Dieses Protokoll beschreibt die Bewertung der modifizierten Xiaoyao San in einem Mausmodell der durch chronischen unvorhersehbaren leichten Stress induzierten Depression, einschließlich Verhaltens-, histologischer und molekularer Untersuchungen der neuronalen Nekroptose.
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Forschungsartikel
Modifiziertes Xiaoyao San lindert depressionsähnliche Verhaltensweisen und neuronale Nekroptose in einem Mausmodell für chronischen unvorhersehbaren milden Stress
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neuronaler Verlust und Schaden sind wichtige pathologische Merkmale der Depression, und die Nekroptose wurde als ein möglicher Mechanismus des neuronalen Zelltods vorgeschlagen. Die Analyse von Gene Expression Omnibus (GEO)-Datensätzen (GSE54565, GSE54566 und GSE54568) ergab einen Zusammenhang zwischen Depression und Nekroptose, was darauf hindeutet, dass die Hemmung dieses Signalwegs eine potenzielle therapeutische Strategie darstellen könnte. Modifiziertes Xiaoyao San (MXYS), eine modifizierte Formulierung des traditionellen chinesischen Arzneimittels Xiaoyao San, wurde durch die Zugabe von hitzelindernden, blutkühlenden, kognitionsfördernden und belebenden Kräutern entwickelt, um die therapeutische Wirksamkeit zu verbessern. Allerdings sind seine Wirkungen auf die neuronale Nekroptose sowie die aktiven Inhaltsstoffe, die das Gehirngewebe erreichen, bisher unklar. Mittels ultra-leistungsfähiger Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit massenspektrometrischer Hochauflösung (UHPLC-HRMS) wurden MXYS-Inhaltsstoffe, die im Gehirngewebe nachgewiesen wurden, vorläufig identifiziert. Die therapeutische Wirksamkeit wurde in einem Mausmodell der Depression mit chronischem unvorhersehbarem leichtem Stress (CUMS) mittels Verhaltensanalysen, histologischer Untersuchung, Immunfluoreszenz, Western Blotting und bioinformatischer Analysen bewertet. Die Gabe von MXYS war mit einer Verbesserung depressionstypischer Verhaltensweisen, einer Abschwächung der pathologischen Hirnschädigung sowie einer verminderten Phosphorylierung der proteininteragierenden Rezeptorkinase 3 (RIPK3) und des Proteins mit gemischter Kinasedomäne-ähnlicher Struktur (MLKL) assoziiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MXYS antidepressiv wirkende Effekte entfaltet, die mit einer Verringerung von Markern der neuronalen Nekroptose verbunden sind, und liefern experimentelle Hinweise für die weitere Untersuchung von MXYS als potenzielle therapeutische Strategie bei Depression.
Einleitung
Depression, eine schwere psychische Erkrankung im Spektrum der affektiven Störungen, zeichnet sich hauptsächlich durch anhaltende Niedergeschlagenheit aus und wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst1. Klinisch zeigen Patienten mit Depression häufig Symptome wie gedrückte Stimmung, verlangsamte kognitive Leistungen, verminderte verbale Kommunikation und körperliche Aktivität sowie im schweren Verlauf selbstverletzendes Verhalten und Suizidgedanken2. Aufgrund ihrer hohen Prävalenz, Rezidivrate, Behinderungshäufigkeit und Suizidalität ist die Depression weltweit eine der Hauptursachen für Behinderung und verursacht erhebliche soziale und wirtschaftliche Belastungen3. Laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wird erwartet, dass die Depression bis zum Jahr 2030 die Hauptursache für die globale Krankheitslast darstellt und dabei Krebs sowie Herz-Kreislauf- und zerebrovaskuläre Erkrankungen übertrifft3. Zudem war die Pandemie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) mit einem Anstieg der globalen Prävalenz der schweren Depression um 27,6 % verbunden4. In China beträgt die jährliche Prävalenz der Depression 3,6 %, die Lebenszeitprävalenz liegt bei 6,8 %5. Die Pathogenese der Depression ist aufgrund ihrer komplexen Ätiologie und der Vielzahl an beteiligten Faktoren noch nicht vollständig verstanden. Dementsprechend bleiben die therapeutischen Optionen begrenzt, und etwa 30–40 % der Patienten entwickeln eine therapieresistente Depression, da sie unzureichend auf die derzeit verfügbaren Antidepressiva ansprechen6. Außerdem stellen die verzögerte Wirkungseintrittszeit, verbleibende Symptome, Neurotoxizität und Nebenwirkungen der bestehenden Antidepressiva weiterhin erhebliche therapeutische Herausforderungen dar7.
