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Forschungsartikel
miR-488-3p könnte als neuartiger, nicht-invasiver diagnostischer Marker für RA dienen. miR-488-3p moduliert die biologische Funktion von Synoviozyten über ROCK1. Es zeigte eine signifikante negative Korrelation mit der Krankheitsschwere bei RA-Patienten.
Die Diagnose der rheumatoiden Arthritis (RA) bleibt aufgrund der Einschränkungen bestehender Biomarker eine Herausforderung. Ziel der Studie war es, das Potenzial von miR-488-3p im Serum als Biomarker für RA zu untersuchen und dessen möglichen Wirkmechanismus aufzuklären. Die Studie umfasste 135 RA-Patienten, 130 Patienten mit Osteoarthritis (OA) und 125 gesunde Kontrollpersonen. Die Expressionsniveaus von miR-488-3p wurden mittels RT-qPCR untersucht. Der Wirkmechanismus wurde durch funktionelle Tests (CCK-8, Durchflusszytometrie, ELISA) und Target-Validierungsexperimente (LUCIFERASE-REPORTERGEN, RIP) analysiert. Die Expression von miR-488-3p im Serum war bei RA-Patienten signifikant niedriger als bei Patienten mit Osteoarthritis (OA) und gesunden Kontrollen (p < 0,001). Die ROC-Kurvenanalyse zeigte, dass miR-488-3p eine hohe diagnostische Genauigkeit bei der Unterscheidung von RA gegenüber gesunden Kontrollen und OA-Patienten aufweist. miR-488-3p korrelierte negativ mit der Erythrozyten-Sedimentationsrate (ESR), C-reaktivem Protein (CRP), rheumatoidem Faktor (RF) und DAS28-Scores. Die funktionelle Validierung ergab, dass eine Überexpression von miR-488-3p die Proliferation und inflammatorische Reaktion von Synoviozyten hemmte und gleichzeitig Apoptose induzierte. Mechanistische Untersuchungen zeigten, dass miR-488-3p direkt das Rho-assoziierte, coiled-coil-haltige Proteinkinase 1 (ROCK1) targeten kann, wodurch seine schützenden Effekte vermittelt werden. Serum-miR-488-3p stellt einen aussichtsreichen, neuartigen, nicht-invasiven diagnostischen Marker für RA dar und schützt Synoviozyten vor Schädigungen.
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine häufige Autoimmunerkrankung, die durch eine Entzündung der Synovialmembran, Gelenkerosion und -zerstörung gekennzeichnet ist1,2. Die globale Prävalenz von RA liegt bei etwa 0,5 %–1 %3, was die Lebensqualität der Patienten und ihre Arbeitsfähigkeit erheblich beeinträchtigt. Die Erkrankung beginnt schleichend, und frühe Symptome sind oft atypisch, leicht fälschlich diagnostizierbar oder werden übersehen4. Im Fortschreiten der Erkrankung kann es zu Gelenkdeformitäten, Funktionsverlust und sogar zu einem erhöhten Risiko für Komplikationen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen kommen5, was eine erhebliche Belastung für die Patienten, ihre Familien und die Gesundheitssysteme darstellt.
Zurzeit ist eine Kombination aus klinischen Symptomen, Befunden, Labortests und bildgebenden Verfahren für die Diagnose der rheumatoiden Arthritis (RA) erforderlich6. Häufig verwendete laborchemische Parameter sind die Blutsenkungsgeschwindigkeit (ESR) und das C-reaktive Protein (CRP), die unspezifische Marker einer systemischen Entzündung darstellen, sowie der rheumatoide Faktor (RF) und Antikörper gegen zyklisches zitruilliniertes Peptid (anti-CCP), die wichtige serologische Biomarker für die RA sind7,8. Diese herkömmlichen Biomarker weisen jedoch Grenzen auf: Der RF kann bei einigen gesunden Personen und Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen positiv sein (falsch-positiver Befund in etwa 5 % der Fälle); anti-CCP ist zwar hochspezifisch (>95 %), weist aber in den frühen Stadien der Erkrankung eine begrenzte Sensitivität auf (etwa 60–70 %)4,9, und einige RA-Patienten bleiben seronegativ10. Daher ist es wichtig, empfindlichere und spezifischere Biomarker für die Frühdiagnose, Krankheitsüberwachung und prognostische Beurteilung der RA zu finden11.
