Diese Studie zeigte, dass LUS und serummiR-486-3p bei Neugeborenen mit akutem Atemnotsyndrom (ARDS) erhöht waren. Die kombinierte Bewertung verbesserte die Vorhersage von Krankheitsschwere und Prognose, und es wurde festgestellt, dass miR-486-3p die Funktion von ARDS-Modellzellen durch gezielte Beeinflussung des Delta-ähnlichen kanonischen Notch-Liganden 4 reguliert.
Forschungsartikel
Prognostischer Wert des Lungenultraschall-Scores und des Serum-miR-486-3p beim neonatalen akuten Atemnotsyndrom
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die vorliegende Studie zielte darauf ab, den prognostischen Wert der Lungenultraschall-Score (LUS) und des serumgebundenen miR-486-3p bei der akuten respiratorischen Distress-Syndrom (ARDS) des Neugeborenen zu bewerten und den zugrundeliegenden Wirkmechanismus zu untersuchen. Insgesamt wurden 112 Neugeborene mit ARDS und 100 gesunde Säuglinge, die im gleichen Zeitraum geboren wurden, in die Studien- bzw. gesunde Kontrollgruppe eingeschlossen. Jedes Neugeborene erhielt innerhalb von 6 Stunden nach Aufnahme auf die Intensivstation eine Lungenultraschalluntersuchung, anhand derer der LUS ermittelt wurde. Die Genexpression wurde mittels Echtzeit-quantitativer PCR quantifiziert, während die Leistungsfähigkeit der Prognoseabschätzung und Korrelationen mittels ROC-Kurvenanalyse (Receiver Operating Characteristic) und Pearsonscher Korrelationsanalyse bewertet wurden. Darüber hinaus wurde ein ARDS-Modell in vitro unter Verwendung von HPMECs etabliert, um den zugrundeliegenden Mechanismus von miR-486-3p zu erforschen. Ein Dual-Luciferase-Reporter-Assay wurde durchgeführt, um die Zielbeziehung zwischen miR-486-3p und dem Delta-ähnlichen kanonischen Notch-Liganden 4 (DLL4) zu verifizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass LUS und serumgebundenes miR-486-3p bei Neugeborenen mit ARDS signifikant hochreguliert waren. Die ROC-Kurvenanalyse ergab, dass sowohl miR-486-3p als auch LUS die Prognose bei neugeborenen ARDS-Patienten vorhersagen konnten (AUC = 0,883 und 0,873; Sensitivität: 96,4 % und 89,3 %; Spezifität: 77,4 % und 73,8 %). Die Kombination aus miR-486-3p und LUS wies eine bessere Vorhersageleistung auf (AUC = 0,929; Sensitivität: 92,9 %; Spezifität: 84,5 %). Mechanistisch gesehen regulierte miR-486-3p über die gezielte Beeinflussung von DLL4 die biologischen Funktionen der ARDS-Modellzellen. Insgesamt könnte die kombinierte Beurteilung von LUS und serumgebundenem miR-486-3p ein aussichtsreiches Verfahren zur Einschätzung des Schweregrads und zur Prognoseabschätzung bei Neugeborenen mit ARDS darstellen. Weitere multizentrische Validierungen sind jedoch erforderlich, um die allgemeine Anwendbarkeit zu bestätigen.
Einleitung
Das akute respiratorische Distresssyndrom (ARDS) des Neugeborenen ist eine lebensbedrohliche, schwere Atemwegserkrankung, die hauptsächlich durch eine gestörte Funktion des alveolären Surfactants gekennzeichnet ist und die Überlebenschancen von Neugeborenen erheblich gefährdet1,2. Trotz der Entwicklung verschiedener Behandlungsmodalitäten bleibt die Gesamtprognose für betroffene Neugeborene unbefriedigend3. Eine frühzeitige Einschätzung des Schweregrads der Erkrankung sowie eine genaue prognostische Beurteilung sind daher entscheidend, um klinische Maßnahmen zu optimieren und die Behandlungsergebnisse zu verbessern. Sobald sich ein ARDS entwickelt hat, ist die Lungenfunktion des Neugeborenen erheblich beeinträchtigt, begleitet von einer gestörten Ventilation und Gasaustauschstörungen4. Die Lungenultraschalluntersuchung kann als primäre bildgebende Methode zur Überwachung der Ventilation beim ARDS angesehen werden5. Sie hat sich als bevorzugtes bildgebendes Verfahren am Bett des Patienten zur Beobachtung pulmonaler Läsionen beim ARDS etabliert, und der Lungenultraschall-Score (LUS) wird häufig zur Diagnose akuter Atemwegserkrankungen des Neugeborenen sowie zur Beurteilung von Schweregrad und Prognose in der intensivmedizinischen Versorgung eingesetzt6. Einzelne bildgebende Verfahren oder Labortests weisen jedoch inhärente Nachteile auf und können den klinischen Beurteilungsbedarf nicht vollständig abdecken7. Daher ist die Erforschung neuer Biomarker zur Entwicklung eines kombinierten Bewertungssystems von großer klinischer Bedeutung.
Micro-RNA (miRNA) stellt eine neuartige Klasse von Genregulationsfaktoren dar, die eine entscheidende Rolle in der Pathogenese des ARDS spielen8. Beispielsweise ist das herunterregulierte miR-141-3p eng mit der Krankheitsschwere bei Lungenfibrose und Lungenschädigung assoziiert9. miR-124-3p wirkt als Schutzfaktor für ARDS, indem es p65 gezielt beeinflusst10. Frühere Hochdurchsatz-Sequenzierungsstudien haben bestätigt, dass miR-486-3p bei Patienten mit ARDS signifikant hochreguliert ist11. Aktuelle Forschungsergebnisse haben die hsa_circ_0006892/miR-486-3p-Achse als potenziellen molekularen Mechanismus hervorgehoben, der an der Entstehung des ARDS beteiligt ist12. Diese Befunde legen nahe, dass miR-486-3p eng mit ARDS verknüpft ist. Dennoch bleibt der prognostische und prädiktive Wert von miR-486-3p hinsichtlich der Schwere und des Krankheitsverlaufs des neonatalen ARDS weiterhin unvollständig geklärt.