Der programmierte Zelltod ist seit Langem ein zentrales Forschungsthema der biomedizinischen Wissenschaft. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass Depressionen mit der Nekroptose assoziiert sind8,9,10,11. Die Nekroptose ist, ähnlich wie die Apoptose, eine Form des programmierten Zelltods; im Gegensatz zur Apoptose löst sie jedoch ausgeprägte Immun- und Entzündungsreaktionen aus12. Bei fehlender Caspase-8-Aktivität bindet Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) an den Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor 1 (TNFR1), was zur Aktivierung der proteininteragierenden Rezeptorkinase 1 (RIPK1) führt13. Die aktivierte RIPK1 interagiert mit der proteininteragierenden Rezeptorkinase 3 (RIPK3) und bildet den Nekrosom-Komplex, der anschließend das Protein mit der gemischten Kinasedomäne (mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL) aktiviert14. Nach der Oligomerisierung wandert MLKL vom Zytoplasma an die Plasmamembran, was zu einer Schwellung der Organellen15,16, zur Störung der Integrität der Zellmembran und zur Freisetzung intrazellulärer Inhaltsstoffe führt, einschließlich schädigungsassoziiierter molekularer Muster (DAMPs) und entzündungsfördernder Mediatoren wie TNF-α, Interleukin (IL)-1 und IL-6, wodurch die entzündlichen Reaktionen verstärkt werden17. Die Nekroptose ist an zahlreichen entzündlichen und neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt, darunter Multiple Sklerose, Depression, amyotrophe Lateralsklerose, Morbus Parkinson und Morbus Alzheimer18,19,20. Proteom-Analysen haben gezeigt, dass die durch chronischen unvorhersehbaren leichten Stress (CUMS) induzierte Depression mit einer erhöhten Expression von RIPK3 und MLKL sowie mit der Aktivierung des Nekroptose-Signalwegs assoziiert ist2. In einem weiteren CUMS-Mausmodell der Depression zeigte Fluoxetin antidepressiv ähnliche Wirkungen, die mit der Hemmung der RIPK1-vermittelten Nekroptose einhergingen10. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Nec-1s, ein Inhibitor der Nekroptose, lipopolysaccharidinduzierte (LPS) depressionsähnliche Verhaltensweisen verbessert21. Da neuronale Schädigungen ein wichtiges pathologisches Merkmal der Depression darstellen, könnte die gezielte Beeinflussung der Nekroptose eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Depressionen darstellen.
Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) hat eine lange Geschichte bei der Behandlung von Depressionen. Laut der TCM-Theorie regiert die Leber den freien Fluss des Qi; daher wird Depression hauptsächlich einer emotionalen Belastung zugeschrieben, die zu einer Stagnation des Leber-Qi führt. Demzufolge besteht die primäre therapeutische Strategie darin, die Leber zu beruhigen und die Depression zu lindern. Xiaoyao San (XYS) ist ein klassisches Kräuterrezept, das weithin zu diesem Zweck eingesetzt wird, und umfangreiche Belege unterstützen seine Anwendung bei der Behandlung von Depressionen22. Darüber hinaus wurde berichtet, dass XYS anti-nekroptotische Eigenschaften besitzt23,24. Basierend auf den TCM-Konzepten der „Umwandlung von Leberdepression in Feuer“ und des „Aufsteigens des klaren Yang zum Gehirn“ wurde XYS modifiziert, indem Moutan Cortex (Mudan Pi) und Gardeniae Fructus (Zhizi) hinzugefügt wurden, um Hitze abzuleiten und das Blut zu kühlen, sowie Acori Tatarinowii Rhizoma (Shi Changpu) und Polygalae Radix (Yuan Zhi), um die kognitive Funktion und die Wiederbelebung zu fördern. Die resultierende Formulierung wurde als modifiziertes Xiaoyao San (MXYS) bezeichnet und wurde entwickelt, um auf Grundlage der TCM-Prinzipien verbesserte therapeutische Wirkungen zu erzielen. In dieser Studie wurde jedoch kein direkter Vergleich mit der ursprünglichen XYS-Formulierung durchgeführt25. Klinische Studien haben die antidepressive Wirksamkeit von MXYS nachgewiesen26,27,28, und seine therapeutischen Effekte könnten mit der Regulation der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA-Achse) und der Hemmung von Neuroinflammation verbunden sein29,30,31. Dennoch bleibt unklar, ob MXYS mit einer verminderten neuronalen Nekroptose assoziiert ist.
In der vorliegenden Studie wurde die ultrahochleistungsfähige Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie (UHPLC-HRMS) verwendet, um MXYS-abgeleitete Verbindungen, die im Gehirngewebe nachgewiesen wurden, vorläufig zu identifizieren. Öffentlich zugängliche Genexpressions-Omnibus-(GEO-)Datensätze und bioinformatische Analysen, einschließlich der gewichteten Gen-koexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA), differentieller Expressionsanalyse und Anreicherungsanalyse, wurden verwendet, um die Zusammenhänge zwischen MXYS, Depression und Nekroptose zu untersuchen. Basierend auf diesen Ergebnissen vermuteten wir, dass MXYS antidepressiv ähnliche Wirkungen entfalten könnte, die mit einer Verringerung der Marker der neuronalen Nekroptose assoziiert sind, wobei der Weg des aktivierenden Transkriptionsfaktors 4 (ATF4)/cAMP-Antwort-Element-bindenden Proteins (CREB)/des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDNF) einen möglichen korrelativen Wirkmechanismus darstellt. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden Verbindungen im Gehirngewebe mittels UHPLC-HRMS vorläufig identifiziert, bioinformatische Analysen durchgeführt, um potenzielle therapeutische Zielstrukturen zu ermitteln, und In-vivo-Experimente durchgeführt, um zu prüfen, ob eine MXYS-Behandlung mit Veränderungen der Nekroptose-Marker und des ATF4/CREB/BDNF-Wegs assoziiert ist. Diese Ergebnisse liefern vorläufige Hinweise, die eine mögliche therapeutische Anwendung von MXYS bei Depressionen unterstützen, wobei anerkannt wird, dass vergleichende Studien mit der ursprünglichen XYS-Formulierung sowie Dosis-Wirkungs-Validierungen weiterhin erforderlich sind.
