miR-488-3p könnte als neuartiger, nicht-invasiver diagnostischer Marker für RA dienen. miR-488-3p moduliert die biologische Funktion von Synoviozyten über ROCK1. Es zeigte eine signifikante negative Korrelation mit der Krankheitsschwere bei RA-Patienten.
Forschungsartikel
Serumexpression von Mir-488-3p dient als nicht-invasiver diagnostischer Biomarker bei Patienten mit rheumatoider Arthritis
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Diagnose der rheumatoiden Arthritis (RA) bleibt aufgrund der Einschränkungen bestehender Biomarker eine Herausforderung. Ziel der Studie war es, das Potenzial von miR-488-3p im Serum als Biomarker für RA zu untersuchen und dessen möglichen Wirkmechanismus aufzuklären. Die Studie umfasste 135 RA-Patienten, 130 Patienten mit Osteoarthritis (OA) und 125 gesunde Kontrollpersonen. Die Expressionsniveaus von miR-488-3p wurden mittels RT-qPCR untersucht. Der Wirkmechanismus wurde durch funktionelle Tests (CCK-8, Durchflusszytometrie, ELISA) und Target-Validierungsexperimente (LUCIFERASE-REPORTERGEN, RIP) analysiert. Die Expression von miR-488-3p im Serum war bei RA-Patienten signifikant niedriger als bei Patienten mit Osteoarthritis (OA) und gesunden Kontrollen (p < 0,001). Die ROC-Kurvenanalyse zeigte, dass miR-488-3p eine hohe diagnostische Genauigkeit bei der Unterscheidung von RA gegenüber gesunden Kontrollen und OA-Patienten aufweist. miR-488-3p korrelierte negativ mit der Erythrozyten-Sedimentationsrate (ESR), C-reaktivem Protein (CRP), rheumatoidem Faktor (RF) und DAS28-Scores. Die funktionelle Validierung ergab, dass eine Überexpression von miR-488-3p die Proliferation und inflammatorische Reaktion von Synoviozyten hemmte und gleichzeitig Apoptose induzierte. Mechanistische Untersuchungen zeigten, dass miR-488-3p direkt das Rho-assoziierte, coiled-coil-haltige Proteinkinase 1 (ROCK1) targeten kann, wodurch seine schützenden Effekte vermittelt werden. Serum-miR-488-3p stellt einen aussichtsreichen, neuartigen, nicht-invasiven diagnostischen Marker für RA dar und schützt Synoviozyten vor Schädigungen.
Einleitung
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine häufige Autoimmunerkrankung, die durch eine Entzündung der Synovialmembran, Gelenkerosion und -zerstörung gekennzeichnet ist1,2. Die globale Prävalenz von RA liegt bei etwa 0,5 %–1 %3, was die Lebensqualität der Patienten und ihre Arbeitsfähigkeit erheblich beeinträchtigt. Die Erkrankung beginnt schleichend, und frühe Symptome sind oft atypisch, leicht fälschlich diagnostizierbar oder werden übersehen4. Im Fortschreiten der Erkrankung kann es zu Gelenkdeformitäten, Funktionsverlust und sogar zu einem erhöhten Risiko für Komplikationen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen kommen5, was eine erhebliche Belastung für die Patienten, ihre Familien und die Gesundheitssysteme darstellt.
Zurzeit ist eine Kombination aus klinischen Symptomen, Befunden, Labortests und bildgebenden Verfahren für die Diagnose der rheumatoiden Arthritis (RA) erforderlich6. Häufig verwendete laborchemische Parameter sind die Blutsenkungsgeschwindigkeit (ESR) und das C-reaktive Protein (CRP), die unspezifische Marker einer systemischen Entzündung darstellen, sowie der rheumatoide Faktor (RF) und Antikörper gegen zyklisches zitruilliniertes Peptid (anti-CCP), die wichtige serologische Biomarker für die RA sind7,8. Diese herkömmlichen Biomarker weisen jedoch Grenzen auf: Der RF kann bei einigen gesunden Personen und Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen positiv sein (falsch-positiver Befund in etwa 5 % der Fälle); anti-CCP ist zwar hochspezifisch (>95 %), weist aber in den frühen Stadien der Erkrankung eine begrenzte Sensitivität auf (etwa 60–70 %)4,9, und einige RA-Patienten bleiben seronegativ10. Daher ist es wichtig, empfindlichere und spezifischere Biomarker für die Frühdiagnose, Krankheitsüberwachung und prognostische Beurteilung der RA zu finden11.
