halten.
  5. Legen Sie das Tier in die Handfläche und sichern Sie Rücken und Schwanz mit Ringfinger und kleinem Finger. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage, sodass der Bauch vollständig freiliegt und der Körper stabilisiert ist.
  6. Desinfektion: Desinfizieren Sie die Injektionsstelle am Bauch mit 75 %igem Ethanol unter Verwendung eines sterilen Tupfers.
  7. Anästhesie: Führen Sie die Nadel der Spritze, die Zoletil (25 mg/kg) enthält, etwa 0,5 cm seitlich zur Mittellinie im unteren Bauchbereich ein. Stossen Sie die Nadel in einem Winkel von 45° etwa 2–3 mm tief in die Bauchhöhle vor, nachdem die Haut durchdrungen wurde. Ziehen Sie leicht an, um Blutungen auszuschließen, und verabreichen Sie dann das Anästhetikum langsam.
    ANMERKUNG: Optimieren Sie die Dosis des Anästhetikums anhand von Vorversuchen, um eine ausreichende Anästhesie sicherzustellen und die Sterblichkeit zu minimieren. Vermeiden Sie wiederholte Einstiche, um Gewebeschäden zu reduzieren.
  8. Bestätigung der Anästhesie: Überprüfen Sie den anästhesierten Zustand durch Beobachtung einer stabilen und regelmäßigen Atmung ohne Anzeichen von Atemnot oder respiratorischer Belastung.
  9. Intranasale Applikation von SARS-CoV-2 (Tag 0): Verabreichen Sie 100 µL virale Suspension von SARS-CoV-2 (50 µL pro Nasenloch) langsam tropfenweise auf die äußeren Nasenöffnungen mittels einer Mikropipette oder Spritze während eines gleichmäßigen Atemzyklus und zu Beginn der Einatmung.
  10. Wechseln Sie zwischen den Nasenlöchern, um eine gleichmäßige Inhalation zu fördern. Behandeln Sie Kontrollmäuse mit einem gleichen Volumen an physiologischer Kochsalzlösung nach demselben Verfahren.
    ANMERKUNG: Verabreichen Sie die Lösung tropfenweise, wobei sichergestellt werden muss, dass jeder Tropfen vor der Applikation des nächsten in die Nasenhöhle eingeatmet wurde, bis das Zielvolumen erreicht ist.
  11. Nachbehandlung nach der Verabreichung: Halten Sie den Kopf der Maus nach der intranasalen Applikation etwa 30–60 s leicht erhöht, um den Transport der Lösung in die unteren Atemwege zu unterstützen. Bringen Sie die Mäuse zurück in ihre Käfige, sobald Anzeichen der Erholung von der Anästhesie sichtbar sind, und beobachten Sie sie, bis volles Bewusstsein wiederhergestellt ist.
  12. Dokumentation und Überwachung: Notieren Sie das verabreichte Volumen und die Identifikationsnummer jeder Maus. Überwachen Sie die Tiere während des gesamten Versuchszeitraums kontinuierlich hinsichtlich Überleben und allgemeinem physiologischem Zustand.
  13. Intranasale Applikation von LPS (Tag 2): Verabreichen Sie LPS am Tag 2 nach SARS-CoV-2-Infektion. Führen Sie die intranasale Applikation von LPS (5 mg/kg) nach demselben Protokoll wie bei der SARS-CoV-2-Verabreichung durch. Verabreichen Sie Kontrollmäusen ein gleiches Volumen an physiologischer Kochsalzlösung nach demselben Verfahren.
    ANMERKUNG: In diesem Schritt wurden LPS und physiologische Kochsalzlösung nach demselben Verfahren wie bei der SARS-CoV-2-Inokulation verabreicht, einschließlich Anästhesie und intranasaler Applikation.

