Methodenartikel

Herstellung von formalinfixierten, paraffineingebetteten Knochenmarkproben für die räumliche Transkriptomik unter Verwendung einer EDTA-basierten Dekalzifizierung

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DOI:

10.3791/72474

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28. August 2026

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1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein standardisierter Workflow zur Vorbereitung von formalinfixierten, paraffin-eingebetteten Knochenproben für die räumliche Transkriptomik umfasst eine 10-tägige Entkalkung mit EDTA, um die RNA-Integrität zu bewahren. Wichtige Qualitätskontrollschritte helfen dabei zu bestimmen, ob die Proben die Anforderungen für nachfolgende Analysen der räumlichen Genexpression erfüllen.

Zusammenfassung

Das Knochenmark (BM) ist eine komplexe und dynamische Struktur, in der räumliche Beziehungen das Zellverhalten, die Signalübertragung und die Funktion beeinflussen. Daher erfordert das Verständnis der vollständigen Dynamik zellulärer Interaktionen ergänzende räumliche Methoden, die die Architektur von Zellpopulationen in situ erhalten und abbilden. Trotz erheblicher Fortschritte in Einzelzelltechnologien, die zum Verständnis der transkriptionellen Heterogenität gesunder und erkrankter BM-Gewebe beigetragen haben, müssen die räumliche Organisation verschiedener Zelltypen, nischenspezifische regulatorische Programme und deren Interaktionen weiter untersucht werden. Neuere Entwicklungen in der räumlichen Transkriptomik haben eine unvoreingenommene Genexpressionsanalyse mit räumlichem Kontext in verschiedenen Geweben ermöglicht, wodurch diese Technologien zu den Einzelzellmethoden, die über keine räumliche Auflösung verfügen, komplementär werden. Während die räumliche Transkriptomik bereits häufig in Weichgeweben eingesetzt wird, beschränkt sich ihre Anwendung in mineralisierten Geweben wie dem BM aufgrund der mit der Aufbereitung von Knochengewebe verbundenen Herausforderungen noch. Der hier vorgestellte Protokollansatz wurde zur Herstellung von formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Proben aus gesundem und erkranktem Maus- und Humanmaterial verwendet. Ein 10-tägiger Entmineralisierungsschritt auf Basis von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ist enthalten, um die RNA-Integrität zu bewahren und die Anwendung der räumlichen Transkriptomik an langen Knochenproben zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von BM-Proben für die räumliche transkriptomische Analyse, einschließlich Gewebeverarbeitung, Konservierung und Schnitttechnik, sowie wesentliche Qualitätsbewertungsschritte wie die Beurteilung der Schnittintegrität, der Gewebemorphologie und der RNA-Qualität. Der Arbeitsablauf unterstützt zudem die Identifizierung von Zelltypen und die Integration mit Einzelzell-Transkriptomdaten, um die zelluläre Zusammensetzung zu charakterisieren, Zell-Zell-Interaktionen zu definieren und die räumliche Verteilung transkriptionell heterogener Zellen in gesunden und erkrankten Zuständen zu visualisieren. Insgesamt bereitet dieser Workflow vollständig mineralisierte gesunde und maligne Gewebe für die räumliche transkriptomische Analyse vor, wobei die Architektur des Knochenmarks erhalten bleibt.

Einleitung

Das Knochenmark (BM) ist ein äußerst komplexes und kompartimentalisiertes Organ, das als primärer Ort der Hämatopoese und der Reifung von Immunzellen dient1,2. Dieses heterogene Gewebe besteht aus einer vielfältigen Ansammlung hämatopoetischer, mesenchymaler, endothelialer und immunologischer Zelllinien, die in einer hochspezialisierten und organisierten dreidimensionalen Nische koexistieren3,4. Innerhalb dieser Nische nimmt jede Zellpopulation definierte anatomische Bereiche ein, und der räumliche Kontext spielt eine grundlegende Rolle bei der Regulation des zellulären Verhaltens, der Signalübertragung und der Funktion4,5. Die räumliche Nähe zu bestimmten Strukturen, wie zum Beispiel trabekulärem Knochen oder vaskulären Netzwerken, steuert wesentliche physiologische Prozesse, darunter die Aufrechterhaltung der Ruhephase hämatopoetischer Stammzellen (HSC) und die Knochenremodellierung6,7. Folglich formt diese dynamische Mikroumgebung sowie die eng regulierten Wechselwirkungen zwischen ihren zellulären und stromalen Bestandteilen die regulatorischen Netzwerke, die die Homöostase aufrechterhalten und den Verlauf hämatologischer Erkrankungen beeinflussen8,9,10,11,12,13.

Fortschritte in der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) haben unser Verständnis der zellulären Vielfalt des Knochenmarks (BM) revolutioniert und ermöglichen die Entdeckung bisher unbekannter Zellsubtypen sowie deren vorhergesagte Interaktionen innerhalb der Nische3,10,11,12,14,15,16. Die Einzelzell-Transkriptomik bietet zwar hochauflösende Informationen über die einzelnen Komponenten der hämatopoetischen Nische, ist jedoch grundsätzlich durch den Gewebedigesterprozess begrenzt, der Zellen von ihrem nativen Milieu löst und möglicherweise ihren ursprünglichen Zustand verändert17, sowie durch den Mangel an räumlichem Kontext, der die Organisation des Knochengewebes definiert4,18. Dieser Verlust des positionsbezogenen Kontexts macht es unmöglich, definitiv abzubilden, wo bestimmte transkriptionell unterschiedliche Populationen lokalisiert sind oder wie sie mit benachbarten Zellen interagieren19. Darüber hinaus wird dichtes Knochengewebe oft nur teilweise dissoziiert, was zu einer Unterrepräsentation wichtiger Zellpopulationen wie Osteozyten und Adipozyten in scRNA-seq-Datensätzen und einer verzerrten Darstellung der Gewebeheterogenität führt20,21. Die räumliche Transkriptomik ermöglicht die Untersuchung der Genexpression in situ in räumlich erhaltenen Gewebeschnitten und gewinnt dadurch kontextuelle Informationen zurück, wodurch die Einschränkungen der Einzelzelltechnologien behoben werden8,19,22,23,24,25,26. Diese Technologie stellt eine wesentliche Weiterentwicklung auf dem Gebiet dar, da sie eine präzise räumliche Positionierung und strukturelle Organisation der verschiedenen Zellpopulationen im Knochenmark ermöglicht, was unverzichtbar ist, um deren Interaktionen und funktionelle Rollen in ihrem nativen Mikromilieu zu verstehen8,26. Zudem ermöglicht die räumliche Transkriptomik im Krankheitskontext Forschern und Klinikern, die Lücke zwischen der traditionellen Pathologie und der Hochdurchsatz-Genomik zu schließen, indem sie molekulare Daten auf morphologische Bilder aufbringen1,8. Räumliche Transkriptomik-Technologien können in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden: sequenzbasierte Methoden und bildbasierte Methoden17,24. Sequenzbasierte Plattformen wie Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) und die Open-Source-Plattform Open-ST erfassen mRNA auf räumlich barcodierten Arrays oder Kügelchen vor der NGS-Sequenzierung. Bildbasierte Methoden wie Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX und Xenium visualisieren Transkripte direkt in situ durch multiplexe Hybridisierung oder Padlock-Probe-Chemie27,28. Alternativ können Plattformen je nachdem, ob sie eine sondenbasierte Detektion erfordern, als gezielt oder ungerichtet klassifiziert werden17,24.

Methoden der räumlichen Transkriptomik wurden bereits erfolgreich auf Weichgewebe wie Gehirn, Herz und Leber angewandt, bei denen die Herstellung intakter histologischer Schnitte einfach ist29,30,31. Dagegen ist die Anwendung der räumlichen Transkriptomik an Knochen aufgrund seiner mineralisierten Struktur deutlich schwieriger, was einen Entkalkungsprozess erfordert32,33, also die kontrollierte Entfernung von Calciumphosphat, um das Gewebe weich genug für das Schneiden sowie für nachfolgende histologische oder molekulare Analysen zu machen8,20,23,34. Herkömmliche Entkalkungsmethoden, die routinemäßig in der klinischen Praxis verwendet werden, basieren typischerweise auf starken sauren Lösungen wie Salz-, Salpeter-, Ameisen- oder Phosphorsäure, die die RNA-Integrität stark beeinträchtigen und die zelluläre Morphologie stören35,36. Eine solche molekulare Degradation verringert das Signal-Rausch-Verhältnis bei räumlichen Assays und führt häufig zu unannehmbar niedrigen Gen-Detektionsraten im Vergleich zu Weichgeweben8,10. Diese Einschränkung verdeutlicht die Notwendigkeit standardisierter Entkalkungsprotokolle, die die mRNA-Integrität in mineralisierten Proben zuverlässig für sequenzbasierte räumliche Analysen bewahren8,20.

