Eine markierungsfreie, echtzeitbasierte impedanzmetrische Methode für das High-Throughput-Antiviral-Screening

Ashley Zolfaghari; Naveenchandra Suryadevara; Jing Zhang; Nancy Li; Li Leyna Zhao; James E. Crowe; Xiaoyu Zhang; Robert H. Carnahan

doi:10.3791/72539

Methodenartikel

Eine markierungsfreie, echtzeitbasierte impedanzmetrische Methode für das High-Throughput-Antiviral-Screening

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DOI:

10.3791/72539

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3. September 2026

Ashley Zolfaghari¹ , Naveenchandra Suryadevara¹ , Jing Zhang² , Nancy Li² , Li Leyna Zhao² , James E. Crowe¹^,³^,⁴ , Xiaoyu Zhang² , Robert H. Carnahan¹^,⁴

¹Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, ²Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, ³Department of Pathology, Microbiology and Immunology, ⁴Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der impedanzbasierte Echtzeit-Zellanalyseansatz (RTCA) ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung von virusinduzierten zytopathischen Effekten ohne Markierung und bietet damit eine schnelle Methode zur Bewertung antiviraler Verbindungen und monoklonaler Antikörper mittels eines integrierten, softwaregesteuerten Assay-Workflows.

Zusammenfassung

Impedanzbasierte Technologien bieten ein robustes und objektives Mittel, um zytopathische Effekte (CPE) in Zellkultur-Monolagen zu quantifizieren, und überwinden dabei die Einschränkungen traditioneller Endpunkt- oder visuell subjektiver Assays. Lytische Viren verursachen typischerweise ausgeprägte morphologische Veränderungen und Zelltod in infizierten Kulturen, weshalb Impedanzmessungen, die Veränderungen in Zelladhäsion, Morphologie und Vitalität widerspiegeln, einen empfindlichen und dynamischen Indikator für Virusinfektion und Krankheitsverlauf darstellen. Folglich bieten impedanzbasierte Messungen einen leistungsstarken und effizienten Ansatz, um den Schutzeffekt antiviraler Interventionen zu bewerten. Diese Studie stellt eine echtzeitfähige, markierungsfreie Screening-Plattform vor, die fortschrittliche Impedanzmesssysteme nutzt, um virusinduzierte CPE kontinuierlich zu überwachen. Dieser Ansatz ermöglicht eine schnelle, quantitative Beurteilung der antiviralen Wirksamkeit sowohl von niedermolekularen Wirkstoffen als auch von monoklonalen Antikörpern, ohne zusätzliche Markierungs- oder Färbeschritte. Das Protokoll beschreibt den gesamten Assay-Ablauf, von der Zellseeding und Virusinfektion bis hin zur Datenaufnahme und -analyse. Darüber hinaus vereinfacht die systemintegrierte Software, die speziell für virologische Anwendungen angepasst ist, die Datenverarbeitung und -interpretation und erleichtert so die Bestimmung der neutralisierenden Potenz monoklonaler Antikörper sowie die Aktivität antiviraler Verbindungen.

Einleitung

Wenn eine virale Ausbruchssituation droht, stellen Impfstoffe und antivirale Therapeutika die primären Strategien zur Begrenzung der Virusübertragung und zur Behandlung infizierter Patienten dar¹. Impfstoffe verhindern Infektionen, indem sie das Immunsystem darauf vorbereiten, Krankheitserreger zu erkennen, und bieten proaktiven sowie langfristigen Schutz. Antivirale Therapeutika haben je nach Wirkweise und Konstruktion des Arzneimittels unterschiedliche Anwendungen. Ähnlich wie Impfstoffe können monoklonale Antikörper einen proaktiven, andauernden Schutz (von mehreren Wochen bis zu vielen Monaten) bieten und zudem als Instrument zur Kontrolle nach einer Exposition eingesetzt werden. Sowohl monoklonale Antikörper als auch antivirale niedermolekulare Therapeutika werden zur Behandlung bereits bestehender Infektionen eingesetzt, indem sie direkt virale Bestandteile angreifen oder hemmen, wodurch die Krankheitsschwere verringert wird und sie als reaktive, kurzfristige Maßnahme dienen.