Derzeit sind die Thoraxröntgenaufnahme, die Blutgasanalyse und der Nachweis einzelner Biomarker die gängigen Methoden zur Beurteilung des neonatalen ARDS. Die Bildgebung des Thorax beinhaltet eine Strahlenexposition und ermöglicht keine Echtzeit-Überwachung mit wiederholten Messungen. Die Blutgasanalyse spiegelt lediglich die akute respiratorische Funktion wider und besitzt keine prognostische Aussagekraft hinsichtlich des Langzeitverlaufs. Der Nachweis einzelner Mikro-RNAs liefert objektive quantitative Ergebnisse, kann jedoch keine Echtzeit-Abbildungen morphologischer Veränderungen des Lungengewebes liefern. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Verfahren kombiniert die Lungenultraschalluntersuchung (LUS) mit dem Nachweis von serumgebundenem miR-486-3p die Vorteile der bettseitigen Bildgebung und der molekularen Detektion.
Diese Studie konzentrierte sich auf Neugeborene, die die Kriterien für ein akutes Atemnotsyndrom (ARDS) erfüllten, und nicht auf das klassische, durch Surfactantmangel verursachte Atemnotsyndrom (RDS). Daher zielt diese Studie darauf ab zu untersuchen, ob die Lungenultraschalluntersuchung (LUS) im Grundzustand und das serumgebundene miR-486-3p die kurzfristige Sterblichkeit beim neonatalen ARDS vorhersagen können. Die vorliegende Forschung soll wertvolle Daten liefern, um die klinische Beurteilung des Krankheitszustands und die kurzfristige prognostische Einschätzung beim neonatalen ARDS zu verbessern.
Protokoll
Diese Studie erhielt die ethische Genehmigung durch den Medizinischen Ethikausschuss des Ersten Volkskrankenhauses von Yongkang unter strikter Einhaltung der Deklaration von Helsinki.
Probanden
Diese einzentrische, Beobachtungsstudie mit einem in-vitro-experimentellen Bestandteil wurde zwischen Januar 2022 und Dezember 2023 durchgeführt. Insgesamt 112 aufeinanderfolgende Neugeborene mit einer Diagnose von ARDS wurden am First People's Hospital of Yongkang eingeschlossen. Zu Vergleichszwecken wurden gesunde Säuglinge, die im gleichen Zeitraum geboren wurden und keine Vorgeschichte von Asphyxie oder intrauteriner Belastung aufwiesen, als Kontrollpersonen rekrutiert.
Einschlusskriterien:
Alle Teilnehmer erfüllten die diagnostischen Kriterien für das akute Atemnotsyndrom des Neugeborenen gemäß den Montreux-Richtlinien (Ausgabe 2017). Die Diagnose wurde durch bildgebende Verfahren und klinische Beurteilung bestätigt: Röntgenuntersuchungen zeigten diffuse Opazitäten in beiden Lungen, die mit einem Lungenödem vereinbar waren, und die Echokardiographie ergab keinen Hinweis auf einen erhöhten Druck im linken Vorhof, wodurch ein kardiogenes Lungenödem ausgeschlossen wurde. Weitere Kriterien waren ein akuter Symptombeginn und die Notwendigkeit einer mechanischen Beatmung über mehr als 3 Tage, bei gleichzeitigem Fehlen schwerer extrapulmonaler Infektionen. Die informierte Einwilligung wurde ordnungsgemäß von den Familien der Neugeborenen eingeholt.
Ausschlusskriterien:
Neugeborene mit primärer alveolärer Tensiddefizienz, angeborener Herzkrankheit, Stoffwechselstörungen oder anderen schwerwiegenden zugrunde liegenden Erkrankungen wurden ausgeschlossen. Außerdem wurden Säuglinge mit Lungen- oder Brustwandmissbildungen oder anderen schweren angeborenen Anomalien ausgeschlossen. Ein neonatales Atemnotsyndrom (RDS) wurde ausgeschlossen.
Klinische Daten
Gestationsalter, Geschlecht, Geburtsgewicht bei Aufnahme und mütterliche Merkmale wurden für alle Teilnehmer dokumentiert. Jedes Neugeborene erhielt innerhalb von 6 Stunden nach Aufnahme auf die Intensivstation eine Lungenultraschalluntersuchung und wurde hinsichtlich der LUS beurteilt. Die LUS wurde auf einer Skala mit einem Maximum von 36 Punkten bewertet, wobei ein höherer Wert auf eine stärkere Ausprägung pulmonaler Symptome hinwies. Blutproben wurden unmittelbar bei Aufnahme im Rahmen der initialen klinischen Beurteilung und vor jeder größeren therapeutischen Maßnahme (z. B. erneute Gabe von Surfactant, Eskalation des Beatmungsmodus oder Einleitung vasaktiver Substanzen) entnommen. Bei gesunden Neugeborenen wurden die Blutproben zum Zeitpunkt der Einschreibung gewonnen. Zur Gewinnung des Serums wurde Vollblut in Trennröhrchen für Serum gegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhiggestellt, um eine vollständige Gerinnselbildung zu ermöglichen. Anschließend wurden die Proben bei 4 °C 15 Minuten lang mit 1500 x g zentrifugiert. Der obere, klare serumhaltige Überstand wurde vorsichtig abgesaugt, in sterile kryogene Gefäße portioniert und unverzüglich zur späteren Analyse bei -80 °C in einem Tieftemperaturgefrierschrank gelagert. Für nachfolgende Experimente wurden ausschließlich klare, nicht hämolytierte Serumproben verwendet. Verwendete Blutentnahmeröhrchen und restliches Blut wurden gemäß den institutionellen Vorschriften als medizinischer biologischer Abfall entsorgt.
Gruppierung
Alle Neugeborenen wurden anhand der Befunde des initialen Röntgenthorax und der Schwere der Erkrankung 24 Stunden nach Aufnahme in zwei Gruppen eingeteilt: die milde Gruppe (Grad I–II) und die schwere Gruppe (Grad III–IV). Die Röntgenthorax-Befunde zeigten Grad I, gekennzeichnet durch beidseitig verminderte Lungenlichtdurchlässigkeit sowie kleine Partikel und netzartige Schatten im Lungenparenchym. Grad II zeigte sich durch Ausdehnung der Läsionen in die mittleren und peripheren Lungenfelder, begleitet von Anzeichen des Luftbronchogramms. Bei Grad III war die Durchsichtigkeit beider Lungen deutlich vermindert, wodurch die Konturen von Herz und Zwerchfell verschwommen waren. Grad IV war durch ausgeprägte Luftbronchogrammzeichen gekennzeichnet, die in eine nahezu vollständige Verschattung mündeten, die einem weißen Lungenbild ähnelte.