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Protokoll
Die Tierversuche wurden von dem Tierversuchsausschuss der Henan-Universität für Chinesische Medizin genehmigt (Genehmigungsnummer DWLLGZR202200023). Alle Verfahren wurden gemäß den institutionellen und nationalen Richtlinien zum Tierschutz durchgeführt und entsprachen den ARRIVE-Richtlinien. Männliche Sprague–Dawley-(SD)-Ratten wurden von einem lizenzierten Lieferanten für Laborversuchstiere bezogen. Die Tiere wurden bei kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit bei einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Wechsel gehalten und erhielten standardisierte Nahrung und Wasser ad libitum.
Nachweis der im Gehirngewebe enthaltenen Bestandteile von MXYS
Herstellung des gefriergetrockneten MXYS-Pulvers:
Die 11 Kräuter von MXYS wurden 2 Stunden lang in 10 Volumina destilliertem Wasser eingeweicht und anschließend 40 Minuten gekocht. Pfefferminze wurde in den letzten 5 Minuten der Extraktion hinzugefügt. Eine zweite Extraktion wurde auf die gleiche Weise mit 8 Volumina destilliertem Wasser durchgeführt. Beide Extrakte wurden vereinigt, durch Gaze filtriert, unter vermindertem Druck auf eine Konzentration von 1 g/mL (entsprechend rohem Arzneimittel) eingeengt und 48 Stunden im Vakuum gefriergetrocknet, um das gefriergetrocknete MXYS-Pulver zu erhalten. Die Ausbeute der Extraktion betrug 21,7 % (w/w)25,29,31.
Tiere und Verabreichung von MXYS:
Zwölf männliche SD-Ratten wurden zufällig zwei Gruppen zugewiesen und erhielten entweder MXYS oder gereinigtes Wasser zweimal täglich per oraler Gavage. Die beiden täglichen Verabreichungen erfolgten um 8:00 Uhr morgens und 8:00 Uhr abends (12-Stunden-Intervall). MXYS-Pulver wurde in gereinigtem Wasser gelöst und in einer Dosis von 24,4 g/kg verabreicht (etwa das Doppelte der klinischen Dosis für Ratten)25. Die Kontrollgruppe erhielt gereinigtes Wasser in einem äquivalenten Volumen (10 mL/kg).
Herstellung von MXYS-haltigem Gehirngewebe:
Nach 14 Tagen wurden alle Ratten 2 Stunden nach der letzten Gabe von MXYS mit Natriumpentobarbital (40 mg/kg, intraperitoneal) anästhesiert. Die Gehirngewebe wurden nach transkardialer Perfusion mit physiologischer Kochsalzlösung entnommen. Die gesamten Gehirne wurden umgehend exzisiert und auf Eis gelegt, um unbehandelte Gehirngewebeproben und mit MXYS behandelte Gehirngewebeproben zu erhalten.
Chromatographische/Massenspektrometrie-Bedingungen und Datenbank:
Gefriertrockenes MXYS-Pulver, mit MXYS-Pulver versetztes leeres Gehirngewebe, leeres Gehirngewebe sowie Extrakte aus Gehirngewebe mit MXYS wurden mittels eines Systems für die Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie analysiert, das mit einer HSS-T3-Säule (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) bei 35 °C betrieben wurde. Die mobilen Phasen bestanden aus Wasser mit 0,1 % Ameisensäure (mobile Phase A) und Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure (mobile Phase B). Die Proben wurden bei einer Flussrate von 0,3 mL/min mit einem Gradienten getrennt, der 5 % B für 1 min, Anstieg auf 98 % B innerhalb von 16 min, Rückkehr auf 5 % B innerhalb von 0,5 min und Halten bei 5 % B für 2,5 min umfasste.
Massenspektren wurden im positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodus mittels datenabhängiger Akquisition über einen m/z-Bereich von 90–1.300 erfasst. MS/MS-Spektren wurden aus den 10 intensivsten Vorläuferionen unter Verwendung gestaffelter Kollisionsenergien für die hochenergetische Kollisionsdissociation mit 20, 40 und 60 eV erzeugt. Die Kapillartemperatur wurde bei 320 °C gehalten, und die Probentemperatur des Probenheizers wurde auf 350 °C eingestellt.
Die Verbindungszuordnung erfolgte durch Abgleich der exakten Masse, der isotopischen Verteilung und der MS/MS-Spektren mit einer internen Datenbank für traditionelle chinesische Medizin sowie mit den öffentlichen Datenbanken GNPS32, ReSpect33 und MassBank34. Es wurden Verbindungen beibehalten, die eine zuverlässige Übereinstimmung der MS/MS-Daten und konsistente chromatographische Peakformen aufwiesen. Die vollständige Liste der vorläufig identifizierten Verbindungen ist in Zusätzliche Tabelle 1 enthalten.
Bioinformatik
Auswahl und Vorverarbeitung von Datensätzen aus der GEO-Datenbank:
Um die mögliche Beteiligung der Nekroptose an der Pathologie der Depression zu untersuchen, wurde die GEO-Datenbank mit dem Suchbegriff „depression“ durchsucht. Basierend auf den Auswahlkriterien wurden drei Datensätze (GSE54566, GSE54565 und GSE54568) für eine weitere Analyse identifiziert. Die Datensätze stammten aus verschiedenen Hirnregionen: GSE54565 (vorderer Cingulumkortex), GSE54566 (Amygdala) und GSE54568 (dorsolateraler präfrontaler Kortex, BA9). Alle Datensätze wurden mittels der Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array-Plattform (GPL570) generiert und enthielten postmortale Hirngewebeproben von Patienten mit einer schweren Depression (MDD) sowie von nichtpsychiatrischen Kontrollpersonen. Die detaillierten Probeneigenschaften für jeden Datensatz sind in Ergänzende Tabelle 2 zusammengefasst. Diese Datensätze umfassten transkriptomische Daten aus drei Hirnregionen, die mit der Depression assoziiert sind. Eine differentielle Genexpressionsanalyse wurde zwischen den MDD- und Kontrollgruppen für jeden Datensatz durchgeführt, und konsistent hoch- und herunterregulierte Gene wurden mithilfe des Robust Rank Aggregation (RRA)-R-Pakets integriert.