Der herkömmliche Ansatz zur funktionellen Beurteilung antiviraler Aktivität in biologischen Systemen ist der Virusreduktions-Neutralisationstest (VRNT), bei dem die Verringerung der Plaque-Bildung in Plaque-Reduktions-Neutralisationstests (PRNT) und Foci quantifiziert wird über Immunfärbung im Fokus-Reduktions-Neutralisationstest (FRNT) oder zytopathische Effekte (CPE) mittels Zellviabilitäts-basierter Assays. Der PRNT gilt als Goldstandard-Methode für phänotypische Untersuchungen zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität antiviraler Wirkstoffe gegen eine breite Palette viral bedingter Infektionen.². Allerdings ist der PRNT zeitaufwendig und arbeitsintensiv, und die Interpretation der Ergebnisse kann subjektiv sein, insbesondere wenn es bei längerer Inkubation zu einer Überwucherung oder Fusion der Plaques kommt. Die Objektivität der Assayauswertung kann mit dem FRNT verbessert werden, der auf dem Nachweis virus-spezifischer Antigene oder der Expression eines Reportergens beruht. Dieser Ansatz kann jedoch durch die Verfügbarkeit und Leistungsfähigkeit hochwertiger Antikörper oder Nachweisenzyme eingeschränkt sein. Mehrere Reagenzien und Assayprotokolle sind etabliert und weit verbreitet zur Beurteilung der Zellviabilität und messen bestimmte Aspekte des zytopathischen Effekts (CPE). Die enzymatische Reduktion des Mono-Tetrazoliumsalzes MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid), einem farbmetrischen Reagenz, durch mitochondriale Dehydrogenasen lebender Zellen erzeugt ein quantifizierbares farbmetrisches Signal, das durch das gefärbte Formazan-Produkt verursacht wird. Das Reagenz für den Viabilitätsassay (das Zellen lysiert und intrazelluläres ATP freisetzt, welches eine luciferasekatalysierte Reaktion antreibt, bei der das Substrat Luciferin in Oxyluciferin umgewandelt wird) ist ein homogener lumineszenter Assay. Solche Zellviabilitätsassays können verwendet werden, um die Abnahme des CPE bei der Screening von antiviralen Wirkstoffen zu quantifizieren.³. Diese Methoden erfordern jedoch mehrere Wasch- und Färbungsschritte und sind, wie auch PRNT- und FRNT-Assays, Endpunkt-Assays. Daher können teilweise wirksame antivirale Wirkstoffe, die verzögerte Effekte auf die Virusinfektion ausüben, übersehen werden, wenn der antivirale Assay zu einem suboptimalen Zeitpunkt beendet wird. Deshalb besteht ein großer Bedarf an einem automatisierten, mittel- bis hochdurchsatzfähigen Assay, der eine Echtzeitüberwachung der zellulären Reaktionen auf Virusinfektionen ermöglicht.

Systeme zur Echtzeit-Zellanalyse (RTCA) ermöglichen eine kontinuierliche Überwachung der Entwicklung zytopathogener Effekte (CPE) und antiviraler Reaktionen in permissiven Zellmodellen mittels eines markerfreien, nichtinvasiven, impedanzbasierten Nachweises. Zu den virusinduzierten zytopathogenen Effekten gehören nicht nur Zelltod, sondern auch Veränderungen in der zellulären Morphologie und Adhäsion, die alle empfindlich durch Änderungen der elektrischen Impedanz detektiert werden können⁴^,⁵. Diese Impedanzmessungen werden mithilfe von in eine spezielle 96-Well-Zellkulturplatte eingebetteten Gold-Mikroelektroden-Sensoren durchgeführt, wodurch eine quantitative Beurteilung dynamischer zellulärer Reaktionen ohne Markierung oder Reporter-Genexpression möglich ist. Die RTCA-Technologie wurde bereits vielfach für den Nachweis zytopathogener Effekte in verschiedenen infizierten Zellmodellen beschrieben, die mit Viren unterschiedlicher Familien infiziert wurden, sowie zur Bewertung der neutralisierenden Wirkung von Antikörpern^6–10.

