Methodenartikel

Herstellung von formalinfixierten, paraffineingebetteten Knochenmarkproben für die räumliche Transkriptomik unter Verwendung einer EDTA-basierten Dekalzifizierung

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DOI:

10.3791/72474

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28. August 2026

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1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein standardisierter Workflow zur Vorbereitung von formalinfixierten, paraffin-eingebetteten Knochenproben für die räumliche Transkriptomik umfasst eine 10-tägige Entkalkung mit EDTA, um die RNA-Integrität zu bewahren. Wichtige Qualitätskontrollschritte helfen dabei zu bestimmen, ob die Proben die Anforderungen für nachfolgende Analysen der räumlichen Genexpression erfüllen.

Zusammenfassung

Das Knochenmark (BM) ist eine komplexe und dynamische Struktur, in der räumliche Beziehungen das Zellverhalten, die Signalübertragung und die Funktion beeinflussen. Daher erfordert das Verständnis der vollständigen Dynamik zellulärer Interaktionen ergänzende räumliche Methoden, die die Architektur von Zellpopulationen in situ erhalten und abbilden. Trotz erheblicher Fortschritte in Einzelzelltechnologien, die zum Verständnis der transkriptionellen Heterogenität gesunder und erkrankter BM-Gewebe beigetragen haben, müssen die räumliche Organisation verschiedener Zelltypen, nischenspezifische regulatorische Programme und deren Interaktionen weiter untersucht werden. Neuere Entwicklungen in der räumlichen Transkriptomik haben eine unvoreingenommene Genexpressionsanalyse mit räumlichem Kontext in verschiedenen Geweben ermöglicht, wodurch diese Technologien zu den Einzelzellmethoden, die über keine räumliche Auflösung verfügen, komplementär werden. Während die räumliche Transkriptomik bereits häufig in Weichgeweben eingesetzt wird, beschränkt sich ihre Anwendung in mineralisierten Geweben wie dem BM aufgrund der mit der Aufbereitung von Knochengewebe verbundenen Herausforderungen noch. Der hier vorgestellte Protokollansatz wurde zur Herstellung von formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Proben aus gesundem und erkranktem Maus- und Humanmaterial verwendet. Ein 10-tägiger Entmineralisierungsschritt auf Basis von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ist enthalten, um die RNA-Integrität zu bewahren und die Anwendung der räumlichen Transkriptomik an langen Knochenproben zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von BM-Proben für die räumliche transkriptomische Analyse, einschließlich Gewebeverarbeitung, Konservierung und Schnitttechnik, sowie wesentliche Qualitätsbewertungsschritte wie die Beurteilung der Schnittintegrität, der Gewebemorphologie und der RNA-Qualität. Der Arbeitsablauf unterstützt zudem die Identifizierung von Zelltypen und die Integration mit Einzelzell-Transkriptomdaten, um die zelluläre Zusammensetzung zu charakterisieren, Zell-Zell-Interaktionen zu definieren und die räumliche Verteilung transkriptionell heterogener Zellen in gesunden und erkrankten Zuständen zu visualisieren. Insgesamt bereitet dieser Workflow vollständig mineralisierte gesunde und maligne Gewebe für die räumliche transkriptomische Analyse vor, wobei die Architektur des Knochenmarks erhalten bleibt.

Einleitung

Das Knochenmark (BM) ist ein äußerst komplexes und kompartimentalisiertes Organ, das als primärer Ort der Hämatopoese und der Reifung von Immunzellen dient1,2. Dieses heterogene Gewebe besteht aus einer vielfältigen Ansammlung hämatopoetischer, mesenchymaler, endothelialer und immunologischer Zelllinien, die in einer hochspezialisierten und organisierten dreidimensionalen Nische koexistieren3,4. Innerhalb dieser Nische nimmt jede Zellpopulation definierte anatomische Bereiche ein, und der räumliche Kontext spielt eine grundlegende Rolle bei der Regulation des zellulären Verhaltens, der Signalübertragung und der Funktion4,5. Die räumliche Nähe zu bestimmten Strukturen, wie zum Beispiel trabekulärem Knochen oder vaskulären Netzwerken, steuert wesentliche physiologische Prozesse, darunter die Aufrechterhaltung der Ruhephase hämatopoetischer Stammzellen (HSC) und die Knochenremodellierung6,7. Folglich formt diese dynamische Mikroumgebung sowie die eng regulierten Wechselwirkungen zwischen ihren zellulären und stromalen Bestandteilen die regulatorischen Netzwerke, die die Homöostase aufrechterhalten und den Verlauf hämatologischer Erkrankungen beeinflussen8,9,10,11,12,13.

Fortschritte in der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) haben unser Verständnis der zellulären Vielfalt des Knochenmarks (BM) revolutioniert und ermöglichen die Entdeckung bisher unbekannter Zellsubtypen sowie deren vorhergesagte Interaktionen innerhalb der Nische3,10,11,12,14,15,16. Die Einzelzell-Transkriptomik bietet zwar hochauflösende Informationen über die einzelnen Komponenten der hämatopoetischen Nische, ist jedoch grundsätzlich durch den Gewebedigesterprozess begrenzt, der Zellen von ihrem nativen Milieu löst und möglicherweise ihren ursprünglichen Zustand verändert17, sowie durch den Mangel an räumlichem Kontext, der die Organisation des Knochengewebes definiert4,18. Dieser Verlust des positionsbezogenen Kontexts macht es unmöglich, definitiv abzubilden, wo bestimmte transkriptionell unterschiedliche Populationen lokalisiert sind oder wie sie mit benachbarten Zellen interagieren19. Darüber hinaus wird dichtes Knochengewebe oft nur teilweise dissoziiert, was zu einer Unterrepräsentation wichtiger Zellpopulationen wie Osteozyten und Adipozyten in scRNA-seq-Datensätzen und einer verzerrten Darstellung der Gewebeheterogenität führt20,21. Die räumliche Transkriptomik ermöglicht die Untersuchung der Genexpression in situ in räumlich erhaltenen Gewebeschnitten und gewinnt dadurch kontextuelle Informationen zurück, wodurch die Einschränkungen der Einzelzelltechnologien behoben werden8,19,22,23,24,25,26. Diese Technologie stellt eine wesentliche Weiterentwicklung auf dem Gebiet dar, da sie eine präzise räumliche Positionierung und strukturelle Organisation der verschiedenen Zellpopulationen im Knochenmark ermöglicht, was unverzichtbar ist, um deren Interaktionen und funktionelle Rollen in ihrem nativen Mikromilieu zu verstehen8,26. Zudem ermöglicht die räumliche Transkriptomik im Krankheitskontext Forschern und Klinikern, die Lücke zwischen der traditionellen Pathologie und der Hochdurchsatz-Genomik zu schließen, indem sie molekulare Daten auf morphologische Bilder aufbringen1,8. Räumliche Transkriptomik-Technologien können in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden: sequenzbasierte Methoden und bildbasierte Methoden17,24. Sequenzbasierte Plattformen wie Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) und die Open-Source-Plattform Open-ST erfassen mRNA auf räumlich barcodierten Arrays oder Kügelchen vor der NGS-Sequenzierung. Bildbasierte Methoden wie Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX und Xenium visualisieren Transkripte direkt in situ durch multiplexe Hybridisierung oder Padlock-Probe-Chemie27,28. Alternativ können Plattformen je nachdem, ob sie eine sondenbasierte Detektion erfordern, als gezielt oder ungerichtet klassifiziert werden17,24.

Methoden der räumlichen Transkriptomik wurden bereits erfolgreich auf Weichgewebe wie Gehirn, Herz und Leber angewandt, bei denen die Herstellung intakter histologischer Schnitte einfach ist29,30,31. Dagegen ist die Anwendung der räumlichen Transkriptomik an Knochen aufgrund seiner mineralisierten Struktur deutlich schwieriger, was einen Entkalkungsprozess erfordert32,33, also die kontrollierte Entfernung von Calciumphosphat, um das Gewebe weich genug für das Schneiden sowie für nachfolgende histologische oder molekulare Analysen zu machen8,20,23,34. Herkömmliche Entkalkungsmethoden, die routinemäßig in der klinischen Praxis verwendet werden, basieren typischerweise auf starken sauren Lösungen wie Salz-, Salpeter-, Ameisen- oder Phosphorsäure, die die RNA-Integrität stark beeinträchtigen und die zelluläre Morphologie stören35,36. Eine solche molekulare Degradation verringert das Signal-Rausch-Verhältnis bei räumlichen Assays und führt häufig zu unannehmbar niedrigen Gen-Detektionsraten im Vergleich zu Weichgeweben8,10. Diese Einschränkung verdeutlicht die Notwendigkeit standardisierter Entkalkungsprotokolle, die die mRNA-Integrität in mineralisierten Proben zuverlässig für sequenzbasierte räumliche Analysen bewahren8,20.