Dieses Protokoll stellt einen standardisierten Arbeitsablauf zur Vorbereitung von formalinfixierten, paraffin-eingebetteten (FFPE) Knochenmarkproben (BM) für die räumliche Transkriptomik vor, der zuvor bereits von Muiños-Lopez et al.8 angewandt wurde. Der Arbeitsablauf umfasst eine 10-tägige Entkalkung mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei kontrolliertem pH-Wert. Im Gegensatz zu aggressiven Säuren wirkt EDTA als sanfter Chelator, der die mikroskopische Struktur erhält und die Qualität der Nukleinsäuren bewahrt, wodurch seine Verwendung in molekularen Anwendungen unterstützt wird8,20,33,36,37. Als Machbarkeitsnachweis wurde das Protokoll an Knochengewebeproben von gesunden und an multiplem Myelom (MM) erkrankten Mausmodellen sowie an humanen BM-Proben von gesunden und erkrankten Individuen durchgeführt, anschließend erfolgte die Sequenzierung auf der Visium Spatial Gene Expression-Plattform38. Der Arbeitsablauf beinhaltet standardisierte Verfahren zur Gewebeentnahme sowohl von humanen als auch von murinen Knochenproben, Fixierung, Entkalkung, Dehydrierung, Paraffineinbettung und Schnitt, gefolgt von einer umfassenden Qualitätskontroll-Pipeline, die die Beurteilung der Schnittintegrität, Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung, die Bewertung der RNA-Qualität (DV200) sowie optional eine Immunfluoreszenz (IF) zur Zelltypverifizierung umfasst. Diese Vorbereitungsschritte stellen sicher, dass nur hochwertige Schnitte in nachfolgende Arbeitsabläufe der räumlichen Transkriptomik übergehen, einschließlich der Vorverarbeitung der Gewebeschnitte, Bibliothekserstellung, Sequenzierung sowie anschließender Datenqualitätskontrolle und -analyse.

Dieses standardisierte Verfahren unterstützt die Aufbereitung und Qualitätsbeurteilung menschlicher und muriner BM-Proben für die räumliche transkriptomische Analyse. Es soll Untersuchungen nischenspezifischer regulatorischer Programme bei hämatologischen und skelettalen Erkrankungen erleichtern.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß der europäischen Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz von für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tieren durchgeführt und durch den Ausschuss für Tierversuche der Universität Navarra (Comité de Ética para la Experimentación Animal; Protokolle CEEA082-20 und CEEA039-20) genehmigt. Die Tierhaltung, -behandlung und -euthanasie erfolgten unter Einhaltung der spanischen Gesetzgebung, um Schmerzen und Leiden so gering wie möglich zu halten.

Die Humanstudie wurde vom Forschungsethikkomitee der medizinischen Fakultät der Universität Navarra (Comisión de Ética de Investigación, CEI; Projekte 2022.100mod1 und 2023.172) sowie vom Forschungsethikkomitee des Gesundheitsdienstes von Navarra (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1) genehmigt. Alle Verfahren an menschlichen Teilnehmern wurden gemäß den ethischen Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Persönliche Daten wurden vertraulich behandelt und entsprachen der spanischen Gesetzes über den Schutz personenbezogener Daten und die Gewährleistung digitaler Rechte (Organisches Gesetz 3/2018) sowie dem spanischen Gesetz 14/2007 über biomedizinische Forschung.

HINWEIS: Eine detaillierte Liste der in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte ist in der Tabelle der Materialien enthalten. Die umfassende experimentelle Abfolge zur Durchführung der räumlichen Transkriptomik in Knochengeweben ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt und in drei Arbeitsphasen unterteilt: Probenahme, Qualitätskontrolle (QC) und räumliche Transkriptom-Profilierung. Die Probenahme umfasst das Sammeln menschlicher oder muriner Knochenfragmente, gefolgt von Fixierung, EDTA-Dekalzifizierung, Dehydrierung, Paraffineinbettung sowie Schnittstellung und Objektträgerpräparation. Die QC-Phase bewertet die histologische Integrität und die RNA-Erhaltung. Bestätigte Knochenschnitte werden anschließend einer Gewebedurchlässigmachung direkt auf dem Objektträger, Bibliotheksherstellung, Sequenzierung und Datenauswertung unterzogen.

Gewebeprozessierung von Knochen: Fixierung, Dekalzifizierung, Dehydratisierung; Workflow-Diagramm der räumlichen Transkriptomik.
Abbildung 1: Probensammlung und Arbeitsablauf zur EDTA-basierten Probenvorbereitung bei murinen und menschlichen Knochenproben. Mausefemora und menschliche Knochenproben werden gesammelt, fixiert, in EDTA dekalzifiziert, dehydriert, in Paraffin eingebettet und geschnitten. Die Probenqualität wird mittels H&E-Färbung und Beurteilung der RNA-Integrität (DV200) evaluiert, gefolgt von der Vorbereitung des Gewebes für die räumliche Transkriptomik, der Bibliotheksherstellung, Sequenzierung und Qualitätskontrolle der Daten. Abkürzungen: BM = Knochenmark; DV200 = Anteil an RNA-Fragmenten länger als 200 Nukleotide; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; H&E = Hämatoxylin und Eosin; QC = Qualitätskontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Gewinnung und Aufbereitung von Knochenproben

