Methodenartikel

Ein Exzisionswundenmodell bei Ratten zur Untersuchung von Therapeutika bei Hautwunden kritischer Größe

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DOI:

10.3791/72315

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25. September 2026

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1Department of Hand Surgery, Plastic Surgery and Burns, Linkoping University, 2Center for Biomedical Resources, Linkoping University, 3Basic Medical Sciences Department, College of Medicine, Ajman University, 4Medical Laboratory Science Department, College of Health Sciences, University of Sharjah

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein exzisionelles Wundmodell an der Rattenhaut, das eine feuchte Kammer umfasst. Das System ermöglicht die Bewertung topischer flüssiger Formulierungen, Zellsuspensionen, Biomaterialien und anderer Wundtherapeutika.

Zusammenfassung

Hautwunden stellen eine bedeutende globale Herausforderung für die Gesundheitsversorgung dar und verursachen erhebliche Morbidität sowie wirtschaftliche Belastungen. Zuverlässige und klinisch relevante Tiermodelle sind unerlässlich, um die Mechanismen der Gewebereparatur zu untersuchen und neuartige therapeutische Strategien zu bewerten. Herkömmliche exzisionelle Wundmodelle an Nagetieren weisen jedoch aufgrund des Panniculus carnosus eine schnelle Wundkontraktion auf, was sich deutlich von der menschlichen Wundheilung unterscheidet. Letztere erfolgt hauptsächlich über die Bildung von Granulationsgewebe und Reepithelialisierung. Diese Studie beschreibt ein exzisionelles Rattenwundmodell, das darauf ausgelegt ist, die Wundkontraktion einzuschränken und gleichzeitig eine geschützte Umgebung für die Prüfung empfindlicher therapeutischer Maßnahmen bereitzustellen. Vollschichtige 10-mm-dorsale Exzisionswunden wurden bei Sprague-Dawley-Ratten angelegt und mittels einer mit Einzelknopfnähten befestigten Nitril-Butadien-Kautschuk-(NBR-)O-Ring-Schienen stabilisiert. Um eine feuchte Wundumgebung aufrechtzuerhalten, wurde ein Eakin-kohäsiver Verschluss und eine transparente Klebefolie angebracht, um eine Kammer zu bilden, die für die topische Applikation von Zellen, Biomaterialien oder pharmazeutischen Wirkstoffen geeignet ist. Zusätzliche Schutzschichten aus einer Schaumstoffauflage, Klebeband, einem tubulären Verband und einem Doppel-Schulter-Befestigungssystem verhinderten, dass die Tiere den Verband entfernten. Die Wundheilung wurde über 14 Tage mittels digitaler Planimetrie und histologischer Beurteilung mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung überwacht. Das Verfahren dauerte pro Tier etwa 30 Minuten und führte zu reproduzierbaren Ergebnissen hinsichtlich der Wundheilung. Der NBR-O-Ring diente als Schiene zur Begrenzung der Wundkontraktion. Die Heilung erfolgte vorwiegend durch Granulationsgewebebildung und Reepithelialisierung. Die Verbände blieben bis zu sieben Tage intakt, ohne Anzeichen einer Infektion. Die histologische Analyse zeigte eine aktive Gewebereparatur, gekennzeichnet durch epidermale Regeneration und Infiltration entzündlicher Zellen. Dieses Modell bietet eine Plattform für die präklinische Bewertung von Wundtherapeutika und fortschrittlichen regenerativen Behandlungsverfahren.

Einleitung

Hautwunden, einschließlich schwer heilender Wunden, betreffen weltweit mehr als 40 Millionen Patienten und verursachen eine erhebliche Belastung für die Gesundheitssysteme, mit jährlichen Kosten von 22 Milliarden US-Dollar bis 2024. Allein in Europa leiden jährlich 4 Millionen Patienten an schwer heilenden Wunden, die bis zu die Hälfte der verfügbaren akuten Krankenhausaufenthalte in Anspruch nehmen1. Trotz Fortschritten in der chirurgischen Technik, den intraoperativen Verfahren und der Verfügbarkeit fortschrittlicher Wundauflagen zeigen sich manche Wunden als therapieresistent, und letztendlich treten Komplikationen auf. Daher ist es unerlässlich, neue therapeutische Ansätze zu entwickeln, für die ein experimentelles Tiermodell von Hautwunden erforderlich ist, um eine Vielzahl topisch anzuwendender Materialien zu testen.

Unter den experimentellen Tiermodellen für Hautwunden ist die Hautexzision die am besten geeignete Technik, um ein Wundheilungsmodell zu erstellen2. Ein solches Modell kann helfen, Blutungen, entzündliche Reaktionen, Granulation, Reepithelialisierung, Angiogenese und Gewebeumbildung zu untersuchen3. Exzisionelle Wunden werden hauptsächlich am Rücken des Tieres durch chirurgische Entfernung eines definierten Hautareals angelegt. Die Wunde sollte eine kritische Größe aufweisen, um eine spontane Heilung auszuschließen. Diese kritische exzisionelle Wunde ermöglicht direkten Zugang zur Untersuchung der topischen Anwendung verschiedener Chemikalien, Zellen oder Biomaterialien und deren Beteiligung am Heilungsprozess4,5.