Mikro-RNAs (miRNAs) sind eine Gruppe endogener, nicht-kodierender regulatorischer RNA-Moleküle mit einer Länge von etwa 22–25 Basen12,13. Es wurde festgestellt, dass miRNAs als Schlüsselregulatoren bei der Entstehung einer Vielzahl von Krankheiten wirken, und ihre fehlerhafte Expression steht in engem Zusammenhang mit der Krankheitspathogenese13,14,15, wodurch miRNAs vielversprechende Biomarker für die Krankheitsdiagnose und therapeutische Überwachung darstellen. In den letzten Jahren hat die Rolle von miRNAs bei rheumatoider Arthritis (RA) zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen16. Studien haben gezeigt, dass mehrere miRNAs mit einer dysregulierten Expression (z. B. miR-146a, miR-155 usw.) im Serum, in Synovialgeweben und peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von RA-Patienten assoziiert sind17,18,19. Diese miRNAs tragen zur RA-Pathogenese bei, indem sie die Produktion entzündungsfördernder Zytokine regulieren, die Proliferation und Invasion von Synovialzellen fördern und die Differenzierung von Osteoklasten beeinflussen20. Unter ihnen wird miR-488 auf dem menschlichen Chromosom 1q25.2 lokalisiert21, und frühere Studien haben seine neuroprotektiven Wirkungen bestätigt: Es spielt eine regulatorische Rolle beim Fortschreiten von Gliomen22 und Neuroblastomen23, und bemerkenswerterweise fördert miR-488-3p die Apoptose von chondrozytären Zellen bei Arthrose (OA)24. Obwohl OA und RA unterschiedliche Gelenkerkrankungen sind, teilen sie gemeinsame Mechanismen in den pathologischen Prozessen der Synovialentzündung und Knorpelzerstörung25. Wir vermuteten, dass miR-488-3p durch die Regulation ähnlicher Zielwege möglicherweise auch bei RA eine Rolle spielt. Die spezifische Funktion und die zugrundeliegenden Mechanismen von miR-488-3p bei RA sind jedoch bisher nicht geklärt.
Die Studie untersuchte die Veränderungen der Expression von miR-488-3p im Serum bei Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) sowie deren Zusammenhang mit der Krankheitsaktivität und klinischen Indikatoren, um den potenziellen Wert von miR-488-3p als nicht-invasivem diagnostischem Marker für RA zu bewerten. Diese Studie liefert neue Erkenntnisse für das frühe Screening und die Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei RA und trägt somit zur Verbesserung der Prognose von RA-Patienten bei.
Protokoll
Die Studie wurde von dem Ethikkomitee des Hefei BOE Hospital genehmigt (Genehmigungsnummer 2021–1), und vor der Einschreibung wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche informierte Einwilligung eingeholt.
Patienten und Proben
In diese Studie wurden 135 Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), die gemäß den Klassifikationskriterien von 2010 der ACR/EULAR diagnostiziert wurden, aus der Abteilung für Rheumatologie und Immunologie des Hefei BOE Hospitals, 130 Patienten mit Arthrose (OA), die gemäß den diagnostischen Kriterien der Chinesischen Medizinischen Gesellschaft von 2018 diagnostiziert wurden, aus der Abteilung für Orthopädie sowie 125 alters- und geschlechtsangepasste gesunde Kontrollpersonen aus dem medizinischen Untersuchungszentrum desselben Krankenhauses eingeschlossen. Die Teilnehmer waren zwischen 30 und 80 Jahren alt. Bei den gesunden Kontrollpersonen wurde durch eine umfassende Anamnese, körperliche Untersuchung und laborchemische Tests ausgeschlossen, dass sie an Autoimmunerkrankungen, Gelenkstörungen oder akuten Infektionen litten. Teilnehmer wurden ausgeschlossen, wenn sie an weiteren Autoimmunerkrankungen litten, in den letzten drei Monaten eine Infektion oder ein Trauma erlitten hatten, an einer malignen Erkrankung litten oder schwanger beziehungsweise stillend waren.
Probenahme und Probenvorbereitung
Nüchternes venöses Blut wurde von allen Studienteilnehmern entnommen. Nach Koagulation bei Raumtemperatur für 30 min wurden Serumproben durch Zentrifugation bei 1500 × g für 15 min isoliert. Das Serum wurde bis zur weiteren Analyse bei -80°C gelagert.
Nachweis klinischer und serologischer Marker
Zur umfassenden Beurteilung des Krankheitsstatus und der entzündlichen Aktivität wurden klinische und serologische Biomarker mithilfe standardisierter klinisch-laboratorischer Methoden bestimmt. Die BSG wurde nach der Westergren-Methode gemessen, um eine unspezifische systemische Entzündung zu beurteilen. Das CRP wurde mittels immunoturbidimetrischem Assay quantifiziert (Normalwert: <10 mg/L), um die akute Entzündungsphase zu bewerten. Der Rheumafaktor (RF) wurde mit einem enzymgekoppelten Immunosorbens-Assay (ELISA) gemessen, wobei der Normalwert ≤20 IE/mL beträgt. Anti-CCP-Antikörper wurden mittels ELISA der zweiten Generation bestimmt, um serologische Hinweise für die Diagnose einer rheumatoiden Arthritis (RA) zu liefern.
Zelllinien und Kultur
Humanfibroblast-ähnliche Synovialzellen, die von rheumatoider Arthritis (HFLS-RA) betroffen sind, wurden in Dulbeccos modifiziertem Medium (DMEM) kultiviert, das mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt war. Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ gehalten, und für alle Experimente wurden Zellen zwischen der dritten und sechsten Passage verwendet.
RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-RT-PCR
Gesamt-RNA wurde aus Serumproben unter Verwendung eines RNA-Extraktionsreagenz extrahiert. Die Reverse Transkription wurde unter Verwendung eines miRNA-Erststrang-Synthese-Kits für miRNAs und eines Reverse-Transkriptions-Kits für Boten-RNA-(mRNA-)Zielgene gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) wurde mit einem Echtzeit-PCR-System und einem auf SYBR Green basierenden PCR-Mastermix durchgeführt. Das Thermocycling-Programm wurde auf eine Vor-Denaturierung bei 95 °C für 30 s eingestellt, gefolgt von 40 Zyklen der Amplifikation (Denaturierung bei 95 °C für 5 s und Annealing/Extension bei 60 °C für 30 s). Jede Probe wurde dreifach analysiert. Die kleine nukleäre RNA U6 (U6 snRNA) und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) dienten als endogene Referenzgene zur Normalisierung von miRNA bzw. mRNA. Die Primersequenzen sind in Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Die relativen Expressionsniveaus von miR-488-3p und dessen Zielgenen wurden mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Die Veränderungen der mRNA-Spiegel der Zielgene nach Überexpression oder Hemmung von miR-488-3p wurden ebenfalls analysiert, um deren regulatorische Beziehungen zu überprüfen.
Transfektion von Zellen
HFLS-RA-Zellen wurden in 6-Loch-Platten mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen/Loch ausgesät. Die Zellen wurden unter Verwendung eines liposomalen Transfektionsreagenzes gemäß den Herstelleranweisungen transfiziert. Die Transfektionsgruppen umfassten Einzeltransfektions- und Cotransfektionsgruppen. Die Einzeltransfektionsgruppen waren: 1) Kontrolle – nicht transfizierte Zellen; 2) Mimetikum-Negativkontrolle (NC) – Zellen, die mit der Negativkontrolle des miR-488-3p-Mimetikums transfiziert wurden; 3) miR-488-3p-Mimetikum – Zellen, die mit dem miR-488-3p-Mimetikum transfiziert wurden; 4) Inhibitor-NC – Zellen, die mit der Negativkontrolle des miR-488-3p-Inhibitors transfiziert wurden; 5) miR-488-3p-Inhibitor – Zellen, die mit dem miR-488-3p-Inhibitor transfiziert wurden. Die Cotransfektionsgruppen waren: 1) miR-488-3p-Mimetikum + Überexpression-NC (oe-NC) – Zellen, die mit dem miR-488-3p-Mimetikum und der Negativkontrolle von ROCK1-Überexpressionsvektoren cotransfiziert wurden; 2) miR-488-3p-Mimetikum + oe-ROCK1 – Zellen, die mit dem miR-488-3p-Mimetikum und ROCK1-Überexpressionsvektoren cotransfiziert wurden. Alle Transfektionssequenzen sind in Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Der Überexpressionsvektor für ROCK1 wurde durch Klonierung des kodierenden Sequenzbereichs (CDS) in das pcDNA 3.1-Plasmid hergestellt. Die transfizierten Zellen standen nach 48 Stunden für die folgenden Experimente zur Verfügung.
Test der Zellfunktion
Zellproliferationsassay (Cell Counting Kit-8 [CCK-8]): Transfizierte HFLS-RA-Zellen wurden mit 5 × 103 Zellen/Vertiefung in 96-Well-Platten ausgesät, wobei jede Gruppe drei Wiederholungen umfasste. Nach 0, 24, 48 und 72 h post Transfektion wurden 10 µL CCK-8-Lösung pro Vertiefung zugegeben und anschließend 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde bei 450 nm (Detektionswellenlänge) und 630 nm (Referenzwellenlänge) mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Die relative Proliferationsrate wurde unter Verwendung des Zeitpunkts 0 h als Basislinie berechnet.
Nachweis der Apoptose (Durchflusszytometrie): Die Apoptose wurde mittels Annexin V-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)/Propidiumiodid (PI)-Apoptose-Assay analysiert. Die Zellen wurden mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert und nach Trypsinisierung gesammelt. Die Apoptoserate wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
Entzündungsfaktor-Assay (Enzymgebundener Immunosorbens-Assay [ELISA]): HFLS-RA-Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät und für 48 h mit dem angegebenen miR-488-3p-Mimetikum, dem miR-488-3p-Inhibitor oder den entsprechenden negativen Kontrollen transfiziert. Die Konzentrationen von Interleukin-6 (IL-6), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukin-1β (IL-1β) in den Zellkulturüberständen wurden mithilfe von ELISA-Tests bestimmt.
Validierung des Zielmoleküls
Zielvorhersage: Es wurde vorhergesagt, dass ROCK1 ein downstream-Zielgen von miR-488-3p ist, basierend auf der TargetScan-Datenbank26. Die vorhergesagten Bindungsstellen zwischen miR-488-3p und der ROCK1 3′-unübersetzten Region (3′UTR) wurden ebenfalls identifiziert.
Dual-Luciferase-Reportergen-Assay: Die Wildtyp- oder Mutanten-3′-UTR von ROCK1 wurde in das pGL3-Plasmid kloniert. Die vorhergesagten Bindungs- und Mutationsstellen sind in Abbildung 4 dargestellt. HEK-293T-Zellen wurden gemeinsam mit dem miR-488-3p-Mimetikum oder -Inhibitor und den konstruierten Vektoren transfiziert27. Die Luciferase-Aktivität wurde 48 h nach der Transfektion mit dem miR-488-3p-Mimetikum oder -Inhibitor gemessen.
RNA-Immunpräzipitation (RIP): HFLS-RA-Zellen wurden mit einem Anti-Argonaute-2-(Ago2)-Antikörper (RRID: AB_2882071, 1:200 Verdünnung) oder einem Immunglobulin-G-(IgG)-Kontrollantikörper (RRID: AB_2819160, 1:5000 Verdünnung) inkubiert, gefolgt von der RNA-Extraktion und quantitativer PCR (qPCR) zur Anreicherung von ROCK1-mRNA, wie oben beschrieben.