  1. Knochenentnahme bei Mäusen
    1. Tier mit 5 % Isofluran narkotisieren und Verlust der Reflexe bestätigen.
    2. Nach vollständiger Narkose die Tiere durch Halswirbelverrenkung gemäß den institutionellen und behördlichen Richtlinien euthanasieren.
      ​HINWEIS: Die Euthanasie muss durch geschultes Personal durchgeführt werden, und der Tod muss vor der Gewebeentnahme bestätigt sein.
    3. Die Haut durch Besprühen der dorsalen Fläche der Maus mit 70 %igem Ethanol desinfizieren und mit einer Schere einen kleinen Einschnitt durchführen, um die Haut vorsichtig zu entfernen und die Hintergliedmaßen freizulegen.
    4. Die Hintergliedmaßen oberhalb des Hüftgelenks abschneiden und in ein 50-mL-Gefäß mit 10 mL kalter Dulbeccos Phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) überführen. Das Gefäß auf Eis stellen.
    5. Anhaftende Muskulatur und Bindegewebe mit sterilen Pinzetten und einem Skalpell entfernen.
    6. Die Knochen in einen sterilen 50-mL-Behälter überführen, der zuvor mit kalter, sauberer DPBS gefüllt wurde, und den Behälter auf Eis stellen.
    7. Unverzüglich mit der Fixierung der Proben beginnen, um die Gewebeintegrität zu bewahren.
  2. Handhabung menschlicher Knochenproben
    1. Knochenkernbiopsien oder chirurgische Knochenfragmente in sterilen 100-mL-Behältern entgegennehmen.
    2. Die Knochenfragmente in einen sauberen, sterilen 100-mL-Behälter überführen, der zuvor mit kalter DPBS gefüllt wurde, und diesen auf Eis stellen.
    3. Unverzüglich mit der Probenfixierung beginnen, um die Gewebeintegrität zu bewahren.
      ACHTUNG: Menschliche Proben müssen unter BSL-2-Bedingungen behandelt werden.
  3. Fixierung des Knochengewebes
    1. Das 50-mL- oder 100-mL-Gefäß mit der Knochenprobe entnehmen und die DPBS verwerfen.
    2. Plastikkassetten beschriften und die Knochenproben einzeln in die Kassetten geben. Die Deckel sicher verschließen, um einen Verlust des Gewebes während der weiteren Verarbeitung zu verhindern.
      ​HINWEIS: Bei Mausproben jeweils einen Knochen pro Kassette verwenden. Bei menschlichen Knochenproben gegebenenfalls mit einem sterilen Skalpell das Gewebe in kleine Fragmente schneiden, die in Standardkassetten Platz finden, und jeweils ein Fragment pro Kassette einlegen. Falls menschliche Knochenproben zu hart zum Schneiden sind, können sie vorübergehend ganz belassen und in die Entkalkungslösung überführt werden; nach erfolgter Entkalkung lässt sich das weichere Gewebe dann in geeignete Fragmente schneiden und in beschriftete Kassetten legen.
    3. 4 %ige gepufferte Formaldehydlösung im Verhältnis 1:20 (Probe:Fixiermittel) hinzufügen und die Probe 24 h bei 4 °C inkubieren.
      ACHTUNG: Das Fixiermittel im Abzug handhaben, da es toxisch und flüchtig ist.
      HINWEIS: Eine Überfixierung (>48 h) vermeiden, da diese die RNA-Integrität in FFPE-Workflows beeinträchtigt39.
  4. Entkalkung mineralisierten Knochengewebes
    1. Formalin verwerfen und die Knochenprobe mit ultrareinem Wasser waschen. Mit Wasser spülen, kurz schwenken und das Wasser verwerfen, um verbliebene Formalinrückstände zu entfernen.
    2. Eine 0,25 M EDTA-Lösung in ultrareinem Wasser herstellen und den pH-Wert auf 6,95 einstellen.
      HINWEIS: Obwohl EDTA in traditionellen Entkalkungsprotokollen oft auf pH 8,0 eingestellt wird, wird in diesem Workflow ein pH-Wert von etwa 6,95 verwendet, um eine effiziente Chelatbildung bei gleichzeitiger Erhaltung der Gewebemorphologie und RNA-Qualität zu gewährleisten8.
    3. Die EDTA-Lösung dem Gefäß mit der Knochenprobe hinzufügen und 10 Tage bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
      ​HINWEIS: Für Mausproben sind typischerweise etwa 50 mL EDTA-Lösung ausreichend. Für menschliche Knochenproben werden typischerweise etwa 100 mL verwendet. Diese Menge kann jedoch je nach Knochengröße angepasst werden, um eine vollständige Überdeckung und effektive Entkalkung sicherzustellen.
    4. Nach 5 Tagen Entkalkung die EDTA-Lösung verwerfen und durch frische EDTA-Lösung gleichen Volumens ersetzen, da die Chelatkapazität im Laufe der Zeit gesättigt ist. Die Inkubation unter gleichen Bedingungen fortsetzen.
    5. Nach 10-tägiger Inkubation die EDTA-Lösung verwerfen und überprüfen, ob die Entkalkung vollständig ist.
      1. Mit einem sterilen Skalpell einen kleinen Schnitt oder mit einer feinen sterilen Nadel eine Einstichstelle in eine Ecke oder periphere Region des Gewebes setzen, wobei stets ein Bereich mit geringer analytischer Relevanz gewählt werden sollte, um die interessierenden Regionen nicht zu beeinträchtigen. Den Knochen zur Stabilisierung während des Schneidens oder Nadeleinstichs auf eine sterile Petrischale legen. Wenn das Gewebe leicht geschnitten werden kann oder die Nadel mit minimalem Widerstand durchdringt, ist die Probe ausreichend entkalkt.
      2. Bei Mausfemora die Knochen mit der Pinzette vorsichtig verbiegen, um die Flexibilität zu prüfen, was ein zuverlässiger Indikator für vollständige Mineralentfernung ist.
        HINWEIS: Die Dauer der Entkalkung hängt von der Größe und Dicke der Knochenprobe sowie vom verwendeten EDTA-Volumen ab. Bleibt der Knochen nach der initialen Inkubationszeit fest, sollte die Entkalkung fortgesetzt werden, bis das Gewebe ausreichend weich ist, um leicht geschnitten werden zu können. Eine übermäßige Verlängerung kann die Gewebequalität und RNA-Integrität beeinträchtigen; die Verlängerung sollte daher auf das notwendige Minimum beschränkt bleiben20.
  5. Dehydrierung
    1. Waschen, indem ultrareines Wasser dem Gefäß mit der Knochenprobe zugegeben wird, anschließend 5 min bei 4 °C unter Schütteln inkubieren.
    2. Wasser verwerfen und durch 70 %ige Ethanol-Lösung ersetzen. 1 h bei 4 °C inkubieren.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann als Unterbrechungspunkt dienen. Die Proben können in 70 %igem Ethanol bei 4 °C gelagert werden, bevor die nächsten Schritte durchgeführt werden. Die maximale Lagerdauer wurde in diesem Protokoll nicht experimentell validiert, daher sollten die Anwender gemäß den Standardverfahren ihres Labors vorgehen.
    3. Die Probe nacheinander in steigenden Ethanolkonzentrationen dehydrieren (70 %, 80 %, 96 %; jeweils 1 h bei 4 °C), gefolgt von 100 %igem Ethanol über Nacht bei 4 °C.
    4. 100 %iges Ethanol verwerfen und durch Xylol ersetzen. 4 h bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
    5. Xylol verwerfen und die Probenkassette in ein Glas mit geschmolzenem, sauberem Paraffin stellen. Über Nacht bei 60 °C inkubieren.
      HINWEIS: Bei Verfügbarkeit von vakuumunterstützten Verarbeitungssystemen können kürzere Infiltrationszeiten verwendet werden, da diese Geräte eine effizientere Paraffindurchdringung ermöglichen40,41,42.
      ACHTUNG: Alle Schritte mit Xylol und gestuften Ethanol-Lösungen müssen im Abzug durchgeführt werden, um eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten und die Exposition gegenüber toxischen und brennbaren Dämpfen zu minimieren.
  6. Paraffineinbettung
    ​HINWEIS: Die Oberflächen der Einbettungsstation mit einer RNase-Entkontaminationslösung reinigen, um RNA-Abbau zu verhindern.
    1. Die Einbettungsstation einschalten und das Paraffinreservoir, das Kassetten-Paraffinbad, das Form-Paraffinbad und die Form-Wärmescheibe auf 60 °C vorheizen. Die Kälteplatte aktivieren, damit sie sich vor der Einbettung abkühlen kann.
    2. Das Paraffin vollständig schmelzen lassen und erst dann die Kassetten mit den paraffindurchtränkten Proben in das Kassetten-Paraffinbad stellen. 2 h inkubieren, um eine vollständige Entfernung von Xylol vor der Einbettung sicherzustellen.
    3. Alle benötigten Formen in das Form-Paraffinbad stellen.
      HINWEIS: Für menschliche Proben Standard-Metall-Einbettungsformen verwenden. Für Mausproben Kunststoff-Einbettungsformen verwenden, die mit der Visium-Plattform kompatibel sind und eine quadratische Vertiefung mit Abmessungen aufweisen, die eine korrekte Platzierung der Schnitte auf Visium-Gläsern ermöglichen. Da ganze Mausknochen nicht vollständig in die quadratische Vertiefung dieser Formen passen, müssen die Knochen unmittelbar vor der Einbettung mit einem sterilen Skalpell in Fragmente geeigneter Größe geschnitten werden. Abhängig von den Abmessungen können ein oder zwei Knochenfragmente pro Form eingebettet werden.
    4. Eine dünne Grundschicht frischen Paraffins auftragen, indem geschmolzenes Paraffin aus der zentralen Öffnung der Einbettungsstation abgegeben wird.
    5. Die Kassette öffnen und das Gewebe vorsichtig mit erwärmten Pinzetten aus der Kassette in die Form überführen.
    6. Die mit Paraffin gefüllte Form auf die Wärmescheibe stellen und das Gewebe, solange das Paraffin flüssig ist, mit erwärmten Pinzetten in der gewünschten Schneideebene ausrichten.
    7. Die Form auf die kalte Fläche der Einbettungsstation stellen, um die Position des Knochenfragments kurzzeitig zu fixieren.
    8. Die Form vollständig mit geschmolzenem Paraffin aus dem Spender auffüllen, wobei sichergestellt werden muss, dass das Gewebe vollständig bedeckt ist und keine größeren Blasen verbleiben.
    9. Die beschriftete Kassette auf die Form stellen, sodass sie die Unterseite des Paraffinblocks bildet.
    10. Die Form mit der befestigten Kassette auf die Kälteplatte der Einbettungsstation überführen. Das Paraffin 10 min vollständig erstarren lassen, bis der Block trüb und fest ist.
    11. Nach dem Erstarren den Paraffinblock aus der Form lösen und bei 4 °C bis zur Schnittführung lagern.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann als Unterbrechungspunkt dienen. Der Paraffinblock kann bei 4 °C gelagert werden; dennoch sollten die Gewebeschnitte und nachfolgende räumliche transkriptomische Analysen möglichst bald nach der Einbettung durchgeführt werden, um RNA-Abbau während der Lagerung zu minimieren43,44.
  7. Schneiden und Präparatvorbereitung
    HINWEIS: Mikrotom und Wasserbad mit einer RNase-Entkontaminationslösung reinigen, um RNA-Abbau zu verhindern.
    1. Das Wasserbad mit destilliertem Wasser füllen und auf 42 °C vorheizen. Das Mikrotom einschalten und eine neue Klinge einsetzen. Objektträger mit Bleistift beschriften.
    2. Den Paraffinblock im Probenhalter befestigen, wobei die Kassette entsprechend der gewünschten longitudinalen Schneidebene ausgerichtet sein muss.
      ​HINWEIS: Eine mit Eis gefüllte Plastiktüte bereithalten; wenn das Schneiden aufgrund weichen Paraffins schwierig wird, die Eispackung direkt auf den am Mikrotom befestigten Block legen und einige Minuten mit einem Gummiband fixieren, um das Paraffin zu verfestigen und die Schnittqualität zu verbessern.
    3. Die Mikrotomeinstellung auf 20 µm setzen und die Anschneidschnitte durchführen.
    4. Die Mikrotomeinstellung auf 5 µm ändern. Vier 5-µm-Schnitte in ein beschriftetes, RNase-freies 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen sammeln. Das Röhrchen auf Trockeneis lagern und bei -80 °C aufbewahren.
    5. Weiterhin bei 5 µm schneiden und die Schnittbänder im Wasserbad schwimmen lassen. Sobald der Schnitt vollständig entfaltet und faltenfrei ist, mit dem beschrifteten Objektträger aufnehmen.
      1. In regelmäßigen Abständen (z. B. alle 5–10 Bänder, abhängig von der Gewebegröße) jeweils vier zusätzliche 5-µm-Schnitte in ein neues beschriftetes 1,5-mL-Röhrchen sammeln. Diesen Vorgang wiederholen, bis insgesamt drei 1,5-mL-Röhrchen mit 5-µm-Schnitten vorliegen.
        HINWEIS: Wenn das Gewebe reißt, bricht oder nicht kontinuierlich geschnitten werden kann, ist die Probe nicht ausreichend entkalkt und erfordert zusätzliche Entkalkungszeit. Die Probe kann durch Rückwärtsdurchlaufen der Arbeitsschritte bis zur Entkalkungsphase zurückgewonnen werden. Dazu den Paraffinblock etwa 2 h bei 60 °C schmelzen und die Probe in Xylol überführen (2 h). Die Probe durch gestufte Ethanol-Lösungen (100 %, 96 %, 80 %, 70 %) und anschließend destilliertes Wasser rehydrieren. Die rehydrierte Probe in frische 0,25 M EDTA-Lösung (pH 6,95) geben und die Entkalkungsdauer entsprechend verlängern, bevor die Dehydrierung, erneute Einbettung und Schnittführung fortgesetzt werden. Dieses Wiederherstellungsverfahren sollte nur als letzte Option angewendet werden, da das Rückgängigmachen von FFPE-Schritten die RNA-Integrität beeinträchtigen kann.
    6. Die Objektträger über Nacht in einen 37 °C warmen Ofen stellen, um verbliebene Feuchtigkeit zu verdampfen, und anschließend bei 4 °C lagern.
    7. Zur Verbesserung der Gewebeadhäsion optional die Objektträger vor der Übernachtkultivierung bei 37 °C 3 h bei 42 °C backen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist in der Regel nicht notwendig, wenn die in der Tabelle der Materialien aufgeführten Glasobjektträger verwendet werden, da diese eine starke Adhäsion gewährleisten und das Gewebe während der gesamten Verarbeitung typischerweise fest haftet. Dieser Schritt kann als Unterbrechungspunkt dienen. Die Objektträger können bei 4 °C gelagert werden; dennoch sollten nachfolgende räumliche transkriptomische Analysen möglichst bald nach der Einbettung durchgeführt werden, um RNA-Abbau während der Lagerung zu minimieren43,44.

