Methodenartikel

Präzise Ligation der linken anterioren absteigenden Koronararterie unter Verwendung anatomischer Orientierungspunkte in einem murinen Myokardinfarktmodell

55 Ansichten

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DOI:

10.3791/72336

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18. August 2026

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1Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 2National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 3Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education & Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province (Collaborative Innovation Center for Prevention of Cardiovascular Diseases), 4School of Integrated Traditional and Western Medicine, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll induziert einen Myokardinfarkt bei Mäusen durch eine permanente Ligatur der linken abzweigenden Koronararterie, wobei der Sulcus interventricularis anterior als reproduzierbares Oberflächenmerkmal für eine präzise Nahtplatzierung dient. Der Infarkt wird mittels Elektrokardiographie, Echokardiographie, histologischer Färbung und Analyse von Serum-Biomarkern validiert.

Zusammenfassung

Die dauerhafte Ligatur der Arteria coronaria sinistra (LAD) ist die am häufigsten verwendete Methode zur Erzeugung von Mausmodellen für Myokardinfarkt (MI) in der präklinischen kardiovaskulären Forschung. Bei herkömmlichen Protokollen wird der Ligatursitz jedoch typischerweise 1–2 mm unterhalb des linken atrialen Anhängsels platziert, einem anatomischen Merkmal, das während der Operation oft nur schwer zuverlässig identifizierbar ist. In Kombination mit der erheblichen interindividuellen Variabilität der koronaren Anatomie bei Mäusen führt dies häufig zu ungenauer Lokalisation der LAD, inkonsistenten Ligatursitzen und einer verminderten Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Operateuren. Um diese Einschränkungen zu beheben, führt dieses Protokoll die vordere interventrikuläre Sulcus (AIS) als Orientierungspunkt für die LAD-Ligatur ein. Die AIS ist eine flache Oberflächennut, die direkt unter dem Mikroskop sichtbar ist und unter der die LAD unmittelbar verläuft. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden bietet sie eine stabile anatomische Referenz, die eine konsistentere Auswahl des Ligatursitzes ermöglicht und für unerfahrene Operateure leichter zu identifizieren ist. Das Protokoll kombiniert eine standardisierte Inhalationsanästhesie mit Isofluran mit nichtinvasiver Trachealintubation und validiert den Myokardinfarkt mittels Elektrokardiographie, Echokardiographie, enzymgekoppelter Immunadsorption (ELISA), histopathologischer Färbung und dreidimensionaler Bildgebung der Koronararterien. Dieses Protokoll stellt eine zuverlässige und reproduzierbare experimentelle Methode zur Induktion eines Myokardinfarkts bei Mäusen bereit, um die pathophysiologischen und immunologischen Veränderungen nach einem Infarkt zu untersuchen.

Einleitung

Der Myokardinfarkt (MI), eine der Hauptursachen für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität weltweit, stellt eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar1. Geprägt durch ein plötzliches Auftreten, einen kritischen klinischen Verlauf und eine hohe Letalität, wird MI hauptsächlich durch eine thrombotische Verschlussung der Koronararterien verursacht und kann zu einer tiefgreifenden myokardialen Ischämie, anschließender Nekrose der Kardiomyozyten sowie einer Kaskade von Komplikationen führen, darunter Arrhythmien, Herzinsuffizienz und plötzlicher Herztod2. Trotz bemerkenswerter Fortschritte in der klinischen Kardiologie behindert der eingeschränkte Zugang zu menschlichem Myokardgewebe weiterhin die Untersuchung der zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen des MI sowie die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien3. Daher sind verlässliche, reproduzierbare und klinisch relevante in vivo-Tiermodelle, die die klinischen Merkmale und den Krankheitsverlauf des MI genau nachbilden, nach wie vor unerlässlich für mechanistische Studien und die präklinische Bewertung therapeutischer Ansätze.

Seit Johns und Olson 1954 erstmals ein murines MI-Modell etablierten, wurden die Methoden zur Induktion eines Myokardinfarkts (MI) bei Mäusen kontinuierlich verfeinert4. Die dauerhafte Ligatur der linken absteigenden Koronararterie (LAD) unter direkter mikroskopischer Sichtung hat sich zur am weitesten verbreiteten Technik entwickelt, da sie zentrale pathologische Merkmale des menschlichen Myokardinfarkts reproduziert, einschließlich lokalisierter myokardialer Ischämie, myokardialer Nekrose und ventrikulärer Remodeling-Prozesse nach dem Infarkt5. Die konventionelle LAD-Ligatur erfordert jedoch erhebliche mikrochirurgische Fachkenntnisse, die üblicherweise nur durch umfangreiche Schulung erworben werden, was die konsistente Durchführung und Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Operateuren und Laboren einschränkt6. Zudem tragen intraoperative und postoperative Komplikationen – wie Blutungen, pulmonale Verletzungen oder Einstürze, falsche Platzierung der Ligatur sowie mechanische Gewebeschäden infolge unzureichender Beatmung – zu einer vergleichsweise hohen perioperativen Mortalität bei und beschränken dadurch die breite Anwendung dieses Modells7. Als Reaktion auf diese Einschränkungen stellten Gao et al. eine modifizierte Technik vor, bei der die LAD-Ligatur durch Herzeversion erfolgt, wodurch der chirurgische Eingriff vereinfacht und die technische Hürde für die Erstellung des Modells gesenkt wird8. Weitere experimentelle Ansätze, darunter die koronare Kryoverletzung und die pharmakologische Induktion myokardialer Schädigungen, wurden ebenfalls für spezifische Forschungszwecke entwickelt9,10. Dennoch bleibt die dauerhafte LAD-Ligatur unter direkter Sicht die bevorzugte Methode, da sie die wichtigsten pathophysiologischen Merkmale des menschlichen Myokardinfarkts am besten nachbildet und gleichzeitig eine kontrollierte Induktion von Infarktgröße und -lokalisation ermöglicht.

Trotz ihrer weiten Verbreitung ist die konventionelle LAD-Ligatur durch eine variable Identifizierung der Ligaturstelle, Verfahrensinhomogenitäten, eine vergleichsweise hohe perioperative Mortalität sowie eine interlaboratorische Variabilität in der Reproduzierbarkeit begrenzt, was alles die Zuverlässigkeit und Vergleichbarkeit experimenteller Ergebnisse beeinträchtigen kann11. Das übergeordnete Ziel des vorliegenden Protokolls besteht darin, eine stärker standardisierte und reproduzierbare Methode für die permanente LAD-Ligatur bei Mäusen zu etablieren, indem der vordere interventrikuläre Sulcus (AIS) als äußerer anatomischer Orientierungspunkt zur Gefäßlokalisation verwendet wird. Anstatt die Ligaturstelle anhand eines festen Abstands unterhalb des linken Vorhofanhangs abzuschätzen, nutzt dieses Protokoll den AIS – eine flache Oberflächennut, die unter mikroskopischer Sicht direkt sichtbar ist und über der LAD verläuft – als stabile anatomische Referenz zur Führung der Ligatur. Im Vergleich zur herkömmlichen, an Orientierungspunkten basierenden Schätzung soll dieser Ansatz eine konsistentere Auswahl der Ligaturstelle ermöglichen, die vom Operateur abhängige Variabilität verringern und die Zugänglichkeit für weniger erfahrene Chirurgen verbessern, wobei die Kompatibilität mit standardmäßigen murinen MI-Verfahren erhalten bleibt. Dieses Protokoll eignet sich daher für Forscher, die eine reproduzierbare chirurgische Methode zur Erzeugung permanenter MI-Modelle für Studien zu myokardialen Schäden, ventrikulärer Remodeling, Entzündungen und verwandten kardiovaskulären Krankheitsmechanismen suchen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung der Ethikkommission des Tierversuchszentrums der Southwest Medical University durchgeführt (Genehmigungsnummer: SWMU20240146). Männliche C57BL/6J-Mäuse (spezifisch pathogenfrei [SPF]), 8–10 Wochen alt und mit einem Gewicht von 20,0 ± 3,0 g, wurden in dieser Studie verwendet. Akklimatisieren Sie die Mäuse 1 Woche lang unter standardisierten Laborbedingungen (22 °C ± 2 °C; 12-Stunden-Hell-/12-Stunden-Dunkel-Wechsel) vor Beginn der Experimente.

1. Vorbereitung vor der Operation

  1. Bereiten Sie am Tag der Operation alle chirurgischen Instrumente vor und sterilisieren Sie sie, einschließlich Pinzette, Augenscheren, einer Nadelhalterzange, eines mikrochirurgischen Hämorrhagieklemme, eines V-förmigen Augenlidretraktors, 3/8-Kreis-7-0-Nylonnaht mit Nadel, 6-0-Nylonnaht und 5-0-Nylonnaht. Autoklavieren Sie alle metallischen Instrumente bei 121 °C für 20 Minuten vor dem Eingriff und sterilisieren Sie sie zwischen den Tieren erneut mithilfe eines Glasperlensterilisators (250 °C für 15 s), gefolgt von einer Abkühlung auf einem sterilen Unterlage. Verwenden Sie Nähte aus versiegelten sterilen Verpackungen.
  2. Richten Sie zwei getrennte Arbeitsbereiche ein, um die aseptische Technik sicherzustellen. Bereiten Sie einen Bereich mit Pinzette, einem Intubationskit für Mäuse und einer Anästhesieanlage vor und richten Sie einen zweiten sterilen chirurgischen Bereich mit sterilisierten Instrumenten, Wattestäbchen, Povidon-Jod und steriler Gaze ein.
  3. Tragen Sie ein Enthaarungsmittel 1 Minute lang auf den thorakalen Bereich auf. Entfernen Sie das Mittel und die Haare vorsichtig mithilfe steriler Gaze, die mit steriler Wasser- oder Kochsalzlösung angefeuchtet wurde.
    1. Die Enthaarung allein stellt keine definitive chirurgische Hautvorbereitung dar. Führen Sie die definitive aseptische Hautdesinfektion und die sterile Abdeckung erst durch, nachdem die Maus anästhesiert, intubiert und auf dem Operationsplatz fixiert wurde, unmittelbar vor dem Hautschnitt (Schritt 2.6).
  4. Verabreichen Sie Cefazolin (300 mg/kg) 1 Stunde vor der Operation intraperitoneal. Lösen Sie Cefazolin-Natrium für die Injektion in steriler 0,9%iger Kochsalzlösung zu einer Arbeitskonzentration von 30 mg/mL auf und verabreichen Sie etwa 0,2 mL pro 20 g Körpergewicht, um die Ziel-Dosis zu erreichen. Setzen Sie die Gabe einmal täglich über 5 aufeinanderfolgende Tage nach der Operation fort.
    HINWEIS: Verabreichen Sie in diesem Protokoll keine systemischen oder topischen pharmakologischen Hämostatika. Erzielen Sie die intraoperative Blutstillung durch sanften, kontinuierlichen Druck mit einem sterilen Wattestäbchen für 10–30 s oder bis die Blutung gestoppt ist.