Statistische Analyse
Die Studie wurde statistisch mit SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) und GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798) analysiert. Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Alle Experimente wurden mit drei biologischen Wiederholungen durchgeführt, und jede biologische Wiederholung wurde dreifach analysiert. Die Rohdaten sind im ergänzenden Material enthalten. Die Daten wurden vor parametrischen statistischen Tests anhand eines Normalverteilungsdiagramms (P-P-Plot) überprüft. Der t-Test für unabhängige Stichproben wurde zum Vergleich stetiger Basisvariablen (z. B. Alter, Body-Mass-Index [BMI] usw.) verwendet, und der Chi-Quadrat-Test wurde für kategoriale Variablen (z. B. Geschlecht usw.) angewandt. Genexpressionsniveaus wurden mittels t-Test für unabhängige Stichproben verglichen. Veränderungen der Zellproliferation zu verschiedenen Zeitpunkten wurden mittels Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (repeated-measures ANOVA) analysiert, während eine einfaktorielle ANOVA zum Vergleich der mittels Durchflusszytometrie bestimmten Apoptoseraten verwendet wurde. Die Korrelationsanalyse erfolgte mit dem Spearman-Korrelationskoeffizienten (für Variablen, die keine Normalverteilung aufwiesen) und dem Pearson-Korrelationskoeffizienten (für Variablen mit Normalverteilung). Die diagnostische Aussagekraft wurde mittels ROC-Kurvenanalyse (receiver operating characteristic) bewertet. Der optimale Cutoff-Wert, die Sensitivität und die Spezifität wurden anhand des maximalen Youden-Index bestimmt. Alle statistischen Tests waren zweiseitig, und ein p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnisse
Grundlegende Merkmale der Studienteilnehmer
Diese Studie umfasste 125 gesunde Kontrollpersonen, 130 Patienten mit Arthrose (OA) und 135 Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) für eine systematische Analyse (Tabelle 1). Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Basislinienmerkmalen der drei Gruppen hinsichtlich des Alters (p = 0,191), des Geschlechterverhältnisses (p = 0,203) und des BMI (p = 0,562), was die Vergleichbarkeit der Studienpopulation sicherstellte. Hinsichtlich der Krankheitsmerkmale waren die Werte für BSG (82,63 ± 40,32 vs. 18,39 ± 6,38 mm/h, p < 0,001) und CRP (56,33 ± 38,07 vs. 10,54 ± 4,98 mg/L, p < 0,001) in der RA-Gruppe signifikant höher als in der OA-Gruppe, was das Ausmaß der systemischen Entzündung widerspiegelt. Gleichzeitig war der Rheumafaktor (RF), ein serologischer Marker, der mit der RA assoziiert ist, bei 70,37 % (95/135) positiv, mit einer signifikant höheren Serumkonzentration (144,13 ± 81,05 vs. 5,10 ± 1,37 IU/mL, p < 0,001); die Positivitätsrate für anti-CCP bei RA-Patienten betrug 56,30 % (76/135), bei einem DAS28-Score von 4,12 ± 1,36.
Expressionsmerkmale und diagnostischer Wert von miR-488-3p bei RA-Patienten
Die Serum-Expressionsmengen von miR-488-3p waren bei RA-Patienten im Vergleich zu OA-Patienten und gesunden Kontrollpersonen signifikant herunterreguliert (p < 0,0001, Abbildung 1A). Die ROC-Kurvenanalyse zeigte, dass miR-488-3p eine hohe diagnostische Genauigkeit bei der Unterscheidung von RA gegenüber OA und gesunden Kontrollen aufwies: Bei der Differenzierung von RA und gesunden Kontrollen betrug der AUC-Wert 0,931 (95 % CI: 0,896–0,967), die Sensitivität 96,15 % (95 % CI: 91,31 %–98,35 %) und die Spezifität 80,95 % (95 % CI: 73,22 %–86,85 %, p < 0,001, Abbildung 1B); bei der Unterscheidung von RA- und OA-Patienten betrug der AUC-Wert 0,800 (95 % CI: 0,747–0,854), die Sensitivität 85,93 % (95 % CI: 79,06 %–90,80 %) und die Spezifität 66,15 % (95 % CI: 57,66 %–73,72 %, p < 0,001, Abbildung 1C). Eine multivariable logistische Regressionsanalyse identifizierte miR-488-3p als unabhängigen Faktor, der mit dem RA-Risiko assoziiert ist (OR = 0,166, 95 % CI: 0,097–0,284; Tabelle 2).
Korrelationsanalyse von miR-488-3p mit klinischen Indikatoren der RA
Die Expressionsebenen von Serum-miR-488-3p waren signifikant negativ mit wichtigen klinischen Indikatoren der RA korreliert, einschließlich BKS, CRP, RF und DAS28 (alle p < 0,001; Tabelle 3). Insbesondere zeigte sich eine negative Korrelation zwischen miR-488-3p und BKS (r = −0,718), CRP (r = −0,726), RF (r = −0,805) sowie dem DAS28-Score (r = −0,836) (Tabelle 3).