2. Qualitätsbewertung der Probe

  1. Evaluierung der Schnittqualität
    1. Untersuchen Sie alle Schnitte nacheinander unter einem Standard-Hellfeldmikroskop (4×–10×). Prüfen Sie jeden Objektträger daraufhin, ob die Schnitte fragmentiert sind, und dokumentieren Sie die Qualität jedes einzelnen Schnitts.
      ​HINWEIS: Achten Sie auf Falten, Wellen, Kompressionen oder Rattermarkierungen, die auf Probleme mit der Paraffinhärte, der Messerschärfe oder einer unvollständigen Entkalkung hindeuten können. Stellen Sie sicher, dass keine Gewebeteile durch Ablösung während des Schneidens oder des Transfers in das Wasserbad fehlen.
    2. Wählen Sie die am besten erhaltenen Schnitte für die räumliche Transkriptomik aus (größtmögliche Vollständigkeit, beste Morphologie).
    3. Identifizieren Sie die benachbarten aufeinanderfolgenden Schnitte der ausgewählten Proben und reservieren Sie diese für die H&E-Färbung und die Immunfluoreszenz (IF), um sicherzustellen, dass das gefärbte Bild dem Gewebe, das sequenziert wird, so genau wie möglich entspricht.
  2. H&E-Färbung zur Beurteilung der Gewebeintegrität
    1. Platzieren Sie die Objektträger in einem Glasobjektträger-Gestell und inkubieren Sie sie 15 min bei 60 °C.
    2. Überführen Sie das Gestell in Glasfärbungsgefäße mit Xylol für 15 min.
    3. Rehydrieren Sie die Schnitte, indem Sie das Gestell durch Färbungsgefäße mit 100 %, 96 %, 80 % und 70 % Ethanol bewegen und jeweils 5 min in jeder Lösung inkubieren.
      ​ACHTUNG: Alle Schritte mit Xylol und abgestuften Ethanol-Lösungen müssen in einer chemischen Abzugshaube durchgeführt werden, um eine ausreichende Belüftung sicherzustellen und die Exposition gegenüber toxischen und entflammbaren Dämpfen zu minimieren.
    4. Spülen Sie die Objektträger 5 min in einem mit Wasser gefüllten Färbungsgefäß.
    5. Tauchen Sie das Gestell 10 min in Hämalumin, danach waschen Sie unter fließendem Leitungswasser, bis das Spülwasser klar ist.
    6. Tauchen Sie das Gestell in Wasser mit fünf Tropfen konzentrierter Salzsäure, dabei vorsichtig schwenken, bis ein rötlicher Farbton erscheint.
    7. Überführen Sie das Gestell in mit Lithiumcarbonat gesättigtes Wasser, bis sich eine stabile blaue Färbung entwickelt, danach kurz mit Wasser spülen.
    8. Färben Sie die Schnitte 5 min mit 1 % (w/v) Eosin, danach erneut mit Wasser spülen.
    9. Dehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie das Gestell durch Färbungsgefäße mit Wasser, 70 %, 80 %, 96 % und 100 % Ethanol bewegen und jeweils 5 min in jeder Lösung inkubieren.
    10. Entfetten Sie die Objektträger in Xylol für 15 min.
    11. Trocknen Sie die Rückseite jedes Objektträgers vorsichtig ab, geben Sie Eindeckmedium auf ein Deckglas und montieren Sie die Schnitte. Lassen Sie die Objektträger 24 h bei RT trocknen, bevor Sie sie abbilden.
    12. Führen Sie die Gewebeabbildung mit einem hochauflösenden Mikroskop bei 20facher Vergrößerung durch.
      HINWEIS: Führen Sie zunächst die H&E-Färbung an benachbarten Schnitten als Qualitätskontrolle durch, um die Eignung der Probe für die räumliche Transkriptomik zu beurteilen. Nach der Auswahl führen Sie eine zweite H&E-Färbung direkt auf dem für die räumliche Genexpression vorgesehenen Schnitt durch, gemäß den Herstelleranleitungen zur Gewebevorbereitung für die räumliche Genexpressionsplattform, wie in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
  3. Beurteilung der RNA-Integrität (DV200)
    ​HINWEIS: Für das Protokoll zur räumlichen Genexpression ist die traditionelle RNA-Integritätszahl (RIN) nicht aussagekräftig, da die 18S- und 28S-rRNA-Peaks in fixierten Geweben typischerweise fehlen. Daher wird der DV200-Wert – definiert als der Prozentsatz der RNA-Fragmente, die länger als 200 Nukleotide sind – häufig als aussagekräftigerer Qualitätsparameter für degradierte klinische Proben verwendet. Für Visium v2 empfiehlt 10x Genomics FFPE-Blöcke mit einem DV200-Wert ≥ 30 %, um eine effiziente Hybridisierung der Sonden und optimale Testleistung sicherzustellen. Die Auswahl von Gewebeproben mit den höchstmöglichen DV200-Werten hilft, Sequenzierungs-Ausfälle zu vermeiden und die Empfindlichkeit der Spots zu maximieren.
    1. Entnehmen Sie die 1,5-mL-Röhrchen mit den 5-µm-Schnitten, die während des Gewebeschnittschritts gesammelt wurden, und stellen Sie sie auf Eis, um die RNA zu extrahieren.
    2. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA. Dieses standardisierte Verfahren umfasst die Deparaffinierung der Probe, den Verdau mit Proteinase K zur Aufhebung der Formalin-Quervernetzungen, die Entfernung genomischer DNA durch DNase-I-Behandlung und die abschließende Elution der gereinigten RNA in RNase-freiem Wasser.
    3. Beurteilen Sie die RNA-Integrität mithilfe eines kapillarelektrophoretischen Systems mit einem Hochsensitivitäts-RNA-Assay. Eine Übersicht über den Arbeitsablauf finden Sie in Ergänzende Datei 142,45,46,47,48.
  4. Optionale IF zur Zelltypverifizierung
    1. Platzieren Sie den FFPE-Objektträger in einem Glasobjektträger-Gestell und inkubieren Sie ihn 15 min bei 60 °C.
    2. Überführen Sie das Gestell in Glasfärbungsgefäße mit Xylol für 15 min.
    3. Rehydrieren Sie den Schnitt, indem Sie das Gestell durch 100 %, 96 %, 80 % und 70 % Ethanol jeweils 2 min bewegen, gefolgt von 5 min in Wasser und 5 min in PBS-Tween (1x PBS ergänzt mit 0,1 % Tween-20).
      ACHTUNG: Alle Schritte mit Xylol und Ethanol müssen in einer chemischen Abzugshaube durchgeführt werden.
    4. Führen Sie die Antigen-Retrieval-Behandlung gemäß den Herstellerempfehlungen für den Primärantikörper durch, wobei Puffer, pH-Wert und Erhitzungsbedingungen den Angaben im Antikörper-Datenblatt entsprechen müssen. HINWEIS: In diesem Arbeitsablauf erfolgt die Antigen-Retrieval-Behandlung mit 10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH 9,0, im Kochtopf-Heizsystem 30 min bei 95 °C, anschließend 20 min bei RT abgekühlt.
    5. Waschen Sie den Objektträger zweimal je 10 min in PBS-Tween.
    6. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Markierstift eine Barriere um das Gewebe und blockieren Sie unspezifische Bindungen, indem Sie 5 % BSA in 1x DPBS mindestens 40 min bei RT in einer befeuchteten Kammer auf die Gewebeschnitte auftragen.
      HINWEIS: Die befeuchtete Kammer wird hergestellt, indem ein Filterpapier in eine Kunststoff-Objektträgerfärbekassette gelegt und mit destilliertem Wasser gründlich angefeuchtet wird, um während der Antikörperinkubation eine stabile Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
    7. Bereiten Sie die Primärantikörperlösung in 1x DPBS in der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung für jeden Antikörper vor.
      HINWEIS: In diesem Arbeitsablauf wurden Primärantikörper gegen Emcn (V.7C7) und Cd271 (ME20.4) verwendet, um murine ECs und MSCs zu identifizieren, während Antikörper gegen CD31 (JC70A) oder PRRX1 (polyklonal) zur Identifizierung der menschlichen Entsprechungen eingesetzt wurden, gemäß dem Herstellerprotokoll.
    8. Entfernen Sie die Blockierungslösung, indem Sie vorsichtig die Kante des Objektträgers auf ein saugfähiges Papier klopfen, um Resttropfen zu entfernen, tragen Sie dann die Primärantikörpermischung auf und inkubieren Sie den Objektträger über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
    9. Waschen Sie den Objektträger zweimal je 5 min in PBS-Tween und bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung in der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung vor, wobei sicherzustellen ist, dass die Fluorophore spektral kompatibel sind und sich nicht überlappen.
      HINWEIS: In diesem Arbeitsablauf wurde ein Alexa-Fluor-konjugierter Sekundärantikörper in einer 1:200-Verdünnung verwendet.
    10. Tragen Sie die Sekundärantikörpermischung auf und inkubieren Sie 30 min bei RT, lichtgeschützt in einer befeuchteten Kammer.
    11. Waschen Sie den Objektträger zweimal je 5 min in PBS-Tween.
    12. Tragen Sie eine 1:10-verdünnte Eindecklösung mit DAPI (siehe Tabelle der Materialien), hergestellt in einer 1:1 PBS–Glycerin-Lösung, auf und inkubieren Sie die Probe 5 min.
    13. Montieren Sie den Schnitt mit einem Deckglas und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack, um Austrocknung zu verhindern.
    14. Visualisieren Sie das gefärbte Gewebe mithilfe einer multispektralen Bildgebungsplattform.