Dieses Protokoll stellt einen standardisierten Arbeitsablauf zur Vorbereitung von formalinfixierten, paraffin-eingebetteten (FFPE) Knochenmarkproben (BM) für die räumliche Transkriptomik vor, der zuvor bereits von Muiños-Lopez et al.8 angewandt wurde. Der Arbeitsablauf umfasst eine 10-tägige Entkalkung mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei kontrolliertem pH-Wert. Im Gegensatz zu aggressiven Säuren wirkt EDTA als sanfter Chelator, der die mikroskopische Struktur erhält und die Qualität der Nukleinsäuren bewahrt, wodurch seine Verwendung in molekularen Anwendungen unterstützt wird8,20,33,36,37. Als Machbarkeitsnachweis wurde das Protokoll an Knochengewebeproben von gesunden und an multiplem Myelom (MM) erkrankten Mausmodellen sowie an humanen BM-Proben von gesunden und erkrankten Individuen durchgeführt, anschließend erfolgte die Sequenzierung auf der Visium Spatial Gene Expression-Plattform38. Der Arbeitsablauf beinhaltet standardisierte Verfahren zur Gewebeentnahme sowohl von humanen als auch von murinen Knochenproben, Fixierung, Entkalkung, Dehydrierung, Paraffineinbettung und Schnitt, gefolgt von einer umfassenden Qualitätskontroll-Pipeline, die die Beurteilung der Schnittintegrität, Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung, die Bewertung der RNA-Qualität (DV200) sowie optional eine Immunfluoreszenz (IF) zur Zelltypverifizierung umfasst. Diese Vorbereitungsschritte stellen sicher, dass nur hochwertige Schnitte in nachfolgende Arbeitsabläufe der räumlichen Transkriptomik übergehen, einschließlich der Vorverarbeitung der Gewebeschnitte, Bibliothekserstellung, Sequenzierung sowie anschließender Datenqualitätskontrolle und -analyse.

Dieses standardisierte Verfahren unterstützt die Aufbereitung und Qualitätsbeurteilung menschlicher und muriner BM-Proben für die räumliche transkriptomische Analyse. Es soll Untersuchungen nischenspezifischer regulatorischer Programme bei hämatologischen und skelettalen Erkrankungen erleichtern.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß der europäischen Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz von Tieren, die zu wissenschaftlichen Zwecken verwendet werden, durchgeführt und vom Tierversuchsausschuss der Universität Navarra (Comité de Ética para la Experimentación Animal; Protokolle CEEA082-20 und CEEA039-20) genehmigt. Die Tierpflege, -handhabung und -euthanasie erfolgten unter Einhaltung der spanischen Gesetzgebung, um Schmerzen und Leiden so gering wie möglich zu halten.

Die Humanstudie wurde vom Forschungsethikkomitee der medizinischen Fakultät der Universität Navarra (Comisión de Ética de Investigación, CEI; Projekte 2022.100mod1 und 2023.172) sowie vom Forschungsethikkomitee des Gesundheitsdienstes von Navarra (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1) genehmigt. Alle Verfahren an menschlichen Teilnehmern wurden gemäß den ethischen Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Persönliche Daten wurden vertraulich behandelt und entsprachen der spanischen Gesetzesverordnung 3/2018 zum Schutz personenbezogener Daten und zur Gewährleistung digitaler Rechte sowie dem spanischen Gesetz 14/2007 über biomedizinische Forschung.

HINWEIS: Eine detaillierte Liste der in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte ist in der MaterialienübersichtDie umfassende experimentelle Vorgehensweise zur Implementierung der räumlichen Transkriptomik in Knochengeweben ist schematisch dargestellt in Abbildung 1 und gliedert sich in drei operationelle Phasen: Probenakquise, Qualitätskontrolle (QC) und räumliches Transkriptom-Profil. Die Probenakquise umfasst das Sammeln menschlicher oder muriner Knochenfragmente, gefolgt von Fixierung, EDTA-Dekalzifizierung, Dehydrierung, Paraffineinbettung sowie Schnittstellung und Objektträgerpräparation. Die QC-Phase bewertet die histologische Integrität und die RNA-Erhaltung. Bestätigte Knochenschnitte durchlaufen anschließend eine Gewebedurchlässigmachung direkt am Objektträger, Bibliotheksherstellung, Sequenzierung und Datenanalyse.

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Abbildung 1: Ablaufschema zur Probensammlung und EDTA-basierten Aufbereitung von murinen und menschlichen Knochengeweben. Mausfemora und menschliche Knochenproben werden gesammelt, fixiert, mit EDTA entkalkt, dehydriert, in Paraffin eingebettet und geschnitten. Die Probenqualität wird mittels H&E-Färbung und Beurteilung der RNA-Integrität (DV200) überprüft, gefolgt von der Vorbearbeitung des Gewebes für die räumliche Transkriptomik, Bibliotheksaufbereitung, Sequenzierung und Qualitätskontrolle der Daten. Abkürzungen: BM = Knochenmark; DV200 = Anteil der RNA-Fragmente länger als 200 Nukleotide; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; H&E = Hämatoxylin und Eosin; QC = Qualitätskontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Gewinnung und Aufbereitung von Knochenproben