2. Einleitung der Anästhesie und Intubation der Luftröhre

  1. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer (16 × 10 × 11 cm), die mit dem Anästhesiegerät verbunden ist. Stellen Sie die Trägergasflussrate auf 0,5 L/min ein und induzieren Sie die Anästhesie mit 3,5 %–4,0 % Isofluran.
    ANMERKUNG: Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie durch das Fehlen des Zehe-zurückzieh-Reflexes. Unter diesen Einstellungen erreicht die Maus in der Regel innerhalb von 2–4 min eine chirurgische Anästhesietiefe.
  2. Positionieren Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage auf der murinen Trachealintubationsplattform. Hängen Sie die Maus durch Einhängen der oberen Schneidezähne in das Gummiband der Plattform so auf, dass Kopf und Hals in einem Winkel von etwa 45° gestreckt sind. Richten Sie die orale, pharyngeale und laryngeale Achse aus, um die Stimmlippenöffnung direkt sichtbar zu machen.
  3. Führen Sie die orotracheale Intubation durch
    1. Führen Sie die orotracheale Intubation unter direkter Laryngoskopie ohne Tracheotomie durch, um eine kontrollierte mechanische Beatmung einzurichten. Verwenden Sie einen intravenösen Katheter mit 20 G (Außendurchmesser etwa 0,9 mm; Länge etwa 15 mm) als endotrachealen Schlauch.
    2. Öffnen Sie den Mund und schieben Sie die Zunge vorsichtig mit einer Pinzette zur Seite. Führen Sie die Klinge eines Kleintier-Laryngoskops entlang des Zungendorsals ein und drücken Sie die Zungenbasis herab.
    3. Schieben Sie das Laryngoskop vor, bis die Epiglottis sichtbar ist. Heben Sie das Laryngoskop entlang der Achse des Griffs nach oben und vorne an, um die Epiglottis anzuheben und die V-förmige glottische Öffnung sowie die blassen Stimmbänder freizulegen.
    4. Schieben Sie den Katheter während der Inspiration durch die offene Glottis vor, während Sie die Stimmbänder direkt im Blick behalten. Entfernen Sie das Laryngoskop, nachdem der Katheter durch die Glottis vorgerückt ist.
    5. Schieben Sie den Katheter bis zu einer Tiefe von etwa 5–7 mm vor. Ziehen Sie den Versteifungsdraht zurück und verbinden Sie den Katheter mit dem Beatmungsgerät.
      ANMERKUNG: Bestätigen Sie eine korrekte Position des endotrachealen Schlauchs durch Beobachtung einer symmetrischen, beidseitigen Brustwandbewegung, die mit der Beatmung synchronisiert ist. Falls die Brustwandbewegung minimal ist und stattdessen rhythmische Bauchbewegungen auftreten, begleitet von einer zunehmenden Aufhellung der Anästhesie, ziehen Sie den Katheter aus der Speiseröhre heraus und wiederholen Sie die Intubation.
    6. Falls die Glottis nicht sichtbar ist, ziehen Sie das Laryngoskop zurück, positionieren Sie die Maus erneut auf der Intubationsplattform mit um etwa 45° gestrecktem Kopf und Hals, richten Sie die orale, pharyngeale und laryngeale Achse erneut aus, entfernen Sie oropharyngeale Sekrete mit einem sterilen Wattestäbchen und wiederholen Sie die Laryngoskopie. Falls Anzeichen für ein Aufwachen aus der Anästhesie erkennbar sind, stellen Sie die Maus erneut in die Induktionskammer zurück, vertiefen Sie die Anästhesie und wiederholen Sie anschließend den Intubationsversuch.
    7. Beenden Sie den Eingriff, falls bei der Maus Zyanose, eine Blutung im Kehlkopfbereich oder anhaltende Apnoe auftritt. Stellen Sie die Gabe von Isofluran ein und legen Sie die Maus auf eine temperaturgeregelte Heizplatte (37 °C), bis sie sich vollständig erholt hat.
    8. Fahren Sie nicht mit der Thorakotomie fort, falls die tracheale Intubation nicht erfolgreich war. Verschieben Sie den Eingriff auf einen späteren Zeitpunkt oder schließen Sie das Tier aus der Studie aus und dokumentieren Sie dies als Verfahrensfehler.
      ANMERKUNG: Wiederholte Intubationsversuche können zu einem Larynxödem führen und damit das Risiko einer postoperativen Atemnot erhöhen. In den meisten Fällen gelingt die Intubation innerhalb der ersten beiden Versuche nach direkter Sichtung der Glottis. Die Beherrschung der orotrachealen Intubation erfordert Übung und Vertrautheit mit der Technik.
  4. Geben Sie Luft als Trägergas mit einer Flussrate von 0,5 L/min ab und erhalten Sie die Anästhesie mit 1,5 %–2,0 % Isofluran aufrecht. Stellen Sie das Beatmungsgerät auf eine Atemfrequenz von 130 Atemzügen/min, ein Atemzugvolumen von 2 mL und ein Inspirations- zu Exspirations-Verhältnis von 5:4 ein.
    ANMERKUNG: Das am Beatmungsgerät eingestellte Atemzugvolumen liegt über dem theoretischen, aus dem Körpergewicht geschätzten Wert, da es das komprimierbare Volumen des Beatmungssystems und den Totraum des endotrachealen Schlauchs ausgleicht. Bewerten Sie die Beatmung während des gesamten Eingriffs, indem Sie die Maus auf Zyanose sowie auf Anzeichen einer Barotrauma, einschließlich Pneumothorax und subkutanem Emphysem, überwachen.
    1. Überwachen Sie die Anästhesietiefe kontinuierlich während des gesamten Eingriffs. Bewerten Sie das Atemmuster und den Zehe-zurückzieh-Reflex alle 2 min. Überwachen Sie die Herzfrequenz kontinuierlich mittels Elektrokardiogramm (EKG) und passen Sie die Isoflurankonzentration so an, dass eine Herzfrequenz von 400–500 Schlägen/min aufrechterhalten wird; eine Isoflurankonzentration von 1,5 %–2,0 % ist in der Regel ausreichend. Achten Sie während des Eingriffs auf spontane Atemanstrengungen gegen das Beatmungsgerät, auf Schnurrhaarbewegungen und auf Farbveränderungen der Schleimhäute.
    2. Erhöhen Sie die Isoflurankonzentration in 0,5 %-Schritten, maximal bis zu 3,0 %, falls der Zehe-zurückzieh-Reflex erneut auftritt, Schnurrhaarbewegungen beobachtet werden oder spontane Atemanstrengungen gegen das Beatmungsgerät erfolgen. Verringern Sie die Isoflurankonzentration in 0,5 %-Schritten, minimal bis zu 1,0 %, falls die Herzfrequenz unter 350 Schläge/min fällt. Unterbrechen Sie den chirurgischen Eingriff, sobald diese Anzeichen auftreten, setzen Sie die Überwachung der Herzfrequenz, des Atemmusters, der Schleimhautfarbe und der Schnurrhaarbewegungen fort und setzen Sie den Eingriff erst wieder fort, nachdem sich die physiologischen Parameter stabilisiert haben.
  5. Kippen Sie die Maus zur rechten Seite, sodass die linke Seite oben liegt, um die linke Thoraxwand freizulegen. Sichern Sie die vier Gliedmaßen und den Schwanz mit Klebeband auf der Plattform.
  6. Desinfizieren Sie die Operationsstelle durch dreimaliges Auftragen von Povidon–Jod. Verwenden Sie für jede Applikation einen neuen, sterilen Wattestäbchen, beginnend an der geplanten Inzisionsstelle und in konzentrischen Spiralen nach außen bis etwa 1 cm jenseits der geplanten Inzision in alle Richtungen. Entsorgen Sie den Wattestäbchen nach jeder Applikation und tauchen Sie keinen benutzten Wattestäbchen erneut in die Mitte des Operationsfelds. Lassen Sie die letzte Applikation vollständig an der Luft trocknen, legen Sie dann ein steriles Tuch an, wobei nur das Operationsfeld freigelegt bleibt, bevor Sie den Hautschnitt durchführen.

3. Thorakotomie und Darstellung des Herzens

HINWEIS: Der gesamte chirurgische Arbeitsablauf, einschließlich der Tierpositionierung, Thorakotomie, Exposition des Herzens, Ligatur der LAD-Koronararterie, thorakalen Naht und postoperativen Erholung, ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt.

Herz-Anatomie-Diagramm mit Ligationsstelle und Koronararterien; Bilder des Operationsgebiets.
Abbildung 1: Anatomische Lokalisation der Ligationsstelle der linken vorderen abzweigenden Koronararterie unter Verwendung des vorderen interventrikulären Sulcus. (A) Ventrikulare Ansicht des freigelegten murinen Herzens vor der Ligatur, mit Darstellung des vorderen interventrikulären Sulcus (AIS). (B) Ansicht desselben Bereichs nach Ligatur der linken vorderen abzweigenden (LAD) Koronararterie; der markierte Bereich zeigt die Ligationsstelle. (C) Schematische Darstellung der räumlichen Beziehung zwischen dem AIS und den Koronararterien. Die LAD verläuft entlang des AIS, und die Ligationsstelle befindet sich im oberen Drittel des Sulcus. RCA, rechte Koronararterie; LCA, linke Koronararterie; LCX, linke circumflexe Koronararterie. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.