4. Maussektion und Gewebesammlung der Lunge

  1. Töten Sie die Mäuse am 3. Tag nach SARS-CoV-2-Infektion zur Gewebesammlung. Betäuben Sie die Tiere zuerst und töten Sie sie anschließend durch Halsbruch. Verarbeiten Sie Kontrollmäuse mit dem gleichen Verfahren.
    ANMERKUNG: Detaillierte Verfahren zum Halsbruch finden Sie in Supplementary File 1.
  2. Fixieren Sie die euthanasierten Mäuse in Rückenlage auf einem Präparationsbrett, wobei Bauch- und Brustbereich vollständig freigelegt sind. Befeuchten Sie das Bauchfell mit 75 %igem Ethanol, um Kontaminationen zu minimieren.
  3. Verwenden Sie sterile Scheren, um das Brustbein entlang der bilateralen Rippenränder vorsichtig zu durchtrennen und die Brusthöhle schrittweise zu öffnen. Ziehen Sie mit einer Pinzette das Gewebe vorsichtig zur Seite und dissezieren Sie die Lungen schrittweise von den umgebenden thorakalen Strukturen ab, wobei mechanische Schädigungen des Lungengewebes vermieden werden sollen.
    ANMERKUNG: Achten Sie sorgfältig auf die Ausrichtung der Scherenspitzen während des Schneidens, um Schäden am Herzen, an den Lungen und an größeren Gefäßstrukturen zu vermeiden.
  4. Legen Sie das entnommene Lungengewebe unverzüglich in vorab gekühltes PBS oder physiologische Kochsalzlösung und spülen Sie es vorsichtig 2–3 Mal aus, um verbliebenes Blut und Gewebereste zu entfernen. Tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit behutsam mit fusselfreiem Filterpapier ab und vermeiden Sie Druck, um strukturelle Schäden am Gewebe zu verhindern.
  5. Wiegen Sie das verarbeitete Lungengewebe umgehend mit einer elektronischen Waage und notieren Sie die Messwerte.
  6. Entfernen Sie das rechte kaudale Lappenstück und fixieren Sie es unverzüglich in 4 % Paraformaldehyd in einem Volumen, das das Zehnfache des Gewebes beträgt, für die anschließende histopathologische Analyse.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist toxisch; handhaben Sie es gemäß den Sicherheitsrichtlinien der Institution.
  7. Sammeln Sie das verbleibende Lungengewebe, portionieren Sie es in Kryoröhrchen, gefrieren Sie es rasch in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei −80 °C zur Konservierung. Verwenden Sie den rechten kranialen Lappen, den rechten mittleren Lappen und den Accessoriuslappen zur Bestimmung der SARS-CoV-2-Viruslast und proinflammatorischer Zytokine, und behalten Sie die linke Lunge für die ELISA-Analyse zurück.
    ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff ist extrem kalt; tragen Sie geeignete kryogene Handschuhe und Schutzbrille, um Kälteverbrennungen oder Erfrierungen zu vermeiden.
  8. Reinigen und sterilisieren Sie alle Instrumente nach Abschluss der Sektion gründlich gemäß den Standardverfahren. Entsorgen Sie Tierkadaver und biologische Abfälle gemäß den institutionellen und behördlichen Richtlinien für Tierversuche.

5. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung23

  1. Frisches Lungengewebe 24 h lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd fixieren.
    ANMERKUNG: Die Fixierdauer sorgfältig kontrollieren. Unzureichende Fixierung vermeiden, da diese zu einer unvollständigen Gewebeerhaltung führen kann, sowie eine zu lange Fixierung, die eine übermäßige Proteinkreuzvernetzung verursachen und die Färbungsqualität beeinträchtigen könnte.
  2. Die fixierten Gewebeproben mit einem automatisierten Gewebeprozessor für eine gestufte Dehydrierung, Klärung und Paraffindurchtränkung aufarbeiten.
    ANMERKUNG: Das Protokoll für den automatisierten Gewebeprozessor ist in Supplementary File 2 enthalten.
  3. Die paraffindurchtränkten Gewebeproben in Einbettungsschalen platzieren. Geschmolzenes Paraffin hinzufügen und die Gewebeproben sorgfältig ausrichten.
  4. Die Schalen auf eine Kühlplatte zur Verfestigung übertragen. Die Paraffinblöcke nach vollständiger Aushärtung aus den Schalen entfernen.
  5. Die Paraffinblöcke am Mikrotom befestigen und die Schneidefläche parallel zur Klinge ausrichten. Serienschnitte mit einer Dicke von etwa 3–5 µm anfertigen.
  6. Die Schnitte unverzüglich in ein Wasserbad von etwa 45 °C überführen, um das vollständige Aufschwimmen und Entfalten zu ermöglichen.
  7. Die Schnitte mithilfe von Objektträgern aufnehmen, indem man ein Ende des Objektträgers vertikal ins Wasser eintaucht, und mit einer Pinzette die korrekte Anheftung der Schnitte an der Trägeroberfläche unterstützen.
  8. Die Objektträger etwa 1 h lang in einen bei 65 °C beheizten Trockner stellen, um die Gewebehaftung zu verbessern.
    ANMERKUNG: Die Trocknungszeit entsprechend der Gewebetypen, Schnittdicke und Gerätebedingungen anpassen. Überhitzung vermeiden, um Gewebeschäden zu verhindern.
  9. Die getrockneten Schnitte mit einem automatisierten Färbeapparat mit H&E färben.
    ANMERKUNG: Das Protokoll für den automatisierten Färbeapparat ist in Supplementary File 3 enthalten.
  10. Die gefärbten Schnitte entnehmen und an der Luft trocknen lassen. Einen Tropfen neutralen Eindeckmittel auftragen und die Objektträger abdecken. Die Schnitte nach dem Aushärten des Eindeckmittels unter dem Lichtmikroskop untersuchen.