  1. Mausknochenpräparation
    1. Betäuben Sie die Tiere mit 5 % Isofluran und überprüfen Sie den Verlust der Reflexe.
    2. Nach vollständiger Anästhesie erfolgt die Tötung durch Halswirbelbruch gemäß den institutionellen und behördlichen Richtlinien.
      ​HINWEIS: Die Euthanasie muss durch geschultes Personal durchgeführt werden, und der Tod muss vor der Gewinnung von Gewebeproben bestätigt werden.
    3. Desinfizieren Sie die Haut, indem Sie 70 %igen Ethanol auf die dorsale Fläche der Maus sprühen, und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt, um die Haut vorsichtig zu entfernen und die Hintergliedmaßen freizulegen.
    4. Entfernen Sie die Hintergliedmaßen durch einen Schnitt oberhalb des Hüftgelenks und überführen Sie sie in ein 50-mL-Gefäß, das 10 mL kalte Dulbecco’s Phosphat-gepufferte Salzlösung enthält. (DPBS). Stellen Sie das Röhrchen auf Eis.
    5. Entfernen Sie anhaftende Muskulatur und Bindegewebe mit sterilen Pinzetten und einem Skalpell.
    6. Überführen Sie die Knochen in einen sterilen 50-mL-Behälter, der zuvor mit kaltem, sauberem DPBS gefüllt wurde, und stellen Sie den Behälter anschließend auf Eis.
    7. Führen Sie unverzüglich die Fixierung des Gewebeprobenmaterials durch, um die Gewebeintegrität zu bewahren.
  2. Handhabung menschlicher Knochenproben
    1. Knochenbohrbiopsien oder chirurgische Knochenfragmente in sterilen Behältern mit 100 mL aufnehmen.
    2. Überführen Sie die Knochenfragmente in einen sauberen, sterilen 100-mL-Behälter, der vorab mit kaltem DPBS gefüllt wurde, und stellen Sie diesen anschließend auf Eis.
    3. Führen Sie unverzüglich die Probeneinbettung durch, um die Gewebeintegrität zu bewahren.
      ACHTUNG: Menschliche Proben müssen unter BSL-2-Bedingungen behandelt werden.
  3. Fixierung von Knochengewebe
    1. Nehmen Sie den 50 mL oder 100 mL Behälter mit der Knochenprobe und entsorgen Sie das DPBS.
    2. Beschriften Sie Plastikkassetten und geben Sie die Knochenproben in einzelne Kassetten. Schließen Sie die Deckel sicher, um einen Gewebeverlust während der anschließenden Verarbeitung zu verhindern.
      ​HINWEIS: Bei Mausproben ein Knochen pro Kassette verwenden. Bei menschlichen Knochenproben, falls erforderlich, mit einem sterilen Skalpell das Gewebe in kleine Stücke schneiden, die in Standardkassetten passen, und jeweils ein Fragment pro Kassette geben. Falls menschliche Knochenproben zu diesem Zeitpunkt zu hart zum Schneiden sind, können sie ganz belassen und in die Entkalkungslösung überführt werden; nach erfolgter Entkalkung kann das aufgeweichte Gewebe dann in passend dimensionierte Fragmente zerschnitten und in beschriftete Kassetten gegeben werden.
    3. Geben Sie eine 4%ige gepufferte Formaldehydlösung im Verhältnis von 1:20 (Probenmenge zu Fixierungslösung) hinzu und inkubieren Sie die Probe 24 h bei 4 °C.
      ACHTUNG: Das Fixiermittel aufgrund seiner Toxizität und flüchtigen Dämpfe stets in einer chemischen Abzugshaube handhaben.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine Überfixierung (>48 h), was die RNA-Integrität in FFPE-Workflows beeinträchtigt39.
  4. Entkalkung von mineralisiertem Knochengewebe
    1. Entfernen Sie die Formalinlösung und waschen Sie die Knochenprobe mit ultrareinem Wasser. Spülen Sie mit Wasser, bewegen Sie die Probe kurz, und entsorgen Sie die Flüssigkeit, um eventuelle Reste von Formalin vollständig zu entfernen.
    2. Stellen Sie eine 0,25 M EDTA-Lösung in ultrareinem Wasser her und stellen Sie den pH-Wert auf 6,95 ein.
      HINWEIS: Obwohl EDTA in herkömmlichen Entkalkungsprotokollen häufig auf pH 8,0 eingestellt wird, verwendet dieser Arbeitsablauf EDTA bei etwa pH 6,95, um eine effiziente Chelatbildung bei gleichzeitiger Erhaltung der Gewebemorphologie und RNA-Qualität zu gewährleisten.8.
    3. Geben Sie die EDTA-Lösung zu dem Behälter mit der Knochenprobe hinzu und inkubieren Sie für 10 Tage bei 4 °C unter leichtem Schütteln.
      ​HINWEIS: Für Mausproben ist in der Regel etwa 50 mL EDTA-Lösung ausreichend. Für menschliche Knochenproben werden in der Regel etwa 100 mL verwendet. Dieses Volumen kann jedoch je nach Knochengröße angepasst werden, um eine vollständige Immersion und eine wirksame Dekalzifizierung sicherzustellen.
    4. Nach 5 Nach mehreren Tagen der Entkalkung verwerfen Sie die EDTA-Lösung und ersetzen Sie durch das gleiche Volumen frischer EDTA-Lösung, da die chelatbildende Kapazität im Laufe der Zeit gesättigt wird. Setzen Sie die Inkubation unter den gleichen Bedingungen fort.
    5. Nach 10 Tagen Inkubation die EDTA-Lösung verwerfen und überprüfen, ob die Entkalkung vollständig ist.
      1. Führen Sie einen kleinen Schnitt mit einem sterilen Skalpell durch oder setzen Sie eine feine, sterile Nadel in eine Ecke oder einen peripheren Bereich des Gewebes ein, wobei stets ein Bereich mit geringer analytischer Relevanz gewählt werden sollte, um die Bereiche von Interesse nicht zu verändern. Legen Sie den Knochen zur Stabilisierung während des Schneidens oder des Nadeleinsatzes auf eine sterile Petrischale. Wenn das Gewebe leicht geschnitten werden kann oder die Nadel mit minimalem Widerstand eindringt, ist die Entkalkung ausreichend.
      2. Im Fall von Mäusefemora die Knochen vorsichtig mit einer Pinzette verbiegen, um die Flexibilität zu beurteilen, ein zuverlässiger Indikator für eine vollständige Entfernung von Mineralien.
        HINWEIS: Die Dauer des Entkalkungsschritts hängt von der Größe und Dicke der Knochenprobe sowie vom verwendeten EDTA-Volumen ab. Falls der Knochen nach der anfänglichen Inkubationszeit noch fest ist, sollte die Entkalkung fortgesetzt werden, bis das Gewebe ausreichend weich ist, um leicht schneiden zu können. Eine übermäßige Verlängerung kann die Gewebequalität und die RNA-Integrität beeinträchtigen; die Verlängerung sollte daher auf das notwendige Mindestmaß beschränkt werden, um eine ausreichende Weichheit zu erreichen.20.
  5. Dehydratation
    1. Waschen, indem ultrareines Wasser zum Behälter mit der Knochenprobe gegeben wird, dann 5 min bei 4 °C unter Rühren.
    2. Entfernen Sie das Wasser und ersetzen Sie es durch eine 70 %ige Ethanol-Lösung. Inkubieren Sie 1 h bei 4 °C.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann als Haltepunkt dienen. Die Proben können in 70 %igem Ethanol aufbewahrt werden bei 4 °C bevor mit den nächsten Schritten fortgefahren wird. Die maximale Lagerdauer wurde in diesem Protokoll nicht experimentell validiert, daher sollten die Anwender gemäß den Standardverfahren ihres Labors vorgehen.
    3. Dehydrieren Sie die Probe nacheinander in steigenden Konzentrationen von Ethanol (70 %, 80 %, 96 %; 1 h jeweils 4 °C), gefolgt von 100 % Ethanol über Nacht bei 4 °C.
    4. Verwerfen Sie das 100%ige Ethanol und ersetzen Sie es durch Xylol. Inkubieren Sie 4 h bei Raumtemperatur (RT).
    5. Entfernen Sie das Xylol und geben Sie die Probenkassette in ein Glas mit geschmolzenem, sauberem Paraffin. Inkubieren Sie über Nacht in geschmolzenem Paraffin bei 60 °C.
      HINWEIS: Kürzere Infiltrationszeiten können verwendet werden, wenn Vakuum-unterstützte Aufbereitungssysteme verfügbar sind, da diese Geräte eine effizientere Penetration von Paraffin ermöglichen40,41,42.
      ACHTUNG: Alle Schritte, bei denen Xylol und gestufte Ethanol-Lösungen verwendet werden, müssen in einer chemischen Abzugshaube durchgeführt werden, um eine ordnungsgemäße Belüftung sicherzustellen und die Exposition gegenüber toxischen und entzündbaren Dämpfen zu minimieren.
  6. Paraffineinbettung
    ​HINWEIS: Reinigen Sie die Oberflächen der Einbettungsstation mit einer RNase-Entkontaminationslösung, um eine RNA-Degradation zu verhindern.
    1. Schalten Sie die Einbettungsstation ein und heizen Sie das Paraffinreservoir, das Paraffinbad für Kassetten, das Paraffinbad für Formen und die Formenwarmpalte vor auf 60 °C. Aktivieren Sie die Kühlplatte, damit sie vor dem Einbetten abkühlen kann.
    2. Lassen Sie das Paraffin vollständig schmelzen und erst danach die Kassetten mit paraffinimprägnierten Proben in das Kassetten-Paraffinbad geben. Inkubieren Sie für 2 h, um eine vollständige Entfernung von Xylol vor der Einbettung sicherzustellen.
    3. Platzieren Sie alle erforderlichen Formen in das Paraffinbad für Formen.
      HINWEIS: Verwenden Sie für humane Proben Standard-Metalleinbettungsschalen. Für Mausproben verwenden Sie kunststoffbasierte Einbettungsschalen, die mit der Visium-Plattform kompatibel sind und einen quadratischen Hohlraum mit Abmessungen aufweisen, die eine geeignete Platzierung der Schnitte auf Visium-Objektträgern ermöglichen. Da ganze Maus-Knochen nicht vollständig in den quadratischen Hohlraum dieser Schalen passen, schneiden Sie die Knochen unmittelbar vor der Einbettung mit einem sterilen Skalpell, um Fragmente geeigneter Größe zu erhalten. Pro Schale kann ein oder zwei Knochenfragmente eingebettet werden, abhängig von deren Abmessungen.
    4. Tragen Sie eine dünne Grundschicht frischen Paraffins auf, indem Sie geschmolzenes Paraffin aus der zentralen Öffnung der Einbettungsstation abgeben.
    5. Öffnen Sie die Kassette und überführen Sie das Gewebe vorsichtig mit einer warmen Pinzette von der Kassette in die Form.
    6. Stellen Sie die mit Paraffin gefüllte Form auf die wärmegeregelte Platte und richten Sie das Gewebe mit einer warmen Pinzette in der gewünschten Schnittebene aus, solange das Paraffin flüssig bleibt.
    7. Stellen Sie die Form auf die kalte Oberfläche der Einbettungsstation, um die Position des Knochenfragments kurzzeitig zu fixieren.
    8. Füllen Sie die Form vollständig mit geschmolzenem Paraffin aus dem Spender, wobei das Gewebe vollständig bedeckt sein muss und keine großen Blasen verbleiben dürfen.
    9. Platzieren Sie die beschriftete Kassette auf der Oberseite der Form, sodass sie die Basis des Paraffinblocks bildet.
    10. Überführen Sie die Form mit dem daran befestigten Kassette auf die Kühlplatte der Einbettstation. Lassen Sie das Paraffin vollständig 10 Minuten lang erstarren, bis der Block trüb und fest ist.
    11. Sobald der Block fest ist, die Paraffinblock aus der Form nehmen und bei 4 °C bis zur Schnittführung
      HINWEIS: Dieser Schritt kann als Haltepunkt dienen. Der Paraffinblock kann bei 4 °C; jedoch sollten, wann immer möglich, das Schneiden von Gewebeschnitten und die anschließenden räumlichen transkriptomischen Analysen so bald wie praktikabel nach der Einbettung durchgeführt werden, um den RNA-Abbau während der Lagerung zu minimieren43,44.
  7. Schnitttechnik und Objektträgerpräparation
    HINWEIS: Reinigen Sie das Mikrotom und das Wasserbad mit einer RNase-Deskontaminationslösung, um eine RNA-Degradation zu verhindern.
    1. Füllen Sie das Wasserbad mit destilliertem Wasser und heizen Sie es auf 42 °CSchalten Sie das Mikrotom ein und installieren Sie eine neue Klinge. Beschriften Sie Objektträger mit einem Bleistift.
    2. Montieren Sie den Paraffinblock im Probenträger, wobei sicherzustellen ist, dass die Kassette gemäß der gewünschten Längsschnittebene ausgerichtet ist.
      ​HINWEIS: Bereiten Sie eine Plastiktüte mit Eis vor. Wenn das Schneiden aufgrund weichen Paraffins schwierig wird, legen Sie die Eistüte direkt auf den Block, während dieser noch am Mikrotom befestigt ist, und sichern Sie sie mit einem Gummiband für mehrere Minuten, um das Paraffin zu verfestigen und die Schnittqualität zu verbessern.
    3. Stellen Sie die Mikrotomdicke auf 20 ein µm und führen Sie die Trimmschnitte durch.
    4. Ändern Sie die Mikrotom-Einstellung auf 5 µm. Sammeln Sie vier 5 µm Abschnitte in ein beschriftetes, RNase-freies 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Das Röhrchen auf Trockeneis aufbewahren und bei -80 °C.
    5. Fahren Sie mit dem Schneiden bei 5 fort µm und lassen Sie die Bänder im Wasserbad schwimmen. Sobald der Schnitt vollständig entfaltet und faltenfrei ist, nehmen Sie ihn mit dem beschrifteten Objektträger auf.
      1. Bei jeder festgelegten Anzahl von Schnitten (z. B. alle 5–10 Bänder, abhängig von der Gewebegröße) zusätzliche 4 von 5 sammeln µm Abschnitte in ein neues beschriftetes 1,5-mL-Gefäß. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis insgesamt drei 1,5-mL-Gefäße mit jeweils 5 erhalten wurden µm Abschnitte.
        HINWEIS: Wenn das Gewebe Risse bildet, bricht oder nicht als zusammenhängender Schnitt gewonnen werden kann, ist die Entkalkung unvollständig und erfordert eine längere Entkalkungszeit. Gewinnen Sie die Probe zurück, indem Sie die Arbeitsschritte rückwärts durchführen, bis die Entkalkungsphase erreicht ist. Schmelzen Sie dazu den Paraffinblock bei 60 °C für etwa 2 Stunden und überführen Sie die Probe in Xylol (2 Stunden). Rehydrieren Sie die Probe durch abgestufte Ethanol-Lösungen (100 %, 96 %, 80 %, 70 %) gefolgt von destilliertem Wasser. Geben Sie die rehydrierte Probe in frische 0,25 M EDTA (pH 6,95) zurück und verlängern Sie die Entkalkungszeit nach Bedarf, bevor Sie mit der Dehydrierung, erneuten Einbettung und Schnittführung fortfahren. Dieses Wiederherstellungsverfahren sollte ausschließlich als letzte Option angewendet werden, da die Umkehrung der FFPE-Verarbeitung die RNA-Integrität beeinträchtigen kann.
    6. Platzieren Sie die Objektträger in einem 37 °C im Ofen über Nacht, um Wasserreste zu verdampfen, und lagern Sie sie dann bei 4 °C.
    7. Um die Gewebeklebung zu verbessern, die Objektträger optional 3 h bei 42 °C bevor sie über Nacht bei 37 °C.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist in der Regel nicht erforderlich, wenn die im Materialienübersicht, da diese Objektträger eine starke Haftung bieten und das Gewebe in der Regel während der gesamten Verarbeitung fest angeheftet bleibt. Dieser Schritt kann als Haltepunkt dienen. Die Objektträger können bei 4 °C; jedoch sollten nachgeschaltete räumliche Transkriptomik-Analysen, wann immer möglich, so bald wie praktikabel nach der Einbettung durchgeführt werden, um den RNA-Abbau während der Lagerung zu minimieren43,44.