Chirurgische Vorgehensweise an einer Maus, Herzfreilegung, experimentelle Forschung, Schritt-für-Schritt-Diagramm.
Abbildung 2: Chirurgisches Vorgehen zur ligatur der linken absteigenden Koronararterie unter Führung entlang der vorderen interventrikulären Sulcus bei Mäusen. (A) Positionieren und fixieren Sie die anästhetisierte Maus mit enthaarter linker Thoraxregion. (B) Führen Sie einen Hautschnitt über der linken Thoraxwand durch. (C) Trennen Sie die Brustmuskulatur und identifizieren Sie den geeigneten Interkostalraum für die Thorakotomie. (D,E) Setzen und positionieren Sie den Hohlfeldhalter, um den Interkostalraum zu weiten und das Operationsfeld freizulegen. (F) Sichtbarmachen des freigelegten Herzens und Identifikation der vorderen interventrikulären Sulcus (AIS). (G) Führen Sie eine 7-0-Nylonnaht über die AIS und unterhalb der linken absteigenden Koronararterie (LAD) hindurch. (H) Fixieren Sie die Naht, um eine dauerhafte LAD-Ligatur zu erzielen. (I) Entfernen Sie den Hohlfeldhalter und verschließen Sie die Thoraxwand. (J,K) Verschließen Sie nacheinander die Muskel- und Hautschichten. (L) Lassen Sie die Maus nach der Operation unter Wärmezufuhr aus der Narkose aufwachen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Erstellen Sie mit Augenscheren einen 1 cm langen, longitudinalen Hautschnitt an der linken Thoraxwand, parallel zur Längsachse des Brustbeins und etwa 2 mm lateral zur linken Brustbeinkante. Legen Sie die darunterliegenden Brustmuskeln frei.
  2. Trennen Sie mit feinen Pinzetten die Muskeln M. pectoralis major und M. pectoralis minor stumpf entlang ihrer Faserführung. Retrahieren Sie die Muskeln lateral, um die Rippen und die Interkostalräume freizulegen, und vermeiden Sie es, die Muskeln zu schneiden, um Blutungen zu minimieren.
  3. Identifizieren Sie den geeigneten Interkostalraum, bevor Sie die Brusthöhle öffnen. Lokalisieren Sie die Arteria intercostalis anterior, einen Ast der Arteria thoracica interna, die innerhalb eines Interkostalraums parallel zu den Rippen verläuft, und identifizieren Sie den dritten Interkostalraum unmittelbar kranial zu der am deutlichsten sichtbaren Arterie im vierten Interkostalraum.
  4. Falls die Arteria intercostalis anterior nicht deutlich sichtbar ist, tasten Sie die erste Rippe ab und zählen kaudal, um den Zwischenraum zwischen der dritten und vierten Rippe zu identifizieren. Stellen Sie sicher, dass der ausgewählte Interkostalraum eine direkte, ungehinderte Sicht auf das linke Vorhofohr und die vordere freie Wand des linken Ventrikels bietet, bevor Sie fortfahren.
    HINWEIS: Eine genaue Identifizierung des dritten Interkostalraums ist entscheidend, da ein falscher Thorakotomieort die Sicht auf das Herz beeinträchtigen und das Verfahren gefährden kann.
  5. Führen Sie eine Thorakotomie durch den linken dritten Interkostalraum durch. Weiten Sie den Interkostalraum vorsichtig mit einem V-förmigen Augenlidretraktor, bis das linke Vorhofohr und das obere Drittel des linken Ventrikels innerhalb des Operationsfelds deutlich freigelegt sind.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt ist das Herz noch von dem Perikard bedeckt; daher kann die AIS nicht zuverlässig identifiziert werden. Identifizieren Sie die AIS erst nach Öffnung des Perikards (Schritt 3.6), wie in den Schritten 4.2–4.3 beschrieben.
  6. Fassen Sie das Perikard vorsichtig mit einem Paar feiner Pinzetten an und heben Sie es vom Myokard ab. Verwenden Sie ein zweites Paar feiner Pinzetten, um das Perikard langsam aufzureißen und das Herz vollständig freizulegen.

4. Orientierungspunkt-gestützte Ligatur des linken vorderen Abstiegszweigs der Koronararterie

  1. Führen Sie einen 6-0-Nylon-Faden durch die Brustwand ein und üben Sie leichten Zug aus, um das Operationsfeld zu vergrößern. Legen Sie die AVS vollständig frei, bevor Sie die Ligationsstelle identifizieren (Abbildung 1A).
  2. Identifizieren Sie die AVS als flache, schräg vom Herzbasisende zur Herzspitze verlaufende Furche, die die Oberflächengrenze zwischen linkem und rechtem Ventrikel markiert Abbildung 1C. Unter dem Mikroskop erscheint sie als annähernd kreisförmige Vertiefung, die sich etwa 1–2 mm unterhalb des unteren Randes des linken Vorhofohrs befindet.
  3. Falls die AVS schwer zu erkennen ist, tupfen Sie die epikardiale Oberfläche vorsichtig mit einem mit warmer Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen ab. Untersuchen Sie das Operationsfeld erneut unter dem Mikroskop, um die Furche deutlicher zu erkennen.
    ANMERKUNG: Unter dem Operationsmikroskop ist die AVS eine leicht erkennbare, flache Furche, die die anatomische Grenze zwischen den Ventrikeln darstellt, wobei die vordere absteigende Koronararterie (LAD) direkt darunter verläuft. Bleibt die AVS nach dem Abtupfen weiterhin undeutlich, überprüfen Sie zunächst, ob die Thorakotomie eine ausreichende Exposition ermöglicht. Identifizieren Sie anschließend die LAD direkt nach zuvor beschriebenen Methoden: Im Vergleich zur begleitenden Herznervenvene ist die Arterie heller (rosafarbener), dünner kalibriert und deutlich pulsierend12.
    1. Falls die AVS oder die LAD-Koronararterie nicht identifiziert werden können, überprüfen Sie zunächst, ob die Thorakotomie durch den linken dritten Interkostalraum erfolgt ist. Falls erforderlich, verändern Sie die Thorakotomiestelle wie in den Schritten 3.3–3.5 beschrieben und wiederholen Sie die Identifikation der AVS und der LAD gemäß den Schritten 4.1–4.3.
    2. Beenden Sie den Eingriff, wenn die AVS oder die LAD nach 10-minütiger sorgfältiger Untersuchung nicht identifiziert werden können, wenn eine nicht kontrollierbare Blutung auftritt, wenn die gesamte Brustöffnung länger als 20 Minuten dauert oder wenn die Herzfrequenz trotz Anpassung der Anästhesietiefe unter 300 Schlägen/Minute bleibt. Betäuben Sie die Maus tief mit 5 % Isofluran, töten Sie sie durch Halswirbelbruch und dokumentieren Sie das Tier als operativen Misserfolg für die Analyse der chirurgischen Ergebnisse.
  4. Führen Sie einen 7-0-Nylon-Faden quer durch die Furche im oberen Drittel der AVS ein Abbildung 1B. Stechen Sie die Nadel senkrecht zur epikardialen Oberfläche in einer Tiefe von etwa 0,5–1 mm ein, wobei die Einstich- und Austrittsstellen auf gegenüberliegenden Seiten der Furche liegen und etwa deren maximale Breite überspannen.
  5. Versichern Sie die Ligatur mit einem Chirurgenknoten. Passen Sie die Ligatur so an, dass unmittelbar nach dem ersten Knoten eine Aufhellung des Myokards distal zur Ligaturstelle eintritt, ohne dass eine deutliche lokale Gewebeeinziehung sichtbar ist.
    ANMERKUNG: Ziehen Sie den Faden nur so fest, dass der koronare Blutfluss unterbunden wird. Eine übermäßige Spannung kann das angrenzende Myokard verletzen oder dazu führen, dass der Faden durch das Gefäß und das umliegende Gewebe schneidet.
  6. Bestätigen Sie innerhalb von 1 Minute nach der Ligatur eine erfolgreiche Koronarokklusion durch Beobachtung einer fleckigen ischämischen Aufhellung des Myokards distal zur Ligaturstelle12. Bestätigen Sie die Okklusion zusätzlich durch Nachweis einer ST-Strecken-Hebung im EKG.
  7. Falls der ischämische Bereich übermäßig klein ist oder keine Aufhellung auftritt, lösen Sie die Ligatur und wiederholen Sie den Ligationsvorgang.

5. Verschluss und postoperative Genesung

  1. Entfernen Sie vorsichtig den V-förmigen Augenlidretraktor. Verschließen Sie die Thorakotomie mit einer einzelnen unterbrochenen 5-0-Nylonnaht, indem Sie die Nadel um die angrenzenden dritten und vierten Rippen führen, um den dritten Interkostalraum wieder zu approximieren. Halten Sie die Nadel nahe an der Rippenoberfläche, um eine Verletzung des interkostalen neurovaskulären Bündels zu vermeiden. Vor dem Zuziehen der Naht komprimieren Sie den Thorax leicht am Ende der Ausatmung, um restliche intrathorakale Luft zu entfernen, und halten Sie den Druck aufrecht, während Sie die Naht mit einem Chirurgenknoten sichern.
  2. Verschließen Sie den Hautschnitt in Schichten mit 5-0-Nylonnähten. Stellen Sie eine vollständige Annäherung der Wundränder sicher, bevor Sie fortfahren.
  3. Legen Sie die Maus auf eine temperaturgesteuerte Heizplatte (37 °C), beenden Sie die Gabe von Isofluran und setzen Sie die maschinelle Beatmung fort, bis die spontane Atmung wieder einsetzt. Beobachten Sie das Tier beim Aufwachen aus der Narkose, einschließlich der Bewegung von Schwanz oder Schnurrhaaren sowie der Wiederherstellung eines regelmäßigen Atemmusters von etwa 150 Atemzügen/min.
  4. Bestätigen Sie die Bereitschaft zur Extubation durch Überprüfung einer regelmäßigen spontanen Atmung, sichtbarer Brustwandbewegung, synchron zur Beatmung, sowie gezielter Bewegungen der Gliedmaßen oder Schnurrhaare. Ziehen Sie die endotracheale Tube langsam während der Ausatmungsphase heraus und überwachen Sie das Tier danach weitere 3–5 Minuten auf der Heizplatte, um das Fehlen von Atemnot zu bestätigen.
    HINWEIS: Atemnot nach der Extubation wird am häufigsten durch einen Pneumothorax verursacht, der auf eine unvollständige Schließung des Interkostalraums zurückzuführen ist. Tritt Atemnot auf, führen Sie eine vorübergehende Reanästhesie und Beatmung der Maus durch, öffnen Sie die Hautnähte erneut, überprüfen Sie die Verschlussnaht im Interkostalraum und setzen Sie zusätzliche Nähte an Stellen mit Luftleckage, bevor Sie den Extubationsvorgang wiederholen.
  5. Bringen Sie die Maus nach der Narkoseerholung in ihren Heimkäfig zurück. Verabreichen Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg, subkutan) unmittelbar nach der Operation und alle 4–6 Stunden während der ersten 48 Stunden.
  6. Überwachen Sie jede Maus mindestens zweimal täglich während der ersten drei postoperativen Tage und danach einmal täglich. Bewerten Sie Körpergewicht, Haltung, Aktivität, Atemmuster und den Operationswundbereich und setzen Sie jedes Tier, das die vorab festgelegten tierschutzgerechten Endpunkte erreicht, artgerecht euthanasiert ab, einschließlich anhaltender Atemnot, Unfähigkeit, Futter oder Wasser zu erreichen, oder einer verkrümmten, bewegungslosen Haltung, die auf Reize nicht anspricht.