Die Überexpression von miR-488-3p hemmt die Zellproliferation und entzündlichen Reaktionen und induziert die Apoptose in HFLS-RA-Zellen
Um den Effekt von miR-488-3p auf die Funktion von HFLS-RA zu untersuchen, modulierten wir dessen Expression durch Transfektion mit Mimics und Inhibitoren. Die RT-qPCR-Analyse bestätigte, dass der Expressionsgrad von miR-488-3p in der miR-488-3p-Mimic-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höher war (p = 0,0001), während der Expressionsgrad in der miR-488-3p-Inhibitor-Gruppe signifikant niedriger lag (p = 0,0003, Abbildung 2A). Der CCK-8-Assay zeigte, dass die Überexpression von miR-488-3p die Zellproliferation hemmte, die nach 24 h, 48 h und 72 h signifikant niedriger war als in der Kontrollgruppe (p = 0,0208, p < 0,0001, p = 0,0036), und dass die Hemmung der miR-488-3p-Expression die Zellproliferation signifikant erhöhte (Abbildung 2B). Die Durchflusszytometrie zeigte, dass die Überexpression von miR-488-3p die Apoptose signifikant förderte (p = 0,0033, Abbildung 2C).
Anschließend führten wir einen ELISA durch, um den Einfluss einer Hochregulierung der miR-488-3p-Expression auf die Spiegel entzündlicher Zytokine zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass bei Überexpression von miR-488-3p die Konzentrationen entzündlicher Zytokine (IL-6, TNF-α und IL-1β) signifikant abnahmen (p < 0,0001, Abbildung 3A-C), während die Hemmung der miR-488-3p-Expression den gegenteiligen Effekt hervorrief. Diese signifikanten regulatorischen Effekte wurden in allen drei unabhängigen biologischen Wiederholungsexperimenten bestätigt, und die negativen Kontrollen zeigten keine signifikanten Veränderungen (p > 0,05).
MiR-488-3p reguliert die Expression von ROCK1-Molekülen
Um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die der Rolle von miR-488-3p beim Fortschreiten der rheumatoiden Arthritis zugrunde liegen, untersuchten wir die downstream liegenden Zielstrukturen von miR-488-3p. Bioinformatische Analysen zeigten, dass eine Bindung von miR-488-3p an den 3'UTR-Bereich von ROCK1 vorhergesagt wurde (Abbildung 4A). Ein duales Luciferase-Reporter-Assay bestätigte, dass die Luciferase-Aktivität signifikant abnahm, wenn der wildtypische ROCK1-3'UTR gemeinsam mit miR-488-3p-Mimetika transfiziert wurde (p < 0,0001), und dass die Luciferase-Aktivität signifikant anstieg, wenn die Expression von miR-488-3p gehemmt wurde (p < 0,0001); hingegen blieb dieser regulatorische Effekt nach Mutation der Bindungsstelle ohne signifikante Veränderung (Abbildung 4B). RIP-Experimente bestätigten diese regulatorische Beziehung weiter, indem sie zeigten, dass der Expressionsgrad von ROCK1-mRNA in mit Ago2-Antikörper angereicherten Komplexen im Vergleich zu IgG-Kontrollen signifikant erhöht war (p < 0,0001, Abbildung 4C).
Darüber hinaus zeigte ROCK1 in klinischen Proben ein expressionsmuster, das dem von miR-488-3p entgegengesetzt war, wobei eine signifikante Hochregulation von ROCK1 im Vergleich zu OA-Patienten und gesunden Kontrollen beobachtet wurde (Abbildung 4D). In HFLS-RA-Zellen zeigte die RT-qPCR, dass eine Überexpression von miR-488-3p zu einer signifikanten Abnahme der ROCK1-Expression führte (p = 0,0093), während die Hemmung von miR-488-3p die ROCK1-Expression signifikant erhöhte (p = 0,0003, Abbildung 4E).
ROCK1 vermittelt die regulatorischen Effekte von miR-488-3p auf HFLS-RA-Zellen
In HFLS-RA-Zellen wurde die Hemmung der ROCK1-Expression durch die Überexpression von miR-488-3p durch die Transfektion mit ROCK1-Überexpressionsvektoren umgekehrt (Abbildung 5A). Ebenso wurde die hemmende Wirkung der miR-488-3p-Überexpression auf die Zellproliferation durch die ROCK1-Überexpression abgeschwächt (Abbildung 5B). Darüber hinaus kehrte die ROCK1-Überexpression auch die durch miR-488-3p verstärkte Apoptose um (Abbildung 5C) und normalisierte die entzündlichen Zytokinspiegel, die durch die Überexpression von miR-488-3p gesenkt worden waren (Abbildung 5D).