Zusatzdatei 1: Zusammenfassung der Protokollschritte zur Bewertung der RNA-Integrität und zur Visium-Spatial-Transkriptomik-Arbeitsablauf. Diese Zusatzdatei enthält eine detaillierte Übersicht der gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführten Verfahrensschritte. Dazu gehören: (i) der High Sensitivity RNA ScreenTape-Assay zur Beurteilung der RNA-Integrität (DV200), wie in Schritt 2.3.3 des Hauptprotokolls beschrieben, und (ii) ein Überblick über den Visium CytAssist Spatial Gene Expression-Arbeitsablauf, der die Gewebevorbehandlung, die Bibliotheksherstellung und die Sequenzierung umfasst (Schritte 3.1–3.3 des Hauptprotokolls).Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

3. Räumliche Transkriptomik

HINWEIS: Führen Sie den Ablauf der räumlichen Transkriptomik mithilfe der Plattform und der Reagenzien aus der Tabelle der Materialien durch, und befolgen Sie dabei die entsprechenden Benutzeranleitungen42,45,46. Supplementärdatei 1 fasst die wichtigsten Schritte der Gewebevorbehandlung, Bibliotheksherstellung und Sequenzierung zusammen.

  1. Kontrolle der Datenqualität der räumlichen Transkriptomik
    1. Demultiplexen Sie die Daten der räumlichen Transkriptomik mithilfe der Standard-Pipeline für Visium-Datensätze (siehe Table of Materials).
    2. Karten Sie die Reads auf das entsprechende Ensembl-105-Referenzgenom ab.
      HINWEIS: Für humane Proben wurde GRCh38 und für Mausproben mm10 verwendet.
    3. Erzeugen Sie die gefilterten Merkmal-Barcode-Matrizen mithilfe derselben Pipeline und importieren Sie sie in die nachgeschaltete Einzelzell- bzw. räumliche Analyseumgebung (siehe Table of Materials).
    4. Untersuchen Sie die H&E-Bilder in der Visualisierungsoberfläche, die von der Pipeline für die räumliche Transkriptomik bereitgestellt wird (siehe Table of Materials), und entfernen Sie manuell Spots, die mit dem kortikalen Knochenbereich oder Knochengewebe überlappen, je nach Datensatz.
    5. Normalisieren Sie die Datensätze mithilfe einer varianzstabilisierenden Transformationsmethode, die üblicherweise in Workflows der Einzelzellanalyse angewendet wird (siehe Table of Materials).

Ergebnisse

Um die Anwendbarkeit dieses auf EDTA basierenden Arbeitsablaufs über verschiedene Arten und Krankheitskontexte hinweg zu bewerten, wurde das Protokoll auf vier Knochenmarkproben angewendet: zwei murine Femora und zwei humane Knochenproben, die gesunde und Multiple-Myelom-(MM-)Bedingungen repräsentieren (Table 1 und Abbildung 1).

ProbenidentifikationArtGeschlechtAlterErkrankung
YFPcγ1MouseWeiblich210 daysGesund
mMMMouseMännlich314 daysMM
hHBMHumanMännlich76 yearsGesund
hMMHumanWeiblich50 yearsMM

Tabelle 1: Murine und humane Knochenproben, die in die Studie eingeschlossen wurden. Für jede Probe sind Art, Geschlecht, Alter und Gesundheitszustand angegeben. Abkürzungen: hHBM = gesundes menschliches Knochenmark; hMM = humanes Multiples Myelom; mMM = murines Multiples Myelom; MM = Multiples Myelom; YFPcγ1 = gesunde Kontrollmaus.

Die in dieser Studie verwendeten Proben wurden bereits früher von der Forschungsgruppe charakterisiert und in früheren Veröffentlichungen beschrieben, insbesondere in den Arbeiten von Muiños-Lopez et al. und Cenzano et al., mit Ausnahme der Mausprobe mit MM. Für die zuvor publizierten Proben liegen die Daten und Ergebnisse der räumlichen Transkriptomik in jenen Studien vor8,10. Daher dient das hier enthaltene Material zur Beurteilung der technischen Eignung des Protokolls für die räumliche Transkriptomik und nicht zur Präsentation neuartiger biologischer Erkenntnisse.

Mäusefemurproben wurden aus dem genetisch veränderten MM-Mausmodell BIC (BIcγ1) gewonnen, das die klinischen und immunologischen Merkmale von MM-Patienten nachbildet, sowie aus der entsprechenden gesunden Kontrollmaus (YFPcγ1)8,49. Ein einzelner Femur von jedem Tier wurde entnommen, gereinigt und gemäß dem standardisierten Protokoll aufbereitet (Abbildung 2A). Femuren wurden speziell für diese Analysen verwendet, da sie ein reichlich vorhandenes Markangebot, eine überlegene Nischenqualität und eine einfache, reproduzierbare Aufarbeitung bieten, was sie besonders gut für eine sequenzbasierte räumliche Transkriptomik-Plattform geeignet macht8,10. Der erfolgreiche Entkalkungsprozess am Femur der Kontrollmaus wurde makroskopisch durch eine deutliche Zunahme der Gewebeflexibilität während der manuellen Handhabung mit der Pinzette bestätigt (Abbildung 2B). Anschließend wurde dieses Knochenfragment effizient in Paraffin eingebettet, wobei eine spezielle, mit der räumlichen Transkriptomik kompatible Form verwendet wurde, um die RNA-Integrität und die Gewebearchitektur für die nachfolgende molekulare Analyse zu bewahren (Abbildung 2C).