2. Qualitätsbewertung der Probe

  1. Bewertung der Schnittqualität
    1. Untersuchen Sie alle Schnitte nacheinander unter einem Standard-Hellfeldmikroskop (4×–10×). Prüfen Sie jeden Objektträger darauf, ob die Schnitte nicht fragmentiert sind, und dokumentieren Sie die Qualität jedes einzelnen Schnitts.
      ​HINWEIS: Achten Sie auf Falten, Wellen, Kompressionen oder Rattermarkierungen, die auf Probleme mit der Paraffinhärte, der Schärfe der Klinge oder einer unvollständigen Entkalkung hindeuten können. Stellen Sie sicher, dass keine Gewebestellen aufgrund von Ablösung während des Schneidens oder des Transfers in das Wasserbad fehlen.
    2. Wählen Sie die am besten erhaltenen Schnitte für die räumliche Transkriptomik aus (größte Vollständigkeit, beste Morphologie).
    3. Identifizieren Sie die benachbarten aufeinanderfolgenden Schnitte und reservieren Sie diese für die H&E-Färbung und die Immunfluoreszenz (IF), um sicherzustellen, dass das gefärbte Bild dem Gewebe, das sequenziert wird, so genau wie möglich entspricht.
  2. H&E-Färbung zur Beurteilung der Gewebeintegrität
    1. Legen Sie die Objektträger in einen Glasobjektträgerhalter und inkubieren Sie sie 15 min bei 60 °C.
    2. Überführen Sie den Halter in Glasfärbegläser mit Xylol für 15 min.
    3. Rehydrieren Sie die Schnitte, indem Sie den Halter durch Färbegläser mit 100 %, 96 %, 80 % und 70 % Ethanol bewegen und jeweils 5 min in jeder Lösung inkubieren.
      ​ACHTUNG: Alle Schritte mit Xylol und abgestuften Ethanol-Lösungen müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden, um eine ausreichende Belüftung sicherzustellen und die Exposition gegenüber toxischen und entflammbaren Dämpfen zu minimieren.
    4. Spülen Sie die Objektträger 5 min in einem mit Wasser gefüllten Färbeglas.
    5. Tauchen Sie den Halter 10 min in Hämalum, danach waschen Sie unter fließendem Leitungswasser, bis das Spülwasser klar ist.
    6. Tauchen Sie den Halter in Wasser mit fünf Tropfen konzentrierter Salzsäure und schwenken Sie vorsichtig, bis ein rötlicher Farbton erscheint.
    7. Überführen Sie den Halter in mit Lithiumcarbonat gesättigtes Wasser, bis sich eine stabile blaue Färbung entwickelt, danach kurz mit Wasser spülen.
    8. Färben Sie die Schnitte 5 min mit 1 % (w/v) Eosin, danach erneut mit Wasser spülen.
    9. Dehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie den Halter durch Färbegläser mit Wasser, 70 %, 80 %, 96 % und 100 % Ethanol bewegen und jeweils 5 min in jeder Lösung inkubieren.
    10. Entfärben Sie die Objektträger in Xylol für 15 min.
    11. Trocknen Sie die Rückseite jedes Objektträgers vorsichtig ab, geben Sie Eindeckmedium auf ein Deckglas und bringen Sie die Schnitte ein. Lassen Sie die Objektträger bei RT 24 h trocknen, bevor Sie die Bilder aufnehmen.
    12. Nehmen Sie die Gewebebilder mit einem hochauflösenden Mikroskop bei 20facher Vergrößerung auf.
      HINWEIS: Führen Sie zunächst die H&E-Färbung an benachbarten Schnitten als Qualitätskontrolle durch, um die Eignung der Probe für die räumliche Transkriptomik zu beurteilen. Nach der Auswahl führen Sie eine zweite H&E-Färbung direkt auf dem für die räumliche Genexpression vorgesehenen Schnitt durch, gemäß den Herstelleranweisungen zur Gewebevorbereitung für die räumliche Genexpressionsplattform, wie in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
  3. Bewertung der RNA-Integrität (DV200)
    ​HINWEIS: Für das Protokoll zur räumlichen Genexpression ist die traditionelle RNA-Integritätszahl (RIN) nicht aussagekräftig, da die 18S- und 28S-rRNA-Peaks in fixierten Geweben typischerweise fehlen. Daher wird der DV200-Wert, definiert als der Prozentsatz der RNA-Fragmente mit mehr als 200 Nukleotiden, häufig als aussagekräftigerer Qualitätsparameter als die RIN für degradierte klinische Proben verwendet. Für Visium v2 empfiehlt 10x Genomics FFPE-Blöcke mit einem DV200-Wert ≥ 30 % zu verwenden, um eine effiziente Hybridisierung der Sonden und optimale Assay-Leistung sicherzustellen. Die Auswahl von Gewebeproben mit den höchstmöglichen DV200-Werten hilft, Sequenzierungs-Ausfälle zu vermeiden und die Spot-Sensitivität zu maximieren.
    1. Holen Sie die 1,5-mL-Röhrchen mit den 5 µm dicken Schnitten, die während des Gewebeschnittschritts gesammelt wurden, hervor und legen Sie sie auf Eis, um die RNA zu extrahieren.
    2. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA. Dieses standardisierte Verfahren umfasst die Deparaffinierung der Probe, den Verdau mit Proteinase K zur Aufhebung der Formalin-Quervernetzungen, die Entfernung genomischer DNA durch DNase-I-Behandlung und die abschließende Elution der gereinigten RNA in RNase-freiem Wasser.
    3. Beurteilen Sie die RNA-Integrität mithilfe eines kapillarelektrophoretischen Systems mit einem Hochsensitivitäts-RNA-Assay. Eine Übersicht über den Arbeitsablauf finden Sie in Ergänzende Datei 142,45,46,47,48.
  4. Optionale Immunfluoreszenz (IF) zur Zelltypverifizierung
    1. Legen Sie den FFPE-Objektträger in einen Glasobjektträgerhalter und inkubieren Sie ihn 15 min bei 60 °C.
    2. Überführen Sie den Halter in Glasfärbegläser mit Xylol für 15 min.
    3. Rehydrieren Sie den Schnitt, indem Sie den Halter durch 100 %, 96 %, 80 % und 70 % Ethanol jeweils 2 min bewegen, gefolgt von 5 min in Wasser und 5 min in PBS-Tween (1x PBS ergänzt mit 0,1 % Tween-20).
      ACHTUNG: Alle Schritte mit Xylol und Ethanol müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden.
    4. Führen Sie die Antigen-Retrieval-Behandlung gemäß den Herstellerempfehlungen für den Primärantikörper durch, wobei Puffer, pH-Wert und Erhitzungsbedingungen den Angaben im Antikörper-Datenblatt entsprechen müssen. HINWEIS: In diesem Arbeitsablauf erfolgt die Antigen-Retrieval-Behandlung mit 10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH 9,0, in einem Kochtopf-Heizsystem für 30 min bei 95 °C, anschließend 20 min bei RT abgekühlt.
    5. Waschen Sie den Objektträger zweimal je 10 min in PBS-Tween.
    6. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Markierstift eine hydrophobe Barriere um das Gewebe und blockieren Sie unspezifische Bindungen, indem Sie 5 % BSA in 1x DPBS mindestens 40 min bei RT in einer befeuchteten Kammer auf die Gewebeschnitte auftragen.
      HINWEIS: Die befeuchtete Kammer wird hergestellt, indem ein Filterpapier in eine Kunststoff-Objektträgerfärbekassette gelegt und mit destilliertem Wasser gründlich angefeuchtet wird, um während der Antikörperinkubation eine stabile Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
    7. Bereiten Sie die Primärantikörperlösung in 1x DPBS in der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung für jeden Antikörper vor.
      HINWEIS: In diesem Arbeitsablauf wurden Primärantikörper gegen Emcn (V.7C7) und Cd271 (ME20.4) verwendet, um murine EC und MSC zu identifizieren, während Antikörper gegen CD31 (JC70A) oder PRRX1 (polyklonal) zur Identifizierung der menschlichen Gegenstücke eingesetzt wurden, gemäß dem Herstellerprotokoll.
    8. Entfernen Sie die Blockierungslösung, indem Sie die Kante des Objektträgers vorsichtig auf ein saugfähiges Papier klopfen, um verbleibende Tropfen zu entfernen, tragen Sie danach die Primärantikörermischung auf und inkubieren Sie den Objektträger über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
    9. Waschen Sie den Objektträger zweimal je 5 min in PBS-Tween und bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung in der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung vor, wobei sicherzustellen ist, dass die Fluorophore spektral kompatibel sind und sich nicht überlappen.
      HINWEIS: In diesem Arbeitsablauf wurde ein mit Alexa Fluor konjugierter Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:200 verwendet.
    10. Tragen Sie die Sekundärantikörermischung auf und inkubieren Sie 30 min bei RT, lichtgeschützt in einer befeuchteten Kammer.
    11. Waschen Sie den Objektträger zweimal je 5 min in PBS-Tween.
    12. Tragen Sie eine 1:10 verdünnte Lösung des DAPI-haltigen Eindeckmediums (siehe Tabelle der Materialien) auf, die in einer 1:1 PBS–Glycerin-Lösung hergestellt wurde, und inkubieren Sie die Probe 5 min.
    13. Bringen Sie den Schnitt mit einem Deckglas ein und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack, um Austrocknung zu verhindern.
    14. Untersuchen Sie das gefärbte Gewebe mithilfe einer multispektralen Bildgebungsplattform.