Mikro-RNAs (miRNAs) sind eine Gruppe endogener, nicht-kodierender regulatorischer RNA-Moleküle mit einer Länge von etwa 22–25 Basen12,13. Es wurde festgestellt, dass miRNAs als Schlüsselregulatoren bei der Entstehung einer Vielzahl von Krankheiten wirken, und ihre fehlerhafte Expression steht in engem Zusammenhang mit der Krankheitspathogenese13,14,15, wodurch miRNAs vielversprechende Biomarker für die Krankheitsdiagnose und therapeutische Überwachung darstellen. In den letzten Jahren hat die Rolle von miRNAs bei rheumatoider Arthritis (RA) zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen16. Studien haben gezeigt, dass mehrere miRNAs mit einer dysregulierten Expression (z. B. miR-146a, miR-155 usw.) im Serum, in Synovialgeweben und peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von RA-Patienten assoziiert sind17,18,19. Diese miRNAs tragen zur RA-Pathogenese bei, indem sie die Produktion entzündungsfördernder Zytokine regulieren, die Proliferation und Invasion von Synovialzellen fördern und die Differenzierung von Osteoklasten beeinflussen20. Unter ihnen wird miR-488 auf dem menschlichen Chromosom 1q25.2 lokalisiert21, und frühere Studien haben seine neuroprotektiven Wirkungen bestätigt: Es spielt eine regulatorische Rolle beim Fortschreiten von Gliomen22 und Neuroblastomen23, und bemerkenswerterweise fördert miR-488-3p die Apoptose von chondrozytären Zellen bei Arthrose (OA)24. Obwohl OA und RA unterschiedliche Gelenkerkrankungen sind, teilen sie gemeinsame Mechanismen in den pathologischen Prozessen der Synovialentzündung und Knorpelzerstörung25. Wir vermuteten, dass miR-488-3p durch die Regulation ähnlicher Zielwege möglicherweise auch bei RA eine Rolle spielt. Die spezifische Funktion und die zugrundeliegenden Mechanismen von miR-488-3p bei RA sind jedoch bisher nicht geklärt.
Die Studie untersuchte die Veränderungen der Expression von miR-488-3p im Serum bei Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) sowie deren Zusammenhang mit der Krankheitsaktivität und klinischen Indikatoren, um den potenziellen Wert von miR-488-3p als nicht-invasivem diagnostischem Marker für RA zu bewerten. Diese Studie liefert neue Erkenntnisse für das frühe Screening und die Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei RA und trägt somit zur Verbesserung der Prognose von RA-Patienten bei.
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Die Studie wurde von dem Ethikkomitee des Hefei BOE Hospital genehmigt (Genehmigungsnummer 2021–1), und vor der Einschreibung wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche informierte Einwilligung eingeholt.
Patienten und Proben
In diese Studie wurden 135 Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), die gemäß den Klassifikationskriterien von 2010 der ACR/EULAR diagnostiziert wurden, aus der Abteilung für Rheumatologie und Immunologie des Hefei BOE Hospitals, 130 Patienten mit Arthrose (OA), die gemäß den diagnostischen Kriterien der Chinesischen Medizinischen Gesellschaft von 2018 diagnostiziert wurden, aus der Abteilung für Orthopädie sowie 125 alters- und geschlechtsangepasste gesunde Kontrollpersonen aus dem medizinischen Untersuchungszentrum desselben Krankenhauses eingeschlossen. Die Teilnehmer waren zwischen 30 und 80 Jahren alt. Bei den gesunden Kontrollpersonen wurde durch eine umfassende Anamnese, körperliche Untersuchung und laborchemische Tests ausgeschlossen, dass sie an Autoimmunerkrankungen, Gelenkstörungen oder akuten Infektionen litten. Teilnehmer wurden ausgeschlossen, wenn sie an weiteren Autoimmunerkrankungen litten, in den letzten drei Monaten eine Infektion oder ein Trauma erlitten hatten, an einer malignen Erkrankung litten oder schwanger beziehungsweise stillend waren.
Probenahme und Probenvorbereitung
Nüchternes venöses Blut wurde von allen Studienteilnehmern entnommen. Nach Koagulation bei Raumtemperatur für 30 min wurden Serumproben durch Zentrifugation bei 1500 × g für 15 min isoliert. Das Serum wurde bis zur weiteren Analyse bei -80°C gelagert.