Zwei humane Knochenmarkproben mit unterschiedlichen Aufbereitungshistorien wurden ebenfalls analysiert8,10. Eine frische humane Knochenmarkprobe von hämatologisch gesundem Gewebe wurde aus operativem Abfallmaterial während eines Hüftgelenkersatzes am Hospital Universitario de Navarra gewonnen (Abbildung 2D–F). Um die Übertragbarkeit des Protokolls zu demonstrieren, wurde diese Probe genauso wie murine Proben aufbereitet. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen an Mausgewebe wurde eine erfolgreiche EDTA-Dekalzifizierung menschlichen Knochens makroskopisch durch vollständige Weichheit des Gewebes bestätigt, erkennbar an einer mühelosen Nadelpenetration (Abbildung 2E). Das dekalzifizierte menschliche Knochenfragment wurde erfolgreich mit einem standardmäßigen Metallformwerkzeug in Paraffin eingebettet, um nachfolgende Verfahrensschritte zu ermöglichen (Abbildung 2F). Die zweite humane Probe bestand aus archivierten FFPE-Knochenmarkbiopsien aus dem Darmbeinstachel eines Multiplen-Myelom-Patienten aus der Pathologieabteilung der Clínica Universidad de Navarra (CUN). Bemerkenswerterweise war diese archivierte MM-Probe zuvor mit einem standardmäßigen klinischen Protokoll unter Verwendung starker Säuren dekalzifiziert worden36. Diese Probe dient als qualitativer Vergleich zu den mit EDTA behandelten Proben; aufgrund von Unterschieden in der Gewebequelle, Fixierungshistorie, Lagerung und Dekalzifizierung können die beobachteten Unterschiede jedoch nicht allein auf das Dekalzifizierungsmittel zurückgeführt werden.

Histologische Gewebeverarbeitung: sechs Gewebeproben mit Maßstäben; Bildgebung zur Analyse in der Forschung.
Abbildung 2: Maus- und menschliche Knochenproben während der EDTA-basierten Aufbereitung. (A) Intakte Kontroll-Mausfemora vor der Entkalkung. (B) Entkalktes Kontroll-Mausfemur mit erhöhter Flexibilität. (C) Kontroll-Mausknochenfragmente in Paraffin eingebettet. (D) Gesunde menschliche Knochenfragmente aus Hüftchirurgie vor der Entkalkung. (E) Derselbe Fragment nach EDTA-Entkalkung, mit sichtbarer Nadelpenetration. (F) Mit EDTA entkalkte gesunde menschliche Knochenprobe in Paraffin eingebettet. Maßstäbe: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Abkürzung: EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zur Analyse der allgemeinen Geweearchitektur wurde eine H&E-Färbung durchgeführt (Abbildung 3). Die bessere morphologische Erhaltung in den murinen Schnitten könnte Unterschiede in der Probennahme und -verarbeitung widerspiegeln, anstatt inhärenter, artspezifischer Merkmale. Die murinen Femora wurden speziell für die räumliche Transkriptomik entnommen und unverzüglich als intakte Knochen weiterverarbeitet, wodurch ihre Architektur erhalten blieb (Abbildung 3A, B). Im Gegensatz dazu stammen die humanen Proben entweder von Restmaterial aus Hüftersatzoperationen (Abbildung 3C) oder von diagnostischen Knochenbiopsien bei multipler Myelom-Erkrankung (MM) (Abbildung 3D), wobei die präanalytische Gewebequalität variabel sein kann. Folglich sind die morphologischen Unterschiede zwischen der EDTA-entkalkten humanen Probe und der säureentkalkten MM-Biopsie geringfügig, da bereits beide humanen Präparate grundlegende strukturelle Einschränkungen aufweisen, die nicht nur durch die Entkalkung, sondern auch durch die allgemeine Gewebeverarbeitung verursacht werden (Abbildung 3C, D). Um die Probengüte für die räumliche Transkriptomik daher umfassend beurteilen zu können, müssen mehrere unterschiedliche Parameter evaluiert werden. Erstens muss die Gewebeintegrität sorgfältig überwacht werden, da die Erhaltung der Struktur stark von der jeweiligen Probentypologie abhängen kann und nicht ausschließlich von der verwendeten entkalkenden Säure. Zweitens sollte auch die RNA-Qualität bewertet werden, da die Bedingungen der Entkalkung diese beeinflussen können20,35,36.

Histologischer Vergleich von Gewebeproben unter dem Mikroskop; 500 µm Maßstab für die strukturelle Analyse.
Abbildung 3: H&E-gefärbte Schnitte zur Beurteilung der Gewebequalität. Aufeinanderfolgende FFPE-Schnitte entsprechen (A) einem gesunden Kontrollmaus10, (B) einer Maus mit MM, (C) gesundem menschlichem Knochen8,10 und (D) einer menschlichen MM-Biopsie8. Maßstabsbalken = 500 µm. Abkürzungen: FFPE = formalinfixiert, paraffingeeicht; H&E = Hämatoxylin und Eosin; MM = multiple Myelom. Klicken Sie bitte hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zur Ergänzung der histologischen Analyse wurde die RNA-Qualität bewertet. Während die H&E-Färbung uneindeutige Unterschiede zeigte, unterschied sich die RNA-Integrität deutlich zwischen den beiden Entkalkungsmethoden (Tabelle 2). Die DV200-Werte sowohl der murinen Proben als auch der gesunden menschlichen Knochenprobe lagen über der für Visium-FFPE-Assays empfohlenen Schwelle, was auf eine ausreichende Verteilung der RNA-Fragmentlängen für die Sondenhybridisierung und die Bibliothekskonstruktion hinweist. Die Probe des gesunden YFP-Mausgewebes weist einen DV200-Wert von 82,55 % auf, und die gesunde menschliche Knochenprobe (hHBM) erreicht 58 %, beide deutlich über der von 10x Genomics definierten Akzeptanzschwelle von 30 %. Die Probe der MM-Maus (mMM) zeigt einen DV200-Wert von 31,3 %, nahe der unteren Grenze der Akzeptanz, was möglicherweise auf eine längere Lagerung des Paraffinblocks bei 4 °C vor dem Aufschneiden sowie andere probenspezifische Faktoren zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu weist die säureentkalkte menschliche MM-Biopsie (hMM) lediglich einen DV200-Wert von 8 % auf, was mit einer deutlich verringerten RNA-Integrität assoziiert war, selbst wenn die morphologische Degeneration weniger ausgeprägt war. Zusammenfassend ist es wichtig, sowohl strukturelle als auch molekulare Bewertungen durchzuführen, um die Eignung von Proben für nachfolgende räumliche Analysen zu beurteilen.

ProbenidentifikationDV200 (%)1
YFPcγ182,55
mMM31,3
hHBM58
hMM28
1DV200: Anteil der gesamten RNA-Fragmente > 200 Nukleotide in Prozent.
2Diese Probe wurde mit einem standardmäßigen klinischen Protokoll, das starke Säuren verwendet, entmineralisiert.

Tabelle 2: RNA-Qualität der untersuchten Proben. DV200 ist der Prozentsatz an RNA-Fragmenten, die länger als 200 Nukleotide sind; Werte von mindestens 30 % wurden als geeignet für anschließende räumliche Transkriptomik-Analysen betrachtet. Abkürzungen: hHBM = gesundes menschliches Knochenmark; hMM = menschliches Multiplen Myelom; mMM = murines Multiplen Myelom.