Zusatzdatei 1: Zusammenfassung der Protokollschritte zur Beurteilung der RNA-Integrität und des Visium-Spatial-Transkriptomik-Arbeitsablaufs. Diese Zusatzdatei enthält eine detaillierte Übersicht über die gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführten Verfahrensschritte. Sie umfasst: (i) den High-Sensitivity-RNA-ScreenTape-Assay zur Bewertung der RNA-Integrität (DV200), wie in Schritt 2.3.3 des Hauptprotokolls beschrieben, und (ii) einen Überblick über den Visium CytAssist Spatial Gene Expression-Arbeitsablauf, der die Gewebevorbehandlung, die Bibliotheksherstellung und die Sequenzierung einschließt (Schritte 3.1–3.3 des Hauptprotokolls).Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

3. Räumliche Transkriptomik

HINWEIS: Führen Sie den Ablauf der räumlichen Transkriptomik mithilfe der Plattform und der Reagenzien aus der Tabelle der Materialien durch, und befolgen Sie dabei die entsprechenden Bedienungsanleitungen42,45,46. Supplementärdatei 1 fasst die wichtigsten Schritte der Gewebevorbehandlung, Bibliotheksherstellung und Sequenzierung zusammen.

  1. Kontrolle der Datenqualität bei der räumlichen Transkriptomik
    1. Demultiplexen Sie die Daten zur räumlichen Transkriptomik mithilfe der Standard-Pipeline für Visium-Datensätze (siehe Materialtabelle).
    2. Karten Sie die Reads auf das entsprechende Ensembl-105-Referenzgenom ab.
      HINWEIS: Für humane Proben wurde GRCh38 und für Mausproben mm10 verwendet.
    3. Erzeugen Sie die gefilterten Merkmal-Barcode-Matrizen mithilfe derselben Pipeline und importieren Sie sie in die nachgeschaltete Einzelzell- bzw. räumliche Analyseumgebung (siehe Materialtabelle).
    4. Untersuchen Sie die H&E-Bilder in der Visualisierungsoberfläche, die von der Pipeline zur räumlichen Transkriptomik bereitgestellt wird (siehe Materialtabelle), und entfernen Sie manuell Spots, die mit dem kortikalen Knochenbereich oder Knochengewebe überlappen, je nach Datensatz.
    5. Normalisieren Sie die Datensätze mithilfe einer varianzstabilisierenden Transformationsmethode, die üblicherweise in Workflows der Einzelzellanalyse angewendet wird (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Um die Anwendbarkeit dieses auf EDTA basierenden Arbeitsablaufs über verschiedene Arten und Krankheitskontexte hinweg zu bewerten, wurde das Protokoll auf vier Knochenmarkproben angewendet: zwei murine Femora und zwei humane Knochenproben, die gesunde und Multiple-Myelom-(MM-)Bedingungen repräsentieren (Tabelle 1 und Abbildung 1).

ProbenidentifikationArtGeschlechtAlterErkrankung
YFPcγ1MausWeiblich210 TageGesund
mMMMausMännlich314 TageMM
hHBMMenschMännlich76 JahreGesund
hMMMenschWeiblich50 JahreMM

Tabelle 1: Murine und humane Knochenproben, die in die Studie eingeschlossen wurden. Art, Geschlecht, Alter und Gesundheitszustand sind für jede Probe angegeben. Abkürzungen: hHBM = gesundes menschliches Knochenmark; hMM = humanes Multiples Myelom; mMM = murines Multiples Myelom; MM = Multiples Myelom; YFPcγ1 = gesunde Kontrollmaus.

Die in dieser Studie verwendeten Proben wurden bereits in früheren Veröffentlichungen der Forschungsgruppe, insbesondere in den Arbeiten von Muiños-Lopez et al. und Cenzano et al., charakterisiert und beschrieben, mit Ausnahme der Mausprobe mit MM. Für die zuvor beschriebenen Proben werden die Daten und Ergebnisse der räumlichen Transkriptomik in jenen Studien präsentiert8,10. Daher dient das hier enthaltene Material der Beurteilung der technischen Eignung des Protokolls für die räumliche Transkriptomik und nicht der Darstellung neuartiger biologischer Erkenntnisse.