Nachweis klinischer und serologischer Marker
Zur umfassenden Beurteilung des Krankheitsstatus und der entzündlichen Aktivität wurden klinische und serologische Biomarker mithilfe standardisierter klinisch-laboratorischer Methoden bestimmt. Die BSG wurde nach der Westergren-Methode gemessen, um eine unspezifische systemische Entzündung zu beurteilen. Das CRP wurde mittels immunoturbidimetrischem Assay quantifiziert (Normalwert: <10 mg/L), um die akute Entzündungsphase zu bewerten. Der Rheumafaktor (RF) wurde mit einem enzymgekoppelten Immunosorbens-Assay (ELISA) gemessen, wobei der Normalwert ≤20 IE/mL beträgt. Anti-CCP-Antikörper wurden mittels ELISA der zweiten Generation bestimmt, um serologische Hinweise für die Diagnose einer rheumatoiden Arthritis (RA) zu liefern.
Zelllinien und Kultur
Humanfibroblast-ähnliche Synovialzellen, die von rheumatoider Arthritis (HFLS-RA) betroffen sind, wurden in Dulbeccos modifiziertem Medium (DMEM) kultiviert, das mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt war. Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ gehalten, und für alle Experimente wurden Zellen zwischen der dritten und sechsten Passage verwendet.
RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-RT-PCR
Gesamt-RNA wurde aus Serumproben unter Verwendung eines RNA-Extraktionsreagenz extrahiert. Die Reverse Transkription wurde unter Verwendung eines miRNA-Erststrang-Synthese-Kits für miRNAs und eines Reverse-Transkriptions-Kits für Boten-RNA-(mRNA-)Zielgene gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) wurde mit einem Echtzeit-PCR-System und einem auf SYBR Green basierenden PCR-Mastermix durchgeführt. Das Thermocycling-Programm wurde auf eine Vor-Denaturierung bei 95 °C für 30 s eingestellt, gefolgt von 40 Zyklen der Amplifikation (Denaturierung bei 95 °C für 5 s und Annealing/Extension bei 60 °C für 30 s). Jede Probe wurde dreifach analysiert. Die kleine nukleäre RNA U6 (U6 snRNA) und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) dienten als endogene Referenzgene zur Normalisierung von miRNA bzw. mRNA. Die Primersequenzen sind in Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Die relativen Expressionsniveaus von miR-488-3p und dessen Zielgenen wurden mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Die Veränderungen der mRNA-Spiegel der Zielgene nach Überexpression oder Hemmung von miR-488-3p wurden ebenfalls analysiert, um deren regulatorische Beziehungen zu überprüfen.
Transfektion von Zellen
HFLS-RA-Zellen wurden in 6-Loch-Platten mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen/Loch ausgesät. Die Zellen wurden unter Verwendung eines liposomalen Transfektionsreagenzes gemäß den Herstelleranweisungen transfiziert. Die Transfektionsgruppen umfassten Einzeltransfektions- und Cotransfektionsgruppen. Die Einzeltransfektionsgruppen waren: 1) Kontrolle – nicht transfizierte Zellen; 2) Mimetikum-Negativkontrolle (NC) – Zellen, die mit der Negativkontrolle des miR-488-3p-Mimetikums transfiziert wurden; 3) miR-488-3p-Mimetikum – Zellen, die mit dem miR-488-3p-Mimetikum transfiziert wurden; 4) Inhibitor-NC – Zellen, die mit der Negativkontrolle des miR-488-3p-Inhibitors transfiziert wurden; 5) miR-488-3p-Inhibitor – Zellen, die mit dem miR-488-3p-Inhibitor transfiziert wurden. Die Cotransfektionsgruppen waren: 1) miR-488-3p-Mimetikum + Überexpression-NC (oe-NC) – Zellen, die mit dem miR-488-3p-Mimetikum und der Negativkontrolle von ROCK1-Überexpressionsvektoren cotransfiziert wurden; 2) miR-488-3p-Mimetikum + oe-ROCK1 – Zellen, die mit dem miR-488-3p-Mimetikum und ROCK1-Überexpressionsvektoren cotransfiziert wurden. Alle Transfektionssequenzen sind in Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Der Überexpressionsvektor für ROCK1 wurde durch Klonierung des kodierenden Sequenzbereichs (CDS) in das pcDNA 3.1-Plasmid hergestellt. Die transfizierten Zellen standen nach 48 Stunden für die folgenden Experimente zur Verfügung.