Zusätzliche Qualitätsbewertungen können ebenfalls durchgeführt werden. Um die Gewebeintegrität weiter zu validieren und die Erhaltung spezifischer zellulärer Kompartimente nach der EDTA-Dekalzifizierung zu bestätigen, wurde eine optionale Immunfluoreszenz-Färbung an benachbarten FFPE-Schnitten von Maus- und Humanproben durchgeführt. Antikörper gegen Endomucin (Emcn) und Cd271 wurden verwendet, um endotheliale Zellen (EC) bzw. mesenchymale Zellen (MSC) in der MM-Mausprobe darzustellen (Abbildung 4A). Diese Färbung zeigte, dass Gewebe, die mit EDTA verarbeitet wurden, gut definierte vaskuläre Strukturen mit kontinuierlicher Emcn-Färbung und erhaltenen stromalen Netzwerken aufwiesen, was darauf hinweist, dass die getesteten Marker nach der Aufarbeitung weiterhin nachweisbar blieben. Darüber hinaus lieferte die hochauflösende Bildgebung mittels eines automatisierten multispektralen Bildgebungssystems zusätzliche Belege dafür, dass die untersuchten Antigene für die Zelltyp-Verifizierung weiterhin detektierbar waren, was eine zusätzliche Qualitätssicherungsebene vor der räumlichen Transkriptomik-Analyse darstellt. Diese Befunde wurden zudem auch in gesunden menschlichen Proben von älteren Spender*innen beobachtet, bei denen der EC-Ausdruck mittels CD31- und der MSC-Ausdruck mittels PRRX1 (Paired Related Homeobox 1)-Antikörpern nachgewiesen wurde, was zeigt, dass die untersuchten Nischenmarker nach der EDTA-Dekalzifizierung weiterhin identifizierbar blieben (Abbildung 4B). Im Gegensatz dazu konnten diese Ergebnisse bei humanen MM-Biopsien, die verschiedenen säurebasierten Dekalzifizierungsprotokollen unterzogen wurden, nicht reproduziert werden. Wie bereits erwähnt, war die RNA-Integrität in diesen Proben gering, was die nachgeschaltete Transkriptomik-Analyse einschränkte. Aufgrund des degradierten Zustands dieser humanen Proben war ihre nachgeschaltete Anwendbarkeit auf eine Baseline-Transkriptom-Profilierung8 und die immunhistochemische (IHC) Beurteilung maligner Plasmazellen (PC) beschränkt (Abbildung 4C).

Immunfluoreszenzmikroskopie von Gewebeschnitten; mehrfarbige Färbung; Analyse der zellulären Struktur.
Abbildung 4: Optionale Immunfluoreszenz- und Immunhistochemiefärbung zur Bestätigung der Zelltypen. (A) Maus-MM-Gewebe mit DAPI-gefärbten Kernen (blau), CD271-positive MSC (grün) und EMCN-positive EC (rot). (B) Gesundes menschliches Knochengewebe mit DAPI-gefärbten Kernen (blau), PRRX1-positive MSC (grün) und CD31-positive EC (rot)10. (C) Menschliche MM-Biopsie mit CD138-positiven malignen PC8. Maßstäbe: (A) 250 µm (Übersicht), 20 µm (vergrößerte Überlagerung) und 50 µm (Einzelkanal-Bilder); (B) 500 µm (Übersicht) und 20 µm (vergrößerte Überlagerung und Einzelkanal-Bilder); (C) 500 µm. Abkürzungen: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; EC = endotheliale Zelle; MM = multiples Myelom; MSC = mesenchymale Stromazelle; PC = Plasmazelle. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zusammen unterstützen die Gewebemorphologie und die DV200-Ergebnisse die Eignung von mit EDTA behandelten Proben für nachgeschaltete räumliche Transkriptom-Analysen. Räumliche Transkriptom-Anwendungen dieses Probenvorbereitungsworkflows wurden bereits früher berichtet8,10.

Diskussion

Durch die Kombination einer EDTA-basierten kontrollierten Entkalkung, standardisierter FFPE-Aufarbeitung und strenger Qualitätskontrollschritte überwindet dieses Protokoll viele der traditionell mit der Probenvorbereitung von Knochengewebe für die räumliche Transkriptomik verbundenen Einschränkungen, insbesondere jene, die durch RNA-Abbau und morphologische Schäden verursacht werden und auf stark säurebasierte Entkalkungsmethoden zurückgehen8,10,20,33,36. Der kritischste Schritt bei der Aufarbeitung mineralisierter Proben für die räumliche Transkriptomik ist die Entkalkung. Unzureichende Entkalkung führt dazu, dass der Knochen zu starr zum Schneiden bleibt, wodurch die Gewinnung hochwertiger Schnitte für die räumliche Transkriptomik physisch unmöglich wird8,20,23,37,50. Wenn das Knochengewebe zu hart bleibt, zerbricht oder vibriert es an der Mikrotomklinge, was zu zerrissenen Schnitten oder Löchern führt, die die native Knochenmarkarchitektur nicht korrekt wiedergeben. Wichtig ist, dass der Erfolg der Entkalkung erst im Mikrotomierschritt endgültig überprüft werden kann: Auch Proben, die oberflächlich weicher erscheinen, können noch Restmineral enthalten, das sich erst beim Versuch, dünne FFPE-Schnitte anzufertigen, bemerkbar macht. Aus diesem Grund ist eine sorgfältige Überwachung des Entkalkungsfortschritts entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen.

Der Workflow verwendet 0,25 M EDTA bei pH 6,95 über einen Zeitraum von 10 Tagen mit konstanter Agitation und Austausch der Lösung am fünften Tag8,10. Während der Protokollentwicklung wurden EDTA allein, EDTA ergänzt mit Polyvinylpyrrolidon sowie 10 % Ameisensäure evaluiert, zusammen mit unterschiedlichen Entkalkungsdauern und Zeitplänen für den Lösungsaustausch; die vergleichenden Daten werden hier nicht dargestellt. Kürzere Dauern als 10 Tage führten häufig zu Gewebefrakturen beim Schneiden von Mausproben, während menschliche Proben eine probenspezifische Reaktion zeigten. Daher wird eine Dauer von 10 Tagen für murine Femora verwendet, während menschliche Proben je nach Dichte und trabekulärem Gehalt eine längere Entkalkung erfordern können. Vor der Einbettung in Paraffin sollten physische Qualitätskontrollschritte durchgeführt werden. Falls während der Mikrotomie eine unzureichende Entkalkung erkennbar wird, sollte das Nachbearbeitungsverfahren nur als letzter Rettungsschritt angewendet werden, da zusätzliche Wärme, Lösungsmittelbelastung und Rehydratation die RNA-Qualität beeinträchtigen können.

Die Hauptbeschränkung dieser Methode ist die lange Bearbeitungszeit, die im starken Gegensatz zu den schnellen, säurebasierten Protokollen steht, die üblicherweise in der klinischen Pathologie verwendet werden20,36. Obwohl längere Bearbeitungszeiten in der Forschung im Allgemeinen akzeptabel sind, zeigen neuere Studien – wie beispielsweise das von Miao et al. beschriebene Protokoll, das Morssche Lösung (22,5 % Ameisensäure und 10 % Natriumcitrat) verwendet, um innerhalb von 24 h zu dekalkifizieren – das wachsende Interesse an einer Beschleunigung der Knochenpräparation für räumliche Assays20. Säurebasierte Methoden bergen jedoch historisch ein deutlich höheres Risiko der RNA-Degradation, was die DV200-Werte verringert und letztlich ihre Verträglichkeit mit der räumlichen Transkriptomik einschränkt1,8,35,36. Dieser auf EDTA basierende Ansatz priorisiert die RNA-Erhaltung gegenüber der Geschwindigkeit und gewährleistet so die Kompatibilität mit sequenzbasierten räumlichen Plattformen wie Visium.

Eine mögliche Einschränkung der BM-Spatial-Transkriptomik ist das hohe Vorkommen von Immunglobulin-Transkripten, die von PC stammen und die Detektion von Transkripten mit geringer Häufigkeit beeinträchtigen können. Wie bei den Qualitätskontroll- und Filterstrategien, die in einer früheren Studie der Forschungsgruppe angewandt wurden – einschließlich des Ausschlusses von Spots mit geringer Qualität (<200 UMIs und <150 nachgewiesene Gene), der Filterung von Zelltypen mit geringem Beitrag (<20 % pro Spot) während der Dekonvolutionanalysen sowie der Auswahl von Marker-Genen, die in den räumlichen Transkriptomdatensätzen detektiert wurden – können Immunglobulin-Transkripte ebenfalls rechnerisch im Rahmen der nachgelagerten Analyse gefiltert werden, um ihren Einfluss gegebenenfalls zu minimieren8. Gezielte Ansätze der räumlichen Transkriptomik können die Detektion von Transkripten mit geringer Häufigkeit in bestimmten Anwendungen weiter verbessern.