6. Expression der viralen Last von SARS-CoV-2 und proinflammatorischer Zytokine im Lungengewebe

  1. Homogenisierung von Lungengewebe
    1. Bereiten Sie RNase-freie Homogenisierungsgefäße vor, indem Sie 4–5 Edelstahlkugeln (3 mm Durchmesser) und 900 µL vorgekühlten Lysepuffer als Homogenisierungsmedium hinzufügen.
      HINWEIS: Passen Sie das Volumen des Lysepuffers entsprechend dem Gewebegewicht an, typischerweise im Verhältnis von etwa 9 mL pro 1 g Gewebe.
    2. Wiegen Sie etwa 50 mg Lungengewebe ab, zerkleinern es fein und überführen es in das Homogenisierungsgefäß.
    3. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Gewebemühle (60 Hz, 60 s, 2–3 Zyklen mit 10 s Intervallen zwischen den Zyklen).
      HINWEIS: Optimieren Sie die Homogenisierungsparameter je nach Gerät und Gewebetyp.
    4. Überprüfen Sie die Probe nach der Homogenisierung, um eine vollständige Zerstörung sicherzustellen. Wiederholen Sie den Homogenisierungsschritt, falls sichtbare Gewebefragmente verbleiben, bis ein homogener Lysat erhalten ist.
  2. Säulengestützte Extraktion der gesamten RNA aus Lungengewebe
    ​HINWEIS: Extrahieren Sie die gesamte RNA aus Lungengewebe mithilfe eines säulengestützten Reinigungsverfahrens gemäß den Herstelleranweisungen. Führen Sie alternative RNA-Extraktionsmethoden nach den entsprechenden Produktanleitungen durch, wenn zutreffend.
    1. Überführen Sie den Homogenat in ein neues, RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL). Geben Sie 100 µL gDNA-Eliminator-Lösung hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen und schütteln Sie es kräftig für 15–20 s.
    2. Öffnen Sie den Verschluss kurz, geben Sie 180 µL Chloroform hinzu und wirbeln Sie gründlich für 15 s.
      ACHTUNG: Chloroform ist flüchtig und toxisch; handhaben Sie es in einem gut belüfteten Bereich oder unter einem Abzug und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, um Inhalation und Hautkontakt zu vermeiden.
    3. Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 2 min und zentrifugieren Sie anschließend bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
    4. Überführen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen. Geben Sie ein gleiches Volumen an 70 %igem Ethanol hinzu und mischen Sie gründlich durch Wirbeln.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zwischenphase und die organische Schicht zu stören, wenn Sie die wässrige Phase abnehmen, um die RNA-Reinheit sicherzustellen. Fahren Sie direkt nach Zugabe des 70 %igen Ethanol mit dem nächsten Schritt fort, ohne zu zentrifugieren.
    5. Überführen Sie die Mischung in eine Säule und zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 15 s. Entsorgen Sie den Durchlauf.
    6. Geben Sie 700 µL Waschpuffer auf die Säule und zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 15 s. Entsorgen Sie den Durchlauf.
    7. Geben Sie 500 µL Waschpuffer auf die Säule und zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 15 s. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal.
    8. Überführen Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen und zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 1 min, um restlichen Waschpuffer zu entfernen.
    9. Setzen Sie die Säule in ein neues, RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL). Geben Sie 30 µL RNase-freies Wasser direkt in die Mitte der Membran und zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 1 min, um die RNA zu eluieren.
      HINWEIS: Passen Sie das Volumen des RNase-freien Wassers je nach nachgeschalteter Anwendung zwischen 30–50 µL an. Verwenden Sie ein geringeres Elutionsvolumen, wenn eine höhere RNA-Konzentration erforderlich ist.
  3. Nachweis der SARS-CoV-2-Viruslast mittels reverser Transkription digitaler PCR (RT-dPCR)
    ​HINWEIS: Für die absolute Quantifizierung der SARS-CoV-2-RNA wurde ein One-Step-RT-dPCR-Assay verwendet. Spezifische Primer-Sonden-Sets, die das Nukleokapsid-(N)-Gen targeten, wurden zur Bestimmung der Kopienzahl der viralen RNA eingesetzt.
    1. Tauen Sie die RNA-Proben und Reagenzien auf Eis auf.
    2. Bereiten Sie das RT-dPCR-Reaktionsgemisch gemäß den Herstelleranweisungen vor.
    3. Mischen Sie 20 µL RT-dPCR-Reaktionsgemisch mit 20 µL RNA-Vorlage. Wirbeln Sie das Gemisch kurz, zentrifugieren Sie es kurz und lagern Sie es auf Eis.
    4. Füllen Sie das 40 µL große Reaktionsgemisch in die Vertiefungen des digitalen PCR-Chips und versiegeln Sie den Chip gemäß den Instrumentenanweisungen.
    5. Führen Sie die Amplifikation unter folgenden thermischen Zyklenbedingungen durch: 50 °C für 40 min (1 Zyklus), 95 °C für 2 min (1 Zyklus), gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 15 s und 57 °C für 60 s. Stellen Sie die Detektionskanäle auf GRÜN (250 ms) und ROT (150 ms) ein.
  4. Nachweis der Expression entzündungsfördernder Zytokine mittels reverser Transkription quantitativer PCR (RT-qPCR)
    1. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und -reinheit mithilfe eines UV-Spektrophotometers.
    2. Verwenden Sie 1.000 ng Gesamt-RNA pro Reaktion für die reverse Transkription zur Synthese komplementärer DNA (cDNA) gemäß den Herstelleranweisungen.
    3. Führen Sie die RT-qPCR mit 100 ng cDNA pro Reaktion als Vorlage unter Verwendung eines SYBR-Green-PCR-Mastermixes und genspezifischer Primer durch. Verwenden Sie folgende Zyklenbedingungen: 95 °C für 2 min, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 5 s und 60 °C für 10 s. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
      HINWEIS: Optimieren Sie die Reaktionsbedingungen je nach verwendeten Reagenzien und Geräten und befolgen Sie die entsprechenden Herstelleranweisungen.
    4. Verwenden Sie GAPDH als internes Referenzgen und berechnen Sie die relativen Genexpressionsniveaus nach der 2−ΔΔCt-Methode.

7. Nachweis proinflammatorischer Zytokine im Lungengewebe mittels Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)24

HINWEIS: ELISA-Kits gemäß der spezifischen Protokolle verwenden, die von verschiedenen Herstellern bereitgestellt werden. Die Anweisungen des entsprechenden Herstellers strikt befolgen, wenn Kits von alternativen Anbietern verwendet werden.