Neugeborene, bei denen ARDS diagnostiziert wurde, erhielten nach ihrer Aufnahme auf die neonatale Intensivstation ein umfassendes Behandlungsregime. Dieses umfasste die mechanische Beatmung, Sedierung, Gabe von pulmonalem Surfactant, antiinflammatorische Therapien, Ernährungsunterstützung, Exspektorationshilfe sowie Maßnahmen zur Flüssigkeitsersatztherapie. Der neonatale ARDS-Diagnosezeitpunkt diente als Ausgangspunkt der Studie. Die Endpunkte wurden entweder als erfolgreiche Genesung und Entlassung des Patienten oder als Tod des Patienten infolge einer unwirksamen Behandlung definiert. Basierend auf den klinischen Ergebnissen wurden die Teilnehmer in zwei Gruppen eingeteilt: die Überlebensgruppe und die Todesgruppe.
Zellkultur und Behandlung
Menschliche pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (HPMECs) wurden in DMEM kultiviert, der mit 10% fetalem Kälberserum, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt war. Die Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ gehalten. Zur Erstellung eines ARDS-Zellmodells wurden die Zellen mit Lipopolysaccharid (LPS) in einer Konzentration von 1 mg/L13,14 behandelt. Die erfolgreiche Modellerstellung wurde bestätigt, indem eine leichte Zellverkleinerung unter dem umgekehrten Mikroskop nach der LPS-Behandlung beobachtet wurde. Nach Abschluss der Experimente wurden verbrauchtes Kulturmedium, abgestorbene Zellen und Einweg-Kulturmaterialien als biologisch gefährlicher Abfall entsorgt.
Transfektion von Zellen und Gruppierung
HPMECs wurden in Kulturplatten ausgesät und bis zur 70 %igen Konfluenz vor der Transfektion inkubiert. Transfektionskomplexe wurden gemäß den Herstelleranweisungen hergestellt. Die Zellen wurden in Gruppen unterteilt: leerer Kontrollansatz, miR-486-3p-Mimetikum, Mimetikum-Negativkontrolle, miR-486-3p-Inhibitor, Inhibitor-Negativkontrolle, miR-486-3p-Mimetikum + DLL4-Überexpression-Plasmid (OE-DLL4) sowie miR-486-3p-Mimetikum + leeres Überexpression-Plasmid (OE-NC). Die Transfektionskomplexe wurden den entsprechenden Vertiefungen zugegeben und 4–6 h inkubiert. Danach wurde das Medium durch frisches komplettes Medium ersetzt, und die Kultivierung wurde für 24–48 h fortgesetzt, bis die nachfolgenden Experimente durchgeführt wurden. Eine erfolgreiche Transfektion zeigte sich durch stabile Zellkonfluenz ohne übermäßigen Zelltod.
Quantitative Echtzeit-PCR
Gesamt-RNA wurde aus Serumproben und kultivierten Zellen unter Verwendung eines RNA-Extraktionsreagens extrahiert. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurden mithilfe eines Spektrophotometers gemessen, und Proben mit einem A260/A280-Verhältnis von 1,8–2,1 galten als geeignet für weitere Analysen. Komplementäre DNA (cDNA) wurde unter Verwendung eines Reverse-Transkriptions-Kits synthetisiert. Anschließend wurde eine quantitative PCR unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Systems mit folgenden Zyklenbedingungen durchgeführt: eine initiale Denaturierung bei 95 °C für 3 min, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s. Zur Detektion von Mikro-RNA wurde die relative Expression von miR-486-3p mit der 2-ΔΔCt-Methode berechnet, wobei U6 snRNA als interne Referenz diente. Zur mRNA-Quantifizierung wurde die DLL4-Expression mittels des identischen 2-ΔΔCt-Algorithmus auf GAPDH-mRNA normalisiert. Die Primersequenzen lauteten wie folgt: miR-486-3p vorwärts: 5'-GTATGACGGGGCAGCTCAGTA-3' und miR-486-3p rückwärts: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3', U6 vorwärts: 5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3' und U6 rückwärts: 5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'. DLL4 vorwärts: 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC-3' und DLL4 rückwärts: 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA-3', GAPDH vorwärts: 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3' und GAPDH rückwärts: 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'.
CCK-8-Proliferationsassay an Zellen
Transfizierte Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 103 Zellen pro Vertiefung in 96-Well-Platten ausgesät und für 24, 48 bzw. 72 h inkubiert. Anschließend wurde das Kulturmedium abgesaugt und die Zellen zweimal mit 1× PBS gewaschen. Danach wurden 100 µL frisches 1× PBS und 10 µL CCK-8-Lösung zu jedem Well hinzugefügt, und die Platten wurden 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Extinktion wurde bei 450 nm mithilfe eines Mikroplattenlesegeräts gemessen, und die Zellproliferation wurde anhand der Extinktionswerte bewertet. Ein erfolgreicher Assayverlauf zeigte sich in zeitabhängigen Veränderungen der Extinktion zwischen den experimentellen Gruppen.
Apoptose-Assay mittels Durchflusszytometrie
Die Zellen wurden mit 0,25 % Trypsin verdaut, die resultierende Zellsuspension gesammelt und bei 4 °C 5 min bei 1500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellpellets dreimal mit vorab gekühltem 1× PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 500 µL 1× Bindungspuffer resuspendiert, woraufhin 5 µL Annexin V-FITC und 5 µL Propidiumiodid (PI) zugegeben wurden. Nach vorsichtigem Mischen wurden die Proben 40 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Zellapoptose wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen und die Daten mit geeigneter Software zur Analyse von Durchflusszytometriedaten ausgewertet. Ein erfolgreicher Assay war gekennzeichnet durch eine geringe Apoptoserate in der normalen Kontrollgruppe und eine deutliche Zunahme der Apoptose in der ARDS-Modellgruppe.