Test der Zellfunktion
Zellproliferationsassay (Cell Counting Kit-8 [CCK-8]): Transfizierte HFLS-RA-Zellen wurden mit 5 × 103 Zellen/Vertiefung in 96-Well-Platten ausgesät, wobei jede Gruppe drei Wiederholungen umfasste. Nach 0, 24, 48 und 72 h post Transfektion wurden 10 µL CCK-8-Lösung pro Vertiefung zugegeben und anschließend 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde bei 450 nm (Detektionswellenlänge) und 630 nm (Referenzwellenlänge) mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Die relative Proliferationsrate wurde unter Verwendung des Zeitpunkts 0 h als Basislinie berechnet.
Nachweis der Apoptose (Durchflusszytometrie): Die Apoptose wurde mittels Annexin V-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)/Propidiumiodid (PI)-Apoptose-Assay analysiert. Die Zellen wurden mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert und nach Trypsinisierung gesammelt. Die Apoptoserate wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
Entzündungsfaktor-Assay (Enzymgebundener Immunosorbens-Assay [ELISA]): HFLS-RA-Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät und für 48 h mit dem angegebenen miR-488-3p-Mimetikum, dem miR-488-3p-Inhibitor oder den entsprechenden negativen Kontrollen transfiziert. Die Konzentrationen von Interleukin-6 (IL-6), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukin-1β (IL-1β) in den Zellkulturüberständen wurden mithilfe von ELISA-Tests bestimmt.
Validierung des Zielmoleküls
Zielvorhersage: Es wurde vorhergesagt, dass ROCK1 ein downstream-Zielgen von miR-488-3p ist, basierend auf der TargetScan-Datenbank26. Die vorhergesagten Bindungsstellen zwischen miR-488-3p und der ROCK1 3′-unübersetzten Region (3′UTR) wurden ebenfalls identifiziert.
Dual-Luciferase-Reportergen-Assay: Die Wildtyp- oder Mutanten-3′-UTR von ROCK1 wurde in das pGL3-Plasmid kloniert. Die vorhergesagten Bindungs- und Mutationsstellen sind in Abbildung 4 dargestellt. HEK-293T-Zellen wurden gemeinsam mit dem miR-488-3p-Mimetikum oder -Inhibitor und den konstruierten Vektoren transfiziert27. Die Luciferase-Aktivität wurde 48 h nach der Transfektion mit dem miR-488-3p-Mimetikum oder -Inhibitor gemessen.
RNA-Immunpräzipitation (RIP): HFLS-RA-Zellen wurden mit einem Anti-Argonaute-2-(Ago2)-Antikörper (RRID: AB_2882071, 1:200 Verdünnung) oder einem Immunglobulin-G-(IgG)-Kontrollantikörper (RRID: AB_2819160, 1:5000 Verdünnung) inkubiert, gefolgt von der RNA-Extraktion und quantitativer PCR (qPCR) zur Anreicherung von ROCK1-mRNA, wie oben beschrieben.
