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Fallbericht

Ein Fallbericht über eine Familie mit distaler hereditärer motorischer Neuropathie, verursacht durch eine homozygote c.1124G>A-Variante im VRK1-Gen (Vaccinia-Related Kinase 1)

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DOI:

10.3791/72503

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14. August 2026

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1Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2The First Clinical Medical College, Yunnan University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie berichtet über eine chinesische konsanguine Verwandtschaftsreihe mit einer im Erwachsenenalter beginnenden distalen hereditären motorischen Neuropathie (dHMN), die durch eine homozygote c.1124G>A-Variante im Gen für die Vaccinia-verwandte Kinase 1 (VRK1) verursacht wird. Die Befunde erweitern das klinische Phänotyp- und Genotypspektrum der VRK1-assoziierten dHMN in der chinesischen Bevölkerung.

Zusammenfassung

Diese Studie hatte das Ziel, die klinischen Phänotypen, neurophysiologischen Merkmale und die Pathogenität von Genvarianten in einer Familie mit distaler hereditärer motorischer Neuropathie (dHMN) aufgrund von VRK1-Varianten zu analysieren und Belege zur Unterstützung der klinischen Diagnose und genetischen Beratung bei dieser Erkrankung bereitzustellen. Wir berichten über eine chinesische konsanguine Familie mit dHMN, die durch eine homozygote c.1124G>A-Variante im VRK1-Gen verursacht wird. Es wurden klinische und elektrophysiologische Daten des Probanden erhoben. Mittels Ganz-Exom-Sequenzierung (WES) und Validierung durch Sanger-Sequenzierung wurde die Variantenstelle identifiziert, und die Bewertung der Pathogenität erfolgte gemäß den Leitlinien des American College of Medical Genetics and Genomics/Association for Molecular Pathology (ACMG/AMP). Der Proband war ein 24-jähriger Mann, der über eine zweijährige progrediente Schwäche und Atrophie der distalen unteren Extremitäten klagte, begleitet von schlanken oberen Extremitäten und ohne sensorische Störungen. Die elektrophysiologische Untersuchung zeigte eine verminderte Amplitude der zusammengesetzten Muskelaktionspotentiale (CMAP) in den motorischen Nerven beider oberer und unterer Extremitäten, was auf eine periphere neurogene Schädigung hindeutet, während die sensible Nervenleitgeschwindigkeit normal war. Die genetische Analyse detektierte eine homozygote c.1124G>A (p.Trp375Ter)-Variante im VRK1-Gen. Seine Eltern und älteren Schwestern waren heterozygote Träger, und das Erbgangmuster der Familie entsprach einer autosomal-rezessiven Vererbung. Gemäß den ACMG-Leitlinien wurde diese Variante als pathogen eingestuft (Nachweise: PVS1, PM2, PP1). Die homozygote VRK1 c.1124G>A-Variante verursacht eine dHMN mit Erwachsenenbeginn, im Gegensatz zur pontozerebellären Hypoplasie Typ 1A (PCH1A), wie sie in einigen genetischen Datenbanken annotiert ist. Diese Familie weist charakteristische Phänotypen auf, darunter schlanken obere Extremitäten und eine diffuse Verminderung der CMAP-Amplituden in beiden oberen und unteren Extremitäten, wodurch das klinische und genetische Spektrum der VRK1-assoziierten dHMN in der chinesischen Bevölkerung erweitert wird.

Einleitung

Die distale hereditäre motorische Neuropathie (dHMN) stellt eine genetisch heterogene Gruppe erblicher Erkrankungen des peripheren Nervensystems dar, die pathologisch durch eine längeabhängige Degeneration der unteren Motoneurone und ihrer Axone definiert ist. Klinisch zeigen Patienten eine progrediente Schwäche und Atrophie der distalen Extremitätenmuskulatur, während die sensorische Funktion in den meisten Fällen weitgehend erhalten bleibt1. Die ersten Symptome betreffen typischerweise die distalen Abschnitte der unteren Extremitäten, einschließlich einer Schwäche der Zehenbeuger und einer Atrophie der Wadenmuskulatur sowie der intrinsischen Fußmuskulatur, wobei sich die Erkrankung im Verlauf allmählich auf die Interosseusmuskeln der Hand sowie die Thenar- und Hypothenarmuskulatur ausdehnt2. Die Vererbungsmuster variieren je nach Subtyp, wobei sowohl autosomal-dominante als auch autosomal-rezessive Formen beschrieben wurden. Bisher wurden über 50 krankheitsverursachende Gene mit der dHMN assoziiert, doch bei mehr als der Hälfte der Betroffenen bleibt die zugrundeliegende genetische Ursache ungeklärt3.