Mausfemurproben wurden aus dem genetisch veränderten MM-Mausmodell BIC (BIcγ1) gewonnen, das die klinischen und immunologischen Merkmale von MM-Patienten nachbildet, sowie aus der entsprechenden gesunden Kontrollmaus (YFPcγ1)8,49. Von jedem Tier wurde ein einzelner Femur entnommen, gereinigt und gemäß dem standardisierten Protokoll verarbeitet (Abbildung 2A). Femuren wurden speziell für diese Analysen verwendet, da sie reichlich verfügbares Mark, eine überlegene Nischenqualität und eine einfache reproduzierbare Aufarbeitung bieten, was sie besonders gut für eine sequenzbasierte räumliche Transkriptomik-Plattform geeignet macht8,10. Der erfolgreiche Entkalkungsprozess am Femur der Kontrollmaus wurde makroskopisch durch eine deutliche Zunahme der Gewebeflexibilität bei manueller Handhabung mit einer Pinzette bestätigt (Abbildung 2B). Anschließend wurde dieses Knochenfragment effizient in Paraffin eingebettet, wobei eine spezielle, mit der räumlichen Transkriptomik kompatible Form verwendet wurde, um die RNA-Integrität und die Gewebearchitektur für nachfolgende molekularbiologische Analysen zu bewahren (Abbildung 2C).

Zwei humane KM-Proben mit unterschiedlichen Aufbereitungshistorien wurden ebenfalls analysiert8,10. Eine frische, hämatologisch gesunde humane KM-Probe wurde aus operativem Abfallmaterial während eines Hüftgelenkersatzes am Hospital Universitario de Navarra gewonnen (Abbildung 2D–F). Um die Übertragbarkeit des Protokolls zu demonstrieren, wurde diese Probe genauso wie murine Proben aufbereitet. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen an Mausgewebe wurde eine erfolgreiche EDTA-Entkalkung des menschlichen Knochens makroskopisch durch vollständige Weichheit des Gewebes bestätigt, was sich in einem mühelosen Einstich mit einer Nadel zeigte (Abbildung 2E). Das entkalkte humane Knochenfragment wurde erfolgreich mit einem standardmäßigen Metallformwerkzeug in Paraffin eingebettet, um nachfolgende Verfahrensschritte zu ermöglichen (Abbildung 2F). Die zweite humane Probe bestand aus archivierten FFPE-KM-Biopsien aus dem Darmbein eines MM-Patienten aus der Pathologieabteilung der Clínica Universidad de Navarra (CUN). Bemerkenswerterweise war diese archivierte MM-Probe zuvor mit einem standardmäßigen klinischen Protokoll unter Verwendung starker Säuren entkalkt worden36. Diese Probe dient als qualitativer Vergleich zu den mit EDTA behandelten Proben; aufgrund von Unterschieden in der Gewebequelle, Fixierungshistorie, Lagerung und Entkalkung können die beobachteten Unterschiede jedoch nicht allein auf das Entkalkungsmittel zurückgeführt werden.

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Abbildung 2: Maus- und menschliche Knochenproben während der EDTA-basierten Aufbereitung. (A) Intakte Kontrollmausfemora vor der Entkalkung. (B) Entkalkter Kontrollmausfemur mit erhöhter Flexibilität. (C) Kontrollmausknochenfragmente in Paraffin eingebettet. (D) Gesunde menschliche Knochenfragmente aus einer Hüftoperation vor der Entkalkung. (E) Derselbe Fragment nach EDTA-Entkalkung, mit sichtbarem Nadeleinstich. (F) Mit EDTA entkalkte gesunde menschliche Knochenprobe in Paraffin eingebettet. Maßstäbe: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Abkürzung: EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zur Analyse der allgemeinen Geweearchitektur wurde eine H&E-Färbung durchgeführt (Abbildung 3). Die bessere morphologische Erhaltung in den murinen Schnitten könnte Unterschiede in der Probennahme und -verarbeitung widerspiegeln, anstatt inhärenter, artenspezifischer Merkmale. Die Femora der Mäuse wurden speziell für die räumliche Transkriptomik entnommen und unmittelbar als intakte Knochen verarbeitet, wodurch ihre Architektur erhalten blieb (Abbildung 3A, B). Im Gegensatz dazu stammen die humanen Proben entweder von Restmaterial, das während einer Hüftersatzoperation gewonnen wurde (Abbildung 3C), oder von diagnostischen Knochenbiopsien bei multiplem Myelom (MM) (Abbildung 3D), wobei die präanalytische Gewebequalität variabel sein kann. Infolgedessen sind die morphologischen Unterschiede zwischen der EDTA-entkalkten humanen Probe und der säureentkalkten MM-Biopsie geringfügig, da bereits beide humanen Proben grundlegende strukturelle Einschränkungen aufweisen, die nicht nur durch die Entkalkung, sondern auch durch die allgemeine Gewebeverarbeitung verursacht wurden (Abbildung 3C, D). Daher erfordert die umfassende Beurteilung der Probenqualität für die räumliche Transkriptomik die Evaluierung mehrerer unterschiedlicher Parameter. Erstens muss die Gewebeintegrität sorgfältig überwacht werden, da die strukturelle Erhaltung stark mit dem spezifischen Probentyp variieren kann und nicht allein mit der verwendeten entkalkenden Säure zusammenhängt. Zweitens sollte auch die RNA-Qualität bewertet werden, da die Bedingungen der Entkalkung diese beeinflussen können20,35,36.

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Abbildung 3: Mit H&E gefärbte Schnitte zur Beurteilung der Gewebequalität. Aufeinanderfolgende FFPE-Schnitte entsprechen (A) einer gesunden Kontrollmaus10, (B) einer Maus mit MM, (C) gesundem menschlichem Knochen8,10 und (D) einer menschlichen MM-Biopsie8. Maßstabsbalken = 500 µm. Abkürzungen: FFPE = formalinfixiert, paraffineingebettet; H&E = Hämatoxylin und Eosin; MM = multiples Myelom. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Zur Ergänzung der histologischen Analyse wurde die RNA-Qualität bewertet. Während die H&E-Färbung unklare Unterschiede zeigte, unterschied sich die RNA-Integrität deutlich zwischen den beiden Entkalkungsmethoden (Tabelle 2). DV200-Werte sowohl aus murinen Proben als auch aus der gesunden menschlichen Knochenprobe lagen über der für Visium-FFPE-Assays empfohlenen Schwelle, was auf eine ausreichende Verteilung der RNA-Fragmentlängen für die Hybridisierung von Sonden und den Bibliotheksaufbau hinweist. Die Probe des gesunden YFP-Mausgewebes weist einen DV200-Wert von 82,55 % auf, und die Probe des gesunden menschlichen Knochens (hHBM) erreicht 58 %, beide deutlich über der von 10x Genomics definierten Akzeptanzschwelle von 30 %. Die Probe der MM-Maus (mMM) zeigt einen DV200-Wert von 31,3 %, nahe der unteren Akzeptanzgrenze, was möglicherweise auf eine längere Lagerung des Paraffinblocks bei 4 °C vor dem Schneiden sowie andere probenspezifische Faktoren zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu weist die säureentkalkte menschliche MM-Biopsie (hMM) lediglich einen DV200-Wert von 8 % auf, was mit einer deutlich geringeren RNA-Integrität assoziiert war, selbst wenn die morphologische Degeneration weniger ausgeprägt war. Zusammenfassend ist es wichtig, sowohl strukturelle als auch molekulare Bewertungen durchzuführen, um die Eignung der Proben für nachgeschaltete räumliche Analysen zu beurteilen.

ProbenidentifizierungDV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200: Prozentsatz der gesamten RNA-Fragmente > 200 Nukleotide
2Diese Probe wurde mithilfe eines standardmäßigen klinischen Protokolls unter Verwendung starker Säuren entkalkt.

Tabelle 2: RNA-Qualität der Studienproben. DV200 ist der Prozentsatz an RNA-Fragmenten, die länger als 200 Nukleotide sind; Werte von mindestens 30 % wurden als geeignet für nachgeschaltete räumliche Transkriptomik-Analysen betrachtet. Abkürzungen: hHBM = gesundes menschliches Knochenmark; hMM = menschliches Multiplen Myelom; mMM = murines Multiplen Myelom.