Alle Datensätze wurden mit dem robusten Multi-Array-Durchschnitts-Algorithmus (RMA) zur Hintergrundkorrektur und Normalisierung vorverarbeitet. Nach der RMA-Normalisierung wurde der im sva R-Paket implementierte ComBat-Algorithmus angewendet, um Batch-Effekte zwischen den Datensätzen zu korrigieren, wobei der Ursprung der Datensätze als Batch-Kovariate berücksichtigt wurde. Dieses Vorgehen verringerte die technische Variation zwischen den Datensätzen und verbesserte die Vergleichbarkeit für nachfolgende Analysen.
Die bioinformatischen Analysen wurden mit der R-Software (Version 4.2.1) durchgeführt. Zu den wichtigsten R-Paketen gehörten ClusterProfiler (Version 4.8.2) für die Anreicherungsanalysen der Genontologie (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), WGCNA (Version 1.72) für die gewichtete Gen-ko-Expressionsnetzwerkanalyse, RRA für die Integration differentiell exprimierter Gene und sva (Version 3.48.0) für die ComBat-Batch-Korrektur. Der analytische Arbeitsablauf umfasste die Datenerfassung, RMA-Normalisierung, ComBat-Batch-Korrektur, differentielle Expressionsanalyse mit RRA-Integration, Konstruktion von WGCNA-Modulen, GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen mit einer falschen Entdeckungsrate (FDR) < 0,05 sowie die Zielvorhersage mittels Protein-Protein-Interaktions-(PPI-)Netzwerkanalyse.
Anwendung von WGCNA zur Erstellung von Gen-Ko-Expressionsnetzwerken und Identifizierung von Modulen, die signifikant mit Depression und Nekroptose assoziiert sind:
WGCNA erstellt gewichtete Gen-Ko-Expressionsnetzwerke, indem eine Soft-Thresholding-Potenz (β-Wert) angewandt wird, um eine skalenfreie Topologie anzunähern. Der β-Wert wurde gewählt, wenn der Korrelationskoeffizient zwischen log(k) und log(p(k)) mindestens 0,9 betrug. Nach der Auswahl des β-Werts wurden Genmodule mithilfe der dynamischen Baumzerlegungsmethode identifiziert. Zusätzliche Parameter wurden wie folgt festgelegt: minModuleSize = 30, cutHeight = 0,25 und deepSplit = 2. Der β-Wert wurde gewählt, wenn der Korrelationskoeffizient zwischen log(k) und log(p(k)) mindestens 0,9 erreichte. Für die Netzwerkerstellung wurde eine Soft-Thresholding-Potenz von β = 7 verwendet. Das Modul-Eigenegen (ME) wurde für jedes Modul berechnet, um die Expressionsmuster der Gene zusammenzufassen und Assoziationen mit biologischen Merkmalen zu bewerten. Die Gen-Signifikanz (GS) und die Modul-Zugehörigkeit (MM) wurden anschließend berechnet, und die Beziehungen zwischen Modulen und Merkmalen wurden anhand des Korrelationskoeffizienten (cor) sowie des entsprechenden p-Werts ausgewertet. Höhere Korrelationskoeffizienten und niedrigere p-Werte deuteten auf stärkere Assoziationen zwischen Genmodulen und biologischen Merkmalen hin.
Funktionsanalyse der Anreicherung und Aufbau des PPI-Netzwerks:
Zur Durchführung der KEGG-Pfad-Anreicherungsanalyse wurde ClusterProfiler verwendet. Zur Korrektur für Mehrfachvergleiche kam die Benjamini–Hochberg-FDR-Methode zum Einsatz, wobei ein adjustierter p-Wert (FDR) < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurde. Nach Identifizierung des Zielmoduls wurden die Schlüsselgene innerhalb des Moduls mit Genen, die mit MXYS und Nekroptose assoziiert sind, geschnitten. Anschließend wurde ein PPI-Netzwerk mithilfe der STRING-Datenbank erstellt.
Vorhersage von Zielstrukturen für in Gehirngewebe nachgewiesene Verbindungen:
Die 143 Verbindungen, die nach Gabe von MXYS im Rattenhirngewebe vorläufig identifiziert wurden, wurden zur Vorhersage von Zielstrukturen verwendet. Für jede Verbindung wurden potenzielle Zielstrukturen aus der GeneCards-Datenbank mittels der Funktion „Related Targets“ mit einem Relevanzscore > 5 abgerufen. Doppelte Zielstrukturen wurden zusammengefasst, und es wurden nur humane Gene mit offiziellen Gensymbolen beibehalten, was 3.164 eindeutige Zielstrukturen ergab. Diese Zielstrukturen wurden einer GO- und KEGG-Enrichment-Analyse mit dem ClusterProfiler R-Paket unterzogen, wobei ein FDR < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurde. Als Hintergrund-Genmenge dienten alle in der KEGG-Datenbank annotierten humanen proteincodierenden Gene.