Angesichts der deutlichen genetischen Heterogenität und der umfangreichen phänotypischen Überschneidungen mit anderen neuromuskulären Erkrankungen ist die Diagnose der dHMN allein anhand der klinischen Beurteilung häufig unzuverlässig4. Konventionelle schrittweise diagnostische Ansätze, die von der klinischen Phänotypisierung zur Sequenzierung kandidatengenbasierter Gene übergehen, sind ineffizient und weisen insbesondere bei sporadischen oder phänotypisch atypischen Fällen eine geringe diagnostische Ausbeute auf1,2. Gezielte Genpanels bieten eine kosteneffizientere Alternative, sind jedoch durch vorgegebene Genlisten eingeschränkt und können seltene oder neuartige pathogene Varianten übersehen. Die Ganzgenomsequenzierung bietet die umfassendste genomische Abdeckung, ist jedoch im routinemäßigen klinischen Alltag durch hohe Kosten, längere analytische Durchlaufzeiten und eine hohe Anzahl von Varianten ungewisser Signifikanz begrenzt5. Für die vorliegende Studie verwendeten wir einen integrierten diagnostischen Ansatz, der systematische klinische Beurteilung, neurophysiologische Untersuchung, Ganzexomsequenzierung (WES) und familiäre Segregationsanalyse kombiniert. Die neurophysiologische Testung hilft dabei, eine reine motorische periphere Nervenbeteiligung zu bestätigen und die Verteilung der Nervenschädigung abzugrenzen, wodurch die differenzialdiagnostische Bandbreite eingeengt wird. Die WES ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller bekannten mit dHMN assoziierten Gene, den Nachweis potenziell neuer pathogener Varianten sowie anschließende familiäre Segregationsanalysen, wodurch zusätzliche gutartige Zufallsbefunde ausgeschlossen und die Evidenz für die Pathogenität kandidierender Varianten gestärkt wird, und schafft so ein pragmatisches Gleichgewicht zwischen diagnostischer Ausbeute, Kosten und Interpretierbarkeit.

Das Vaccinia-verwandte Kinase-1-Gen (VRK1) kodiert eine Serin/Threonin-Kinase, die an nukleären Signaltransduktionswegen und DNA-Reparaturmechanismen beteiligt ist, und ihre physiologische Funktion ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der neuronalen Homöostase und Vitalität6. Pathogene Varianten in VRK1 führen zu einem breiten klinischen Spektrum: infantile Form der pontozerebellären Hypoplasie Typ 1A (PCH1A), gekennzeichnet durch Mikrozephalie, schwere Hypotonie und erhebliche motorische Entwicklungsverzögerung; erworbene Form der distalen hereditären motorischen Neuropathie (dHMN) mit vorherrschend distaler Extremitätenbeteiligung; sowie seltenere Erscheinungsformen wie hereditäre spastische Paraplegie (HSP) und amyotrophe Lateralsklerose (ALS)-ähnliche Phänotypen7,8,9. Insbesondere die homozygote c.1124G>A (p.Trp375Ter) Nonsense-Variante in VRK1 wurde bereits in mehreren unabhängigen dHMN-Stammbäumen mit konsistent autosomal-rezessiver Vererbung nachgewiesen, was ihre etablierte kausale Assoziation mit dHMN untermauert10. Diese Variante führt zu einem vorzeitigen Stoppcodon im C-terminalen kodierenden Bereich von VRK1 und wird voraussichtlich zum Funktionsverlust des Proteins führen, entweder durch Bildung eines verkürzten Proteins oder durch Aktivierung des Nonsense-vermittelten mRNA-Abbaus. Obwohl der genaue pathologische Mechanismus für diese spezifische Variante noch nicht funktionell bestätigt wurde, wird vermutet, dass eine beeinträchtigte VRK1-Kinaseaktivität die neuronale DNA-Reparatur und intrazelluläre Signalwege stören könnte, wodurch die Degeneration der motorischen Neuronen und die Entstehung der dHMN begünstigt wird.