Luciferase-Reportergen-Assay
Mögliche Zielgene von miR-486-3p wurden mithilfe der Online-Datenbank TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/) identifiziert. Nach der Identifizierung der vorhergesagten Bindungsstellen wurden Wildtyp-(DLL4-WT)- und Mutanten-(DLL4-MUT)-Luziferase-Reporter-Plasmide, die die entsprechenden Bindungssequenzen enthielten, konstruiert. Die DLL4-WT- und DLL4-MUT-Vektoren wurden jeweils gemeinsam mit miR-486-3p-Mimetika oder -Inhibitoren in HPMECs koadministriert. Die relative Luziferase-Aktivität wurde anschließend mit einem Dual-Luziferase-Reporter-Assay-Kit gemessen. Biolumineszenzsignale wurden gemäß den Herstelleranweisungen mit einem Luminometer detektiert. Eine erfolgreiche Target-Validierung zeigte sich durch eine signifikante Verringerung der Luziferase-Aktivität in der DLL4-WT-Gruppe nach Überexpression von miR-486-3p.
Detaillierte Informationen zu allen Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Laborgeräten, die in dieser Studie verwendet wurden, finden sich in der begleitenden Tabelle der Materialien.
Statistische Methoden
Die statistischen Analysen und Datenvisualisierungen wurden mit SPSS Version 26.0 und GraphPad Prism Version 9.0 durchgeführt. Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben; der Vergleich der Mittelwerte zweier unabhängiger Stichproben erfolgte mittels eines unabhängigen t-Tests. Für Vergleiche zwischen drei oder mehr Gruppen kamen die einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) und die Varianzanalyse mit Messwiederholungen zum Einsatz, gefolgt von Tukeys post-hoc-Test für multiple Vergleiche, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu identifizieren. Kategoriale Daten wurden als Anzahlen (Prozentanteile) ausgedrückt, und die Gruppenvergleiche wurden mittels des Chi-Quadrat-Tests analysiert. Für nichtparametrische Daten wurde der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test angewandt. Zusätzlich wurde eine ROC-Kurve erstellt, um den prädiktiven Wert der Serumspiegel von miR-486-3p und der LUS bezüglich der Sterblichkeit bei pädiatrischen Patienten mit ARDS zu bewerten. Die Korrelationsanalysen erfolgten nach Pearson. Alle experimentellen Gruppen umfassten jeweils drei unabhängige biologische und technische Replikate. Als statistische Einheit galt ein unabhängiges Experiment, wobei jedes biologische Replikat eine separate Zellkulturcharge aus unterschiedlichen Passagen repräsentierte; technische Replikate dienten der Reduktion intraexperimenteller Variationen. Die Daten der technischen Replikate wurden zunächst gemittelt, anschließend erfolgte die statistische Analyse basierend auf den Mittelwerten der biologischen Replikate. Die statistische Signifikanzgrenze wurde bei p < 0,05 festgelegt.
Ergebnisse
Vergleichbare Basisdaten zwischen den Gruppen
Die allgemeinen Merkmale der in die Studie eingeschlossenen Säuglinge sind in Tabelle 1 dargestellt. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den demografischen Basislinienmerkmalen zwischen den beiden Gruppen: Gestationsalter (36,07 ± 2,71 vs. 35,72 ± 2,64 Wochen, p = 0,347), Anteil männlicher Säuglinge (59,0 % vs. 66,1 %, p = 0,290), Geburtsgewicht (3,39 ± 0,57 vs. 3,33 ± 0,55 kg, p = 0,437), mütterliches Alter (29,18 ± 4,00 vs. 29,66 ± 4,05 Jahre, p = 0,387) und Geburtsart (vaginal: 54,0 % vs. 58,0 %; Kaiserschnitt: 46,0 % vs. 42,0 %, p = 0,554), was darauf hinweist, dass die Gruppen vergleichbar waren. Basierend auf der Röntgenthorax-Beurteilung wurden in der ARDS-Gruppe 72 Fälle (64,3 %) als leicht (Grad I–II) und 40 Fälle (35,7 %) als schwer (Grad III–IV) klassifiziert.
Das ARDS-Schweregrad korreliert mit der Patientenprognose
Die vergleichende Analyse der Überlebensergebnisse zwischen der Gruppe von Kindern mit ARDS, die überlebten, und jenen, die verstarben, wird dargestellt in Tabelle 2Unter den 112 Neugeborenen mit der Diagnose ARDS überlebten 84 Fälle (75 %), während 28 Fälle (25 %) mit einem Todesausgang verbunden waren. Bemerkenswerterweise bestanden zwischen den beiden Gruppen keine statistisch signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Alters des Säuglings, des Geschlechts, des Geburtsgewichts, des mütterlichen Alters, der Entbindungsart, der Eigenschaften des Fruchtwassers, der Ätiologie oder anderer Variablen.p > 0,05). Allerdings wurde ein signifikanter Unterschied in der Schwere der ARDS beobachtet (p < 0,01), was einen entscheidenden prognostischen Faktor unterstreicht.
miR-486-3p und LUS sind bei ARDS erhöht. Die RT-qPCR-Analyse zeigte, dass die Serumspiegel von miR-486-3p bei Neugeborenen mit ARDS im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant erhöht waren. Darüber hinaus wiesen die schweren Fälle innerhalb der ARDS-Kohorte deutlich höhere Werte auf als die milden Fälle (P < 0,001) (Abbildung 1A). Außerdem war die LUS in der Gruppe mit schwerem ARDS höher als in der Gruppe mit mildem ARDS (p < 0,001) (Abbildung 1B). Bei Einteilung der ARDS-Patienten nach klinischem Verlauf zeigten die Verstorbenen deutlich höhere LUS- und miR-486-3p-Spiegel als die Überlebenden (Abbildung 1C,D). Bei nicht überlebenden Patienten fand sich eine starke positive Korrelation zwischen LUS und dem Serum-miR-486-3p (r = 0,832, p < 0,001) (Abbildung 1E).
Kombinierte Detektion verbessert die prognostische Vorhersage
Basierend auf dem ROC-Analyseprotokoll bewerteten wir die prognostische Leistung einzelner und kombinierter Indikatoren. Die AUC-Werte von LUS und miR-486-3p zur Vorhersage der kurzfristigen Mortalität betrugen jeweils 0,873 (95 % CI: 0,809–0,936) und 0,883 (95 % CI: 0,822–0,944). Die Sensitivitätswerte lagen bei 89,3 % und 96,4 %, während die Spezifitätswerte jeweils 73,8 % und 77,4 % betrugen. Die optimalen Cut-off-Werte für LUS und miR-486-3p lagen bei 15,500 bzw. 1,465. Darüber hinaus betrug die AUC für das kombinierte Vorhersagemodell 0,929 (95 % CI: 0,883–0,975) und zeigte eine Sensitivität von 92,9 % und eine Spezifität von 84,5 % bei einem optimalen Cut-off-Wert von 1,659 (Abbildung 1F).