6. Elektrokardiographische (EKG) Beurteilung

  1. Aufzeichnung von elektrokardiographischen Signalen mithilfe eines mehrkanaligen physiologischen Aufzeichnungssystems, das mit einem EKG-Verstärker ausgestattet ist. Drei subkutane Extremitäten-Ableitungen werden bei der Maus platziert, wobei der positive Eingang (VIN+) mit dem linken Hinterlauf, der negative Eingang (VIN−) mit dem rechten Vorderlauf und der Erdungspunkt (GND) mit dem rechten Hinterlauf verbunden wird.
  2. Verbinden Sie das EKG-Verstärkermodul mit der Datenerfassungseinheit. Stellen Sie das Bandsperre auf 50 Hz (oder 60 Hz, je nach örtlicher Netzfrequenz) ein, öffnen Sie die Erfassungssoftware und fügen Sie unter den analogen Kanaleinstellungen ein neues EKG-Verstärkermodul hinzu.
    1. Konfigurieren Sie den Verstärker mit folgenden Parametern: Verstärkung = 2000, Modus = normal, Tiefpassfilter = 150 Hz und Hochpassfilter = 0,05 Hz. Öffnen Sie die Erfassungseinstellungen, stellen Sie die Abtastrate auf 1 kHz ein und schließen Sie das Einstellungsfenster.
    2. Nachdem die Elektroden platziert wurden, klicken Sie auf „Start“, um die Aufzeichnung zu beginnen. Stellen Sie die Zeitbasis der Anzeige auf 0,5 s pro große Teilung und die vertikale Skalierung auf 0,25 mV pro große Teilung ein und nehmen Sie das EKG kontinuierlich für mindestens 30 s auf. Wählen Sie einen stabilen, artefaktfreien Abschnitt für die Analyse und eine repräsentative Darstellung aus.
  3. Nehmen Sie das EKG unmittelbar nach der Ligatur auf, während die Maus unter 1,5 % Isofluran-Anästhesie und Normothermie auf einer Wärmematte gehalten wird. Nehmen Sie EKGs sowohl aus der MI- als auch aus der normalen Kontrollgruppe (NC) zum gleichen Zeitpunkt unter vergleichbaren anästhesiologischen Bedingungen auf.

7. Echokardiographie

  1. Entfernen Sie die Haare aus dem vorderen Brustbereich mithilfe einer Enthaarungscreme einen Tag vor der Bildgebung. Betäuben Sie die Maus während der gesamten Untersuchung mit 1,5 % Isofluran.
  2. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine beheizte Plattform, befestigen Sie die vier Gliedmaßen an den EKG-Elektroden und tragen Sie Ultraschallgel auf das Präkordium auf. Stellen Sie die Isoflurankonzentration nach Bedarf so ein, dass eine Herzfrequenz von mehr als 400 Schlägen/min aufrechterhalten wird.
  3. Positionieren Sie den Ultraschallkopf im Bereich des dritten bis vierten Interkostalraums entlang des linken Sternumrandes. Richten Sie die Markierung des Schallkopfs in einem Winkel von etwa 45° zum rechten Vorderglied. 30° und richten die Sonde entlang der langen Achse des Herzens aus.
  4. Führen Sie alle Bildgebungen mit einem linearen Array-Wandler mit einer zentralen Sende­frequenz von 30 MHz, einer Bandbreite von 20–46 MHz und einer axialen Auflösung von 50 μmStellen Sie die Sendeleistung auf 100 %, die Bildtiefe auf 13 mm, die Bildbreite auf 11 mm, die Dynamik auf 60 dB und die zweidimensionale Verstärkung auf 40 dB ein. Nehmen Sie B-Modus-Cine-Loops mit einer Bildfrequenz von 210 Bildern/s auf.
  5. Speichern Sie diese Aufnahmeparameter als Systemvorgabe. Verwenden Sie denselben Wandler, dieselbe Vorgabe, dieselbe Sendeleistung, denselben Dynamikbereich, dieselbe Bildtiefe und dieselbe Bildbreite für alle Tiere und alle Bildgebungssitzungen, und verändern Sie die Bildtiefe nicht zwischen den NC- und MI-Gruppen.
  6. In derselben Langachsenansicht wird die M-Mode-Abtastlinie auf Höhe des mittleren Ventrikels senkrecht zum interventrikulären Septum und zur hinteren Wand des linken Ventrikels positioniert, wobei das Abtastfenster den gesamten anteroposterioren Durchmesser des linken Ventrikels erfasst. Die M-Mode-Aufzeichnung wird zur späteren Analyse gespeichert.
  7. Erwerben Sie B-Bild-Aufnahmen, in denen das linke Ventrikel, das linke Vorhof und die Aortenwurzel deutlich sichtbar sind, und speichern Sie Cine-Loops für die spätere Analyse. Erwerben Sie entsprechende M-Bild-Aufnahmen in derselben Bildebene.
  8. Messen Sie den enddiastolischen inneren Durchmesser der linken Herzkammer (Dd), linksventrikulären end-systolischen inneren Durchmesser (Ds) und die Dicke des interventrikulären Septums aus den erfassten Bildern. Erfassen Sie fünf aufeinanderfolgende Herzzyklen und geben Sie die mittleren Werte an.
    HINWEIS: Berechnen Sie das linksventrikuläre enddiastolische Volumen (LVEDV) und das linksventrikuläre endsystolische Volumen (LVESV) automatisch mithilfe der Bildgebungssoftware. Berechnen Sie die Fractional Shortening (FS) gemäß FS = (Dd − Ds) / Dd × 100 % und Ejektionsfraktion (EF) als EF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 100 %.