In der klinischen Praxis sollte die genetische Testung von VRK1 in folgenden Szenarien priorisiert werden: Patienten mit klinisch vermuteter dHMN, die eine längenabhängige distale motorische Schwäche und Atrophie bei erhaltener Sensibilität aufweisen, insbesondere solche mit autosomal-rezessiver Vererbung oder Erwachsenenbeginn der Erkrankung; Individuen aus verwandtschaftlichen Familien mit unerklärter distaler motorischer Neuropathie; Patienten mit überlappenden Manifestationen des zentralen und peripheren Nervensystems, die nicht auf andere bekannte genetische Erkrankungen zurückzuführen sind; sowie Fälle von dHMN oder Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung Typ 2 (CMT2), bei denen keine häufigen pathogenen Genvarianten nachweisbar sind11,12. Mehrere wichtige Einschränkungen dieses diagnostischen Ansatzes müssen berücksichtigt werden. Erstens weist die VRK1-assoziierte dHMN eine erhebliche phänotypische Überschneidung mit anderen neuromuskulären Erkrankungen auf, darunter spinale Muskelatrophie (SMA), CMT2, HSP und frühes Stadium der ALS, was zu einer möglichen diagnostischen Fehlklassifizierung führen kann. Zweitens bleibt die Interpretation seltener VRK1-Varianten herausfordernd, da die meisten über keine funktionelle Validierung verfügen und stark auf In-silico-Vorhersagewerkzeuge angewiesen sind, was bei einer Teilmenge der Varianten zu unsicheren Pathogenitätsklassifizierungen führt. Drittens ist die Übertragbarkeit unserer Ergebnisse aufgrund der Studie an einem einzigen Stammbaum begrenzt, und Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bedürfen weiterer Bestätigung in größeren Patientenkohorten.

Berichte über VRK1-assoziiertes dHMN in chinesischen Populationen sind derzeit selten, und die vollständige phänotypische Heterogenität sowie die klinischen Merkmale dieser Erkrankung sind noch nicht vollständig beschrieben. In dieser Studie berichten wir über eine chinesische verwandtschaftliche Familie mit dHMN, verursacht durch eine homozygote c.1124G>A-Variante im VRK1-Gen. Durch die Integration klinischer, elektrophysiologischer und genetischer Befunde charakterisieren wir die phänotypischen und genotypischen Merkmale dieser Familie und liefern Referenzdaten, um die genaue klinische Diagnose und genetische Beratung bei VRK1-assoziiertem dHMN zu unterstützen.

FALLDARSTELLUNG:

Der Proband (III₁) war ein 24-jähriger Mann aus Bijie, Provinz Guizhou, der aus einer Ehe zwischen Cousinen hervorging. Das dreigenerationenübergreifende Stammbaumdiagramm ist in Abbildung 1 dargestellt und entspricht einem autosomal-rezessiven Vererbungsmuster. II₁ und II₂ (die Eltern des Probanden) waren beide heterozygote Träger der VRK1 c.1124G>A-Variante und asymptomatisch. Der Proband (III₁) war für die Variante homozygot und wies klinische Symptome auf. III₂ und III₄ (die älteren Schwestern des Probanden) waren heterozygote Träger ohne klinisches Phänotyp. III₃ (die dritte ältere Schwester des Probanden) wurde in der Kindheit adoptiert und berichtete über eine ähnliche Schwäche der unteren Extremitäten und Muskulaturatrophie, jedoch war eine genetische Bestätigung nicht verfügbar.

Klinische Manifestationen

Hauptbeschwerde: Fortgeschreitende Schwäche und Atrophie beider unterer Extremitäten seit 2 Jahren.

Anamnese der Grunderkrankung: Vor zwei Jahren entwickelte der Patient eine schmerzlose Schwäche der distalen unteren Extremitäten ohne offensichtliche auslösende Faktoren. Er berichtete über häufiges Stolpern beim Gehen auf ebenem Untergrund, konnte jedoch ohne Hilfe in die Hocke gehen und wieder aufstehen. Eine allmähliche Abnahme des Beinumfangs unterhalb der Knie wurde vom Patienten und seiner Familie bemerkt. Seit der Kindheit bestand eine verminderte Belastungstoleranz mit Schwierigkeiten beim Laufen und Springen. Es traten keine Sensibilitätsstörungen wie Taubheitsgefühle, Schmerzen oder Temperaturwahrnehmungsstörungen in den Extremitäten auf, keine offensichtliche Schwäche der oberen Extremitäten und keine bulbären Symptome. Seine Intelligenz war normal, und er arbeitete selbstständig als Friseur.