Nager- und menschliche Haut weisen Gemeinsamkeiten in den zellulären und molekularen Phasen der Wundheilung auf, einschließlich der Hämostase, Entzündung, Proliferation und Remodellierung. Ratten und Mäuse sind die am häufigsten verwendeten Arten in Wundmodellen, da sie leicht verfügbar sind, eine geringe Körpergröße aufweisen, genetisch relativ einfach verändert werden können und leicht zu handhaben sind. Ratten bieten mehrere praktische Vorteile gegenüber Mäusen, darunter eine größere Körpergröße und dickere Haut, die aus mehr Schichten von Keratinozyten besteht als die Haut von Mäusen. Wunden bei Mäusen heilen typischerweise innerhalb von 7 Tagen, während der Heilungsprozess bei Ratten über einen Zeitraum von etwa 12–14 Tagen6 beurteilt werden kann.

Eine große Herausforderung beim Einsatz von Nagetieren mit lockerer Haut ist die Wundkontraktion3. Die Haut von Nagetieren weist eine panniculus carnosus-Schicht auf, die sich nach einer Verletzung zusammenzieht, um die exponierte Fläche zu verkleinern. Im Gegensatz dazu besitzen menschliche Wunden eine begrenzte Kontraktionsfähigkeit und sind auf Granulation und Reepithelialisierung zur Reparatur angewiesen7. Ein Ansatz, um die Einschränkungen tierischer Modelle zu überwinden, besteht darin, eine physikalische Fixierung oder Schienung der Haut um den Wundbereich herum durchzuführen8. Titan-Wundkammern gehörten zu den erfolgreich entwickelten Vorrichtungen, um eine Wundkontraktion zu verhindern9, wiesen jedoch Nachteile auf, wie beispielsweise hohe Belastung der Tiere durch das Gewicht der Kammer, komplizierte chirurgische Platzierung, Risiko der Vorrichtungslockerung, Infektionsgefahr und hohe Kosten. Das Konzept des geschienten Wundmodells wurde 2004 von Galiano et al.10 eingeführt, indem ein starrer Silikonring mit Nähten um den Wundrand befestigt wurde. Dieser Ansatz reduziert die Wundkontraktion deutlich11, weist jedoch mehrere Nachteile und Einschränkungen auf, die hauptsächlich auf dem Risiko von Weichteilschäden, einer hohen Rate an Schienenverlagerung und inkonsistenter Wundheilung beruhen. Schienen (wie starre Silikonringe) können übermäßigen Druck auf die umliegende Haut ausüben, was zu Ischämie, Reizung und Nekrose führen kann, insbesondere wenn sie falsch angebracht werden. Silikonschienen werden aufgrund der Bewegung oder der Pflegeverhalten der Tiere häufig verstümmelt, gebrochen oder gelöst8,11. Unauf gleichmäßige Nähte zurückgehende ungleichmäßige Spannungen um die Wunde führen oft zu inkonsistenter Heilung. In dem hier vorgestellten Modell wird ein O-Ring aus Nitril-Butadien-Kautschuk (NBR) durch Platzierung von 8–12 einfachen unterbrochenen Polyamid-Nähten gleichmäßig um den Ring herum am Wundrand der Haut befestigt. Dieser Ansatz soll die zuvor genannten Risiken minimieren und die Wundkontraktion ausreichend begrenzen, sodass die Wunde über die Bildung von Granulationsgewebe und Reepithelialisierung heilen kann, ähnlich wie beim menschlichen Wundheilungsprozess. Dieser Hechanismus würde die Übertragung von Ergebnissen aus tierexperimentellen Modellen auf klinische Anwendungen erleichtern.

Die Theorie der feuchten Wundheilung wurde 1962 von George D. Winter als Konzept für die Entwicklung von Wundpflegeprodukten eingeführt12. Auf Grundlage dieser Theorie wurden in den letzten Jahrzehnten verschiedene Wundauflagen entwickelt, wie z. B. Gazetücher, transparente Folien, Schaumstoffe und Hydrogels13. Andererseits wurde 1974 ein formbarer hydrokolloider Stomaverschlussring entwickelt, um Leckagen zu verhindern und dagegen zu schützen. Diese Ringe können leicht geformt und an die Wundränder angepasst werden, insbesondere in der Stomaversorgung. In diesem Modell wird eine kohäsive Abdichtung außen um die Wunde herum angebracht und bildet gemeinsam mit sterilen, transparenten Folien eine feuchte Kammer, die die klinische Situation von Patienten mit behandelten Hautwunden nachahmt, die Epithelialisierung der Wunde fördert und topisch applizierte Substanzen (z. B. Zellen, Biomaterialien, Wirkstoffe) vor Auslaufen schützt.