Zusätzliche Qualitätsbewertungen können ebenfalls durchgeführt werden. Um die Gewebeintegrität weiter zu validieren und die Erhaltung spezifischer zellulärer Kompartimente nach EDTA-Dekalkifizierung zu bestätigen, wurde optional eine IF-Färbung an benachbarten FFPE-Schnitten von Maus- und Humanproben durchgeführt. Antikörper gegen Endomucin (Emcn) und Cd271 wurden verwendet, um Endothelzellen (EC) bzw. mesenchymale Zellen (MSC) in der MM-Mausprobe darzustellen (Abbildung 4A). Diese Färbung zeigte, dass in EDTA-verarbeiteten Geweben gut definierte vaskuläre Strukturen mit kontinuierlicher Emcn-Färbung und erhaltenen stromalen Netzwerken vorhanden waren, was belegt, dass die getesteten Marker nach der Aufarbeitung weiterhin nachweisbar blieben. Darüber hinaus lieferte die hochauflösende Bildgebung mittels eines automatisierten multispektralen Bildgebungssystems zusätzliche Hinweise darauf, dass die untersuchten Antigene für die Zelltyp-Verifizierung weiterhin detektierbar waren und somit eine zusätzliche Qualitätssicherungsebene vor der räumlichen Transkriptomik-Analyse darstellten. Ferner wurden diese Befunde ebenfalls in gesunden menschlichen Proben älterer Spender beobachtet, bei denen die Expression von EC mittels CD31- und die von MSC mittels PRRX1 (Paired Related Homeobox 1)-Antikörpern nachgewiesen wurde, was zeigt, dass die untersuchten Nischenmarker nach EDTA-Dekalkifizierung weiterhin identifizierbar blieben (Abbildung 4B). Im Gegensatz dazu konnten diese Ergebnisse nicht in menschlichen MM-Biopsien repliziert werden, die verschiedenen säurebasierten Dekalkifizierungsprotokollen unterzogen wurden. Wie bereits erwähnt, war die RNA-Integrität in diesen Proben gering, was die downstream gerichtete transkriptomische Analyse einschränkte. Aufgrund des degradierten Zustands dieser menschlichen Proben war ihre downstream gerichtete Anwendbarkeit auf die Baseline-Transkriptomprofilierung8 und die immunhistochemische (IHC) Beurteilung maligner Plasmazellen (PC) beschränkt (Abbildung 4C).

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Abbildung 4: Optionale Immunfluoreszenz und Immunhistochemie zur Zelltyp-Verifizierung. (A) Maus-MM-Gewebe mit DAPI-gefärbten Kernen (blau), CD271-positiven MSC (grün) und EMCN-positiven EC (rot). (B) Gesundes menschliches Knochengewebe mit DAPI-gefärbten Kernen (blau), PRRX1-positiven MSC (grün) und CD31-positiven EC (rot)10. (C) Menschliche MM-Biopsie mit CD138-positiven malignen PC8. Maßstäbe: (A) 250 µm (Übersicht), 20 µm (zusammengesetzte Vergrößerung) und 50 µm (Einzelkanal-Bilder); (B) 500 µm (Übersicht) und 20 µm (zusammengesetzte und Einzelkanal-Vergrößerungen); (C) 500 µm. Abkürzungen: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; EC = endotheliale Zelle; MM = multiples Myelom; MSC = mesenchymale stromale Zelle; PC = Plasmazelle. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zusammen unterstützen die Gewebemorphologie und die DV200-Ergebnisse die Eignung von EDTA-verarbeiteten Proben für nachgeschaltete räumliche Transkriptom-Analysen. Räumliche Transkriptom-Anwendungen dieses Aufbereitungsworkflows wurden bereits früher berichtet8,10.

Diskussion

Durch die Kombination einer EDTA-basierten kontrollierten Entkalkung, standardisierter FFPE-Aufarbeitung und strenger Qualitätskontrollschritte überwindet dieses Protokoll viele der traditionell mit der Probenvorbereitung von Knochengewebe für die räumliche Transkriptomik verbundenen Einschränkungen, insbesondere jene, die durch RNA-Abbau und morphologische Schäden verursacht werden und auf stark säurebasierte Entkalkungsmethoden zurückgehen8,10,20,33,36. Der kritischste Schritt bei der Aufarbeitung mineralisierter Proben für die räumliche Transkriptomik ist die Entkalkung. Unzureichende Entkalkung führt dazu, dass der Knochen zu starr zum Schneiden bleibt, wodurch die Gewinnung hochwertiger Schnitte für die räumliche Transkriptomik physisch unmöglich wird8,20,23,37,50. Wenn das Knochengewebe zu hart bleibt, zerbricht oder vibriert es an der Mikrotomklinge, was zu zerrissenen Schnitten oder Löchern führt, die die native Knochenmarkarchitektur nicht korrekt wiedergeben. Wichtig ist, dass der Erfolg der Entkalkung erst im Mikrotomierschritt endgültig überprüft werden kann: Auch Proben, die oberflächlich weicher erscheinen, können noch Restmineral enthalten, das sich erst beim Versuch, dünne FFPE-Schnitte anzufertigen, bemerkbar macht. Aus diesem Grund ist eine sorgfältige Überwachung des Entkalkungsfortschritts entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen.

Der Workflow verwendet 0,25 M EDTA bei pH 6,95 über einen Zeitraum von 10 Tagen mit konstanter Agitation und Austausch der Lösung am fünften Tag8,10. Während der Protokollentwicklung wurden EDTA allein, EDTA ergänzt mit Polyvinylpyrrolidon sowie 10 % Ameisensäure evaluiert, zusammen mit unterschiedlichen Entkalkungsdauern und Zeitplänen für den Lösungsaustausch; die vergleichenden Daten werden hier nicht dargestellt. Kürzere Dauern als 10 Tage führten häufig zu Gewebefrakturen beim Schneiden von Mausproben, während menschliche Proben eine probenspezifische Reaktion zeigten. Daher wird eine Dauer von 10 Tagen für murine Femora verwendet, während menschliche Proben je nach Dichte und trabekulärem Gehalt eine längere Entkalkung erfordern können. Vor der Einbettung in Paraffin sollten physische Qualitätskontrollschritte durchgeführt werden. Falls während der Mikrotomie eine unzureichende Entkalkung erkennbar wird, sollte das Nachbearbeitungsverfahren nur als letzter Rettungsschritt angewendet werden, da zusätzliche Wärme, Lösungsmittelbelastung und Rehydratation die RNA-Qualität beeinträchtigen können.

Die Hauptbeschränkung dieser Methode ist die lange Bearbeitungszeit, die im starken Gegensatz zu den schnellen, säurebasierten Protokollen steht, die üblicherweise in der klinischen Pathologie verwendet werden20,36. Obwohl längere Bearbeitungszeiten in der Forschung im Allgemeinen akzeptabel sind, zeigen neuere Studien – wie beispielsweise das von Miao et al. beschriebene Protokoll, das Morssche Lösung (22,5 % Ameisensäure und 10 % Natriumcitrat) verwendet, um innerhalb von 24 h zu dekalkifizieren – das wachsende Interesse an einer Beschleunigung der Knochenpräparation für räumliche Assays20. Säurebasierte Methoden bergen jedoch historisch ein deutlich höheres Risiko der RNA-Degradation, was die DV200-Werte verringert und letztlich ihre Verträglichkeit mit der räumlichen Transkriptomik einschränkt1,8,35,36. Dieser auf EDTA basierende Ansatz priorisiert die RNA-Erhaltung gegenüber der Geschwindigkeit und gewährleistet so die Kompatibilität mit sequenzbasierten räumlichen Plattformen wie Visium.

Eine mögliche Einschränkung der BM-Spatial-Transkriptomik ist das hohe Vorkommen von Immunglobulin-Transkripten, die von PC stammen und die Detektion von Transkripten mit geringer Häufigkeit beeinträchtigen können. Wie bei den Qualitätskontroll- und Filterstrategien, die in einer früheren Studie der Forschungsgruppe angewandt wurden – einschließlich des Ausschlusses von Spots mit geringer Qualität (<200 UMIs und <150 nachgewiesene Gene), der Filterung von Zelltypen mit geringem Beitrag (<20 % pro Spot) während der Dekonvolutionanalysen sowie der Auswahl von Marker-Genen, die in den räumlichen Transkriptomdatensätzen detektiert wurden – können Immunglobulin-Transkripte ebenfalls rechnerisch im Rahmen der nachgelagerten Analyse gefiltert werden, um ihren Einfluss gegebenenfalls zu minimieren8. Gezielte Ansätze der räumlichen Transkriptomik können die Detektion von Transkripten mit geringer Häufigkeit in bestimmten Anwendungen weiter verbessern.