Neurologische Untersuchung

Muskelkraft (MRC-Skala): Hüftbeugung 5/5, Knieextension 4+/5, Dorsalflexion des Sprunggelenks 4/5, Plantarflexion des Sprunggelenks 3+/5 beidseitig; proximale Muskeln der oberen Extremitäten 5/5, Handgelenksextension 4+/5, Fingerbeugung 4/5, intrinsische Handmuskeln 4/5 beidseitig.

Muskulärer Tonus: Normal in allen vier Gliedmaßen; kein erhöhter oder vermindeter Tonus.

Muskelmasse: Eine offensichtliche Atrophie der distalen Muskeln der unteren Extremitäten (M. gastrocnemius, M. tibialis anterior und intrinsische Fußmuskeln) wurde beobachtet (Abbildung 2A). Die oberen Extremitäten erschienen schlank, mit einer leichten Atrophie der intrinsischen Handmuskeln (Abbildung 2B).

Faszikulationen: Es wurden keine sichtbaren Faszikulationen in den Gliedmaßen- oder Rumpfmuskeln beobachtet.

Sehnenreflexe: Die Reflexe der oberen Extremitäten waren vermindert; die Sehnenreflexe der unteren Extremitäten (Kniesehnen- und Achillessehnenreflex) fehlten beidseitig.

Pathologische Zeichen: Der bilaterale Babinski-Zeichen und Chaddock-Zeichen waren negativ.

Sensorische Untersuchung: Die oberflächliche Sensibilität (Schmerz, Berührung, Temperatur) und die tiefe Sensibilität (Vibration, Lageempfinden) waren in allen Gliedmaßen intakt.

Koordination: Finger-Nase-Test und Ferse-Knie-Schienbein-Test waren beidseitig normal.

Hirnnerven: Pupillen gleich groß und auf Licht reagierend; volle Augenbeweglichkeit; Gesichtssymmetrie; normale Gaumenhebung; normale Zungenbewegung ohne Atrophie oder Faszikulation; keine Dysphagie oder Dysarthrie.

Gangbild: Beidseitiges Spitzfußgangbild.

Zusätzliche Labortests: Die Werte für Kreatinkinase (CK) im Serum, Vitamin B₁₂ sowie Schilddrüsenfunktionstests (TSH, FT3, FT4) lagen alle innerhalb der normalen Referenzbereiche.

Neurobildgebung: Eine zerebrale und spinale Magnetresonanztomographie (MRT) wurde bei diesem Patienten nicht durchgeführt.

Differenzialdiagnose

PCH1A: Ausgeschlossen. Der Patient wies eine Erkrankung mit Erwachsenenbeginn auf, keine Mikrozephalie, Hypotonie, zerebelläre Dysplasie oder Entwicklungsverzögerung, was nicht mit dem klassischen infantilen PCH1A-Phänotyp übereinstimmte.

SMA: Ausgeschlossen. Der Patient wies einen Erwachsenenbeginn mit ausschließlich distaler Beteiligung und normaler proximaler Gliedmaßenkraft auf, ohne das typische proximal betonte Schwächesyndrom der SMA.

CMT2: Durch die Neurophysiologie ausgeschlossen. Der Patient wies ausschließlich eine motorische Nervenbeteiligung auf, mit vollständig normalen sensorischen Nervenaktionspotentialen, und erfüllte daher nicht die diagnostischen Kriterien für CMT2.

ALS: Ausgeschlossen. Es gab keinen Befall der oberen Motoneurone, keine bulbären Symptome und keine Faszikulationen in zervikal- oder bulbär innervierten Muskeln; der chronisch progrediente Verlauf mit ausschließlich distalem Befall war atypisch für eine ALS.

HSP: Ausgeschlossen. Der Patient wies keine Spastik, keine Hyperreflexie und keine pathologischen Zeichen auf, sondern ausschließlich eine Beteiligung des unteren motorischen Neurons.

Kennedy-Krankheit (spinobulbäre Muskelatrophie, SBMA): Ausgeschlossen. Es bestand keine Bulbärbeteiligung, keine perioralen Faszikulationen und keine endokrinologischen Manifestationen; das Vererbungsmuster war nicht vereinbar mit einer X-chromosomalen Übertragung.