Die Wundauflage ist entscheidend, um das Wundbett vor mechanischer Belastung und mikrobieller Infektion zu schützen. Die Anlage einer Wundauflage bei Ratten gestaltet sich aufgrund ihrer geringen Verträglichkeit stets schwierig. Ratten entfernen oder zerstören die Verbände häufig, indem sie sie kurz nach der Narkosereanimation sofort abbeißen oder zerreissen. Dadurch wird die Retention topisch applizierter Substanzen wie Zellen und Arzneimittel äußerst schwierig, und der Schutz der Wunde vor äußeren Krankheitserregern und Kontaminationen ist unmöglich. Dies stellt eine weitere Herausforderung im Nagetiermodell dar, insbesondere bei Studien, die eine sterile Umgebung erfordern, wie beispielsweise die Prüfung biologischer Arzneimittel, zellbasierte Therapien und fortgeschrittene therapeutische Arzneimittel. In dem hier vorgestellten Modell wurde ein Schaumverband zusammen mit Klebeband verwendet, um die feuchte Kammer abzudecken. Anschließend kamen ein elastischer Tubularverband, ein Fixierverband und mikroporöses chirurgisches Pflaster zum Einsatz, um einen doppelten, überkreuzten Schulterverband anzulegen, der verhindert, dass die Ratten die Verbände entfernen oder beschädigen.

Das hier beschriebene Modell kombiniert mehrere Elemente aus verschiedenen Protokollen und wurde über einen Zeitraum von mehreren Jahren entwickelt. Ziel war es, ein Modell einer exzisionellen Wunde an Ratten mithilfe einer Feuchtkammer zu etablieren, die vom Tier gut vertragen wird, und um die Prüfung empfindlicher topischer Substanzen, insbesondere in flüssiger Form, zu erleichtern.

Protokoll

Alle unten dargestellten Tierversuche wurden vom Ethikkomitee Linköping (Dnr 5163-2023), Schweden, genehmigt. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

1. Experiment​mentale Tiere

  1. Verwenden Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 8–14 Wochen.
  2. Akklimatieren Sie die Ratten vor dem Experiment mindestens 1 Woche lang in einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Wechselzyklus bei Standardernährung.

2. Vorbereitung vor der Operation

  1. Betäuben Sie das Tier mit 1,5–2,5 % Isofluran (4,5 % für die Induktion), gemischt mit 1,0–1,5 L/min Sauerstoff. Legen Sie das Tier in Bauchlage auf eine Heizplatte, um es warm zu halten. Tragen Sie ein Augenschmiermittel zum Schutz der Augen auf und verabreichen Sie 0,05 mg/kg Buprenorphin-Körpergewicht, in Kochsalzlösung verdünnt, subkutan am Rücken des Tieres zur postoperativen Schmerzlinderung.
    ANMERKUNG: Zwischen Tier und Platte sollte eine dünne Schicht aus wiederverwendbarem Unterlageisolationsmaterial vorhanden sein.
    ACHTUNG: Isofluran ist ein zentralnervöses Depressivum und ein Atemwegsreizstoff. Verwenden Sie einen kalibrierten Verdampfer mit einem aktiven Abgasabsaugsystem, um Dampfexposition zu vermeiden.
  2. Rasieren Sie den dorsalen Bereich mit einer elektrischen Schermaschine vom Halsansatz etwa 10 cm nach kaudal. Reinigen Sie den rasierten Bereich gründlich zweimal mit Chlorhexidin und 70 %igem Ethanol und bedecken Sie das Tier anschließend mit einer fenestrierten Operationshaube, die nur den gereinigten Bereich freilässt.