Die Hochregulierung von miR-486-3p beeinträchtigt die Zellfunktion
Nach dem Zellkultivierungs- und LPS-Interventionsprotokoll stellten wir ein in vitro ARDS-Zellmodell unter Verwendung von HPMECs her. Die qPCR-Ergebnisse zeigten, dass die Expression von miR-486-3p nach LPS-Stimulation zeitabhängig allmählich anstieg (Abbildung 2A). miR-486-3p wurde entweder überexprimiert oder herunterreguliert, um dessen Wirkung auf ARDS-Modellzellen zu untersuchen (Abbildung 2B). Gemäß den Protokollen für den CCK-8- und den Durchflusszytometrie-Assay wurden die Zellproliferation und Apoptose analysiert. Die Überexpression von miR-486-3p hemmte die Zellproliferation signifikant und förderte die Zellapoptose. Umgekehrt milderte die Herunterregulierung von miR-486-3p die durch LPS induzierte Zellschädigung (Abbildung 2C,D).
miR-486-3p reguliert die Expression von DLL4 herab
Gemäß dem Protokoll zur Plasmidkonstruktion und zum Dual-Luciferase-Reporter-Assay überprüften wir die Interaktion zwischen miR-486-3p und DLL4. Die bioinformatische Vorhersage bestätigte eine konservierte Bindungsstelle zwischen miR-486-3p und der 3’UTR von DLL4 (Abbildung 3A). Die Luciferase-Aktivität der DLL4-Wildtyp-Gruppe war nach Überexpression von miR-486-3p signifikant verringert, während in der Mutantengruppe keine offensichtliche Veränderung beobachtet wurde (Abbildung 3B), was beweist, dass DLL4 ein direktes Zielgen von miR-486-3p ist. In Zellmodellen nahm die Expression von DLL4 nach LPS-Behandlung zeitabhängig ab (Abbildung 3C). Die gezielte Modulation der miR-486-3p-Expression regulierte ebenfalls die DLL4-Spiegel negativ (Abbildung 3D).
In klinischen Proben war die DLL4-Expression bei Neugeborenen mit ARDS niedriger als bei gesunden Kontrollen und nahm in der Gruppe der Verstorbenen weiter ab (Abbildung 3E–F). Bei nichtüberlebenden Patienten zeigte sich eine negative Korrelation zwischen miR-486-3p und DLL4 (r = -0,795, P < 0,001) (Abbildung 3G). Alle qPCR-Analysen für DLL4 wurden mit drei technischen Wiederholungen durchgeführt, und die Ergebnisse waren stabil.
DLL4 kehrt die durch miR-486-3p vermittelte Zellschädigung um
Nach dem Co-Transfektionsprotokoll unter Verwendung des miR-486-3p-Mimics und des DLL4-Überexpressionsplasmids führten wir Rescue-Experimente durch. Die qPCR bestätigte, dass die DLL4-Expression nach der Transfektion mit OE-DLL4 wirksam wiederhergestellt wurde (Abbildung 4A). Funktionelle Tests zeigten, dass die Überexpression von DLL4 den inhibitorischen Effekt von miR-486-3p auf die Zellproliferation sowie dessen pro-apoptotischen Effekt teilweise umkehrte (Abbildung 4B,C). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass miR-486-3p die Zellaktivität durch gezielte Beeinflussung von DLL4 teilweise moduliert.
Datenverfügbarkeit:
Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind als Zusätzliche Datei 1 verfügbar.
Abbildung 1: Vergleich von LUS und serumspiegel von miR-486-3p zwischen den Gruppen. (A) Serumspiegel von miR-486-3p bei gesunden Neugeborenen und Neugeborenen mit ARDS. (B) LUS-Werte bei gesunden Neugeborenen und Neugeborenen mit ARDS. (C) Serumspiegel von miR-486-3p in der Überlebenden-Gruppe und der Todesgruppe. (D) LUS-Werte in der Überlebenden-Gruppe und der Todesgruppe. (E) Korrelationsanalyse zwischen serumspiegel von miR-486-3p und LUS bei nicht-überlebenden Neugeborenen mit ARDS. (F) ROC-Kurven der einzelnen LUS, einzelnen miR-486-3p und kombinierten Detektion zur Vorhersage der Prognose des neonatalen ARDS. Alle quantitativen Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben; Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. *** = p <0,001 im Vergleich zur gesunden Gruppe; ### = p <0,001 im Vergleich zur leichten ARDS-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2: Wirkung von miR-486-3p auf Zellen des ARDS-Modells. (A) Zeitabhängige Veränderungen der Expression von miR-486-3p in HPMECs nach LPS-Behandlung. (B) Relative Expression von miR-486-3p nach Überexpression und Knockdown-Intervention. (C) Zellproliferationsaktivität, erfasst mittels CCK-8-Assay nach Modulation der Expression von miR-486-3p. (D) Zellapoptoserate, erfasst mittels Durchflusszytometrie nach Modulation der Expression von miR-486-3p. Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. Statistische Kennzeichnung: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Überprüfung der Targeting-Beziehung zwischen miR-486-3p und DLL4. (A) Schematische Darstellung der vorhergesagten Bindungsstelle zwischen miR-486-3p und der 3’UTR von DLL4. (B) Der duale Luciferase-Reportergen-Assay bestätigte die Targeting-Beziehung zwischen miR-486-3p und DLL4. (C) Dynamische Veränderungen der DLL4-Expression in HPMECs nach LPS-Behandlung. (D) DLL4-Expression nach Überexpression oder Herunterregulation von miR-486-3p. (E) Serumspiegel von DLL4 bei gesunden Neugeborenen und Neugeborenen mit ARDS. (F) DLL4-Spiegel in der Überlebungsgruppe und der Sterbegruppe von Neugeborenen mit ARDS. (G) Korrelationsanalyse zwischen serumgebundenem miR-486-3p und DLL4 bei nicht überlebenden Neugeborenen mit ARDS. Alle quantitativen Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. Statistische Kennzeichnung: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001 im Vergleich zur gesunden Gruppe, ### = p <0,001 im Vergleich zur Gruppe mit leichtem ARDS. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4: Wirkung der gezielten Hemmung von DLL4 durch miR-486-3p in ARDS-Modellzellen. (A) Nachweis der DLL4-Expression nach Cotransfektion des miR-486-3p-Mimics und eines DLL4-Überexpression-Plasmids. (B) Veränderungen der Zellproliferationsaktivität nach Wiederherstellung von DLL4. (C) Veränderungen der Zellapoptoserate nach Wiederherstellung von DLL4. Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. Statistische Kennzeichen:* = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.