Diagnose, Beurteilung und Plan

Diagnose

1. dHMN, bestätigt durch eine homozygote pathogene Variante c.1124G>A (p.Trp375Ter) im VRK1-Gen (autosomal-rezessive Vererbung).

2. Reine motorische axonale periphere Neuropathie, vorwiegend die distalen unteren Gliedmaßen betreffend.

Beurteilung

Der Patient zeigte eine langsam progrediente distale motorische Schwäche und Muskelatrophie bei erhaltener Sensibilität, was mit dem klassischen Phänotyp einer im Erwachsenenalter beginnenden VRK1-assoziierten dHMN übereinstimmt.

Neurophysiologische Befunde zeigten eine diffuse motorische axonale Schädigung bei normaler sensorischer Leitung, was eine reine motorische Neuropathie unterstützt.

Der Schweregrad der Erkrankung war bei der vorliegenden Vorstellung leicht bis mäßig ausgeprägt: Der Patient war weiterhin mobil und in der Lage, die täglichen Aufgaben selbstständig zu verrichten, ohne bulbäre oder respiratorische Beteiligung.

Das Stammbaumdiagramm zeigte eine autosomal-rezessive Vererbung, wobei heterozygote Träger asymptomatisch blieben.

Behandlungs- und Nachsorgeplan

1. Symptomatische Behandlung: Verschreiben Sie Sprunggelenk-Schuh-Orthesen, um die Gangstabilität zu verbessern und Stürze zu verhindern; überweisen Sie zur Rehabilitationsmedizin, um individuelle Kräftigungs- und Dehnübungsprogramme zur Erhaltung der Gelenkbeweglichkeit und zur Verhinderung von Kontrakturen zu erhalten.

2. Regelmäßige Nachsorge: Jährliche neurologische Untersuchungen einschließlich wiederholter Nervenleitungsstudien zur Überwachung des Krankheitsverlaufs planen.

3. Genetische Beratung: Bieten Sie dem Probanden und den Familienmitgliedern eine ausführliche genetische Beratung bezüglich des Rezidivrisikos, der Möglichkeiten der Familienplanung und der präsymptomatischen genetischen Testung für gefährdete Verwandte an.

4. Patientenaufklärung: Raten Sie zur Vermeidung neurotoxischer Medikamente und übermäßiger Erschöpfung; leisten Sie psychologische Unterstützung, um krankheitsbedingte Angstzustände zu bewältigen.

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Protokoll

Diese Studie wurde vom Ethikkomitee des Provinzkrankenhauses für Traditionelle Chinesische Medizin in Yunnan genehmigt (Genehmigungsnummer: YYLW-2026-006). Vor der Einschreibung wurde der Probandin bzw. dem Probanden und allen teilnehmenden Familienmitgliedern eine schriftliche, informierte Einwilligung eingeholt.

1. Vorbereitung der Teilnehmer und klinische Beurteilung

  1. Der Proband und verfügbare Familienmitglieder wurden nach schriftlicher Einwilligung eingeschlossen.
  2. Detaillierte Angaben zur Demografie, Krankengeschichte, Familienanamnese und Inzuchtverhältnissen wurden mittels eines standardisierten Fragebogens erhoben.
  3. Es wurde eine systematische neurologische Untersuchung durchgeführt, einschließlich Bewertungen der Muskelkraft, des Muskeltonus, der Sehnenreflexe, der Sensibilität, der Koordination, des Gangbilds und der Funktion der Hirnnerven.
  4. Die Kraft aller großen Muskelgruppen wurde anhand der Medical Research Council (MRC)-Skala dokumentiert.
  5. Klinische Fotografien der Extremitäten wurden angefertigt, nachdem die schriftliche Einwilligung des Teilnehmers vorlag.
    HINWEIS: Alle klinischen Beurteilungen wurden von einem approbierten Neurologen mit Schwerpunkt auf neuromuskulären Erkrankungen durchgeführt, um die diagnostische Konsistenz sicherzustellen.