3. Anlegen einer exzisionellen Wunde

  1. Verwenden Sie geeignete sterilisierte chirurgische Instrumente, wie beispielsweise eine Schere und eine Pinzette.
  2. Zeichnen Sie mithilfe einer Schablone mit einem chirurgischen Permanentmarker einen Kreis mit einem Durchmesser von 10 mm etwa 4 cm kaudal zur Nackenbasis.
  3. Fassen Sie die Mitte der markierten Haut mit der Pinzette und entfernen Sie das markierte Hautgewebe mit der Schere. Die Wundtiefe sollte bis zur oberflächlichen Faszie reichen. Diese lässt sich erkennen, indem die volle Dicke der Haut gelöst und die halbtransparente, den Muskel bedeckende Faszie sichtbar gemacht wird.
  4. Bringen Sie einen NBR-O-Ring an den Wundrand der Haut an und befestigen Sie ihn durch 8–12 Nähte. Ziel der Ringfixierung ist es, eine Hautkontraktion zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die primären Nähte an der 12-Uhr-, gefolgt von der 6-Uhr-, 3-Uhr- und anschließend der 9-Uhr-Position angebracht werden. Bei Verwendung von 8 Nähten platzieren Sie jeden zusätzlichen Naht in der Mitte zwischen jeweils zwei primären Nähten (Abbildung 1A).
  5. Tragen Sie außerhalb des NBR-O-Rings ein kohäsives Siegel auf, indem Sie dessen klebende Eigenschaften nutzen, um gemeinsam mit einer sterilen, transparenten und selbstklebenden Folie eine feuchte Kammer zu bilden (Abbildung 1B). Zu diesem Zeitpunkt ist die Wunde durch den NBR-O-Ring fixiert, wobei die Seitenwände der Applikationskammer aus dem Hautrand und dem kohäsiven Siegel bestehen; der Boden wird durch die offene Wundfläche gebildet, während das Dach durch die transparente Folie gebildet wird.
  6. Bedecken Sie die Wunde mit einer Schicht der Folie und geben Sie anschließend die Behandlungslösung (Zelllösung oder Wirkstofflösung) durch die Folie auf die Wundoberfläche. Die beschriebene Kammergröße kann problemlos 100 µL aufnehmen.
  7. Bedecken Sie die Injektionsstelle mit einer weiteren Schicht der Folie, um ein Austreten der Behandlungslösung zu verhindern (Abbildung 1C).
  8. Bedecken Sie die Folie mit einem weichen Silikonverband, um die Folie zu schützen (Abbildung 1D).
  9. Bringen Sie Klebestreifen an (Abbildung 1E), danach einen elastischen Tubularverband in einer Doppel-Schulter-Konfiguration um die Ratte, unter Verwendung eines Fixierverbandes und mikroporöser chirurgischer Klebebänder (Abbildung 1F–H).
  10. Schneiden Sie die Krallen der Ratten zurück, um zu verhindern, dass die Tiere den Verband abreißen.
  11. Verabreichen Sie Carprofen (5 mg/kg Körpergewicht), in Kochsalzlösung verdünnt, subkutan dem Tier, bevor es von der Anästhesie abgekoppelt wird.

4. Nach der Operation durchgeführte Verfahren

  1. Halten Sie das Tier auf der Heizplatte, mit einer Decke bedeckt, bis es aus der Narkose erwacht ist. Stellen Sie die Tiere in getrennte Käfige oder in einen gemeinsamen Käfig mit einem Trenner, um zu verhindern, dass sie sich gegenseitig beißen oder den Verband entfernen.
  2. Verabreichen Sie am folgenden Morgen Carprofen (5 mg/kg Körpergewicht) subkutan in physiologischer Kochsalzlösung verdünnt zur Schmerzbehandlung nach der Operation. Die Ratten müssen täglich auf postoperative Schmerzen oder Gewichtsverlust überwacht werden, und gegebenenfalls kann eine zusätzliche Dosis Analgetikum verabreicht werden.

5. Wundmessungen und Verbandwechsel

  1. Untersuchen Sie jedes Tier täglich in der ersten Woche nach der Wundoperation. Der Verband sollte überprüft und korrigiert werden, wenn die Tiere Bewegungsschwierigkeiten haben oder Unbehagen zeigen.
  2. Wechseln Sie den Verband am 7. Tag, während sich das Tier gemäß Schritt 2.1 in Narkose befindet.
  3. Entfernen Sie vorsichtig die Wundauflage von der Haut. Fotografien der Wunde werden mit einem Lineal zur Maßstabsangabe angefertigt. Die Bilder wurden zur Auswertung der Wundoberfläche mit der Fiji/ImageJ-Software analysiert.
  4. Führen Sie Messungen oder andere Verfahren nach Bedarf des Untersuchers durch.
  5. Legen Sie einen sauberen Verband wie in den Schritten 3.8–3.11 beschrieben an und lassen Sie das Tier gemäß Schritt 4.1 auskurieren.

6. Wundensammlung und Tötung

  1. Verabreichen Sie die Anästhesie wie unter Punkt 2.1 am Tag 14 erwähnt oder gemäß dem spezifischen Versuchsplan. Entfernen Sie den Verband und fotografieren Sie die Wundstellen.
  2. Entfernen Sie den Verband und fotografieren Sie die Wundstellen.
  3. Entnehmen Sie Wundhautgewebe. Schneiden Sie mit einem Skalpell die Haut um die Wunde herum aus, wobei etwas gesundes Gewebe eingeschlossen wird.
  4. Geben Sie das Exzisat in ein 2-mL-Röhrchen und schockfrieren Sie es in flüssigem Stickstoff für spätere molekularbiologische Analysen, oder lagern Sie es bei Raumtemperatur in 4 % gepuffertem Formaldehyd für die Histologie. Alternativ können Sie das Exzisat in zwei Stücke schneiden, um beide Analysen durchzuführen.
  5. Nach der Entnahme des Wundgewebes wird das Tier durch CO2-Inhalation oder eine alternative Methode gemäß der ethischen Genehmigung euthanasiert.
    ACHTUNG: CO2 verursacht Schmerzen, Leid und eine rasche Versauerung der Schleimhäute vor dem Bewusstlosigwerden. Verwenden Sie einen geregelt durchflussgeregelter Zähler, um die Luft in der Kammer zu verdrängen.