Experimentelle Verifikation
Zellkultur:
HT-22-Zellen wurden von Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (CL-0697, RRID: CVCL_0321) bezogen und in Wachstumsmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin, kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ gehalten.
Anti-nekroptotische Aktivität von MXYS:
Das gefriergetrocknete MXYS-Pulver wurde in Zellkulturmedium auf eine Konzentration von 1,0 g/mL rekonstituiert und durch eine 0.22 μm Membranfilter und bei −20 °C gelagert20°C bis zur Verwendung. HT-22-Zellen wurden mit einer Dichte von 8.000 Zellen pro Vertiefung in 96-Well-Platten ausgesät, mit jeweils drei Vertiefungen pro Gruppe. MXYS wurde in Wachstumsmedium auf endgültige Konzentrationen von 2, 4 und 6 mg/mL verdünnt. Nach einer Inkubation von 12 h wurden die Zellen mit SM-164-Hydrochlorid (10 nM) und dem Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk behandelt (20 μM) für 30 min, gefolgt von einer Stimulation mit humanem Tumornekrosefaktor-α (h-TNF-α; 20 ng/mL) für weitere 12 h. Die Zellviabilität wurde mittels eines lumineszenzbasierten Zellviabilitätsassays gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Lumineszenz wurde mit einem Mikroplattenreader gemessen. Die Zellmorphologie wurde an einem umgekehrten Mikroskop untersucht und repräsentative Bilder zur Analyse aufgenommen.
Tiere:
Die Tierversuche wurden von dem Tierversuchsausschuss der Henan-Universität für Chinesische Medizin genehmigt (Genehmigungsnummer DWLLGZR202200023). Alle Verfahren wurden gemäß den institutionellen und nationalen Richtlinien zum Tierschutz durchgeführt und entsprachen den ARRIVE-Richtlinien. Zur Erstellung des CUMS-Modells wurden ausschließlich männliche BALB/c-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen verwendet. Die Tiere wurden bei kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit bei einem 12-Stunden-Licht/-Dunkel-Wechsel gehalten und erhielten ad libitum Standardfutter und Wasser.
Modell der durch CUMS induzierten Depression:
Die Mäuse wurden zufällig einer Kontrollgruppe oder einer CUMS-Gruppe zugewiesen. Nach einer Woche der Eingewöhnung wurden die Mäuse der CUMS-Gruppe intermittierenden und unvorhersehbaren leichten Stressreizen ausgesetzt, während die Kontrollmäuse ungestört blieben. Das Stressparadigma bestand aus 13 verschiedenen Stressoren, darunter Käfigkippung, Käfigerschütterung, Käfigwechsel, nasse Einstreu, Wasserverweigerung, Stroboskopbeleuchtung, Lärmbelastung, Dauerlicht, Dauerfinsternis, intermittierende Beleuchtung, Schwimmen in kaltem Wasser (4 °C), Schwimmen in warmem Wasser (40 °C), Fixierungsstress sowie andere milde Stressoren. Jeder Stressor wurde pro Sitzung 2–6 Stunden lang in zufälliger Reihenfolge angewandt, um die Unvorhersehbarkeit aufrechtzuerhalten. Den Mäusen wurde jeden Tag entsprechend einem randomisierten Zeitplan ein oder zwei verschiedene Stressoren ausgesetzt.
Gruppen und Behandlung mit Wirkstoffen:
Nach sechs Wochen CUMS-Exposition wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip den CUMS-, MXYS-, Paroxetin- oder Nec-1-Behandlungsgruppen zugewiesen. Die MXYS-Gruppe erhielt gefriergetrocknetes MXYS-Pulver mittels Magensonde in einer Dosis von 35,2 g/kg/Tag. Die Paroxetin-Gruppe erhielt Paroxetin (20 mg/kg) per Magensonde, während die Nec-1-Gruppe Nec-1 (10 mg/kg) über vier aufeinanderfolgende Wochen hinweg intraperitoneal injiziert bekam. Im gleichen Zeitraum erhielten die Kontroll- und die CUMS-Gruppe ein äquivalentes Volumen an physiologischer Kochsalzlösung per Magensonde.
Verhaltensexperimente:
Die Mäuse wurden vor Beginn der Applikation der Wirkstoffe anhand einer computergenerierten Zufallssequenz willkürlich den experimentellen Gruppen zugewiesen. Die Randomisierungssequenz wurde von einem unabhängigen Untersucher erstellt, der nicht an den anschließenden Experimenten oder der Datenanalyse beteiligt war.
Verhaltensuntersuchungen wurden von einem Untersucher durchgeführt, der hinsichtlich der Behandlungsgruppen verblindet war. Derselbe Untersucher führte die video-basierte Verhaltensauswertung (Stillhaltezeit, zurückgelegte Distanz und in der Mitte verbrachte Zeit) mithilfe einer automatisierten Nachverfolgungssoftware durch, um subjektive Verzerrungen zu minimieren. Der verblindete Untersucher hatte erst Zugang zu den Gruppenzuordnungscodes, nachdem alle Verhaltensdaten erhoben und dokumentiert worden waren.
Die Immunfluoreszenz-Analysen wurden von einem weiteren Untersucher durchgeführt, der ebenfalls über die experimentellen Gruppen verblindet war. Die Proben wurden mit codierten Kennungen versehen, und die Gruppenzuordnung wurde erst nach Abschluss der dichtometrischen oder Fluoreszenzintensitätsmessungen offengelegt. Die statistischen Analysen wurden von einem dritten Untersucher durchgeführt, der bis zur vollständigen Zusammenstellung aller quantitativen Daten verblindet gegenüber der Gruppenzuordnung und den entsprechenden experimentellen Ergebnissen blieb.