2. Neurophysiologische Untersuchung

  1. Patientenvorbereitung
    1. Der Teilnehmer erhielt die Anweisung, mindestens 2 Stunden vor der Untersuchung auf Koffein und anstrengende körperliche Betätigung zu verzichten.
    2. Die Temperatur im Untersuchungsraum wurde bei 24–26 °C gehalten, und die Hauttemperatur der Extremitäten wurde bei Bedarf mithilfe einer Wärmelampe über 32 °C gehalten.
    3. Der Teilnehmer wurde in Rückenlage in einem ruhigen, schwach beleuchteten Untersuchungsraum positioniert.
  2. Untersuchung der Nervenleitgeschwindigkeit
    1. Die Haut an den Elektrodenstellen wurde mit Alkoholtupfern gereinigt, um die Impedanz zu verringern.
    2. Oberflächenableitelektroden wurden über dem motorischen Punkt des Zielmuskels platziert, und die Referenzelektrode wurde distal über dem entsprechenden Sehnenansatz positioniert.
    3. Stimulations­elektroden wurden entlang des Nervenverlaufs an standardmäßigen anatomischen Markern platziert.
    4. Motorische Nervenleitgeschwindigkeitsuntersuchungen wurden an den bilateralen Nervi mediani, ulnares, tibialis und peronei communis durchgeführt. Die distale Latenzzeit, die Amplitude des zusammengesetzten muskulären Aktionspotentials (CMAP) sowie die motorische Leitgeschwindigkeit wurden aufgezeichnet.
    5. Sensible Nervenleitgeschwindigkeitsuntersuchungen wurden an den bilateralen Nervi mediani, ulnares, peronei superficialis und suralis unter Verwendung orthodromer oder antidromer Techniken, je nach Erfordernis, durchgeführt. Die Amplitude des sensiblen Nervenaktionspotentials (SNAP) und die sensible Leitgeschwindigkeit wurden aufgezeichnet.
    6. Der Filterbereich wurde für motorische Untersuchungen auf 20 Hz–10 kHz und für sensible Untersuchungen auf 20 Hz–2 kHz eingestellt. Abtastgeschwindigkeiten von 2 ms/Division und 1 ms/Division wurden für motorische bzw. sensible Untersuchungen verwendet.
  3. Nadelelektromyographie
    1. Unter sterilen Bedingungen wurde eine konzentrische Nadelelektrode in jeden Zielmuskel eingeführt.
    2. Die spontane Aktivität im Ruhezustand wurde beurteilt, einschließlich positiver scharfer Wellen, Fibrillationspotentiale und Faszikulationspotentiale.
    3. Die Morphologie des motorischen Einheitpotentials (MUP) wurde während leichter willkürlicher Kontraktion evaluiert. Dauer, Amplitude und Polyphasie wurden gemessen.
    4. Das Rekrutierungsmuster wurde während maximaler willkürlicher Kontraktion beurteilt.
    5. Die Muskeln Musculus tibialis anterior, Musculus gastrocnemius medialis, Musculus abductor hallucis, erster Musculus interosseus dorsalis, Musculus deltoideus und Musculus rectus femoris wurden bilateral untersucht. Zusätzlich wurden der Musculus sternocleidomastoideus und die paraspinalen Muskeln auf Höhe von T10 untersucht.
      HINWEIS: Alle neurophysiologischen Untersuchungen wurden von einem erfahrenen Elektromyographen durchgeführt. Die Hautimpedanz wurde unter 5 kΩ gehalten, um die Aufnahmequalität sicherzustellen. Die Reproduzierbarkeit aller Wellenformen wurde über mindestens zwei aufeinanderfolgende Stimulationsreize hinweg bestätigt.

3. Sammlung von peripheren Blutproben und Extraktion der genomischen DNA

  1. Proben von peripherem Venenblut (3–5 mL) wurden von jedem Teilnehmer in eine EDTA-Antikoagulationsröhre gegeben.
  2. Die Blutproben wurden unmittelbar nach der Entnahme bei 4 °C gelagert und innerhalb von 24 Stunden verarbeitet.
  3. Genomische DNA wurde aus peripheren Leukozyten mittels eines Kits zur Extraktion genomischer DNA isoliert.
  4. Die DNA-Konzentration und -Reinheit wurden mithilfe eines Spektrophotometers gemessen.
  5. Die DNA-Integrität wurde durch Elektrophorese in 1%iger Agarosegel überprüft.
    HINWEIS: DNA-Proben mit einem A260/A280-Verhältnis von 1,8–2,0 und einer Konzentration von ≥50 ng/µL wurden akzeptiert. Proben, die die Qualitätskontrollkriterien nicht erfüllten, wurden erneut extrahiert.