7. Histochemische Färbung: Wundfixierung, Einbettung und Schneiden

  1. Fixieren Sie die Wundgewebeproben 3 h lang bei Raumtemperatur in einer 4 %igen Formaldehydlösung und lagern Sie sie anschließend über Nacht bei 4 °C.
    ACHTUNG: Formaldehyd ist toxisch, ein starkes Sensibilisierungsmittel und ein bekanntes humanes Karzinogen. Handhaben Sie die Lösung stets in einem Abzug unter Verwendung persönlicher Schutzausrüstung.
  2. Waschen Sie die Proben zweimal mit PBS, jeweils 30 Minuten lang.
  3. Ersetzen Sie das PBS durch Ethanol (70 %) und lagern Sie die Proben bei 4 °C.
  4. Lagern Sie die Proben maximal 24–48 Stunden vor der Weiterverarbeitung, um einen Antigenverlust zu vermeiden, oder bis zu 1–2 Wochen für eine einfache histologische Charakterisierung.
  5. Spülen Sie die Proben gründlich unter fließendem Leitungswasser, um restliches Formaldehyd zu entfernen.
  6. Dehydrieren Sie das Gewebe in Ethanolbädern in der folgenden Reihenfolge: 70 % Ethanol für 20 min; zwei Wechsel mit 95 % Ethanol je 20 min; zwei Wechsel mit 100 % Ethanol je 20 min.
  7. Lagern Sie die Proben bei 65 °C im Paraffinbad.
  8. Geben Sie das geschmolzene Paraffin in die vorgesehene Form, platzieren Sie die Proben in der Mitte und lassen Sie es abkühlen und erstarren. Die Proben sollten senkrecht zur Oberfläche der Form ausgerichtet sein, um bei der Schnittführung alle Hautschichten sichtbar zu machen.
  9. Schneiden Sie den paraffin-eingebetteten Gewebeklotz mit einem Mikrotom in 5 μm dicken Schnitten und legen Sie diese in ein Wasserbad mit entionisiertem Wasser bei 39 °C.
  10. Überführen Sie die Schnitte auf Objektträger und trocknen Sie sie, damit das Gewebe an der Trägeroberfläche haftet. Die Objektträger können bei 4 °C für eine spätere Verwendung aufbewahrt oder unmittelbar für die histochemische Färbung weiterverarbeitet werden.

8. Hämatoxylin- und Eosinfärbung (HE-Färbung)

  1. Entfernen Sie das Paraffin von den Objektträgern auf einer Heizplatte bei 60 °C für 30 min, anschließend in drei Wechseln von Xylol (oder einem beliebigen Ersatz) je 5 min, gefolgt von einem Wechsel von PBS für 2 min.
    ACHTUNG: Xylol ist toxisch und hochentzündlich. Handhaben Sie die Lösung in einem Abzug unter Anwendung der üblichen persönlichen Schutzmaßnahmen.
  2. Führen Sie die Rehydratation in 100 % Ethanol, 96 % Ethanol und dann in dH2O jeweils für 5 min durch.
  3. Tragen Sie die Hämatoxylin-Färbung 5 min auf, danach waschen Sie 5 min unter fließendem Leitungswasser.
  4. Differenzieren Sie mit 0,3 % saurem Alkohol (0,3 % Salzsäure in 70 % Ethanol) für einige Eintauchvorgänge, danach waschen Sie 5 min unter fließendem Leitungswasser.
  5. Färben Sie mit Eosin Y (0,2 %) für 30 s, danach waschen Sie 5 min unter fließendem Leitungswasser.
  6. Dehydrieren Sie in 96 % Ethanol für 1 min, dann in 100 % Ethanol für 1 min.
  7. Geben Sie einige Tropfen Eindeckmedium auf, dann setzen Sie das Deckglas auf.
  8. Untersuchen Sie die Objektträger unter einem Lichtmikroskop und fertigen Sie digitale Aufnahmen an.