Hier wurden die kritischen Schritte dieses echtzeitfähigen und markierungsfreien, impedanzbasierten in vitro-Antivirenassays festgelegt. Dieser Ansatz basierte auf früheren Studien, in denen die Untersuchung antiviraler Verbindungen in Adenovirus-5-infizierten HEK293A-Zellen sowie die Bewertung neutralisierender Antikörper mithilfe eines replikationskompetenten, rekombinanten Vesikulären Stomatitis-Virus, das das Lassa-Glykoprotein (rVSV-LASV(Lin IV)) in Vero CCL-81-Zellen exprimiert, durchgeführt wurde¹¹. Alle diese Experimente wurden an einem RTCA-MP-System durchgeführt, das den gleichzeitigen Betrieb von bis zu 6× 96-Well-Platten ermöglicht. Ziel dieser Arbeit war es, eine Grundlage für die impedanzbasierte antivirale Wirkstoffscreening zu schaffen. Die Methode kann problemlos auf eine breite Palette von Virus-Zelle-Modellen ausgeweitet werden, sobald optimale Testbedingungen mithilfe des hier beschriebenen Protokolls definiert wurden.

Protokoll

Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

1. Permissives Zellkultivieren und Passagieren

HINWEIS: In diesem Protokoll werden Vero CCL-81-Zellen für die Antikörpernelimierung verwendet, während HEK293A-Zellen für die antivirale Wirkstoffscreening-Analyse eingesetzt werden. Um die Variabilität zwischen Experimenten zu verringern, wird dringend empfohlen, einen Zellbankvorrat permissiver Zellen im gleichen Passagenstadium für den Test anzulegen.

Das Zellwachstumsmedium – Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin – vor der Verwendung in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
Eine Ampulle mit kryokonservierten permissiven Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen, bis nur noch ein kleines Eisstückchen übrig ist; dabei die Kappe nicht ins Wasserbad eintauchen.
Die Ampulle mit den reanimierten Zellen nach Abwischen der Außenseite mit 70 %igem Ethanol in die Sicherheitswerkbank (BSC) stellen.
Die Zellen vorsichtig in ein neues 50-mL-Konischgefäß überführen und tropfenweise 9 mL warmes Wachstumsmedium zu den Zellen hinzufügen. Vorsichtig mischen.
Die Zellsuspension 5 min bei Raumtemperatur (RT) mit 200 × g abzentrifugieren.
Die resuspendierten Zellen in 5 mL vorgewärmtem Wachstumsmedium in eine neue T-25-Flasche überführen.
Die Zellen in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO₂ auf 80–90 % Konfluenz wachsen lassen, bevor die nächste Subkultur durchgeführt wird.
Zellen passagieren.
1. Das Medium absaugen und die Zellmonoschicht zweimal vorsichtig mit jeweils 3 mL 1× Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium waschen, um restliches Wachstumsmedium zu entfernen.
2. 2 mL 0,25 %igem Trypsin-EDTA zur Flasche hinzufügen, sodass die Zellen bedeckt sind.
3. Nach 2–5 min Inkubation bei 37 °C das Trypsin durch Zugabe des 5-fachen Volumens vorgewärmten Wachstumsmediums neutralisieren.
4. Die Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren der Zellsuspension an der Flaschenwand resuspendieren.
5. Die Zellen mit frischem Medium in der gewünschten Ansiedlungsdichte oder Aufteilungsrate aussäen.
  HINWEIS: Die gewünschte Zellansiedlungsdichte wird empirisch anhand der Zellwachstumsrate, der Passagierhäufigkeit und der Zielkonfluenz zum Zeitpunkt der Passagierung bestimmt. Beispielsweise ermöglicht das Aussäen von Vero CCL-81-Zellen mit mindestens 0,4 × 10⁴ Zellen/cm², dass die Zellen alle 3 Tage passagiert werden können, bevor sie 90 % Konfluenz erreichen.

2. Screening von antiviralen Wirkstoffen

HINWEIS: Abbildung 1 veranschaulicht den Arbeitsablauf des impedanzbasierten antiviralen Screening-Assays. Kurzgefasst werden permissive Zellen in mikroelektrodenintegrierte 96-Well-Mikroplatten ausgesät und die Zellleistung wird vor dem Assay etwa 24 Stunden lang überwacht. Bei Neutralisationstests mit Antikörpern werden Viren mit einer festgelegten Multiplizität der Infektion (MOI) mit Antikörpern gemischt und 1 Stunde vor der Zugabe zu den Zellen voinkubiert. Im Gegensatz dazu werden bei der antiviralen Wirkstoff-Screening Viren mit fester MOI und Wirkstoffe gleichzeitig zu den Zellen gegeben. Virusinduzierte zytopathische Effekte (CPE) werden kontinuierlich mittels impedanzbasierter Detektion überwacht, und die Datenanalyse kann entweder während des Assays oder nach dessen Abschluss durchgeführt werden.