4. Ganz-Exom-Sequenzierung

  1. Bibliotheksherstellung
    1. Genomische DNA (1 μg) wurde durch Sonifikation in Fragmente von 150–200 bp zerlegt.
    2. Die Endreparatur, A-Anhängung und Adapterligation wurden gemäß der Anleitung des Bibliotheksherstellungs-Kits durchgeführt.
    3. Exonische Regionen wurden mithilfe eines menschlichen Ganz-Exom-Erfassungs-Kits gemäß der Herstellerprotokolle angereichert.
    4. Die angereicherte Bibliothek wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, und die resultierenden Produkte wurden gereinigt.
  2. Sequenzierung
    1. Die paired-end-Sequenzierung wurde auf einer Hochdurchsatz-Sequenzierplattform mit einer Leselänge von 150 bp durchgeführt.
    2. Es wurde eine mittlere Sequenzierungstiefe von ≥100 Χ über das Ziel-Exom angestrebt, wobei ≥98 % der Zielbasen mit einer Tiefe von ≥10 Χ und ≥95 % mit einer Tiefe von ≥20 Χ abgedeckt sein sollten.
    3. HINWEIS: Vor der Sequenzierung wurden eine Bibliothekskonzentration von ≥2 nM und eine Insertgrößenverteilung von 250–350 bp bestätigt. Nach der Sequenzierung wurden Q30-Werte, GC-Gehalt und Abdeckungstiefe zur Überprüfung der Datengüte evaluiert.

5. Bioinformatische Analyse und Variantenfilterung

  1. Die primäre Datenanalyse, einschließlich Base Calling, Qualitätsbewertung und Adapter-Trimming, wurde durchgeführt.
  2. Die bereinigten Reads wurden mit Hilfe einer Sequenzalignierungssoftware an das humane Referenzgenom GRCh37 (hg19) aligniert.
  3. Es wurde eine Variantenidentifikation durchgeführt, um einzelne Nukleotidvarianten (SNVs) sowie kleine Insertionen und Deletionen (Indels) zu erkennen.
  4. Die Varianten wurden mithilfe öffentlicher Datenbanken annotiert, darunter die Genome Aggregation Database (gnomAD), das 1000 Genomes Project, ClinVar und Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM).
  5. Die Varianten wurden anhand der folgenden Kriterien gefiltert und priorisiert:
    1. Es wurden nur Varianten in exonischen Regionen oder kanonischen Spleißstellen beibehalten.
    2. Häufige Varianten mit einer minoren Allelfrequenz (MAF) von >0,01 in Populationsdatenbanken wurden ausgeschlossen.
    3. Nonsense-, Frameshift-, Spleißstellen- und Missense-Varianten, die als schädlich vorhergesagt wurden, erhielten Priorität.
    4. Kandidatengene wurden mit bekannten Genlisten für neuromuskuläre Erkrankungen verglichen. Gene, die mit einem autosomal-rezessiven Vererbungsmuster übereinstimmten, wurden zusätzlich priorisiert.
    5. Als Referenzsequenz für die Variantennomenklatur diente der VRK1-Transkript NM_003384.3.

6. Validierung durch Sanger-Sequenzierung und Analyse der familiären Segregation

  1. PCR-Primer, die die kandidierte Variantenstelle flankieren, wurden mithilfe einer Primer-Design-Software entworfen.
  2. Der Ziel-Genomabschnitt aus der DNA jedes Familienmitglieds wurde mittels PCR amplifiziert.
  3. Die PCR-Produkte wurden gereinigt, und eine bidirektionale Sanger-Sequenzierung wurde durchgeführt.
  4. Die Sequenzier-Chromatogramme wurden mit der Referenzsequenz mithilfe einer Sequenzalignments-Software ausgerichtet.
  5. Der Genotyp jedes Familienmitglieds wurde bestätigt, und die Kopplung der Variante mit dem Krankheitsphänotyp im Stammbaum wurde bewertet.
    HINWEIS: Klare Chromatogramme mit einzelnen Spitzen und ohne Hintergrundrauschen wurden bestätigt. Die PCR-Amplifikation und Sequenzierung wurden für Proben, die mehrdeutige Ergebnisse lieferten, wiederholt.

7. Klassifizierung der Variantenpathogenität und diagnostische Bestätigung

  1. Die verifizierte Variante wurde gemäß den Standards und Leitlinien des American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) aus dem Jahr 2015 klassifiziert.
  2. Klinische Phänotypen, neurophysiologische Befunde, Ergebnisse der genetischen Testung sowie Daten zur familiären Segregation wurden zur Erstellung der endgültigen molekularen Diagnose integriert.
  3. Den Familienangehörigen wurde genetische Beratung hinsichtlich des Rezidivrisikos, der reproduktiven Optionen und der Langzeitprognose bereitgestellt.