Ergebnisse

Die chirurgische Prozedur am Ausschneidewundmodell der Ratte dauerte bei effizienter Durchführung etwa 30 Minuten pro Tier. Die verschiedenen Schritte zur Erstellung des Modells, die Befestigung des O-Rings und die Wundabdeckung sind in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 2 zeigt den Wundheilungsfortschritt an den Tagen 7 und 14. Der Wundradius wurde in mm gemessen, und die Oberfläche wurde mit der Formel (Fläche = πr2) berechnet, wobei r am Tag 0 5 mm betrug. Der Fortschritt der Wundschließung wurde als Prozentsatz der nicht bedeckten Fläche im Verhältnis zur induzierten Wundfläche am Tag 14 dargestellt. Mithilfe der Fiji/ImageJ-Software wurde ein digitales Bild der Wundfläche analysiert, wobei die Skalierung anhand eines im Bild enthaltenen Lineals auf 10 mm kalibriert wurde (Abbildung 2D). Nachdem die Wundfläche umrissen und gemessen worden war, wurde die Fläche in mm2 angegeben. Die verbleibende Wundfläche am Tag 14 (29,4 % ± 10,1 %; n = 7) ist in Abbildung 3 dargestellt.

Die HE-Färbung der Hautwunde am Tag 14 ist in Abbildung 4 dargestellt. Die Schnitte zeigten, dass die Biopsien dem natürlichen Heilungsverlauf von Hautwunden von der Peripherie zum Zentrum folgten. Die Wundheilung blieb unvollständig, wobei das Zentrum keine normale, klassische mehrschichtige Anordnung mit einer dünnen epidermalen Schicht aufwies. Die Dermis zeigte eine starke Infiltration entzündlicher Zellen, was für den physiologischen Heilungsprozess wichtig ist. Insgesamt wurde das Modell von den Tieren gut vertragen, mit Hemmung der Hautkontraktion und unvollständiger, jedoch physiologischer Heilung.

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Abbildung 1: Anlage einer exzisionellen Wunde und Verbandanlage. (A) Exzisionelle Wunde an der dorsalen Fläche der Ratte angelegt, mit einem O-Ring, der um den Wundrand genäht ist. (B) Formbarer Hydrokolloid-Sperrring, der um den O-Ring herum angebracht wird. (C) Zwei Schichten transparenter, adhäsiver Folienverbands angebracht über dem Hydrokolloid-Sperrring. (D) Schaumstoffverband platziert über dem transparenten, adhäsiven Folienverband. (E) Elastisches Haftband angebracht, um den Verband zu fixieren. (F–H) Ein tubulärer Fixierverband wird um die Ratte gelegt, gefolgt von einem Fixierverband und chirurgischem Klebeband, das in einer Doppel-Schulter-Konfiguration angeordnet ist, um den Verband zu sichern. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Repräsentative Bilder der Wundheilung. (A) Repräsentatives Wundbild am Tag 7. (B–D) Repräsentative Wundbilder am Tag 14, die die Wunde mit eingesetztem O-Ring (B) und nach Entfernung des O-Rings (C,D) zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Quantifizierung der Wundfläche am Tag 14. Prozentsatz der verbleibenden Wundfläche am Tag 14, der die Verringerung der Wundgröße zeigt. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt (n = 7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Histologische Beurteilung der Wundheilung am Tag 14. Repräsentative mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbte Schnitte des Wundgewebes bei 10×, 20× und 40× Vergrößerung. Im Wundzentrum zeigte sich eine unvollständige Reepithelialisierung, während an den Wundrändern eine physiologische epidermale Heilung zu beobachten war. Die Dermis enthielt zahlreiche entzündliche Zellen, die mit der normalen Wundheilungsreaktion übereinstimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Schlecht heilende Hautwunden sind Wunden, die nicht innerhalb des erwarteten Zeitrahmens die normalen Heilungsphasen durchlaufen, und können Folge von chirurgischen Eingriffen, Traumata oder allergischen Reaktionen sein, zusätzlich zu zahlreichen anderen Gesundheitsproblemen wie vaskulärer Insuffizienz, Diabetes und Adipositas14. Trotz der Verfügbarkeit mehrerer Behandlungsmodalitäten heilen viele Patienten nicht ausreichend ab. Die Erforschung neuer therapeutischer Ansätze wie zellbasierte Therapien, Chemikalien, Pflanzenextrakte und neu entdeckte Verbindungen ist entscheidend, um neuartige Behandlungsstrategien zu identifizieren. Das Modell kann auf eine breite Palette von Wundheilungsstudien angewendet werden. Die Etablierung eines standardisierten Protokolls zur Prüfung von Arzneimitteln, Zellen und biologischen Therapien könnte die präklinische Forschung zur Wundheilung erleichtern. Das hier beschriebene Exzisionswundmodell behebt die wesentlichen Einschränkungen des Rattenhautwundmodells in der Forschung, nämlich die Hautkontraktion und die Wundabdeckung.

Titan-Spangen werden häufig verwendet, um die Wundkontraktion in murinen exzisionellen Wundmodellen zu verringern; ihre Anwendung ist jedoch nicht frei von Einschränkungen. Die Steifigkeit der Spange verändert das mechanische Umfeld der Wunde und des umgebenden Gewebes, was zelluläre Reaktionen, Entzündungen und die Remodellierung der Matrix beeinflussen kann. Dadurch erfolgt die Heilung unter Bedingungen, die sich von denen in unbehandelter Nagetierhaut unterscheiden. Obwohl die Einschränkung der Kontraktion die Vergleichbarkeit mit dem menschlichen Wundverschluss verbessert, können die durch die Spange auferlegten mechanischen Zwänge auch Artefakte hervorrufen, die den Heilungsprozess beeinflussen, und sollten daher bei der Interpretation experimenteller Ergebnisse berücksichtigt werden15.