| Variable | Gesund (n=100) | Neonatales ARDS (n=112) | p-Wert |
| Tragzeit (Wochen) | 36,07 ± 2,71 | 35,72 ± 2,64 | 0,347 |
| Geschlecht (männlich, %) | 59 (59,0 %) | 74 (66,1 %) | 0,29 |
| Geburtsgewicht (kg) | 3,39 ± 0,57 | 3,33 ± 0,55 | 0,437 |
| Mütterliches Alter (Jahre) | 29,18 ± 4,00 | 29,66 ± 4,05 | 0,387 |
| Geburtsmethode | 0,439 | ||
| vaginal | 54 (54,0 %) | 65 (58,0 %) | |
| Kaiserschnitt | 46 (46,0 %) | 47 (42,0 %) | |
| ARDS-Graden | --- | ||
| I-II | --- | 72 (64,3 %) | |
| III-IV | --- | 40 (35,7 %) |
Tabelle 1: Basischarakteristika der eingeschlossenen Säuglinge. Diese Tabelle fasst die basisdemografischen Informationen gesunder Neugeborener und Neugeborener mit ARDS zusammen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung für stetige Variablen und als Anzahl (Prozentanteil) für kategoriale Variablen angegeben. P-Werte zeigen die statistischen Unterschiede zwischen den Gruppen an. Abkürzungen: ARDS = akutes Atemnotsyndrom.
| Variable | Überleben (n=84) | Tod (n=28) | p-Wert |
| Tragzeit (Wochen) | 35,95 ± 2,58 | 35,04 ± 2,76 | 0,112 |
| Geschlecht (männlich, %) | 53 (63,1 %) | 21 (75,0 %) | 0,253 |
| Geburtsgewicht (kg) | 3,37 ± 0,58 | 3,23 ± 0,42 | 0,248 |
| Mütterliches Alter (Jahre) | 29,49 ± 3,82 | 30,18 ± 4,74 | 0,438 |
| Geburtsmethode | 0,444 | ||
| vaginal | 47 (56,0 %) | 18 (64,3 %) | |
| Kaiserschnitt | 37 (44,0 %) | 10 (35,7 %) | |
| Abweichende Fruchtwasserzusammensetzung | 6 (9,5 %) | 4 (14,3 %) | 0,485 |
| ARDS-Grad | 0,001** | ||
| I–II | 61 (72,6 %) | 11 (39,3 %) | |
| III–IV | 23 (27,4 %) | 17 (60,7 %) | |
| Ätiologie | 0,827 | ||
| Verschlucken | 33 (39,3 %) | 12 (42,9 %) | |
| Pneumonie | 17 (20,2 %) | 6 (21,4 %) | |
| Sepsis | 12 (14,3 %) | 2 (7,1 %) | |
| Meconium-Aspirations-Syndrom | 22 (26,2 %) | 8 (28,6 %) |
Tabelle 2: Vergleich der klinischen Daten zwischen der Überlebensgruppe und der Todesgruppe bei Neugeborenen mit ARDS. Diese Tabelle vergleicht klinische Parameter zwischen überlebenden und verstorbenen Neugeborenen mit ARDS. Stetige Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben, kategoriale Daten als Anzahl (Prozentangabe). Die p-Werte zeigen die statistische Signifikanz zwischen den beiden Gruppen an. ** = p<0,01. Abkürzungen: ARDS = akutes Atemnotsyndrom.
Zusatzdatei 1: Rohdatensätze aus klinischen und experimentellen Untersuchungen, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, einschließlich individueller Messwerte für den Lungenultraschall-Score (LUS), die Expression von Serum-miR-486-3p, die DLL4-Expression und Ergebnisse zellbasierter Assays.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Das neonatale ARDS ist eine führende Ursache für respiratorische Insuffizienz und frühe Mortalität bei schwerkranken Neugeborenen15. Eine frühe und genaue Beurteilung des Schweregrads und der Prognose ist Voraussetzung für individualisierte Interventionen und die Reduktion der Mortalität. Eine zunehmende Zahl von Studien bestätigt, dass Mikro-RNAs in den pathologischen Verlauf des ARDS eingreifen und als aussichtsreiche zirkulierende Biomarker dienen16. Untersuchungen zeigen, dass miR-155 bei septischen Patienten mit akuter Lungenschädigung/ARDS deutlich erhöht ist17. Zudem haben Studien einen Anstieg der Serumspiegel von miR-629-5p bei Kindern mit ARDS nachgewiesen18. Serum-miR-34a steht in enger Beziehung zum Schweregrad und zur Prognose des neonatalen RDS19. Neuere Studien zeigen miR-375 als diagnostischen und prognostischen Biomarker für das neonatale ARDS20. Ähnlich wie diese beschriebenen Moleküle kann serummiR-486-3p im peripheren Blut stabil mittels quantitativer PCR nachgewiesen werden und eignet sich für ein schnelles Screening auf neonatalen Intensivstationen (NICUs). Im Vergleich zu miR-375 und miR-34a, die hauptsächlich den frühen Krankheitsbeginn widerspiegeln, korreliert die Expression von miR-486-3p stärker mit der Schwere der pulmonalen Läsionen und verändert sich dynamisch im Verlauf der Lungenschädigung. In Kombination mit der Lungenultraschalluntersuchung (LUS) erreicht es eine höhere prognostische Genauigkeit hinsichtlich der kurzfristigen Mortalität. Dennoch weist miR-486-3p eine relativ geringe Erkrankungsspezifität auf, und die entsprechenden klinischen Forschungsergebnisse sind im Vergleich zu etablierten miRNA-Biomarkern begrenzt. Insgesamt hat miR-486-3p das Potenzial, als Marker für die unterstützende Diagnose oder die prognostische Vorhersage des neonatalen ARDS zu dienen.