Die möglichen Anwendungen dieser Methode sind umfangreich. Kürzlich durchgeführte Kombinationen räumlicher und Einzelzell-Daten haben spezialisierte humane osteogene Nischen sowie komplexe Signalkaskaden aufgezeigt, die von trabekulärem Knochen ausgehen3,26. Darüber hinaus hat die räumliche Transkriptomik gezeigt, dass das Altern die Gestalt der Knochenmark-Mikroumgebung verändert, indem es die räumliche Organisation und Kommunikation endothelialer Zellen (EC) beeinträchtigt, was zu einer geschwächten osteogenen Unterstützung und zur Entstehung entzündlicher Signalnetzwerke in der alternden Nische führt10. Die multiomische Profilierung hat außerdem unterschiedliche mikroumgebungsbezogene Regionen identifiziert, wie arteriell-osteoendostale Bereiche, die die frühe Myelopoese unterstützen, sowie peri-adipozytäre Zonen, die angereichert sind für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen3. Im Kontext des multiplen Myeloms ermöglicht dieses Protokoll die Integration räumlicher und Einzelzell-Transkriptomik, um die Zusammensetzung des erkrankten murinen Knochenmarks sowie Zell-Zell-Interaktionen zu charakterisieren. Frühere Arbeiten haben räumlich getrennte Verteilungen maligner Plasmazellen (PC) aufgezeigt und immunologische sowie entzündliche Programme identifiziert, wie beispielsweise NETose und IL-17-Signalgebung, die umgekehrt mit tumorangereicherten Regionen assoziiert waren. Zusätzlich korrelierte eine erhöhte Dichte maligner Plasmazellen mit einem Übergang von effektorischen zu erschöpften T-Zell-Zuständen. Diese Befunde wurden ebenfalls in humanen FFPE-Knochenmarkproben bestätigt und belegen somit ihre übertragbare Relevanz bei unterschiedlichem Krankheitsausmaß8. Letztendlich schafft dieser Arbeitsablauf die technische Grundlage, um die komplexen zellulären Interaktionen innerhalb der mineralisierten Architektur des Knochenmarks zu erforschen.

Plattformen für die hochauflösende räumliche Genexpression ermöglichen ein Ganztranskriptom-Profil mit nahezu einzelligen Auflösung38,51,52. Diese Ansätze könnten die Anwendung des Probenvorbereitungsworkflows auf die hochauflösende Analyse räumlich organisierter Knochenmark- und hämatologischer Malignome erweitern. Der Workflow bietet somit eine technische Grundlage für zukünftige Studien zur physiologischen und malignen Hämatopoese.

Offenlegungen

Die Autoren geben keine Wettbewerbsinteressen an. Ein Patent über das Know-how und die experimentelle Anwendung der MIcγ1-Mausmodelle des MM wurde an MIMO Biosciences lizenziert (Anmeldenummer PCT/EP2023/071025).

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Instituto de Salud Carlos III unterstützt und durch ERDF kofinanziert, einen Weg, Europa zu gestalten (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) und RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011; Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC und AIRC im Rahmen des Accelerator Award Programms; die International Myeloma Foundation (Brian van Novis) und die Paula and Rodger Riney Foundation an FP. IAC erhielt Unterstützung durch ein Marie-Curie-Stipendium (H2020-MSCA-IF-837491) der Europäischen Kommission, ein AECC-Talentstipendium (INVES258003CALV) sowie vom Departamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03). MC wurde durch ein FPU-Stipendium (FPU22/03283) des Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades unterstützt. Wir danken dem Personal des Advanced Genomics Laboratory und der Tierhaltungseinrichtung am CIMA Universidad de Navarra für ihre unschätzbare technische und fachliche Unterstützung. Wir danken außerdem den Pathologieabteilungen der Clínica Universidad de Navarra (CUN) und des Hospital Universitario de Navarra für die Bereitstellung von KM-Proben und ihre hervorragende Zusammenarbeit. Besonderer Dank gilt José Ángel Martínez-Climent und Marta Larrayoz für ihre MM-Mausmodelle. Wir danken Patxi San Martín-Uriz, Tania López und Eduardo Larequi für ihre hervorragende Unterstützung bei der Optimierung von Technologien, der Entwicklung von Protokollen und der Fehlersuche bei der Aufbereitung von Maus- und humanen KM-Proben für die räumliche Transkriptomik. Ebenso danken wir Beñat Ariceta und Asier Ullate für ihre gesamte rechnergestützte Arbeit zur räumlichen Transkriptomik. Schließlich sind wir den Patienten und gesunden Spendern, die großzügig an dieser Studie teilgenommen haben, zutiefst dankbar.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5-mL-RöhrchenEppendorf15625367
100-mL-steriler Behälter deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991ASystem basierend auf Kapillarelektrophorese–zur Beurteilung der RNA-Integrität
50-mL-steriler Behälter IberoMedREOR001
50-mL-Röhrchen FALCON352070
Advanced PAP-StiftTed Pella 22309Z377821-1EAHydrophober Barrierestift 
Anti-PRRX1-Antikörper, hergestellt in KaninchenSigma-AldrichHPA051084
BSA (Rinderserumalbumin)Sigma-AldrichA9418-50G
Kassetten KartellLABWARE2921
CD271 (NGF-Rezeptor) monoklonaler Antikörper (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, endotheliale Zelle (Konzentrat) Klon JC70AAligent DakoM0823
DeckgläserFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (VECTASHIELD Antifade-Montagemedium mit DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
DeparaffinisierungslösungQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 1×), Dulbeccos Formulierung, ohne Calcium, ohne Magnesium
DPX-Montagemedium für die HistologieSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA), 0,5 M Lösung, Molekularbiologische Qualität, Ultrapure
Einbettstation Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Emcn-Antikörper (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Ensembl-Referenzgenom (GRCh38 / mm10, Release 105)EMBL-EBIN/AReferenzgenom, verwendet für die Read-Alignment.
EosinMillipore SigmaHT110116
ÄthanolMillipore SigmaE7023-500MLChirurgische Schere
Falc Instruments B-I Histologie-WasserbadFalc610.1030.00
Formalin 4% PanReac AppliChem2524311315Formaldehyd 3,7%–4,0% (w/v), gepuffert auf pH = 7 und mit Methanol stabilisiert (CE-IVD) für die klinische Diagnostik
Glasmalhefter-Färbevorrichtung WHEATONZ710970-3EA
Glasmalfärbegläser BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
GlycerinSigma-AldrichC3H803
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Cross-Adsorbiertes Sekundärantikörper, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig Cross-Adsorbiertes Sekundärantikörper, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Hochgradig Cross-Adsorbiertes Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Haematoxylin Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Beurteilung der RNA-Integrität
High Sensitivity RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5581Beurteilung der RNA-Integrität
High Sensitivity RNA ScreenTape ProbenpufferAgilent5067-5580Beurteilung der RNA-Integrität
Mikroskop mit hoher Auflösung Leica BiosystemsN/AAperio CS2 Scanner
Salzsäure (0,1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Illumina NextSeq 2000 PlattformIllumina20038897
Invitrogen Ziegen-Anti-Ratte-IgG (H+L) Cross-Adsorbiertes Sekundärantikörper, Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
Augenscheren - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Isfluran
Lithiumcarbonat Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/ASoftware zur Visualisierung von HE-Bildern und zur Kuration von Visium-Spots; öffnet .cloupe-Dateien, die von der Analyse-Pipeline generiert wurden.
MetalleinbettformenBio-Optica07-BM24256
Mikroskopische Objektträgeravantor631-0108Superfrost Plus Mikroskopische Objektträger
MikrotomklingenFEATHERFEAT207500006_U
Mikrotom HM 340EEprediaN/AModell HM 340E
KanüleBD301156BD Microlanc 3 Kanüle 21 G 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Hellfeld-Lichtmikroskop
Paraffin PanReac AppliChem256993Paraffin mit Schmelzpunkt 55–58°C, plastifiziert + DMSO-Pellets (CE-IVD) für die klinische Diagnostik
Petri-Schale CorningCLS430167-100EA
Kunststoff-Einbettformen Bio-Optica07-MP7070
Potts-Smith-ZangeF.S.T 11012-18Zange
Qubit 3.0 FluorometerInvotrogen Q33216
Qubit-Assay-RöhrchenInvotrogen Q32856
Qubit RNA HS Assay KitInvotrogen Q32855
RNAse-freies 1,5-mL-MikrozentrifugenröhrchenThermo Scientific AM12400
RNAse-freies Wasser MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780Deskontaminationslösung
RNeasy FFPE Kit (50)Qiagen73504Extraktion der Gesamt-RNA
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/AVarianzstabilisierende Normalisierungsmethode, implementiert in Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/AR-Paket zur Analyse von Einzelzell- und räumlicher Transkriptomik.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/ASoftware zur Demultiplexierung, Alignment und Erstellung von Merkmals-Barcode-Matrizen für Visium-Datensätze.
Stlime Skalpell Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/AR-Paket zur Visualisierung und Integration der räumlichen Transkriptomik.
Chirurgisches Skalpellblatt Nr. 23Swann-Morton210Chirurgische Skalpellklingen
Thermocycler Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455Multispektrales Bildgebungsplattform zur IF-Visualisierung
Visium Zubehörkit 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Visium Human Transkriptom-Probe-Kit Klein 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Visium Mouse Transkriptom-Probe-Kit Klein 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 Reaktionen 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
XylolPanreac214736Xylol, Gemisch von Isomeren zur Analyse, ACS, ISO

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