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Ergebnisse

Genetische Befunde

Die WES-Analyse wurde am Probanden durchgeführt, mit einer mittleren Abdeckungstiefe im Zielbereich von 112 ×; 98,7 % der Zielbasen waren mit einer Tiefe von ≥10 × abgedeckt und 96,2 % mit einer Tiefe von ≥20 ×. Nach Filterung und Priorisierung der Varianten wurde eine homozygote Nonsense-Variante c.1124G>A (p.Trp375Ter) im VRK1-Gen (Transkript NM_003384.3, Genom-Assembly GRCh37/hg19) als kandidierende pathogene Variante identifiziert.

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Diskussion

In dieser Studie wandten wir einen integrierten diagnostischen Arbeitsablauf an, der klinische Phänotypisierung, neurophysiologische Untersuchung, WES und Analyse der familiären Segregation kombiniert, um eine homozygote VRK1 c.1124G>A pathogene Variante in einer chinesischen verwandten Familie mit erwachsenenbeginnendem dHMN zu identifizieren. Diese Stammbaumanalyse erweitert das phänotypische Spektrum der VRK1-assoziierten Erkrankungen und liefert Referenzdaten für die Diagnose von dHMN in der chinesischen...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das nationale Projekt zum Aufbau der vorteilhaften Fachrichtung Traditionelle Chinesische Medizin (Enzephalopathie) 2026 (Yuncaishe [2025] Nr. 219) sowie durch das Programm für Grundlagenforschung des Wissenschafts- und Technologiedepartments der Provinz Yunnan (Förderkennzeichen Nr. 202401AZ070001-057).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien & Verbrauchsmaterialien
EDTA-Antikoagulans-Vakuum-Blutentnahmeröhrchen (5 mL)BD Biosciences (Becton, Dickinson and Company)367861
Kit zur genomischen DNA-Extraktion (Spin-Säulenformat) für peripheres BlutQIAGEN; QIAamp DNA Blood Mini Kit51106
Multiplex-Ligationsabhängiges Probe-Amplifikations-(MLPA-)KitMRC HollandIndividuelles Sonden-Set für Zielgen
PCR-Amplifikationskit (enthält Taq-Polymerase, dNTPs und Reaktionspuffer)Takara Bio; LA Taq PCR KitRR002A
Agarosepulver (Elektrophoresequalität)Biowest111860
Sanger-Sequenzierungs-Reaktionskit (BigDye Terminator v3.1)Thermo Fisher Scientific; Applied Biosystems4337455
Kit zur Reinigung von SequenzierungsproduktenThermo Fisher Scientific; BigDye XTerminator Purification Kit4376484
TAE-ElektrophoresepufferKommerzielle Qualität / im Labor hergestellt—
PCR-8er-Streifenröhrchen, Zentrifugenröhrchen und anderes routinemäßiges VerbrauchsmaterialAxygen—
Geräte & Ausrüstung
Kapillarelektrophorese-Genanalysator (Sanger-Sequenzierplattform)Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific3500 Dx
Gradienten-Thermocycler (PCR-Gerät)Bio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
Ultramikrospektrophotometer (zur Nukleinsäurequantifizierung)NanoDrop One, Thermo Fisher ScientificND-ONE-W
Horizontales Agarose-Gelelektrophorese-SystemBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYY-6C
System zur Dokumentation und Analyse von GelelektrophoreseBio-Rad LaboratoriesGelDoc Go
Benchtop-Kühlmikrozentrifuge mit hoher DrehzahlEppendorf5424 R
System zur Bestimmung der Nervenleitgeschwindigkeit / Elektromyographie (NLG/EMG)Natus MedicalKeypoint 9033A07
Konstanttemperatur-Metallbad / WasserbadDLAB Scientific—
Analyse-Software
MLPA-Datenanalyse-Software (Coffalyser.Net)MRC Hollandv140
Software zur Analyse von Sanger-Sequenzierungspeaks und SequenzalignierungApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificSequencing Analysis v6.0
Primer-Design-SoftwarePremier BiosoftPrimer Premier 6
Werkzeuge zur Sequenzalignierung und VarianteninterpretationNCBI BLAST (online), ClinVar-Datenbank—

Referenzen

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