Die möglichen Anwendungen dieser Methode sind umfangreich. Kürzlich durchgeführte Kombinationen räumlicher und Einzelzell-Daten haben spezialisierte humane osteogene Nischen sowie komplexe Signalkaskaden aufgezeigt, die von trabekulärem Knochen ausgehen3,26. Darüber hinaus hat die räumliche Transkriptomik gezeigt, dass das Altern die Gestalt der Knochenmark-Mikroumgebung verändert, indem es die räumliche Organisation und Kommunikation endothelialer Zellen (EC) beeinträchtigt, was zu einer geschwächten osteogenen Unterstützung und zur Entstehung entzündlicher Signalnetzwerke in der alternden Nische führt10. Die multiomische Profilierung hat außerdem unterschiedliche mikroumgebungsbezogene Regionen identifiziert, wie arteriell-osteoendostale Bereiche, die die frühe Myelopoese unterstützen, sowie peri-adipozytäre Zonen, die angereichert sind für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen3. Im Kontext des multiplen Myeloms ermöglicht dieses Protokoll die Integration räumlicher und Einzelzell-Transkriptomik, um die Zusammensetzung des erkrankten murinen Knochenmarks sowie Zell-Zell-Interaktionen zu charakterisieren. Frühere Arbeiten haben räumlich getrennte Verteilungen maligner Plasmazellen (PC) aufgezeigt und immunologische sowie entzündliche Programme identifiziert, wie beispielsweise NETose und IL-17-Signalgebung, die umgekehrt mit tumorangereicherten Regionen assoziiert waren. Zusätzlich korrelierte eine erhöhte Dichte maligner Plasmazellen mit einem Übergang von effektorischen zu erschöpften T-Zell-Zuständen. Diese Befunde wurden ebenfalls in humanen FFPE-Knochenmarkproben bestätigt und belegen somit ihre übertragbare Relevanz bei unterschiedlichem Krankheitsausmaß8. Letztendlich schafft dieser Arbeitsablauf die technische Grundlage, um die komplexen zellulären Interaktionen innerhalb der mineralisierten Architektur des Knochenmarks zu erforschen.

Plattformen für die hochauflösende räumliche Genexpression ermöglichen ein Ganztranskriptom-Profil mit nahezu einzelligen Auflösung38,51,52. Diese Ansätze könnten die Anwendung des Probenvorbereitungsworkflows auf die hochauflösende Analyse räumlich organisierter Knochenmark- und hämatologischer Malignome erweitern. Der Workflow bietet somit eine technische Grundlage für zukünftige Studien zur physiologischen und malignen Hämatopoese.

Offenlegungen

Die Autoren geben keine Wettbewerbsinteressen an. Ein Patent über das Know-how und die experimentelle Anwendung der MIcγ1-Mausmodelle des MM wurde an MIMO Biosciences lizenziert (Anmeldenummer PCT/EP2023/071025).

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Instituto de Salud Carlos III unterstützt und durch ERDF kofinanziert, einen Weg, Europa zu gestalten (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) und RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011; Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC und AIRC im Rahmen des Accelerator Award Programms; die International Myeloma Foundation (Brian van Novis) und die Paula and Rodger Riney Foundation an FP. IAC erhielt Unterstützung durch ein Marie-Curie-Stipendium (H2020-MSCA-IF-837491) der Europäischen Kommission, ein AECC-Talentstipendium (INVES258003CALV) sowie vom Departamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03). MC wurde durch ein FPU-Stipendium (FPU22/03283) des Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades unterstützt. Wir danken dem Personal des Advanced Genomics Laboratory und der Tierhaltungseinrichtung am CIMA Universidad de Navarra für ihre unschätzbare technische und fachliche Unterstützung. Wir danken außerdem den Pathologieabteilungen der Clínica Universidad de Navarra (CUN) und des Hospital Universitario de Navarra für die Bereitstellung von KM-Proben und ihre hervorragende Zusammenarbeit. Besonderer Dank gilt José Ángel Martínez-Climent und Marta Larrayoz für ihre MM-Mausmodelle. Wir danken Patxi San Martín-Uriz, Tania López und Eduardo Larequi für ihre hervorragende Unterstützung bei der Optimierung von Technologien, der Entwicklung von Protokollen und der Fehlersuche bei der Aufbereitung von Maus- und humanen KM-Proben für die räumliche Transkriptomik. Ebenso danken wir Beñat Ariceta und Asier Ullate für ihre gesamte rechnergestützte Arbeit zur räumlichen Transkriptomik. Schließlich sind wir den Patienten und gesunden Spendern, die großzügig an dieser Studie teilgenommen haben, zutiefst dankbar.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5-mL-RöhrchenEppendorf15625367
100-mL-steriler Behälter deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991ASystem basierend auf Kapillarelektrophorese–zur Beurteilung der RNA-Integrität
50-mL-steriler Behälter IberoMedREOR001
50-mL-Röhrchen FALCON352070
Advanced PAP-StiftTed Pella 22309Z377821-1EAHydrophober Barrierestift 
Anti-PRRX1-Antikörper, hergestellt in KaninchenSigma-AldrichHPA051084
BSA (Rinderserumalbumin)Sigma-AldrichA9418-50G
Kassetten KartellLABWARE2921
CD271 (NGF-Rezeptor) monoklonaler Antikörper (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, endotheliale Zelle (Konzentrat) Klon JC70AAligent DakoM0823
DeckgläserFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (VECTASHIELD Antifade-Montagemedium mit DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
DeparaffinisierungslösungQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 1×), Dulbeccos Formulierung, ohne Calcium, ohne Magnesium
DPX-Montagemedium für die HistologieSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA), 0,5 M Lösung, Molekularbiologische Qualität, Ultrapure
Einbettstation Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Emcn-Antikörper (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Ensembl-Referenzgenom (GRCh38 / mm10, Release 105)EMBL-EBIN/AReferenzgenom, verwendet für die Read-Alignment.
EosinMillipore SigmaHT110116
ÄthanolMillipore SigmaE7023-500MLChirurgische Schere
Falc Instruments B-I Histologie-WasserbadFalc610.1030.00
Formalin 4% PanReac AppliChem2524311315Formaldehyd 3,7%–4,0% (w/v), gepuffert auf pH = 7 und mit Methanol stabilisiert (CE-IVD) für die klinische Diagnostik
Glasmalhefter-Färbevorrichtung WHEATONZ710970-3EA
Glasmalfärbegläser BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
GlycerinSigma-AldrichC3H803
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Cross-Adsorbiertes Sekundärantikörper, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig Cross-Adsorbiertes Sekundärantikörper, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Hochgradig Cross-Adsorbiertes Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Haematoxylin Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Beurteilung der RNA-Integrität
High Sensitivity RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5581Beurteilung der RNA-Integrität
High Sensitivity RNA ScreenTape ProbenpufferAgilent5067-5580Beurteilung der RNA-Integrität
Mikroskop mit hoher Auflösung Leica BiosystemsN/AAperio CS2 Scanner
Salzsäure (0,1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Illumina NextSeq 2000 PlattformIllumina20038897
Invitrogen Ziegen-Anti-Ratte-IgG (H+L) Cross-Adsorbiertes Sekundärantikörper, Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
Augenscheren - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Isfluran
Lithiumcarbonat Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/ASoftware zur Visualisierung von HE-Bildern und zur Kuration von Visium-Spots; öffnet .cloupe-Dateien, die von der Analyse-Pipeline generiert wurden.
MetalleinbettformenBio-Optica07-BM24256
Mikroskopische Objektträgeravantor631-0108Superfrost Plus Mikroskopische Objektträger
MikrotomklingenFEATHERFEAT207500006_U
Mikrotom HM 340EEprediaN/AModell HM 340E
KanüleBD301156BD Microlanc 3 Kanüle 21 G 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Hellfeld-Lichtmikroskop
Paraffin PanReac AppliChem256993Paraffin mit Schmelzpunkt 55–58°C, plastifiziert + DMSO-Pellets (CE-IVD) für die klinische Diagnostik
Petri-Schale CorningCLS430167-100EA
Kunststoff-Einbettformen Bio-Optica07-MP7070
Potts-Smith-ZangeF.S.T 11012-18Zange
Qubit 3.0 FluorometerInvotrogen Q33216
Qubit-Assay-RöhrchenInvotrogen Q32856
Qubit RNA HS Assay KitInvotrogen Q32855
RNAse-freies 1,5-mL-MikrozentrifugenröhrchenThermo Scientific AM12400
RNAse-freies Wasser MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780Deskontaminationslösung
RNeasy FFPE Kit (50)Qiagen73504Extraktion der Gesamt-RNA
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/AVarianzstabilisierende Normalisierungsmethode, implementiert in Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/AR-Paket zur Analyse von Einzelzell- und räumlicher Transkriptomik.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/ASoftware zur Demultiplexierung, Alignment und Erstellung von Merkmals-Barcode-Matrizen für Visium-Datensätze.
Stlime Skalpell Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/AR-Paket zur Visualisierung und Integration der räumlichen Transkriptomik.
Chirurgisches Skalpellblatt Nr. 23Swann-Morton210Chirurgische Skalpellklingen
Thermocycler Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455Multispektrales Bildgebungsplattform zur IF-Visualisierung
Visium Zubehörkit 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Visium Human Transkriptom-Probe-Kit Klein 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Visium Mouse Transkriptom-Probe-Kit Klein 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 Reaktionen 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
XylolPanreac214736Xylol, Gemisch von Isomeren zur Analyse, ACS, ISO

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