8. Gewebeentnahme, histologische Färbung und ELISA

  1. Gewebegewinnung
    1. Führen Sie am Tag 7 nach der Induktion eines Myokardinfarkts (MI) eine Echokardiographie an jeder Maus durch. Betäuben Sie die Maus mit 4 % Isofluran, entnehmen Sie etwa 1,5 mL Blut durch retroorbitale Blutentnahme, töten Sie die Maus durch Halswirbelfraktur und entfernen Sie das Herz.
    2. Lassen Sie die Blutproben über Nacht bei 4 °C gerinnen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2000 × g für 10 min bei 4 °C, sammeln Sie das Serum und lagern Sie es bis zur Analyse bei −80 °C.
  2. Enzymgebundener Immunosorbens-Assay (ELISA)
    1. Quantifizieren Sie Serum-B-Typ-Natriuretisches Peptid (BNP), Interleukin-1β (IL-1β), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und nukleären Faktor-κB p65 (NF-κB p65) mithilfe von ELISA-Kits.
      1. Bringen Sie alle Reagenzien und Serumproben auf Raumtemperatur und bereiten Sie die Arbeitslösungen gemäß den Anweisungen des Kits vor. Verdünnen Sie die Serumproben 1:5 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), das heißt, ein Volumen Serum plus vier Volumina PBS.
      2. Geben Sie jeweils 50 μL der Standards, PBS und verdünnten Serumproben in die Standard-, Null- und Probenlöcher, lassen Sie das Leerloch leer. Geben Sie 100 μL mit Rinder-Schwerstoff-Peroxidase (HRP)-konjugiertem Detektionsantikörper in alle Löcher außer das Leerloch, verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 60 min bei 37 °C im Dunkeln.
      3. Entfernen Sie den Inhalt jedes Lochs und waschen Sie die Platte fünfmal mit Waschpuffer, wobei der Puffer bei jedem Waschgang 20 s in jedem Loch verbleiben soll. Trocknen Sie die Platte durch Vorsichtiges Abtupfen auf fusselfreiem Papier.
      4. Geben Sie 100 μL frisch zubereiteter Substratlösung (Lösung A und B im Volumenverhältnis 1:1 gemischt) in jedes Loch. Inkubieren Sie die verschlossene Platte 15 min bei 37 °C im Dunkeln, geben Sie 50 μL Stopplösung hinzu und messen Sie die optische Dichte bei 450 nm.
    2. Subtrahieren Sie die optische Dichte des Leerwerts von jeder Messung und erstellen Sie eine Standardkurve unter Verwendung eines vierparametrischen logistischen (4PL) Regressionsmodells. Berechnen Sie die Konzentration jeder Probe anhand der angepassten Kurve, multiplizieren Sie den Wert mit dem Verdünnungsfaktor von 5 und geben Sie den Mittelwert aus den Duplikatlöchern an.
  3. Gewebeprozessierung, Einbetten und Schneiden
    1. Spülen Sie jedes entnommene Herz kurz in eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus, um verbleibendes Blut zu entfernen. Fixieren Sie das Gewebe mindestens 24 h bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd.
    2. Präparieren Sie jedes Herz, um eine ebene Querschnittsfläche freizulegen, und legen Sie es in eine beschriftete Gewebekassette. Dehydrieren Sie das Gewebe durch eine abgestufte Ethanolreihe (75 % Ethanol für 4 h, 85 % Ethanol für 2 h, 90 % Ethanol für 2 h, 95 % Ethanol für 1 h und zwei Wechsel mit absolutem Ethanol je 30 min). Überführen Sie das Gewebe durch eine Ethanol–Xylol-Mischung für 5–10 min, klären Sie es in zwei Wechseln Xylol je 10 min und infiltrieren Sie es mit drei Wechseln geschmolzenem Paraffin je 1 h.
    3. Betten Sie jedes Herz mit der Querschnittsfläche zur Blockoberfläche ein. Schneiden Sie serielle 3-μm-Schnitte auf Höhe der mittleren Papillarmuskulatur, lassen Sie die Schnitte auf einem 40 °C warmen Wasserbad schwimmen, montieren Sie sie auf Objektträger und trocknen Sie sie bei 60 °C.
    4. Entparaffinieren Sie die Schnitte in zwei Wechseln Xylol (je 15 min), gefolgt von drei Wechseln absolutem Ethanol (je 5 min), 75 % Ethanol (5 min) und umgekehrter Osmose (RO)-Wasser (5 min).
      ACHTUNG: Paraformaldehyd ist vermutlich krebserregend und reizt Atemwege und Haut; Xylol ist entzündbar und neurotoxisch. Handhaben Sie diese Reagenzien in einer Abzugshaube unter Tragen von sterilen medizinischen Handschuhen, Laborkittel und Augenschutz und entsorgen Sie Abfälle gemäß den Vorschriften der Institution für gefährliche Abfälle. Ethanol und n-Butanol sind entzündbar; halten Sie sie von Zündquellen fern.
  4. Histologische Färbung
    1. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
      1. Legen Sie die entparaffinierten und rehydrierten Schnitte 3–5 min in Hämatoxylin. Spülen Sie die Schnitte mit Wasser ab.
      2. Differenzieren Sie die Schnitte in 1 % saurem Alkohol und spülen Sie sie erneut mit Wasser. Blauen Sie die Schnitte in 0,5 % wässriger Ammoniaklösung an und spülen Sie sie erneut.
      3. Führen Sie die Schnitte nacheinander durch 85 % Ethanol, 95 % Ethanol und absolutes Ethanol je 5 min. Gegenfärben Sie die Schnitte 3–5 min mit Eosin.
      4. Dehydrieren Sie die Schnitte durch drei Wechsel mit absolutem Ethanol je 5 min und anschließend 5 min in n-Butanol. Klären Sie die Schnitte durch drei Wechsel mit Xylol je 5 min und montieren Sie sie mit neutralem Harz.
        HINWEIS: Kerne erscheinen blau, während Zytoplasma und extrazelluläre Matrix rot erscheinen.
    2. Masson-Trichrom-Färbung
      1. Behandeln Sie die entparaffinierten und rehydrierten Schnitte über Nacht für etwa 15 h bei Raumtemperatur mit einer 2,5 %igen Kaliumdichromatlösung. Spülen Sie die Schnitte unter fließendem Wasser etwa 30 s lang aus, bis der gelbe Farbton verschwindet.
      2. Färben Sie die Schnitte 6 min mit Ponceau–Säurefuchsin-Lösung, bis das Gewebe hellrot erscheint. Verlängern Sie die Färbezeit, falls die Färbung blass bleibt, und spülen Sie die Schnitte unter fließendem Wasser aus, bis das Abflusswasser farblos ist.
      3. Entfernen Sie überschüssiges Wasser, ohne die Schnitte austrocknen zu lassen. Differenzieren Sie die Schnitte 1–2 min in wässriger Phosphomolybdinsäure, bis das Kollagen blass erscheint und die Muskelfasern rot bleiben.
      4. Überführen Sie die Schnitte ohne Spülen direkt in Anilinblau-Lösung. Inkubieren Sie die Schnitte 6–30 s.
      5. Differenzieren Sie die Schnitte durch drei bis fünf Wechsel mit 1 % Essigsäure je etwa 8 s. Dehydrieren Sie sie rasch durch drei Wechsel mit absolutem Ethanol je etwa 3, 5 und 5 s.
      6. Klären Sie die Schnitte 5 min in n-Butanol und anschließend 5 min in Xylol. Montieren Sie die Schnitte mit neutralem Harz.
        HINWEIS: Kollagenfasern erscheinen blau, während Muskelfasern, Fibrin und Erythrozyten rot erscheinen.
    3. Sirius-Rot-Färbung
      1. Inkubieren Sie die entparaffinierten und rehydrierten Schnitte 30 min in einer 65 °C warmen Trockenofen mit Sirius-Rot-Lösung A. Waschen Sie die Schnitte unter fließendem Wasser aus, bis der gelbe Farbton verschwindet.
      2. Tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit ab und legen Sie die Schnitte 2 min in Sirius-Rot-Lösung B. Spülen Sie die Schnitte kurz ab und tupfen Sie erneut ab.
      3. Legen Sie die Schnitte 30 min in Sirius-Rot-Lösung C. Spülen Sie sie kurz für 1–2 s.
      4. Dehydrieren Sie die Schnitte durch drei Wechsel mit absolutem Ethanol je etwa 3 s. Klären Sie sie durch drei Wechsel mit Xylol je 5 min und montieren Sie sie mit neutralem Harz.
        HINWEIS: Unter Hellfeldbeleuchtung erscheinen Kollagenfasern rot vor einem gelben Hintergrund.
  5. Bildaufnahme und Quantifizierung
    1. Nehmen Sie alle histologischen Bilder mit einem digitalen Slide-Scanner auf. Verwenden Sie für alle Schnitte aller Gruppen identische Einstellungen für Beleuchtung, Weißabgleich, Belichtung und Vergrößerung und fügen Sie in jedes Bild eine Kalibrierungs-Skalenleiste ein.
    2. Kalibrieren Sie die räumliche Skala vor der Bildanalyse. Laden Sie ein Referenzbild mit der Skalenleiste, das mit derselben Auflösung und Pixelgröße wie die Studienbilder aufgenommen wurde. Unter Messen > Kalibrierung > System festlegen erstellen Sie eine neue räumliche Kalibrierung, setzen Sie die Einheit auf μm, definieren Sie die Umrechnung Pixel-zu-Mikrometer durch Ausrichtung der Kalibrierpunkte an der Skalenleiste, speichern Sie die Kalibrierung und wenden Sie sie auf alle Bilder an.
    3. Laden Sie einen mit Masson-Trichrom gefärbten Schnitt und umreißen Sie das linke Ventrikel mithilfe des unregelmäßigen Bereichs-von-Interesse (AOI)-Werkzeugs. Schließen Sie den Ventrikelfreiheit, das rechte Ventrikel und Artefakte der Gewebeprozessierung aus und notieren Sie die gesamte Fläche des linken Ventrikels.
    4. Öffnen Sie Messen > Zählen/Größe und wählen Sie Farben auswählen, um den Segmentierungsdialog zu öffnen. Wählen Sie die Farbwürfel-basierte Segmentierung und setzen Sie die Parameter wie folgt: Empfindlichkeit = 4, Auswahl um 1 Farbindex erweitern, minimale Farbgröße = 1 Pixel, Kernelgröße = 3 × 3. Wenden Sie dieselben Segmentierungseinstellungen auf alle Schnitte an.
    5. Wählen Sie mithilfe des Pipettenwerkzeugs blaue, kollagenpositive Pixel als Startpunkte aus. Probieren Sie nur eindeutig kollagenpositive Bereiche aus, erzeugen Sie ein Vorschaubild und bestätigen Sie, dass die Maske die kollagenpositiven Bereiche einschließt, während das rotgefärbte Myokard, der Ventrikelfreiheit und der Hintergrund ausgeschlossen werden. Passen Sie die Startpunkte gegebenenfalls an, bevor Sie die Maske anwenden.
      HINWEIS: Wählen Sie für jeden Schnitt erneut Startpixel aus, um geringfügige Unterschiede in der Färbungsintensität zwischen den Schnitten auszugleichen. Verwenden Sie für alle Bilder identische Segmentierungsparameter (Empfindlichkeit, Erweiterungsgrad, minimale Farbgröße und Kernelgröße) und akzeptieren Sie die Segmentierung nur, wenn die Vorschau eine vollständige Abdeckung der kollagenpositiven Bereiche mit Ausschluss nicht-kollagener Strukturen zeigt.
    6. Wenden Sie die Segmentierungsmaske an und schließen Sie den Dialog. Unter Messen > Messungen auswählen wählen Sie Fläche aus, klicken Sie auf Zählen, öffnen Sie Ansicht > Statistik und notieren Sie die summierte kollagenpositive Fläche.
    7. Berechnen Sie den Kollagenvolumenanteil (CVF), indem Sie die kollagenpositive Fläche durch die gesamte Fläche des linken Ventrikels teilen, und geben Sie das Ergebnis in Prozent an.

9. Gewebeklärung und dreidimensionale Koronararterienbildgebung

  1. Fluoreszenzmarkierung der Koronarvasculatur
    1. Injizieren Sie 200 µL einer 2 %igen Evans-Blau-Lösung in die seitliche Schwanzvene, um die Koronarvasculatur zu markieren. Stellen Sie die Maus für 60 min in ihren Käfig zurück, um eine systemische Zirkulation des Farbstoffs zu ermöglichen.
    2. Platzieren Sie die Maus in der Induktionskammer (16 × 10 × 11 cm), die mit dem Anästhesiegerät verbunden ist, und induzieren Sie die Anästhesie mit 4 % Isofluran. Töten Sie die Maus durch Halswirbelverrenkung, öffnen Sie die Brusthöhle, entnehmen Sie das intakte Herz, spülen Sie es mit PBS und fixieren Sie es 24 h bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd (PFA).
      ACHTUNG: PFA ist ein möglicher Karzinogen und reizt Atemwege und Haut. PFA muss in einer chemischen Abzugshaube unter Verwendung steriler medizinischer Handschuhe, eines Laborkittels und Augenschutzes gehandhabt werden. Entsorgen Sie Abfälle gemäß den internen Vorschriften für gefährliche Abfälle.
    3. Stellen Sie eine 3 %ige Agarose-Lösung in RO-Wasser her und einbetten Sie das fixierte Herz so, dass die Ligationsstelle für die Bildgebung korrekt ausgerichtet ist. Injizieren Sie mit einer Mikroliterspritze je 1 µL DAPI-Lösung an acht Stellen rund um den Ligationsbereich und inkubieren Sie die Probe 2 Tage bei Raumtemperatur.
  2. Gewebeklärung
    1. Führen Sie die Gewebeklärung mit einem FDISCO-(Dreidimensionale Bildgebung von mit Lösungsmitteln geklärten Organen mit hervorragender Fluoreszenzerhaltungsfähigkeit)-Klärkit gemäß den Herstelleranweisungen durch. Das Kit enthält sechs Reagenzien (A–F): Reagenzien A, B, C, D und E enthalten jeweils 50 %, 70 %, 80 %, 100 % und 100 % Tetrahydrofuran (THF) in Wasser, Reagenz F ist Dibenzylether.
      ACHTUNG: THF ist hochentzündlich, bildet bei Lagerung explosive Peroxide und reizt Atemwege und Haut. Dibenzylether reizt Haut und Augen. Alle Reagenzien müssen in einer chemischen Abzugshaube unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich steriler medizinischer Handschuhe, Laborkittel und Augenschutz, gehandhabt werden. Entsorgen Sie Abfälle gemäß den internen Vorschriften für gefährliche Abfälle.
    2. Inkubieren Sie jedes Herz nacheinander in den Reagenzien A, B, C, D und E jeweils 6 h lang. Verwenden Sie 10 mL jedes Reagenz pro Herz, was einem minimalen Volumenverhältnis Probe zu Reagenz von 1:5 entspricht.
    3. Überführen Sie die Probe in Reagenz F und fahren Sie mit der Inkubation fort, bis das Gewebe optisch transparent wird, typischerweise etwa 1 h lang.
    4. Führen Sie alle Klärungsschritte bei 6 °C–8 °C mit sanfter Agitation durch. Stellen Sie die Probe in einen Glasbehälter, der mit Aluminiumfolie umwickelt ist, und schützen Sie sie während des gesamten Verfahrens vor Licht, um die Fluoreszenz zu erhalten.
  3. Leuchtfeld-Fluoreszenzbildgebung
    1. Montieren Sie die geklärte Probe auf dem Probenträger. Verwenden Sie ein Leuchtfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einem 4×-Objektiv (numerische Apertur = 0,28; Arbeitsabstand = 20,0 mm).
    2. Legen Sie die montierte Probe in der Bildgebungskammer in Dibenzylether ein. Beleuchten Sie die Probe von beiden Seiten und excitieren Sie nacheinander DAPI bei 405 nm und Evans Blue bei 647 nm.
    3. Stellen Sie die Aufnahmeparameter wie folgt ein: Für den 405-nm-Kanal verwenden Sie eine Laserintensität von 3.000 willkürlichen Einheiten und eine Belichtungszeit von 30 ms; für den 647-nm-Kanal verwenden Sie eine Laserintensität von 4.000 willkürlichen Einheiten und eine Belichtungszeit von 30 ms. Nehmen Sie alle Bilder mit einer z-Schrittgröße von 6 μm und einer Bildauflösung von 1.024 × 1.024 Pixeln auf.
    4. Stellen Sie den Kameramodus auf XYCZT ein, bei dem zuerst laterale (XY-)Bilder aufgenommen werden, gefolgt von der sequenziellen Kanalakquise (C), axialen Schrittbewegung (Z) und Zeitpunkterfassung (T), wie vom Bildgebungssystem konfiguriert.
  4. Bildverarbeitung und dreidimensionale Rekonstruktion
    1. Stapeln Sie die Roh-TIFF-Bilddateien mithilfe der mit dem Mikroskop gelieferten Bildverarbeitungssoftware. Konvertieren Sie die gestapelten Bilddateien in das IMS-Format, indem Sie Datei > In Imaris konvertieren auswählen.
    2. Importieren Sie die konvertierten IMS-Dateien in die Software zur dreidimensionalen Analyse. Erzeugen Sie volumenbasierte Rekonstruktionen mit den Standarddarstellungseinstellungen und exportieren Sie repräsentative Bilder mithilfe des Snapshot-Moduls.
      HINWEIS: Dreidimensionale Rekonstruktionen werden mit der standardmäßigen Rendering-Pipeline der Software ohne Modifikation erzeugt. Es wird keine Bildsegmentierung, Schwellenwertbestimmung, Rauschunterdrückung, Hintergrundsubtraktion oder andere Vorverarbeitung durchgeführt. Die rekonstruierten Bilder dienen der qualitativen Visualisierung der Koronarvasculatur und sind nicht für quantitative Analysen vorgesehen.