  1. Homogenisieren Sie das Lungengewebe wie oben beschrieben. Verwenden Sie PBS oder einen ELISA-spezifischen Puffer zur Gewebelyse als Homogenisierungsmedium.
  2. Zentrifugieren Sie die homogenisierten Proben (z. B. 12.000 × g, 4 °C, 10 min) und sammeln Sie den Überstand für die anschließende Analyse.
  3. Stellen Sie das ELISA-Kit vor der Verwendung 30 min lang auf Raumtemperatur ein. Entnehmen Sie die erforderlichen Mikroplatten-Streifen aus der Aluminiumfolienverpackung.
  4. Bereiten Sie die Standard-, Proben- und Leerproben-Vertiefungen gemäß den Herstelleranweisungen vor. Geben Sie 50 µL der Standardlösungen in die Standard-Vertiefungen und 10 µL Probe plus 40 µL Probenverdünnungspuffer in die Proben-Vertiefungen. Führen Sie für jeden Standard und jede Probe zwei technische Wiederholungen durch.
  5. Geben Sie 100 µL der mit Horseradish-Peroxidase (HRP) konjugierten Detektionsantikörperlösung in jede Standard- und Proben-Vertiefung, ausgenommen die Leerproben-Vertiefungen. Versiegeln Sie die Platte mit einem Klebefolie und inkubieren Sie sie 60 min bei 37 °C.
  6. Entfernen Sie nach der Inkubation die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung und klopfen Sie die Platte vorsichtig auf saugendem Papier ab, um restliche Flüssigkeit zu entfernen.
  7. Füllen Sie jede Vertiefung mit Waschpuffer, lassen Sie ihn 1 min lang stehen und entsorgen Sie anschließend den Puffer. Trocknen Sie die Platte durch vorsichtiges Abklopfen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt fünfmal.
  8. Geben Sie nacheinander jeweils 50 µL Substratlösung A und 50 µL Substratlösung B in jede Vertiefung. Mischen Sie die Platte vorsichtig und inkubieren Sie sie 15 min bei 37 °C im Dunkeln, um die Farbreaktion zu entwickeln.
  9. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 µL Stopplösung in jede Vertiefung geben. Messen Sie die optische Dichte (OD) innerhalb von 10 min bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
  10. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Standardkonzentrationen (x-Achse) gegen die OD-Werte (y-Achse) auftragen und die Kurve anpassen. Berechnen Sie die Konzentrationen der Zielzytokine in den Proben, indem Sie die OD-Werte in die Gleichung der Standardkurve einsetzen und mit den entsprechenden Verdünnungsfaktoren multiplizieren.
  11. Bestimmen Sie die Gesamtprotein-Konzentration im Lungengewebe mithilfe eines BCA-Protein-Assay-Kits. Normalisieren Sie die endgültigen Zytokinspiegel auf den Gesamtproteingehalt und geben Sie die Ergebnisse als Menge des Zielzytokins pro Milligramm Gesamtprotein an (z. B. pg/mg Protein).

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Ergebnisse

Die Modellvalidierung erfolgte durch die Beurteilung pulmonaler histopathologischer Veränderungen, der SARS-CoV-2-Viruslast sowie der Spiegel proinflammatorischer Zytokine und Interferone vom Typ I sowohl in der Kontroll- als auch in der Modelgruppe.

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler (SE) angegeben. Zum Vergleich zwischen Modell- und Kontrollgruppe wurde ein ungepaarter Student-t-Test verwendet. Dieser Test wurde ...