Test zur Saccharosepräferenz (SPT): Die Verhaltensuntersuchung wurde nach der letzten Applikation des Wirkstoffs durchgeführt. Vor dem Test wurden die Mäuse an eine 1%ige Saccharoselösung gewöhnt, indem ihnen zunächst zwölf Stunden lang zwei Flaschen mit 1%iger Saccharoselösung zur Verfügung gestellt wurden, gefolgt von einer weiteren zwölfstündigen Phase mit einer Flasche 1%iger Saccharoselösung und einer Flasche Trinkwasser. Anschließend wurden die Mäuse zwölf Stunden lang sowohl von Nahrung als auch von Wasser entwöhnt, bevor der eigentliche Test begann. Während des Tests erhielt jede Maus eine Flasche mit 1%iger Saccharoselösung und eine Flasche mit Trinkwasser. Nach 12 Stunden wurde das aus jeder Flasche konsumierte Volumen gemessen. Die Saccharosepräferenz wurde wie folgt berechnet:
Test zur Schwanzaufhängung (TST): Der Schwanz jedes Mäuschens wurde mit Klebeband an der Oberseite der Versuchsanordnung befestigt. Das Verhalten der Maus wurde mit einer Videoaufzeichnungs- und Analysesoftware für Verhaltensstudien 6 Minuten lang aufgezeichnet. Die Dauer der Immobilität während der letzten 4 Minuten des Tests wurde quantifiziert.
Open-Field-Test (OFT): Jede Maus wurde einzeln in die Mitte der Open-Field-Apparatur platziert. Die Verhaltensaktivität wurde 5 Minuten lang mit einer Verhaltensverfolgungssoftware aufgezeichnet und analysiert, einschließlich der lokomotorischen Distanz und der Bewegungsaktivität. Nach jedem Test wurde die Apparatur mit 75%igem Ethanol gereinigt.
Probenentnahme:
Mäuse, die während des CUMS-Verfahrens starben oder Anzeichen einer schweren Erkrankung zeigten (z. B. >20 % Gewichtsverlust, sichtbare Infektion oder Bewegungsunfähigkeit) wurden von der Studie ausgeschlossen. Die Tötung erfolgte durch zertifiziertes Personal mittels einer Überdosis Natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneal). Nach dem Verlust des Bewusstseins wurde eine zervikale Dislokation als sekundäre Methode zur sicheren Tötung durchgeführt. Für die Nissl-Färbung und immunfluoreszenzbasierende Analysen wurden jeweils drei Mäuse zufällig aus jeder Gruppe ausgewählt. Hippocampale Gewebeproben für die Western-Blot-Analyse wurden unmittelbar auf Eis disseziert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Nissl-Färbung:
Für die Nissl-Färbung und immunfluoreszenzanalytische Untersuchungen wurden Mäuse tief mit Natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneal) anästhesiert und ohne transkardiale Perfusion enthauptet. Die Gehirne wurden rasch entnommen und 24–48 h in 4 % Paraformaldehyd fixiert, bevor eine Paraffineinbettung erfolgte. Paraffinschnitte wurden mit einer Dicke von 3 μm angefertigt. Die Paraffinschnitte wurden durch sequenzielle Inkubation in Entfettungslösung, absolutem Ethanol und 75 %igem Ethanol entparaffiniert, anschließend mit fließendem Wasser gespült. Gefrorenschnitte, falls zutreffend, wurden auf Raumtemperatur gebracht, 15 Minuten mit Gewebefixiermittel fixiert und mit fließendem Wasser gespült. Die Gewebeschnitte wurden 2–5 Minuten mit Nissl-Färbelösung gefärbt, mit Wasser gespült, mit 0,1 %iger Essigsäure differenziert, zur Beendigung der Reaktion gewaschen, mikroskopisch überwacht, um die Differenzierung zu kontrollieren, getrocknet, 10 Minuten in Xylol geklärt und mit einem neutralen Eindeckmedium eingedeckt.
Immunfluoreszenz:
Immunfluoreszenzverfahren wurden mit Standardmethoden durchgeführt. Gehirngewebe wurde in 4% Paraformaldehyd fixiert und für die Immunfluoreszenzfärbung in Paraffin eingebettet. Gewebeschnitte wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen NeuN (1:200), MLKL (1:300), ATF4 (1:5000) und CREB (1:1000) inkubiert. Nach der Inkubation mit den primären Antikörpern wurden die Schnitte viermal mit PBS gewaschen und anschließend 1 h im Dunkeln mit den entsprechenden fluoreszierenden sekundären Antikörpern versetzt: CY3-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:300, Servicebio, GB21301) für Maus-Anti-ATF4; Alexa Fluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:400, Servicebio, GB25301) für Maus-Anti-MLKL; CY3-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:300, Servicebio, GB21303) für Kaninchen-Anti-NeuN; sowie Alexa Fluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:400, Servicebio, GB25303) für Kaninchen-Anti-CREB. Danach wurden die Schnitte 10 min bei Raumtemperatur mit DAPI gefärbt, mit PBS gewaschen, mit einem Antifade-Einbettmedium auf Objektträgern fixiert und die Fluoreszenzbilder mittels konfokaler Mikroskopie aufgenommen.