Zu diesem Zweck wurden im Modell NBR-O-Ringe verwendet, um die Hautschrumpfung einzuschränken, und am ursprünglichen Wundrand fixiert. Die Ringe wurden von den Tieren gut vertragen und während der gesamten 14-tägigen Versuchsdauer an ihrer Position gehalten. Obwohl bei keinem Tier eine nennenswerte Wundschrumpfung qualitativ beobachtet wurde, könnten Zukunftsstudien die Beurteilung der Wundschrumpfung durch eine Markierung des Wundrands mit Tätowierfarbe oder andere quantitative Methoden verbessern. Daher kann das Tätowieren als optionaler Schritt in diesem Protokoll betrachtet werden.

Die Anwendung von Verbänden schützt Wunden vor Kontamination und Infektion, während gleichzeitig die Behandlung an der Wundstelle aufrechterhalten wird, was für Modelle der Hautwundheilung entscheidend ist. Es ist jedoch nicht ungewöhnlich, dass einige Tiere verschiedene Arten von Verbänden entfernen. Ratten pflegen und manipulieren häufig den Wundbereich, was trotz der Verwendung von Klebefolien oder sekundären Befestigungsmethoden zur Verschiebung oder vollständigen Entfernung des Verbands führen kann. Der Verlust der Abdeckung durch den Verband kann das Wundmilieu verändern, die Wirkstoffzufuhr beeinträchtigen und die Variabilität zwischen den Tieren erhöhen16. In dem hier vorgestellten Modell blieb der Verband bis zu sieben Tage lang intakt, ohne dass er von den Tieren entfernt oder beschädigt wurde. Bei keinem der Versuchstiere zeigten sich Anzeichen einer Infektion der Hautwunde. Es empfiehlt sich, die Verbände wöchentlich zu wechseln, da die Passform enger wird, wenn die Tiere wachsen und an Gewicht zunehmen. Es sollte darauf geachtet werden, eine sichere Befestigung mit der Beweglichkeit der Tiere in Einklang zu bringen, wobei sichergestellt werden muss, dass der Verband nicht zu locker sitzt und von den Tieren abgenommen werden kann.

Das Protokoll ist flexibel und anpassbar. Obwohl wir die Inhalation von Isofluran aufgrund der schnellen Erholung und hohen Sicherheit empfehlen, können Forscher alternativ eine injizierbare Anästhesie wie Ketamin/Xylazin verwenden, falls kein Isofluran-Vaporisator verfügbar ist. Obwohl in dieser Studie nur männliche Ratten verwendet wurden, ist das Protokoll gleichermaßen auf weibliche Ratten anwendbar.