10. Statistische Analyse

  1. Alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angeben. Die statistischen Analysen mit der GraphPad Prism-Software (Version 5.0) durchführen.
  2. Definieren Sie die experimentelle Einheit als das einzelne Tier. Analysieren Sie jeweils n = 8 Mäuse pro Gruppe für alle funktionellen, biomarker- und histomorphometrischen Endpunkte.
  3. Führen Sie die Datenerhebung und -analyse unter Verwendung codierter Probenkennungen durch, wobei die Zuordnung zu den Gruppen für die Untersucher verblindet bleibt. Enthüllen Sie die Gruppenzuteilungen erst nach Abschluss aller quantitativen Analysen.
  4. Überprüfen Sie die Daten auf Normalverteilung mithilfe des Shapiro-Wilk-Tests und auf Varianzhomogenität mithilfe des Levene-Tests in GraphPad Prism (Version 5.0), bevor Sie den geeigneten statistischen Test auswählen.
  5. Vergleichen Sie zwei Gruppen mithilfe eines zweiseitigen ungepaarten Student's t-Tests. t-Test, wenn die Annahmen der Normalverteilung und der Varianzhomogenität erfüllt sind. Andernfalls führen Sie einen Mann-Whitney-Test durch. U Test.
  6. Beachten Sie P < 0,05 statistisch signifikant. Die statistische Signifikanz ist anzugeben als P < 0,05, P < 0,01 und P < 0.001.

Ergebnisse

Die AIS diente als anatomische Landmarke zur Lokalisation der Koronararteria descendens anterior (LAD) und zur Identifizierung der Ligaturstelle (Abbildung 1A–C). Nach Identifizierung der AIS wurde der sequenzielle chirurgische Arbeitsablauf zur Induktion eines Myokardinfarkts, einschließlich Thorakotomie, Herzfreilegung, LAD-Ligatur, thorakaler Nahtverschluss und postoperativer Erholung, wie in Abbildung 2A–L dargestellt, durchgeführt. Das vereinfachte Protokoll ermöglichte eine schnelle und reproduzierbare Induktion eines Myokardinfarkts bei Mäusen. Dieses Protokoll erfordert eine längere Phase praktischer Schulung, bevor es zuverlässig durchgeführt werden kann; die endotracheale Intubation und die AIS-gestützte Ligatur sind die beiden Schritte mit der steilsten Lernkurve. Während der frühen Trainingsphase kann die perioperative Mortalität innerhalb der ersten 7 postoperativen Tage 50 % oder mehr betragen, und die Erfolgsrate der Modellinduktion kann auf 30 % oder darunter sinken. Sobald diese Techniken beherrscht werden, übersteigt die chirurgische Erfolgsrate konstant 90 %. In der vorliegenden Studie trat innerhalb der ersten 7 postoperativen Tage kein perioperativer Tod auf. Alle Schulungsverfahren wurden unter Einhaltung des gleichen institutionell genehmigten Protokolls zum Tierversuch durchgeführt.

Nach LAD-Ligatur wurden charakteristische elektrokardiographische Auffälligkeiten beobachtet, darunter eine deutliche Verstärkung der Q-Welle, eine ST-Strecken-Elevation mit aufwärts konkaver Morphologie, hyperakute T-Wellen-Spitzenbildung (die sich typischerweise in der subakuten Phase zu einer T-Wellen-Inversion entwickelt), eine erhöhte QRS-Komplex-Amplitude mit verbreitertem Ausschlag sowie ausgeprägte Tachykardie (Abbildung 3A). Die makroskopische Untersuchung zeigte im MI-Gruppe im Vergleich zur NC-Gruppe eine lokalisierte Myokardentfärbung und eine ventrikuläre Dilatation distal zur Ligaturstelle (Abbildung 3B). Die histopathologische Untersuchung ergab in der MI-Gruppe desorganisierte Myokardfasern, verbreiterte interzelluläre Räume, Infiltration durch Entzündungszellen, Kollagenablagerungen und strukturelle Myokardschädigungen, wie durch Hämatoxylin-Eosin (H&E), Masson’s Trichrom- und Sirius-Rot-Färbung nachgewiesen (Abbildung 3C). Die quantitative Analyse der mit Masson’s Trichrom gefärbten Schnitten zeigte einen signifikant höheren CVF in der MI-Gruppe im Vergleich zur NC-Gruppe (18,24 % ± 1,67 % vs. 0,05 % ± 0,01 %; P < 0,001; Abbildung 3D).

Analyse der kardialen Fibrose: EKG-Diagramm, Herzgewebebilder, histologische Schnitte, Quantifizierungsdiagramm der Fibrose.
Abbildung 3: Elektrokardiographische, makroanatomische und histopathologische Veränderungen nach Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie bei Mäusen. (A) Repräsentative Elektrokardiogramme (EKGs), die unmittelbar nach der Operation in der normalen Kontrollgruppe (NC) und der Myokardinfarktgruppe (MI) aufgezeichnet wurden. (B) Repräsentative makroskopische Bilder der Herzen aus den Gruppen NC und MI. Maßstäbe = 1 mm. (C) Repräsentative transversale Herzschnitte aus den Gruppen NC und MI, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H&E; links), Masson-Trichrom (Mitte) und Siriusrot (rechts). Bei den mit Masson-Trichrom gefärbten Schnitten erscheint Kollagen blau und Myokard rot; bei den mit Siriusrot gefärbten Schnitten erscheint Kollagen rot vor gelbem Hintergrund. Maßstäbe = 1.000 µm. (D) Kollagenvolumenanteil (CVF), berechnet als kollagenpositiver Bereich geteilt durch die gesamte Fläche des linken Ventrikels und als Prozentsatz angegeben, in den Gruppen NC und MI. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt; n = 8 Mäuse pro Gruppe. Die statistische Signifikanz im Vergleich zur NC-Gruppe ist mit **P < 0,001 angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Die Einschränkung der kardialen Funktion wurde mittels Echokardiographie bestätigt. Repräsentative M-Modus-Aufnahmen zeigten eine verminderte Kontraktilität des linken Ventrikels in der MI-Gruppe (Abbildung 4A). Die quantitative Analyse ergab eine signifikant verminderte Ejektionsfraktion (EF) und Fractional Shortening (FS) des linken Ventrikels in der MI-Gruppe im Vergleich zur NC-Gruppe (Abbildung 4B,C). ELISA-Analysen zeigten signifikant erhöhte Serumkonzentrationen von BNP, TNF-α, NF-κB p65 und IL-1β in der MI-Gruppe (Abbildung 4D–G), was mit einer beeinträchtigten Herzfunktion und einer entzündlichen Reaktion übereinstimmt.

Echokardiographische Bilder mit Balkendiagrammen; EF, FS, BNP, TNFα, p65, IL-1β-Spiegel in der NC- und MI-Gruppe.
Abbildung 4: Veränderungen der Herzfunktion und Konzentrationen von Serum-Biomarkern nach Ligatur der Arteria coronaria descendens anterior. (A) Repräsentative M-Mode-Echokardiographieaufnahmen der normalen Kontrollgruppe (NC) und der Myokardinfarkt-Gruppe (MI). (B) Ejektionsfraktion des linken Ventrikels (EF). (C) Fraktionale Verkürzung des linken Ventrikels (FS). (D–G) Serumkonzentrationen von (D) B-Natriuretischem Peptid (BNP), (E) Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), (F) nukleärem Faktor-κB p65 (NF-κB p65) und (G) Interleukin-1β (IL-1β), gemessen mittels enzymgekoppelter Immunosorbent-Assay (ELISA). EF und FS werden als Prozentangaben ausgedrückt; BNP, TNF-α und IL-1β in pg/mL; NF-κB p65 in ng/mL. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt; n = 8 Mäuse pro Gruppe. Die statistische Signifikanz im Vergleich zur NC-Gruppe ist mit *P < 0,01 und **P < 0,001 gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Die dreidimensionale Fluoreszenz-Bildgebung von klargemachten Herzen zeigte den Verlauf der LAD unterhalb des AIS und ergab, dass die Ligatur an der anatomisch definierten Stelle eine koronare Okklusion verursachte (Abbildung 5A–F). Insgesamt belegen diese Befunde eine erfolgreiche Induktion eines MI-Phänotyps in dieser initialen Serie von jeweils acht Tieren pro Gruppe, gekennzeichnet durch linksventrikuläre Dysfunktion, myokardiale Fibrose und systemische Entzündung. Die vorliegende Studie wurde konzipiert, um die Durchführbarkeit des AIS-gesteuerten MI-Modells zu etablieren und zu demonstrieren, und nicht, um eine umfassende Validierung der Stichprobengröße, der Langzeit-Stabilität des Modells oder der anatomischen Übereinstimmung zwischen dem AIS und der LAD bereitzustellen. Entsprechend werden diese Aspekte als Limitationen der vorliegenden Studie anerkannt und im Diskussionsabschnitt erörtert. Insbesondere beschränkten sich die funktionellen und biochemischen Untersuchungen auf die akute Phase nach dem MI, und die Beziehung zwischen dem AIS und der LAD wurde qualitativ dargestellt, jedoch noch nicht in einem ausreichend großen Kollektiv quantifiziert.