Western Blot:
Gehirngewebe wurden in Radioimmunpräzipitationspuffer (RIPA-Puffer) homogenisiert. Die Proteinkonzentrationen wurden bestimmt, und je 20 μg Gesamtprotein pro Lane wurden mittels 10%iger Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und anschließend auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Nach der Blockierung wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern (1:1000) inkubiert, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit mit Peroxidase (HRP) konjugierten sekundären Antikörpern. Die Proteinbanden wurden mithilfe eines Chemilumineszenz-Imaging-Systems sichtbar gemacht, und die Bandenintensitäten wurden mit der Software ImageJ quantifiziert. Bei der Western-Blot-Analyse von hippocampalem Gewebe wurden jeweils zwei Mäuse pro Gruppe untersucht, und repräsentative Immunoblots werden gezeigt. Für die HT-22-Zellexperimente wurde die Western-Blot-Analyse einmal als repräsentatives Experiment durchgeführt. Diese Daten werden als qualitative Trendbeobachtungen präsentiert und nicht als statistisch quantifizierte Ergebnisse.
Statistische Analyse:
Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Tukey’schen Test für multiple Vergleiche analysiert. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Ein p-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant.
Datenverfügbarkeit:
Die in dieser Studie erzeugten und analysierten Datensätze sind in diesem publizierten Artikel und den ergänzenden Materialien enthalten. Die Ergebnisse der UHPLC-HRMS-basierten Verbindungsidentifizierung finden sich in Supplementary Table 1, und die Merkmale der für die bioinformatischen Analysen verwendeten GEO-Datensätze sind in Supplementary Table 2 zusammengefasst. Weitere unterstützende Daten, einschließlich der GFAP-Immunfluoreszenz (Supplementary Figure 1), der Immunfluoreszenz-Färbung von p-RIPK3 und p-MLKL (Supplementary Figure 2), des experimentellen Designs und des Zeitplans zur Tierzuweisung (Supplementary Figure 3) sowie der ursprünglichen, nicht zugeschnittenen Western Blot-Bilder (Supplementary Figure 4), sind in den ergänzenden Materialien verfügbar.
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Ergebnisse
WGCNA identifiziert ein depressionassoziiertes Genmodul, das im Nekroptose-Signalweg angereichert ist
Das RRA-Paket wurde verwendet, um konstant hoch- und herunterregulierte differentiell exprimierte Gene aus den Datensätzen GSE54566, GSE54565 und GSE54568 zu integrieren, wodurch 2.513 Gene identifiziert wurden. Eine Heatmap dieser Gene ist in Abbildung 1A dargestellt. Die drei Datensätze stammten aus unterschiedlichen Hirnregionen – dem vorderen cingulären Kortex, der A...
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Diskussion
Abnormer neuronaler Zelltod spielt eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Depression8. Die Nekroptose, eine Form des programmierten Zelltods, wurde umfassend erforscht, was zu bedeutenden Fortschritten bei der Entwicklung von Inhibitoren dieses Signalwegs geführt hat39. Seit der Identifizierung des Nekroptose-Inhibitors Nec-1 im Jahr 200540 wurden erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung von Verbindungen erzielt, die gezielt Schlüsselkomp...
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Offenlegungen
Interessenkonflikte:
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Schlüsselprojekt für wissenschaftliche Forschung der Hochschuleinrichtungen von Henan, China (Nr. 26A360008), das Projekt für wissenschaftliche Forschung der Traditionellen Chinesischen Medizin der Provinz Henan (Nr. 2025ZY3152), die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (Nr. 82274496), das Wissenschafts- und Technologieforschungsprojekt der Provinz Henan (Nr. 232301420018) sowie das Zhang-Zhongjing-Projekt zur Weitergabe und Innovation des Wissenschafts- und Technologiedepartments der Nationalen Verwaltung für Traditionelle Chinesische Medizin (Nr. GZY-KJS-2022-044-1).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Acori Tatarinowii Rhizoma (Acorus tatarinowii Schott; Shi Changpu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 231001 | Heilpflanzlicher Bestandteil (12 g) |
| Klebeband | Nicht zutreffend | Nicht zutreffend | Schwanzaufhängetest |
| Angelicae Sinensis Radix (Angelica sinensis (Oliv.) Diels; Dang Gui) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | G01230507-16 | Heilpflanzlicher Bestandteil (10 g) |
| Anti-ATF4-Antikörper (Immunfluoreszenz) | Servicebio | GB111137 | Primärantikörper |
| Anti-ATF4-Antikörper (Western-Blot) | MedChemExpress | HY-P80486 | Primärantikörper |
| Anti-BDNF-Antikörper | MedChemExpress | HY-P80567 | Primärantikörper für Western-Blot |
| Anti-CREB-Antikörper | Beyotime | AF1018 | Primärantikörper für Western-Blot und Immunfluoreszenz |
| Anti-GAPDH-Antikörper | Abcam | ab181602 | Ladungskontrolle |
| Anti-MLKL-Antikörper | Proteintech | 66675-1-Ig | Primärantikörper für Western-Blot und Immunfluoreszenz |
| Anti-NeuN-Antikörper | Servicebio | GB11138 | Primärantikörper für Immunfluoreszenz |
| Anti-phospho-CREB-Antikörper | Beyotime | AF5785 | Primärantikörper |
| Anti-phospho-MLKL-Antikörper | Bioss | bsm-54104R | Primärantikörper |
| Anti-phospho-RIPK1-Antikörper | Biolynx | BX60008 | Primärantikörper |