Wir empfehlen die analgetische Gabe von Buprenorphin in Kombination mit Carprofen, da dies die Schmerzlinderung verstärkt. Buprenorphin allein kann aufgrund seiner relativ langen Wirkdauer ebenfalls eine ausreichende postoperative Analgesie gewährleisten. Im Vergleich zu anderen Opioiden hat dieses Medikament nur minimale Auswirkungen auf die Immunfunktion, was im Hinblick auf den Entzündungsprozess einen Vorteil für die Wundheilung darstellt17. Nichtsteroidale Antiphlogistika, die Entzündungen unterdrücken und Schmerzen reduzieren, sollten bei der Untersuchung von Entzündungen vermieden werden. Obwohl in dieser Studie pro Tier eine Wunde angelegt wurde, könnten die Forscher zusätzliche Wunden mithilfe desselben Protokolls erzeugen, sofern dies ihrer ethischen Genehmigung und dem experimentellen Design entspricht. Aspekte des Tierschutzes und die Grundsätze der 3R sollten sorgfältig berücksichtigt werden. Die Forscher müssen die 3R-Grundsätze (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) beachten und den Tierschutz respektieren, wenn tierexperimentelle Modelle verwendet werden. Chirurgische Eingriffe müssen den Leitlinien entsprechen und das genehmigte Tierversuchsprotokoll strikt einhalten. In dieser Studie wurde die Wundheilung durch Messung der Wundfläche und histologische Beurteilung evaluiert, wobei die Reepithelialisierung einen Bestandteil der Heilungsreaktion darstellt. Die Präsenz der Nähte in Bezug auf die Ringfixierung kann die lokale Heilung beeinträchtigen. Die Anzahl der Nähte muss zwischen den Tieren konstant sein. Bei der Beurteilung der Wundfläche sollten alle offenen Bereiche, einschließlich der Nahtstellen, einbezogen werden18. Dieses Modell kann weiterentwickelt werden, um verschiedene zugrundeliegende Erkrankungen im Zusammenhang mit Hautwunden einzubeziehen, wie beispielsweise Ischämie, Diabetes und Alterung. Die wesentlichen Einschränkungen dieser Studie waren das Fehlen einer nicht geschienten Kontrollgruppe, das Fehlen einer quantitativen Beurteilung der Wundkontraktion sowie die begrenzten quantitativen biologischen Endpunkte über die Wundflächenmessung und die deskriptive Histologie hinaus. Während der Entwicklung dieses Modells traten verschiedene technische Herausforderungen und Probleme auf. Eine korrekte Passform der Schutzweste/der Wundauflage ist entscheidend für das Wohlergehen der Tiere und einen erfolgreichen Heilungsverlauf. Eine zu lose Auflage kann vom Tier nach der Narkoserecovery entfernt werden, während eine zu enge Auflage die Bewegung einschränken, die Durchblutung beeinträchtigen oder die Atmung beeinflussen kann. Zwischen der Auflage und der Haut sollte ausreichend Platz für einen Finger (bzw. einen kleinen Finger bei kleineren Ratten) verbleiben. Die Tiere sollten täglich überwacht werden, und die Auflage sollte angepasst werden, wenn Anzeichen von Unbehagen, eingeschränkter Mobilität oder abnormer Körperhaltung beobachtet werden. Das postoperative Schmerzmanagement kann je nach Tier variieren, da individuelle Unterschiede in der analgetischen Empfindlichkeit bestehen. Die Tiere sollten regelmäßig auf schmerzbedingte Symptome wie Zusammenkauern, verminderte Aktivität, Appetitverlust und Gewichtsabnahme überprüft werden. Bei Bedarf sollte gemäß den institutionellen Richtlinien zusätzliche Analgesie verabreicht werden. Eine konsistente Fixierung des Rings ist entscheidend, um eine Wundkontraktion zu verhindern. Die 8–12 einfachen Einzelknopfnähte sollten gleichmäßig um den Ring verteilt sein, um die Spannung gleichmäßig zu verteilen und ein Anheben oder Verformen zu vermeiden. Jeder Naht sollte mit einem Chirurgenknoten gesichert werden, um ein Lösen während der Erholungsphase zu minimieren. Schließlich empfehlen wir, innerhalb einer Studie Ratten desselben Stammes, Alters, Körpergewichts und Geschlechts zu verwenden, um Variationen zu minimieren. Außerdem sollte derselbe erfahrene Forscher alle chirurgischen Eingriffe durchführen. Um Verzerrungen zu vermeiden, empfehlen wir die Anwendung einer Doppelverblindung bei histologischen und molekularen Analysen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

The authors would like to acknowledge the Region Östergötland for funding this research. The authors thank Mr. Anders Delleskog at CBR, Linköping University, for suggestions, support, and assistance in establishing the animal model. The authors also thank Dr. Maria Ntzouni at the Core Facility, Linköping University, for support and guidance in skin tissue embedding, sectioning, and HE staining. Special thanks to Sallam Abdallah at the R&D unit for skin and cultured cells, Linköping University, for skin sample preparation and HE staining.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BuprenorphinSalfarm Scandinavia451790              Konz. 0,3 mg/mL
CarprofenZoetis Animal Health191380              Rimadyl 50 mg/mL
Eakin-DichtungSwemed2076152              Dicke 3 mm
Einbettungsstation Leica BiosystemsEG1150 H&C              
Eosin Histolab1650              0,2 % Farblösung
absoluter EthanolSolveco1015              analytische Qualität
FixierverbandSwemed2048934              4 cm × 4 m PA/Viskose
FormaldehydHistolab2176              4 % in PBS, pH 7,2–7,4
HaarschneiderSwevetF95000              Schneidlänge: 0,5 mm
HämatoxylinHistolab1800              Harris HTX
Histolab-ClearHistolab14250              Xylol-Ersatz
IsofluranVM Pharma448210              Attane vet 1000 mg/g
LekotapeSwemed2056774
MepilexSwemed2059125              7,5 × 8,5 cm 
Mepore-FolieSwemed2057753               6 × 7 cm mit Rahmen
Chirurgisches Micropore-Pflaster Swemed2063856               1,2 cm × 9,1 m 
MikrotomThermo Fisher Scientific387861               Microm HM355S
Einbettungsmedium Histolab00840-05               Pertex
O-RingRuilogodB0B1TRQBRT               11 mm Innendurchmesser, 1 mm Breite
Nahtmaterial (Ethilon 4-0)Scandivet21274-A               Nicht resorbierbares Polyamid     
Gewebedehydratation Leica Biosystems Leica TP1020               
Tubifast 2-Wege-StretchSwemed2069292               7,5 cm × 10 m PES/PA

Referenzen

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