Fluoreszenzbildgebung der Herzanatomie; DAPI, Evans-Blau-Färbung; Mikroskopie, Analyse der Zellstruktur.
Abbildung 5: Dreidimensionale Fluoreszenzbildgebung des transparent gemachten murinen Koronargefäßsystems. Transparent gemachte Vollherzen wurden mit Evans Blau zur Visualisierung des Koronargefäßsystems und mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zur Visualisierung der Zellkerne markiert, gefolgt von der Lichtblatt-Fluoreszenzbildgebung und dreidimensionaler Rekonstruktion. (A–C) Rekonstruktionen des gesamten Herzens, die zeigen (A) den DAPI-Kanal, (B) den Evans-Blau-Kanal und (C) die überlagerten Kanäle. Maßstäbe = 1.000 µm. (D–F) Vergrößerte Ansichten des koronaren Gefäßbereichs mit (D) dem DAPI-Kanal, (E) dem Evans-Blau-Kanal und (F) den überlagerten Kanälen. Maßstäbe = 400 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Nicht jedes Verfahren führt zu einem optimalen Modell, und die Erkennung suboptimaler Ergebnisse ist wichtig für die Fehlerbehebung. Eine zu proximal platzierte Ligatur oder ein zu tiefes Durchführen der Nadel kann einen übermäßig großen Infarkt mit schwerer Herzinsuffizienz, Arrhythmie oder ventrikulärem Ruptur verursachen, was zu einer frühen Mortalität führt. Umgekehrt kann eine zu distal oder zu oberflächlich platzierte Ligatur lediglich einen kleinen Infarkt verursachen oder die Induktion einer Infarktion versagen. Die erfolgreiche Induktion des Modells sollte daher anhand mehrerer Kriterien bewertet werden. Während der Operation stellt die Blanchierung des Myokards distal zur Ligaturstelle einen unmittelbaren Hinweis auf eine Koronarokklusion dar, obwohl dieses Zeichen nicht immer deutlich sichtbar ist. Die postoperative Echokardiographie und die histopathologische Untersuchung liefern zusätzliche Bestätigung für die erfolgreiche Erstellung des Modells. Ergänzende Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives nicht erfolgreiches Modell, bei dem die histopathologische Untersuchung keine erkennbare Infiltration durch Entzündungszellen oder Fibrose nachweist.

Abbildung 1. Vertretende histologische Befunde aus einem nicht erfolgreichen Myokardinfarkt-Modell. Vertretende Querschnittsbilder des Herzens einer Maus, bei der die Induktion eines Myokardinfarkts nicht erfolgreich war, gefärbt mit (A) Hämatoxylin und Eosin (H&E), (B) Masson-Trichrom und (C) Siriusrot. Im Vergleich zu einer erfolgreichen Myokardinfarkt-Induktion zeigen diese Schnitte keine erkennbare Infiltration von Entzündungszellen oder fibrotische Umbildung im Myokard der linken Herzkammer, was mit einer nicht erfolgreichen Okklusion der Koronararterie übereinstimmt. Maßstabsbalken = 1.000 µm.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In den letzten Jahren sind klinische und experimentelle Modelle des Myokardinfarkts (MI) in der kardiovaskulären Forschung zunehmend wichtiger geworden, doch viele Fragen zur Pathogenese des MI sowie zu Behandlungsstrategien bleiben weiterhin ungeklärt. Dieser Artikel beschreibt ein verfeinertes Verfahren zur Erstellung eines murinen MI-Modells, bei dem mehrere kritische Arbeitsschritte besondere Aufmerksamkeit erfordern. Der erste kritische Schritt ist die Trachealintubation. Einige frühere Protokolle sichern den Atemweg mittels Tracheotomie, bei der die zervikale Haut incidiert und das Gewebe präpariert werden muss, um die Trachea vor der Intubation freizulegen13; andere verwenden die oro-tracheale Intubation, empfehlen jedoch einen medianen zervikalen Hautschnitt, um die Sicht während des Eingriffs zu verbessern14. Im Gegensatz zu beiden Ansätzen verwendet das vorliegende Protokoll einen Laryngoskop, um den Oropharynx zu beleuchten, und führt die oro-tracheale Intubation unter direkter Sicht auf den Kehlkopfeingang (Glottis) ohne zervikalen Schnitt durch. Obwohl dieser Ansatz höhere Anforderungen an die technische Fertigkeit des Operateurs stellt, vermeidet er Traumata am zervikalen Gewebe, reduziert das Risiko von Infektionen und postoperativen Schmerzen und verkürzt die Operationsdauer. Der häufigste Fehler während der Intubation ist die unbeabsichtigte Platzierung des Tubus in der Speiseröhre (Ösophagus). Wenn sich der Thorax während der Beatmung nicht hebt und am Endotrachealtubus keine Kondensation während der Exspiration sichtbar ist, muss der Tubus sofort zurückgezogen und die Intubation wiederholt werden. Der Anschluss an das Beatmungsgerät darf erst erfolgen, nachdem eine symmetrische, beidseitige Bewegung der Brustwand bestätigt wurde.

Der zweite und wichtigste Schritt besteht in der Identifizierung der LAD-Koronararterie und der genauen Platzierung der Ligatur. Herkömmliche Methoden stoßen in diesem Stadium auf mehrere Herausforderungen. Die Ruheherzfrequenz der Maus beträgt etwa 500–600 Schläge/min, und die LAD verläuft neben mehreren begleitenden Koronarvenen, was die Echtzeit-Identifizierung der Arterie während der Operation von vornherein erschwert. Darüber hinaus lässt sich selbst unter optimalen Bedingungen ein erheblicher Teil der LAD-Arterien im Operationsmikroskop nicht klar visualisieren15. Vor diesem Hintergrund sind frühere Protokolle, die die Ligaturstelle als Punkt 1–2 mm unterhalb des linken Ohrläppchens abschätzen, durch die uneinheitliche intraoperative Identifizierung dieses anatomischen Bezugsmerkmals begrenzt12,14, während das komplexe Verzweigungsmuster der linken Koronararterie die Reproduzierbarkeit weiter beeinträchtigen kann16. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, verwendet das vorliegende Protokoll die AIS als anatomisches Referenzmerkmal zur Positionierung der Ligatur. Im Operationsmikroskop erscheint die AIS als flache Furche auf der ventralen Herzoberfläche, wobei die LAD unmittelbar darunter verläuft. Sie stellt somit ein relativ stabiles anatomisches Referenzmerkmal dar, das weniger von der Erfahrung des Operateurs abhängt. Die Platzierung der Ligatur im oberen Drittel der AIS bietet ein konsistentes anatomisches Ziel für die Koronarokklusion. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass dieser Ansatz erfolgreich das erwartete akute MI-Phänotyp bei den untersuchten Tieren hervorgerufen hat.

Der AIS-Markierungspunkt ist nicht unter allen Umständen zuverlässig. Wenn die thorakale Exposition eingeschränkt ist oder epidemisches Bluten die Herzoberfläche verdeckt und die Identifizierung des AIS erschwert, sollte das Operationsfeld vorsichtig mit einem mit Salzlösung angefeuchteten Wattestäbchen abgewischt und die Furche vor der Ligatur erneut beurteilt werden. Falls der AIS weiterhin nicht sicher identifiziert werden kann, sollte die LAD direkt wie im Protokoll beschrieben lokalisiert und die Ligatur unter direkter Sicht durchgeführt werden, anstatt sich auf den AIS zu verlassen. Gegebenenfalls sollte der korrekte Interkostalraum durch Zählen von der ersten Rippe kaudalwärts bestätigt werden, um eine ausreichende Exposition des linken Vorhofanhangs und der Vorderwand des linken Ventrikels sicherzustellen.

Zu den postoperativen Komplikationen ist Pneumothorax die häufigste und manifestiert sich typischerweise als Atemnot nach der Extubation. Der Schlüssel zur Verhinderung eines Pneumothorax liegt in der vollständigen Entfernung der restlichen Luft aus der Brusthöhle vor dem Verschluss des Interkostalraums. Falls ein Pneumothorax vermutet wird, kurzzeitig erneut anästhesieren und die Maus beatmen, die Hautnaht öffnen und den Interkostalverschluss überprüfen. Werden ein oder mehrere Stellen mit unvollständigem Verschluss identifiziert, zusätzliche Nähte an der Stelle des Luftaustritts setzen, bevor die Extubation erneut durchgeführt wird. Eine weitere mögliche Komplikation ist eine intraoperative Blutung, die am häufigsten auftritt, wenn die Nadel bei der Ligatur ein kleines epikardiales Gefäß oder eine begleitende Koronarvene durchsticht. Die Blutung ist in der Regel begrenzt und kann meist kontrolliert werden, indem mehrere Sekunden lang sanfter Druck mit einem mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen ausgeübt wird. Vor dem Verschluss der Brusthöhle sicherstellen, dass im Operationsfeld keine aktive Blutung mehr besteht, um postoperative Komplikationen zu minimieren. Außerdem können Mäuse Arrhythmien entwickeln, darunter vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen oder transiente ventrikuläre Fibrillation, während oder unmittelbar nach dem Eingriff. Diese Arrhythmien lassen sich oft durch Aufrechterhaltung der Körpertemperatur, Stabilisierung der Anästhesietiefe und vorübergehende Unterbrechung des Eingriffs zur spontanen Wiederherstellung des Herzrhythmus lindern. Schließlich resultieren anästhesiebedingte Komplikationen am häufigsten aus dem Versäumnis, die Isoflurankonzentration unverzüglich nach erfolgreicher Trachealintubation zu senken. Die Isoflurankonzentration unmittelbar nach dem Anschließen des Endotrachealtubus an den Beatmungsapparat auf das Erhaltungsniveau reduzieren und Atmung sowie Herzfrequenz während des gesamten Eingriffs kontinuierlich überwachen.

Insgesamt erfordert diese Methode umfangreiche mikrochirurgische Fähigkeiten und unterliegt wie andere Modelle der permanenten LAD-Koronararterienligatur weiterhin Variabilitäten aufgrund anatomischer Unterschiede der Koronararterien und der Erfahrung des Operateurs. Dennoch können Forscher mit angemessener Schulung und konsistenter chirurgischer Technik das MI-Modell mit ausreichender Zuverlässigkeit etablieren, wobei die Reproduzierbarkeit des Verfahrens sowie das Überleben nach der Operation verbessert werden.