Abbildung 1. Expressionsniveaus und diagnostische Leistungsfähigkeit von miR-488-3p bei Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), Osteoarthritis (OA) und gesunden Kontrollpersonen. (A) Vergleich der relativen Expressionsniveaus von miR-488-3p bei RA-Patienten, OA-Patienten und gesunden Kontrollpersonen. (B) Analyse der Receiver-Operating-Characteristic (ROC)-Kurve von miR-488-3p zur Unterscheidung von RA und gesunden Kontrollen. (C) ROC-Kurvenanalyse von miR-488-3p zur Unterscheidung von RA und OA-Patienten. AUC, Fläche unter der Kurve; CI, Konfidenzintervall. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2. Funktionelle Wirkungen von miR-488-3p in HFLS-RA-Zellen. (A) Relative Expression von miR-488-3p in transfizierten HFLS-RA-Zellen, bestimmt mittels quantitativer reverser Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). (B) Wirkungen der Überexpression und Hemmung von miR-488-3p auf die Zellproliferation. (C) Wirkungen der Überexpression und Hemmung von miR-488-3p auf die Apoptose. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. Alle Messungen wurden mit drei biologischen Wiederholungen durchgeführt, jeweils mit drei technischen Wiederholungen. p < 0,05 zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den angegebenen Gruppen an. Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3. Einfluss von miR-488-3p auf die Sekretion entzündungsfördernder Zytokine. (A) Interleukin-6 (IL-6). (B) Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α). (C) Interleukin-1β (IL-1β). Die Zytokinkonzentrationen wurden mittels Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Alle Messungen wurden mit drei biologischen Wiederholungen durchgeführt, jeweils mit drei technischen Wiederholungen. Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4. Validierung des molekularen Mechanismus, der der gezielten Regulation von ROCK1 durch miR-488-3p zugrunde liegt. (A) Vorhergesagte Bindungsstelle von miR-488-3p innerhalb der 3′-unübersetzten Region (3′UTR) von ROCK1. (B) Dualer Luciferase-Reporter-Assay zur Demonstration der Interaktion zwischen miR-488-3p und der wildtypischen oder mutierten ROCK1-3′UTR. (C) RNA-Immunpräzipitations-(RIP-)Assay, der eine Anreicherung von ROCK1-Messenger-RNA (mRNA) in mit Argonaute-2-(Ago2-)Antikörper angereicherten Komplexen zeigt. (D) Relative ROCK1-Expressionsniveaus bei Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), Patienten mit Osteoarthritis (OA) und gesunden Kontrollpersonen. (E) Relative ROCK1-Expression in transfizierten HFLS-RA-Zellen, bestimmt mittels quantitativer reverser Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. Alle Messungen wurden mit drei biologischen Wiederholungen durchgeführt, jeweils mit drei technischen Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 5. Beteiligung von ROCK1 an der Regulation von HFLS-RA-Zellen durch miR-488-3p. (A) Regulation der ROCK1-Expression in HFLS-RA-Zellen nach Zelltransfektion. (B) Auswirkungen einer ROCK1-Überexpression auf die Zellproliferation unter Bedingungen der miR-488-3p-Überexpression. (C) Auswirkungen einer ROCK1-Überexpression auf die Apoptose unter Bedingungen der miR-488-3p-Überexpression. (D) Auswirkungen einer ROCK1-Überexpression auf die Produktion entzündlicher Zytokine unter Bedingungen der miR-488-3p-Überexpression. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. Alle Messungen wurden mit drei biologischen Wiederholungen durchgeführt, jeweils mit drei technischen Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
| Variable | Kontrolle (n = 125) | OA (n = 130) | RA (n = 135) | p-Wert |
| Alter (Jahre) | 55,10 ± 9,30 | 57,21 ± 10,27 | 55,22 ± 11,61 | 0,191 |
| Geschlecht (männlich/weiblich) | 74/51 | 63/67 | 69/66 | 0,203 |
| BMI (kg/m2) | 22,79 ± 1,73 | 22,98 ± 1,98 | 23,04 ± 2,05 | 0,562 |
| Krankheitsdauer (Jahre) | - | 7,96 ± 4,00 | 8,03 ± 3,83 | 0,882 |
| Anti-CCP positiv (n/%) | - | - | 76 (56,30) | - |
| BSG (mm/h) | 18,39 ± 6,38 | 82,63 ± 40,32 | <0,001 | |
| CRP (mg/L) | 10,54 ± 4,98 | 56,33 ± 38,07 | <0,001 | |
| RF positiv | - | - | 95 (70,37) | |
| RF (IU/mL) | - | 5,10 ± 1,37 | 144,13 ± 81,05 | <0,001 |
| DAS28 | - | - | 4,12 ± 1,36 | - |
Tabelle 1: Grundlegende Merkmale der Studienteilnehmer. Die drei Studiengruppen waren bezüglich ihrer demografischen Merkmale vergleichbar. RA-Patienten wiesen erhöhte Entzündungsmarker und RF-Spiegel auf.
| Variable | OR | 95%KI | p-Wert |
| Alter (Jahre) | 1.411 | 0.822–2.422 | 0.211 |
| Geschlecht (männlich/weiblich) | 1.209 | 0.707–2.067 | 0.489 |
| BMI (kg/m2) | 1.336 | 0.778–2.295 | 0.293 |
| Krankheitsdauer (Jahre) | 1.13 | 0.663–1.929 | 0.653 |
| MiR-483-3p | 0.166 | 0.097–0.284 | <0.001 |
Tabelle 2: Unabhängige, durch multivariable logistische Regression ermittelte Faktoren, die mit dem Fortschreiten einer Osteoarthritis zur rheumatoiden Arthritis assoziiert sind. Es wurde festgestellt, dass MiR-488-3p mit dem Risiko für die Entwicklung einer RA bei Patienten mit Osteoarthritis assoziiert ist.
| Elemente | MiR-488-3p (rheumatoide Arthritis) | p-Wert |
| Korrelation (r) | ||
| BSG (mm/h) | -0,718 | <0,001 |
| CRP (mg/L) | -0,726 | <0,001 |
| RF (IU/mL) | -0,805 | <0,001 |
| DAS28 | -0,836 | <0,001 |
Tabelle 3: Korrelationen zwischen miR-488-3p und klinisch-pathologischen Merkmalen von RA-Patienten. miR-488-3p zeigte eine signifikant negative Korrelation mit BSG, CRP, RF und DAS28-Score bei Patienten mit rheumatoider Arthritis.