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Diskussion

Diese Studie etablierte ein murines Modell einer mit COVID-19 assoziierten Lungenverletzung mittels intranasaler Applikation von SARS-CoV-2 und LPS. Die Ergebnisse zeigten, dass die intranasale Kombinationsgabe von SARS-CoV-2 und LPS eine starke Entzündungsreaktion hervorruft, die mit einer Unterdrückung der IFN-I-Signalübertragung einhergeht. Mäuse der Modellgruppe wiesen einen signifikanten Gewichtsverlust sowie einen erhöhten Lungenindex auf, was auf systemische Abmagerung und eine verstärkte pulmonale Schädigung hinw...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde unterstützt durch die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (82374291); das Programm für Wissenschaft und Technologie von Sichuan (2024NSFJQ0059); das Sonderthema für wissenschaftliche Forschung der Verwaltung für Traditionelle Chinesische Medizin von Sichuan (2024zd005); das Projekt „Tianfu Qingcheng Plan“ 2022 für führende wissenschaftliche und technologische Talente (Chuan Qingcheng Nr. 1090); den gemeinsamen Innovationsfonds der Gesundheitskommission von Chengdu und der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Chengdu (WXLH202403091).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Automatischer GewebeprozessorDakewe Biotech Co., Ltd.HP300Wird zur Gewebedehydrierung verwendet.
AutofärberLeica BiosystemsLEICA ST5010Wird zur HE-Färbung verwendet.
ZentrifugeDLAB Scientific D3024RWird zum Zentrifugieren von Proben oder Reagenzien verwendet.
Wasserbad mit konstanter TemperaturShanghai LICHEN-BX Instrument Techonology Co., Ltd.HH-6Wird für Wasserbäder bei konstanter Temperatur verwendet.
Digital-PCR-SystemQIAGENQIAcuity OneWird für RT-dPCR verwendet.
TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix für qPCR (Ein-Schritt gDNA-Entfernung)TransGen Biotech Co.,Ltd.AT341Wird für die Reverse Transkription verwendet.
Eosin-LösungBASOBA4024Wird für die histologische Färbung verwendet.
Fluoreszenz-basiertes quantitatives PCR-SystemRocgene (Beijing) Technology Co., Ltd.Archimed X6Wird für RT-qPCR verwendet.
Hämatoxylin-LösungBASOBA4041Wird für die histologische Färbung verwendet.
IBM SPSS Statistics SoftwareIBM Corp., Armonk, NY, USAVersion 22.0Wird für die statistische Analyse verwendet.
Lipopolysaccharide aus Escherichia coli O55:B5Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.L2880Wird für die Maus-Modellierung verwendet.
MikroplattenreaderMolecular Devices SpectraMax Plus 384Wird für ELISA verwendet.
Maus IFN-α-ELISA-KitZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37863WWird zum Nachweis von IFN-α-Spiegeln im Lungengewebe von Mäusen verwendet.
Maus IFN-β-ELISA-KitZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37887WWird zum Nachweis von IFN-β-Spiegeln im Lungengewebe von Mäusen verwendet.
Maus IL-1β-ELISA-KitZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37974WWird zum Nachweis von IL-1β-Spiegeln im Lungengewebe von Mäusen verwendet.
Maus IL-6-ELISA-KitZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37988WWird zum Nachweis von IL-6-Spiegeln im Lungengewebe von Mäusen verwendet.
Maus TNF-α-ELISA-KitZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-39024WWird zum Nachweis von TNF-α-Spiegeln im Lungengewebe von Mäusen verwendet.
One-Step RT-PCR-Kit für Digital-PCRQIAGEN4829104Wird für die Digital-PCR verwendet.
ParaffineinbettungsgerätHubei Aristion Medical Industrial Co., Ltd.ABM-7LWird zur Paraffineinbettung von Lungengewebe von Mäusen verwendet.
QuantiNova SYBR PCR Mix KitQIAGEN1129280Wird für RT-qPCR verwendet.
RNeasy Plus Universal Mini KitQIAGEN1062832Wird zur Gesamt-RNA-Extraktion verwendet.
SchneidgerätLeica BiosystemsLEICA RM2235Wird für Paraffinschnitte verwendet.
Edelstahlkugeln für GewebehomogenisatorBeyotime BiotechnologyF6621Wird zum Homogenisieren von Lungengewebe verwendet.
XG Primer Pool 1.0 für Digital-PCRQIAGEN4828104Wird für die Digital-PCR verwendet.
Zoletil 50VIRBACBN9VS7AWird zur Anästhesie von Mäusen verwendet.

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