Mehrere Einschränkungen dieser Methode sollten anerkannt werden. Erstens wurden die funktionellen und biochemischen Untersuchungen innerhalb einer Woche nach der Induktion eines Myokardinfarkts (MI) abgeschlossen und spiegeln somit lediglich die akute Phase des MI wider, ohne eine systematische Bewertung langfristiger Ergebnisse wie der ventrikulären Remodellierung 4–8 Wochen nach der Operation. Zweitens können, wie bei anderen Modellen mit dauerhafter Ligatur, die nicht resorbierbare Nähte verwenden, chronische Perikardadhäsionen im Rahmen dieses Protokolls auftreten. Dies stellt ein inhärentes Merkmal des Ligaturmodells dar und keine spezifische Einschränkung der AIS-gesteuerten Methode. Die Schwere dieser Adhäsionen und deren Auswirkungen auf die langfristige Herzfunktion wurden in der vorliegenden Studie jedoch nicht quantifiziert. Zukünftige Studien könnten die Verwendung resorbierbarer Nähte untersuchen und deren Effekte auf die Adhäsionsbildung sowie die Modellleistung bewerten. Drittens wurde mittels dreidimensionaler koronarer Bildgebung zwar qualitativ gezeigt, dass die A. interventricularis anterior (LAD) unterhalb des AIS verläuft, die anatomische Übereinstimmung zwischen diesen Strukturen wurde jedoch noch nicht in einer ausreichend großen Kohorte quantifiziert. Viertens umfasste diese Studie ausschließlich männliche C57BL/6J-Mäuse. Obwohl erwartet wird, dass das AIS eine konsistente anatomische Landmarke darstellt, bedarf ihre Anwendbarkeit bei weiblichen Mäusen, anderen Mausstämmen und anderen Spezies weiterer Validierung. Schließlich basieren die potenziellen Vorteile dieses Protokolls hinsichtlich der Konsistenz der Ligaturstelle und der reproduzierbaren Durchführbarkeit auf Erfahrungen aus einem einzigen Labor und wurden nicht im direkten Vergleich zu herkömmlichen LAD-Ligaturmethoden oder zwischen mehreren Operateuren und Institutionen evaluiert. Zusätzliche Validierungsstudien sind daher erforderlich, um die breitere Generalisierbarkeit der Methode zu belegen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Sichuan Science and Technology Program (Nr. 2026NSFSC1823 und 2022YFS0618), dem Projekt der Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (Büro der Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine Nr. 7 [2024]), dem Projekt der Sichuan Society of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine (Nr. ZXY2025019) sowie dem Projekt der Southwest Medical University (Fördermittel-Nr. 2023ZYYQ04 und 2023ZYYQ17) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % sterile KochsalzlösungSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.-Rekonstitution von Cefazolin
3 % AgaroseSigma-AldrichA0169Einbetten von Proben
4 % ParaformaldehydSigma-Aldrich158127Gewebefixierung
Absolute EthanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0170AGewebedehydrierung; entzündlich
SäurefuchsinAladdinA104916-100gHerstellung der Ponceau–Säurefuchsin-Lösung für die Masson-Trichrom-Färbung
AcqKnowledge-SoftwareBIOPAC SystemsAcqKnowledge 4.0Aufnahme und Analyse von Elektrokardiogrammen
Ammoniaklösung, 0,5 % wässrigChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.2528ABläuen während der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
Anilinblau, säurelöslichAladdinA111200-100gHerstellung der Anilinblau-Lösung für die Masson-Trichrom-Färbung
Medizinische sterile HandschuheNanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.-Chemischer und biologischer Schutz
BuprenorphinQinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.H10940181Postoperative Analgesie
Cefazolin-Natrium zur InjektionCSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.-Perioperative antibiotische Prophylaxe
WattestäbchenShijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.-Abtupfen des Epikards und aseptische Vorbereitung
DAPI-FärbelösungThermo FisherD1306Kernmarkierung
EnthaarungscremeVeet-Entfernung von Brusthaaren
Digitaler Objektträger-Scanner3DHISTECHPannoramic MIDI IIGanzpräparat-Bildgebung
ECG-VerstärkerBIOPAC SystemsECG100CVerstärkung des Elektrokardiogramms
Elektrokardiogramm-AufzeichnungssystemBIOPAC SystemsMP160Aufzeichnung von Elektrokardiogrammen
ELISA-Kit, Maus B-Typ-Natriuretisches PeptidQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RXW202726MQuantifizierung von Serum-BNP
ELISA-Kit, Maus Interleukin-1βQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX203063MQuantifizierung von Serum-IL-1β
ELISA-Kit, Maus Nuklearfaktor-κB p65Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX201879MQuantifizierung von Serum-NF-κB p65
ELISA-Kit, Maus Tumornekrosefaktor-αQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX202412MQuantifizierung von Serum-TNF-α
EinbettkassettenJiangsu Shitai22022Gewebeeinbettung
Endotrachealkatheter, 20 GShenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.B11103orale Intubation; Außendurchmesser ca. 0,9–1,0 mm; vor Gebrauch auf ca. 15 mm gekürzt
Eosin Y, alkohollöslichHefei BASF Biotechnology Co., Ltd.Y0310-100Gzytoplasmatische Kontrastfärbung bei der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
Evans-BlauJarvisbioA312001Markierung der Koronarvasculatur
FeinzangeRWD Life ScienceF12011-10Gewebemanipulation und Öffnung des Perikards
Feinzange, mikrochirurgischRWD Life ScienceFC12002T-08mikrochirurgische Gewebemanipulation
FeinschereRWD Life ScienceS12000-09Augenchirurgische Schere für Hautschnitt und Präparation
EisessigChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.-Herstellung von 1 % Essigsäure zur Differenzierung bei der Masson-Trichrom-Färbung
GlasobjektträgerJiangsu Shitai80312/80302Aufbringen von Schnitten
Glasperlen-SterilisatorRWD Life ScienceRS3002Sterilisation von Instrumenten zwischen Tieren
GraphPad Prism-SoftwareGraphPad SoftwareVersion 5.0Statistische Analyse
HeizplatteRWD Life Science69020postoperative Thermoregulation
Hämatoxylin-FärbelösungWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1004Kernfärbung bei der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
Nachweistantikörper, mit Meerrettichperoxidase konjugiertQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.im Lieferumfang der ELISA-Kits enthaltenELISA-Nachweis
SalzsäureChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.1337AHerstellung von Säurealkohol zur Differenzierung von Hämatoxylin
Image-Pro Plus-SoftwareMedia CyberneticsVersion 6.0Quantifizierung des Kollagenvolumenanteils
Imaris-SoftwareBitplaneVersion 7.2.3Dreidimensionale Rekonstruktion und Analyse
IsofluranRWD Life ScienceR510-22-10Inhalationsanästhetikum
Isofluran-AnästhesiesystemRWD Life ScienceTAIJI-IEVerabreichung von Isofluran
Laryngoskop, für KleintiereShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.SR310-MRDirekte Visualisierung während der Intubation
Lichtscheiben-FluoreszenzmikroskopLight Innovation TechnologyLiToneXLDreidimensionale Fluoreszenzbildgebung
LitScan-SoftwareLight Innovation TechnologyVersion 3.31Bildnaht und -umwandlung
BeatmungsgerätChengdu Taimeng Software Co., Ltd.HX-101EMechanische Beatmung; 130 Atemzüge/min; Atemzugvolumen 2 mL
Mikro-MoskitoklemmeRWD Life ScienceFC21001R-12Halten der Nadel während Ligatur und Naht
MikroliterspritzeShanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.-Lokale DAPI-Injektion
MikroplattenreaderMolecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.SpectraMax iD5Messung der optischen Dichte bei 450 nm
Mikroskop, aufrechtes SeziertischmikroskopMaishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.MSD204Intraoperative Visualisierung
Mikroskop, aufrechtes LichtmikroskopLeicaDM500histologische Bildgebung
MikrotomklingenEprediaMX35 ULTRAParaffinschnitttechnik
Modifizierter Sirius-Red-FärbesatzWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1078Kollagenfärbung; enthält Lösung A, B und C
n-ButanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0886Ahistologische Dehydrierung und Klärung; entzündlich
Neutrale EinbettmasseShanghai YiyangYSQN41-91Eindecken von Objektträgern
Nylonnaht, 3/8-Kreis 7-0 mit NadelNingbo Medical Needle Co., Ltd.-Ligatur der linken absteigenden Koronararterie
Nylonnaht, 5-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.-Schließen von Thorax und Haut
Nylonnaht, 6-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.-Exposition und Retraktion der Brustwand
ParaffineinbettstationWuhan Junjie ElectronicsJB-L5Gewebeeinbettung
ParaffinNANAGewebedurchtränkung und -einbettung
phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichP3813Gewässerung von Geweben und Verdünnung von Reagenzien
PhosphormolybdänsäureTianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.-Differenzierung bei der Masson-Trichrom-Färbung
Ponceau 2RAladdinP104989-25gHerstellung der Ponceau–Säurefuchsin-Lösung für die Masson-Trichrom-Färbung
DichromatZhengzhou Paini Chemical Reagent Factory7778-50-9Mordant bei der Masson-Trichrom-Färbung
Povidon–JodSingleLadyGB26368-2010Hautdesinfektion
UmkehrosmosewasserIm Labor gereinigtNicht zutreffendLösungsherstellung
DrehmikrotomLeica Instruments (Shanghai)RM2016Paraffinschnitttechnik
Probenhalter-AdapterLight Innovation Technologyim Lieferumfang von LiToneXL enthaltenBefestigung geklärter Proben für die Lichtscheiben-Bildgebung
HautklebebandQingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.-Befestigung von Gliedmaßen und Schwanz
DeckgläserJiangsu Shitai80340-1630Abdecken von Präparaten
ObjektträgertrocknerShaoxing Luyue101-3BTrocknen von Objektträgern
Stop-LösungQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.im Lieferumfang der ELISA-Kits enthaltenBeendigung der ELISA-Reaktion
Substratlösungen A und BQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.im Lieferumfang der ELISA-Kits enthaltenFarbentwicklung bei ELISA
GewebeschwimmwanneWuhan Junjie ElectronicsJK-5/6Schwebenlassen von Schnitten
GewebeprozessorWuhan Junjie ElectronicsJT-12SAutomatisierte Gewebeverarbeitung
Gewebeklär-Satz, Reagenzien A–FJarvisbioJA11012Lösungsmittelbasierte Gewebeklärung
TrachealintubationsplattformRWD Life ScienceRe20-MPositionierung für orale Intubation
Ultraschall-Analyse-SoftwareFujifilm VisualSonicsVevoLAB 3.2.6Analyse von Echokardiographiedaten
UltraschallgelTianjin Jinya Electronics Co., Ltd.TM-100Kopplung bei Echokardiographie
UltraschallbildgebungssystemFujifilm VisualSonicsVevo 3100Echokardiographie
V-förmiger AugenlidretraktorSuqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.SS5009GRetraktion zwischen den Rippen und der Rippen
WaschpufferQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.im Lieferumfang der ELISA-Kits enthaltenWaschen der ELISA-Platten
WasseraufreinigungssystemSichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.UPT-II-20THerstellung von Umkehrosmosewasser
XylolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0586AGewebeklärung und Entparaffinierung; entzündlich und neurotoxisch

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