Erweiterte Tabelle 1. Sequenzinformationen zu Zelltransfektion und PCR-Assay. Zusammenfassung der in der Studie verwendeten Primersequenzen und Transfektionsreagenzien.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Wie Smolen et al.1 in den neuesten Leitlinien zur Diagnose und Behandlung der rheumatoiden Arthritis (RA) hervorheben, besitzt die Entwicklung neuartiger Biomarker einen erheblichen klinischen Wert. In dieser Studie bestätigten wir, dass das serumgebundene miR-488-3p bei Patienten mit RA signifikant herunterreguliert war und eine vielversprechende diagnostische Leistung zeigte, mit relativ zufriedenstellender Sensitivität und Spezifität. Die frühe Diagnose der RA war schon immer eine klinische Herausforderung, und bestehende Biomarker sind für die Diagnose der RA nicht ausreichend sensitiv, wohingegen das signifikante diagnostische Potenzial von miR-488-3p diese Lücke schließen könnte, insbesondere bei der Identifizierung seronegativer RA-Patienten. Im Vergleich zu gesunden Individuen wiesen RA-Patienten eine ausgeprägtere systemische Entzündung auf. Während OA-Patienten hauptsächlich an einer lokalen degenerativen Gelenkstörung leiden, wird häufig eine niedriggradige systemische Entzündung beobachtet. Daher ist die Differenzierungseffizienz von miR-488-3p im Vergleich zu gesunden Individuen deutlich höher als im Vergleich zu OA-Patienten. Die diagnostische Leistung von miR-488-3p wurde nicht direkt mit der etablierter klinischer Biomarker verglichen. Die in dieser Studie eingeschlossenen Patienten wurden gemäß dem aktuellen klinischen Goldstandard für RA diagnostiziert, der etablierte Biomarker wie Anti-CCP-Antikörper, RF, BSG und CRP einbezieht. Zwischen OA- und RA-Patienten wurden signifikante Unterschiede bezüglich dieser Marker beobachtet (Tabelle 1). Daher eignete sich dieser Kollektiv nicht für einen direkten Vergleich der diagnostischen Leistung von miR-488-3p mit diesen etablierten Biomarkern. Solche Vergleiche erfordern eine unabhängige Validierungskohorte.
Darüber hinaus zeigten die Expressionsspiegel von miR-488-3p eine signifikante negative Korrelation mit verschiedenen klinischen Indikatoren der rheumatoiden Arthritis (RA), einschließlich systemischer Entzündungsmarker (ESR, CRP)28 und Autoantikörpern (RF)6. Von besonderer klinischer Bedeutung ist, dass miR-488-3p eine starke negative Korrelation mit dem Disease Activity Score (DAS28) aufwies. DAS28 ist ein zusammengesetzter Index, der die Krankheitsaktivität anhand von Gelenkschwellungen, -druckschmerzlichkeit, Entzündung und dem klinischen Status der Patienten widerspiegelt. Daher legen diese Ergebnisse nahe, dass miR-488-3p als potenzieller Biomarker für die Krankheitsaktivität bei RA dienen könnte. Zudem wird seine regulatorische Rolle in der Pathogenese der RA untermauert, und es könnte den Krankheitsverlauf beeinflussen, indem es entzündliche Signalwege oder autoimmune Reaktionen hemmt29.
In funktionellen Experimenten stellten wir fest, dass miR-488-3p die Proliferation hemmte und die Apoptose von HFLS-RA-Zellen aus RA-Patienten förderte sowie die Produktion entzündlicher Zytokine (IL-6, TNF-α und IL-1β) signifikant verringerte. HFLS-RA-Zellen spielen eine Schlüsselrolle beim pathologischen Prozess der RA30, und ihre fehlgeleitete Proliferation sowie invasives Wachstum können zur Synovialhyperplasie und Gelenkzerstörung führen, während die Überproduktion entzündlicher Faktoren die lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen weiter verschärft31. Daher könnte die Regulation der HFLS-RA-Funktion durch miR-488-3p direkt die synoviale Invasion und Knochenerosion bei RA hemmen und eine theoretische Grundlage für die Entwicklung neuartiger gezielter therapeutischer Strategien bieten. Frühere Studien haben gezeigt, dass andere miRNAs wie miR-155 den Verlauf der RA durch die Regulation der Synoviocytenfunktion beeinflussen können19, was unsere Ergebnisse weiter unterstützt.
Mechanistische Studien zeigten, dass miR-488-3p direkt ROCK1 ansteuern und dessen Expression durch Bindung an dessen 3'UTR hemmen kann. ROCK1 ist ein zentrales Effektorprotein des Rho/ROCK-Signalwegs, der an der Reorganisation des Zytoskeletts, der Entzündungsreaktion und der Fibrose beteiligt ist32. Frühere Untersuchungen zeigten, dass ROCK1 in RA-Synoviozyten hoch exprimiert ist und deren Migration und Invasion fördert33. Wie erwartet, kehrte die Überexpression von ROCK1 die Wirkungen von miR-488-3p auf HFLS-RA-Zellen signifikant um, was auf dessen Beteiligung an der regulatorischen Rolle von miR-488-3p beim Fortschreiten der RA hinweist.