| Anti-phospho-RIPK3-Antikörper | Abcam | ab195117 | Primärantikörper |
| Anti-RIPK1-Antikörper | Cell Signaling Technology | 3493S | Primärantikörper |
| Anti-RIPK3-Antikörper | Proteintech | 17563-1-AP | Primärantikörper |
| Atractylodes macrocephala (Atractylodes macrocephala Koidz.; Bai Zhu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230801 | Heilpflanzlicher Bestandteil (10 g) |
| Automatische Verhaltensverfolgungssoftware | Panlab (Harvard Apparatus) | N/V | SMART 3.0 Video-Tracking-Software für offenen Feld- und Schwanzaufhängetest |
| BCA-Protein-Assay-Kit | CWBIO | CW0014S | Proteinquantifizierung |
| Verhaltensaufzeichnungssystem | Panlab (Harvard Apparatus) | SMART V3.0 | Offener Feld- und Schwanzaufhängetest |
| Chemilumineszenz-Bildgebungssystem von Bio-Rad | Bio-Rad | 12003154 | ChemiDoc MP Imaging System zur chemilumineszenten Western-Blot-Detektion |
| CellTiter-Lumi II Lumineszenz-Testkit zur Bestimmung der Zellviabilität | Beyotime | C0056XL | Zellviabilitätsassay |
| Konfokales Mikroskop | Nikon Eclipse C1 | N/V | Immunfluoreszenzbildgebung |
| DAPI | Servicebio | G1012 | Kernfärbung |
| Umweltfreundliche Entparaffinierungslösung | Servicebio | G1128 | Paraffin-Deparaffinisierung |
| Fötales Rinderserum (FBS) | BI | C04001-500 | Zellkulturzusatz |
| Gardeniae Fructus (Gardenia jasminoides J. Ellis; Zhi Zi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 22102109 | Heilpflanzlicher Bestandteil (12 g) |
| Glycyrrhizae Radix (Glycyrrhiza uralensis Fisch.; Gan Cao) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230301 | Heilpflanzlicher Bestandteil (3 g) |
| CY3-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG | Servicebio | GB21301 | Fluoreszierender sekundärer Antikörper für Maus-Anti-ATF4 (IF, CY3, 1:300) |
| Alexa Fluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG | Servicebio | GB25301 | Fluoreszierender sekundärer Antikörper für Maus-Anti-MLKL (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| CY3-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG | Servicebio | GB21303 | Fluoreszierender sekundärer Antikörper für Kaninchen-Anti-NeuN (IF, CY3, 1:300) |
| Alexa Fluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG | Servicebio | GB25303 | Fluoreszierender sekundärer Antikörper für Kaninchen-Anti-CREB (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| HRP-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG | Absin | abs20040 | Sekundärantikörper für Western-Blot |
| HRP-konjugiertes Maus-Anti-Kaninchen-IgG-Leichtkette | ABclonal | AS061 | Sekundärantikörper für Western-Blot |
| Menschliches TNF-α | Novoprotein | C008 | Nekroptose-Induktor |
| HT-22-Zellen | Procell | CL-0697 | RRID: CVCL_0321 |
| HyClone-Wachstumsmedium | Cytiva (HyClone) | SH30022.01 | Zellkulturmedium |
| ImageJ | NIH | Kostenlose Software | Bandquantifizierung |
| Invertiertes Mikroskop | Nikon | Eclipse Ti-SR | Zellmorphologie |
| Flüssiger Stickstoff | Henan Jilai New Energy Technology Co., Ltd. | N/V | Gewebekonservierung |
| Mikroplattenlesegerät von Molecular Devices | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Lumineszenzmessung |
| Moutan Cortex (Paeonia suffruticosa Andr.; Mu Danpi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 22121714 | Heilpflanzlicher Bestandteil (12 g) |
| Necrostatin-1 (Nec-1) | Selleck | S8037 | RIPK1-Inhibitor |
| Paraformaldehyd | Servicebio | G1101-500ML | Gewebefixierung |
| Paroxetin-Hydrochlorid-Hemihydrat | Aladdin | P129711 | Positivkontrolle |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | Waschpuffer |
| Minze (Mentha haplocalyx Briq.; Bo He) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230101 | Heilpflanzlicher Bestandteil (6 g) |
| Penicillin–Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Zellkulturantibiotikum |
| Polygalae Radix (Polygala tenuifolia Willd.; Yuan Zhi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 20221101 | Heilpflanzlicher Bestandteil (12 g) |
| Polyvinylidenfluorid-(PVDF-)Membran | Merck Millipore | ISEQ00010 | Western-Blot |
| Poria (Wolfiporia cocos; Fu Ling) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | D23070601 | Heilpflanzlicher Bestandteil (15 g) |
| Lysispuffer für Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA) | CWBIO (Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd.) | CW2333S | Proteinextraktion |
| Radix Bupleuri (Bupleurum chinense DC.; Chai Hu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230801 | Heilpflanzlicher Bestandteil (12 g) |
| SDS-PAGE-Reagenzien | Solarbio; Servicebio; Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. | Nicht zutreffend | Acrylamid, Bis-Acrylamid, Tris, SDS, APS und TEMED, selbst hergestellt |
| Natriumpentobarbital | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 69020181 | Anästhetikum |
| System für ultrahochleistungsfähige Flüssigkeitschromatographie | Thermo Fisher Scientific | Vanquish UHPLC-System | LC-MS-Analyse |
| UHPLC HSS-T3-Säule (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) | Waters | 186003539 | Chromatographische Trennung |
| z-VAD-fmk | TargetMol | T6013 | Pan-Caspase-Inhibitor |
Referenzen
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