Die LUS ist ein etablierter bildgebender Parameter am Krankenbett, der die pulmonale Belüftung anhand der ultraschallmäßigen Eigenschaften des Lungengewebes bewertet21. Insbesondere dient die LUS als effektives quantitatives Maß zur Beurteilung des Ausmaßes der alveolären Ventilation22. Studien haben ihre Nützlichkeit bei der Einschätzung von Schweregrad und Prognose des neonatalen ARDS bestätigt23. In Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen zeigte unsere klinische Studie, dass die LUS-Werte bei Neugeborenen mit ARDS im Vergleich zu gesunden Neugeborenen signifikant erhöht waren. Darüber hinaus wiesen die betroffenen Neugeborenen in der schweren Untergruppe deutlich höhere LUS-Werte auf als diejenigen in der leichten Untergruppe, was einen direkten Zusammenhang zwischen erhöhten LUS-Werten und der Schwere von Atelektasen, Lungenödem und Lungenkonsolidierung unterstreicht24. Unsere Ergebnisse zeigten weiterhin, dass Patienten, die letztendlich verstarben, ebenfalls erheblich höhere LUS-Werte aufwiesen als Überlebende. Bei nicht überlebenden Neugeborenen wurde eine starke positive Korrelation zwischen LUS und serumgebundenem miR-486-3p beobachtet, was den synergistischen Nutzen beider Parameter weiter untermauert. Jede Methode weist inhärente Eigenschaften auf: Die LUS ist strahlungsfrei, portabel und eignet sich für die Echtzeit-Überwachung am Krankenbett, doch ihre Interpretation hängt stark von der Erfahrung des Untersuchers ab und ist subjektiven Verzerrungen unterworfen. Die Bestimmung von serumgebundenem miR-486-3p liefert objektive, reproduzierbare quantitative Ergebnisse, kann jedoch keine Echtzeit-Veränderungen der Lungengewebsmorphologie widerspiegeln. In der klinischen Praxis wird empfohlen, diesen kombinierten Ansatz routinemäßig auf neonatalen Intensivstationen einzusetzen. Er eignet sich zur frühen Risikostratifizierung von Neugeborenen mit vermutetem oder bestätigtem ARDS, zur regelmäßigen dynamischen Beurteilung des Krankheitsverlaufs sowie zur unterstützenden Einschätzung der kurzfristigen klinischen Prognose. Diese Methode soll jedoch keine definitiven bildgebenden oder ätiologischen Untersuchungen ersetzen; bei Neugeborenen mit zusätzlichen entzündlichen Lungenerkrankungen zeigt sie eine eingeschränkte Spezifität. Zudem bleibt aufgrund der Durchführung unserer Studie an einem einzigen Zentrum die Übertragbarkeit auf Populationen aus verschiedenen Regionen noch zu überprüfen.
Klinisch beobachteten wir, dass erhöhte LUS-Werte in Kombination mit hohen Serumspiegeln von miR-486-3p mit einer ungünstigen Prognose beim neonatalen ARDS assoziiert waren, was darauf hindeutet, dass miR-486-3p eng mit schweren vaskulären Lungenverletzungen und einer beeinträchtigten vaskulären Reparaturkapazität in der unreifen Lunge verknüpft sein könnte. Unsere in-vitro-Zellversuche ergänzten diese klinische Beobachtung, indem sie zeigten, dass miR-486-3p die Proliferation und Apoptose von Endothelzellen direkt moduliert, zentrale Prozesse, die die vaskuläre Integrität und Reparatur in der neonatalen Lunge steuern. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass miRNAs entscheidende Rollen in verschiedenen zellulären Prozessen spielen25,26. Es ist gut belegt, dass miRNAs ihre Wirkung hauptsächlich durch die posttranskriptionelle Regulation von Zielgenen entfalten, wobei vor allem das Spleißen von miRNA und die Hemmung der Proteinsynthese eine Rolle spielen27. Das DLL4-Gen spielt eine wichtige Rolle bei der vaskulären Entwicklung und Angiogenese28. Untersuchungen haben darauf hingewiesen, dass die microRNA-30-Familie DLL4 gezielt ansteuert, um das Verhalten von Endothelzellen während der Angiogenese zu modulieren29. Diese Befunde legen nahe, dass eine Modulation des endothelialen DLL4 mit vaskulären Lungenverletzungen beim neonatalen ARDS assoziiert sein könnte. In unserer Untersuchung identifizierten und validierten wir die Zielbeziehung zwischen miR-486-3p und DLL4. Nachfolgende Analysen zeigten, dass eine erhöhte Expression von miR-486-3p die Proliferation von LPS-induzierten HPMECs signifikant hemmte, während sie die Apoptose förderte. Wichtig ist, dass die Expression von DLL4 die durch miR-486-3p vermittelten Effekte teilweise umkehren konnte. Dies deutet darauf hin, dass miR-486-3p DLL4 gezielt ansteuert, um die Funktion von HPMECs zu beeinflussen und den Verlauf des neonatalen ARDS zu regulieren. Ob es jedoch direkt pulmonale vaskuläre Dysfunktion beeinflusst und zur Entstehung des ARDS beiträgt, muss noch weiter überprüft werden. Auffällig ist, dass DLL4 die durch miR-486-3p induzierten zellulären Veränderungen nur teilweise umkehrte. Als typische miRNA moduliert miR-486-3p mehrere downstream liegende Zielgene. Künftige Studien werden darauf abzielen, weitere Zielgene zu identifizieren, um den vollständigen Wirkmechanismus von miR-486-3p beim neonatalen ARDS aufzuklären.
Abschließend ist anzumerken, dass eine strikte Standardisierung zentraler Protokollschritte zuverlässige und reproduzierbare Daten gewährleistet. Wir haben die Probenentnahmeverfahren vereinheitlicht, standardisierte Zellkultivierungs- und Transfektionsprotokolle eingeführt und unabhängige Wiederholungen einbezogen, um experimentelle Fehler zu minimieren. Häufige betriebliche Probleme und deren Lösungen sind wie folgt zusammengefasst: Bei der LUS-Beurteilung sollten das 12-Bereiche-Scanning-Protokoll und die einheitlichen Bewertungsregeln standardisiert sowie die Körperhaltung von Neugeborenen angepasst werden, um klare Bilder zu erhalten. Bei der Detektion von serumgebundenen miRNAs sind mehrfache Einfrier- und Auftauzyklen zu vermeiden, die RNA-Reinheit zu überprüfen (A260/A280 = 1,8–2,1) und technische Wiederholungen einzubeziehen. Bei LPS-induzierten Zellmodellen ist frisch zubereitetes LPS mit einer Konzentration von 1 mg/L sowie stabile Kulturbedingungen zu verwenden. Die Zellkonfluenz und das Reagenzienverhältnis sollten während der Transfektion optimiert und das Medium gewechselt werden, um die Zytotoxizität zu verringern. Für Dual-Luciferase-Assays ist eine vollständige Zelllyse und eine standardisierte Durchführung sicherzustellen.