Es bleibt jedoch noch viel Arbeit für zukünftige Forschungsarbeiten zu leisten. Die Expression von miR-488-3p in klinischen Proben wurde mittels RT-qPCR mit U6 als internem Referenzgen evaluiert. Frühere Studien berichteten widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der Stabilität von U6, insbesondere in zirkulierenden Proben wie Serum. Obwohl im vorliegenden Studiendesign Vorversuche durchgeführt wurden, um die Stabilität von U6 sicherzustellen, bleibt die potenzielle Variabilität von U6 eine Limitation und erhöht damit das Risiko einer Fehldiagnose. Eine weitere Validierung unter Verwendung stabilerer interner Referenzgene ist erforderlich. Andererseits basierte die klinische Bewertung von miR-488-3p auf einer Einzelzentrum-Kohorte ohne externe Validierung. Die Stichprobengröße war relativ klein und auf das Krankenhausniveau begrenzt. Zudem fehlte ein longitudinales Follow-up zur Beurteilung des prognostischen Werts von miR-488-3p. Diese Limitationen sollten in zukünftigen Studien adressiert werden. Darüber hinaus zeigen einige Studien, dass in vivo Die Abgabe von miRNAs stellt weiterhin eine große Herausforderung für die klinische Übertragung dar34Zukünftige Studien könnten das therapeutische Potenzial von miR-488-3p in vivo überprüfen, indem sie konditionale Knockout-Mäuse erzeugen oder gezielte Abgabesysteme wie Nanotransporter verwenden.35.
Zusammenfassend zeigte diese Studie den potenziellen Wert von miR-488-3p für die Diagnose und mögliche therapeutische Zielgerichtetheit bei RA auf. MiR-488-3p wies eine hohe diagnostische Leistungsfähigkeit auf und hemmte die Proliferation sowie entzündliche Reaktionen von HFLS-RA-Zellen, während es die Apoptose förderte. Dies legt nahe, dass es ein aussichtsreiches Ziel für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien bei RA darstellen könnte. Künftige Forschungsarbeiten sollten sich auf 1) die Validierung der diagnostischen Stabilität von miR-488-3p in großen, multizentrischen Kohorten, 2) die Erforschung seiner synergistischen Effekte mit bestehenden therapeutischen Wirkstoffen, wie JAK-Inhibitoren oder Biologika28, und 3) die Optimierung der miRNA-Abgabesysteme zur Verbesserung ihrer klinischen Übertragbarkeit konzentrieren36.
VERFÜGBARKEIT VON DATEN:
Die Rohdaten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind in den ergänzenden Materialien enthalten, die mit diesem Manuskript eingereicht wurden.
Offenlegungen
Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC Apoptose-Nachweiskit | BD Bioscience | 556547 | Apoptose von Zellen |
| anti-Ago2 Antikörper | Proteintech | 66720-1-Ig | RNA-Immunpräzipitation |
| CCK-8 Lösung | Dojindo | CK04 | Zellproliferation |
| Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 121000146 | Zellkultur |
| Fetales Rinderserum | Thermo Fisher | 10437028 | Zellkultur |
| Durchflusszytometer | BD Bioscience | FACSCalibur | Apoptose von Zellen |
| ELISA-Kit für humanen anti-CCP-Antikörper | Cusabio | CSB-E09077h | Nachweis von anti-CCP |
| ELISA-Kit für humanes RF-IgA | Feien Biotechnology | EH4270 | Nachweis von RF |
| Humaner rheumatoide Arthritis fibroblastenähnlicher Synoviozyt (HFLS-RA) | Cell Applications | HFLS-RA-200 | In-vitro-Validierung der Funktion von miR-488-3p |
| IgG-Kontrollantikörper | Abcam | ab205718 | RNA-Immunpräzipitation |
| Interleukin-1β (IL-1β)-ELISA-Kit | R&D Systems | DY201-05 | zelluläre IL-1β-Konzentration |
| Interleukin-6 (IL-6)-ELISA-Kit | R&D Systems | D6050B | zelluläre IL-6-Konzentration |
| Liposom-Transfektionsreagenz 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | Zelltransfektion |
| Mikroplattenreader | BioTek | ELx808 | ELISA-Assay |
| Mir-XTM miRNA Erststrang-Synthesekit | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | Reverse Transkription |
| Opti-MEM Medium | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | Zelltransfektion |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | Überexpression von ROCK1 |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Zellkultur |
| Phadia 250 Labor-System | Thermo Fisher | Phadia 250 | Blutanalyse |
| PrimeScriptTM Reverse Transkription Kit | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | Reverse Transkription |
| Propidiumiodid (PI)/Ribonuklease (RNase) | BD Bioscience | 550825 | Apoptose von Zellen |
| QuantStudio 5 System | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | PCR-Assay |
| RNAiso Plus Reagenz | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | RNA-Isolierung |
| SYBR Green Premix Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | PCR-Amplifikation |
| TargetScan-Datenbank | TargetScan | N/A | Vorhersage von Bindungsstellen, (https://www.targetscan.org/) |
| Tina-quant C-reaktives Protein IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | CRP-Nachweis |
| Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α)-ELISA-Kit | R&D Systems | DY210-05 | zelluläre TNF-α-Konzentration |
Referenzen
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