Statistische Analyse
Die Studie wurde statistisch mit SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) und GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798) analysiert. Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Alle Experimente wurden mit drei biologischen Wiederholungen durchgeführt, und jede biologische Wiederholung wurde dreifach analysiert. Die Rohdaten sind im ergänzenden Material enthalten. Die Daten wurden vor parametrischen statistischen Tests anhand eines Normalverteilungsdiagramms (P-P-Plot) überprüft. Der t-Test für unabhängige Stichproben wurde zum Vergleich stetiger Basisvariablen (z. B. Alter, Body-Mass-Index [BMI] usw.) verwendet, und der Chi-Quadrat-Test wurde für kategoriale Variablen (z. B. Geschlecht usw.) angewandt. Genexpressionsniveaus wurden mittels t-Test für unabhängige Stichproben verglichen. Veränderungen der Zellproliferation zu verschiedenen Zeitpunkten wurden mittels Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (repeated-measures ANOVA) analysiert, während eine einfaktorielle ANOVA zum Vergleich der mittels Durchflusszytometrie bestimmten Apoptoseraten verwendet wurde. Die Korrelationsanalyse erfolgte mit dem Spearman-Korrelationskoeffizienten (für Variablen, die keine Normalverteilung aufwiesen) und dem Pearson-Korrelationskoeffizienten (für Variablen mit Normalverteilung). Die diagnostische Aussagekraft wurde mittels ROC-Kurvenanalyse (receiver operating characteristic) bewertet. Der optimale Cutoff-Wert, die Sensitivität und die Spezifität wurden anhand des maximalen Youden-Index bestimmt. Alle statistischen Tests waren zweiseitig, und ein p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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Grundlegende Merkmale der Studienteilnehmer
Diese Studie umfasste 125 gesunde Kontrollpersonen, 130 Patienten mit Arthrose (OA) und 135 Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) für eine systematische Analyse (Tabelle 1). Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Basislinienmerkmalen der drei Gruppen hinsichtlich des Alters (p = 0,191), des Geschlechterverhältnisses (p = 0,203) und des BMI (p = 0,562), was die Vergleichbarkeit d...
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Wie Smolen et al.1 in den neuesten Leitlinien zur Diagnose und Behandlung der rheumatoiden Arthritis (RA) hervorheben, besitzt die Entwicklung neuartiger Biomarker einen erheblichen klinischen Wert. In dieser Studie bestätigten wir, dass das serumgebundene miR-488-3p bei Patienten mit RA signifikant herunterreguliert war und eine vielversprechende diagnostische Leistung zeigte, mit relativ zufriedenstellender Sensitivität und Spezifität. Die frühe Diagnose der RA war schon immer eine klinische Her...
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Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC Apoptose-Nachweiskit | BD Bioscience | 556547 | Apoptose von Zellen |
| anti-Ago2 Antikörper | Proteintech | 66720-1-Ig | RNA-Immunpräzipitation |
| CCK-8 Lösung | Dojindo | CK04 | Zellproliferation |
| Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 121000146 | Zellkultur |
| Fetales Rinderserum | Thermo Fisher | 10437028 | Zellkultur |
| Durchflusszytometer | BD Bioscience | FACSCalibur | Apoptose von Zellen |
| ELISA-Kit für humanen anti-CCP-Antikörper | Cusabio | CSB-E09077h | Nachweis von anti-CCP |
| ELISA-Kit für humanes RF-IgA | Feien Biotechnology | EH4270 | Nachweis von RF |
| Humaner rheumatoide Arthritis fibroblastenähnlicher Synoviozyt (HFLS-RA) | Cell Applications | HFLS-RA-200 | In-vitro-Validierung der Funktion von miR-488-3p |
| IgG-Kontrollantikörper | Abcam | ab205718 | RNA-Immunpräzipitation |
| Interleukin-1β (IL-1β)-ELISA-Kit | R&D Systems | DY201-05 | zelluläre IL-1β-Konzentration |
| Interleukin-6 (IL-6)-ELISA-Kit | R&D Systems | D6050B | zelluläre IL-6-Konzentration |
| Liposom-Transfektionsreagenz 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | Zelltransfektion |
| Mikroplattenreader | BioTek | ELx808 | ELISA-Assay |
| Mir-XTM miRNA Erststrang-Synthesekit | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | Reverse Transkription |
| Opti-MEM Medium | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | Zelltransfektion |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | Überexpression von ROCK1 |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Zellkultur |
| Phadia 250 Labor-System | Thermo Fisher | Phadia 250 | Blutanalyse |
| PrimeScriptTM Reverse Transkription Kit | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | Reverse Transkription |
| Propidiumiodid (PI)/Ribonuklease (RNase) | BD Bioscience | 550825 | Apoptose von Zellen |
| QuantStudio 5 System | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | PCR-Assay |
| RNAiso Plus Reagenz | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | RNA-Isolierung |
| SYBR Green Premix Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | PCR-Amplifikation |
| TargetScan-Datenbank | TargetScan | N/A | Vorhersage von Bindungsstellen, (https://www.targetscan.org/) |
| Tina-quant C-reaktives Protein IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | CRP-Nachweis |
| Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α)-ELISA-Kit | R&D Systems | DY210-05 | zelluläre TNF-α-Konzentration |
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