Insgesamt ist die kombinierte LUS/miR-486-3p-Strategie im Vergleich zu herkömmlichen Methoden wie Brustbildgebung, Blutgasanalyse und Einzelbiomarker-Tests strahlungsfrei, kostengünstig und einfach durchzuführen und weist eine verbesserte Vorhersageleistung auf. Sie fungiert als zuverlässiges ergänzendes prognostisches Werkzeug beim neonatalen ARDS. Klinisch kann diese Methode zur frühen Risikostratifizierung und dynamischen Zustandsüberwachung auf neonatalen Intensivstationen eingesetzt werden. Zudem kann sie als einheitlicher Evaluierungsindex für multizentrische Studien dienen. Mechanistisch eröffnet die validierte miR-486-3p/DLL4-Achse neue Ansatzpunkte zur Erforschung pathologischer Mechanismen und zielgerichteter Therapien. Diese kombinierte Vorgehensweise weist jedoch auch inhärente technische Limitationen auf. Die LUS-Ergebnisse variieren je nach Untersucher, und miR-486-3p fehlt die Erkrankungsspezifität für entzündliche Lungenerkrankungen. Die Methode ermöglicht lediglich eine Einzelmessung zum Zeitpunkt der Probennahme und kann definitive Bildgebung oder ätiologische Untersuchungen nicht ersetzen.
Trotz der aussichtsreichen Ergebnisse verdienen mehrere Limitationen Beachtung. Erstens beschränkt das Einzelzentrum-Design die Generalisierbarkeit unserer Schlussfolgerungen. Zweitens fehlte eine externe Validierungsgruppe, um die Robustheit der prädiktiven Leistung des LUS/miR-486-3p-Tests zu überprüfen. Drittens wurde das serumgebundene miR-486-3p nur zu einem einzigen Zeitpunkt gemessen, wodurch seine dynamische Assoziation mit dem Krankheitsverlauf nicht erfasst wurde. Viertens beeinträchtigt das Fehlen zusätzlicher Proteinanalysen sowie einer in-vitro- oder in-vivo-Validierung die Robustheit unserer mechanistischen Schlussfolgerungen. Schließlich ist die spezifische Rolle von miR-486-3p in der Pathophysiologie des neonatalen ARDS noch nicht vollständig aufgeklärt und erfordert weitere Untersuchungen. Zusammenfassend stellen die erhöhte LUS und die erhöhten serumgebundenen Spiegel von miR-486-3p bei Neugeborenen mit ARDS bedeutende Referenzpunkte in der klinischen Praxis dar. Die synergistische Bewertung dieser beiden Biomarker könnte die genaue Vorhersage sowohl der Schwere als auch der Prognose des neonatalen ARDS erleichtern und weist somit einen gewissen klinischen Anwendungswert auf.
Offenlegungen
Grammarly wurde zur Optimierung des englischen Ausdrucks, zur Grammatikprüfung und zur Formatstandardisierung verwendet. Alle Forschungsideen, Experimente, Daten und Schlussfolgerungen sind Originalarbeiten der Autoren.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| PCR-Röhrchen, 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Brutschrank für Zellkultur mit 5 % CO2 und Feuchte | Thermo Fisher | 3111 | |
| 6-Loch-Zellkulturplatten | Corning | 3516 | |
| 96-Loch-Zellkulturplatten | Corning | 3599 | |
| Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Annexin V-FITC Apoptose-Nachweiskit | BD Biosciences | 556547 | |
| Tischzentrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Biologischer Sicherheitswerkbank | Thermo Fisher | 1300 Series A2 | |
| CCK-8 Zellzählkit | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| Einweg-Steril-Blutentnahmeröhrchen | BD Vacutainer | 367815 | |
| DLL4-Überexpressionsplasmid (OE-DLL4) | GenePharma | EX-M02151 | |
| DLL4-MUT-Luciferase-Reporterplasmid | GenePharma | PGL3-DLL4-MUT | |
| DLL4-WT-Luciferase-Reporterplasmid | GenePharma | PGL3-DLL4-WT | |
| DMEM-Hochglukose-Medium | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | |
| Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit | Biolab | BL101A | |
| Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA)-Reader | Thermo Fisher | Multiskan FC | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 10099141C | |
| Filter-Pipettenspitzen (10 μL, 200 μL, 1000 μL) | Axygen | TF-10-R-S, TF-200-R-S, TF-1000-R-S | |
| Durchflusszytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Durchflusszytometrie-Röhrchen | BD Biosciences | 352054 | |
| Kühlschnellzentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Lungen-Ultraschallsystem | Mindray | M9 | |
| Mikrovolumen-Spektrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop 2000 | |
| miR-486-3p-Inhibitor | RiboBio | HmiR0000486-AS | |
| miR-486-3p-Mimetikum | RiboBio | HmiR0000486 | |
| miR-486-3p qPCR-Primer-Set | RiboBio | HmiRQP0486 | |
| Negativkontroll-Inhibitor (NC) | RiboBio | HmiR0001-AS | |
| Negativkontroll-Mimetikum (NC) | RiboBio | HmiR0001 | |
| Negativkontroll-Überexpressionsplasmid (OE-NC) | GenePharma | EX-NEG | |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung (100×) | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1× | Gibco (Thermo Fisher) | 10010023 | |
| Pipettenset (10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL) | Eppendorf | Research Plus | |
| Propidiumiodid (PI)-Färbungslösung | BD Biosciences | 556463 | |
| Echtzeit-quantitative PCR-Anlage | Applied Biosystems (Thermo Fisher) | 7500 Fast | |
| RNase-freies Wasser | Invitrogen (Thermo Fisher) | 10977015 | |
| RT-PCR Quick Master Mix | Toyobo | FSQ-101 | |
| Sterile Einweg-Pipetten | Corning | 4487, 4488, 4489 | |
| SYBR Green Echtzeit-PCR Master Mix | Toyobo | QPK-201 | |
| Trizol-Reagenz | Invitrogen (Thermo Fisher) | 15596026 | |
| U6 snRNA qPCR-Primer-Set | RiboBio | HmiRQP0001 | |
| Vortex-Mischer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Referenzen
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