Tag 0: Hintergrund der Platte messen und permissive Zellen aussäen
1. Um ein Experiment zu beginnen, öffnen Sie die Instrumentensoftware (RTCA Pro) und wählen Sie die gewünschte Halterung für den Assay aus. Wählen Sie anschließend die Virologie Modul, bevor Sie das Experiment beginnen.
2. Geben Sie alle relevanten Notizen in die Exp. Hinweise Reiter (z. B., Experimentname, Geräte-SN, Gerätetypoder andere relevante Angaben). Diese Felder sind optional und können leer gelassen werden, wenn sie nicht zutreffen.
3. Wechseln Sie zu dem Layout Register und definieren Sie die für das Experiment verwendeten Wells. Falls bestimmte Wells nicht verwendet werden, wählen Sie die ungenutzten Wells aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste innerhalb der Plattenlayout-Oberfläche und wählen Sie Brunnen ausschalten aus dem Dropdown-Menü, um sie vom Assay auszuschließen.
4. Messung des Hintergrunds der mikroelektrodenintegrierten 96-Well-Mikroplatte
  1. Abgeben 50 µL des Assaymediums in jede Vertiefung der Platte unter Verwendung einer Mehrkanalpipette im Umkehrpipettiermodus, um die Bildung von Blasen zu minimieren.
    HINWEIS: Die Auswahl des Assay-Mediums sollte vor dem Screening optimiert werden, um Störungen der Assay-Empfindlichkeit zu minimieren und eine genaue Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung zu gewährleisten. Beispielsweise wurden Antikörperneutralisationsassays in DMEM mit 2 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin durchgeführt, während für das Screening antiviraler Substanzen das Zellkulturmedium DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin verwendet wurde.
  2. Platzieren Sie die Platte in die Halterung des Geräts, die sich innerhalb des Geräts befindet 37 °C Brutschrank mit 5 % CO₂₂Stellen Sie sicher, dass die Platte korrekt ausgerichtet ist, wobei die Vertiefung A1 gemäß der Angabe positioniert ist. Überprüfen Sie anschließend die Registerkarte „Message“ auf eventuelle Fehlermeldungen.
    HINWEIS: Jedes Mal, wenn die Platte in die Halterung eingelegt wird, überprüfen Sie, ob die Meldung „Platte gescannt. Verbindungen in Ordnung“ angezeigt wird. Tritt ein Fehler auf, nehmen Sie die Platte heraus und setzen Sie sie erneut in die Halterung ein.
  3. Wechseln Sie zu dem Zeitplan Tab; Schritt 1 wird standardmäßig angezeigt, da er für die Messung des Plattenhintergrunds erforderlich ist. Klicken Sie auf die Start Schaltfläche, um die Aufnahme aus den Vertiefungen zu starten. Der Schritt schließt automatisch ab, nachdem eine einzelne Hintergrundimpedanzmessung aufgezeichnet wurde.
    HINWEIS: Dieser Hintergrundschritt muss vor jedem Experiment durchgeführt werden. Alle in dem Experiment verwendeten Vertiefungen sollten nur Assay-Medium enthalten (d. h. vor der Zellseeding).
5. Permissive Zellseeding in die mikroelektrodenintegrierte 96-Well-Platte
  1. Die permissiven Zellen im T25-Fläschchen mit Trypsin behandeln, wie in der Sektion zum Passagieren permissiver Zellen beschrieben.
  2. Zählen Sie die in dem Testmedium resuspendierten Zellen und führen Sie die folgenden Berechnungen durch:
    1. Berechnen Sie die Gesamtanzahl an lebensfähigen Zellen in der Suspension mithilfe der Dichte an lebensfähigen Zellen: Gesamtanzahl an lebensfähigen Zellen = Dichte an lebensfähigen Zellen × Suspensionsvolumen
    2. Stellen Sie die Zellsuspension auf eine Enddichte ein (z. B. 0,30–0,35) × 10⁶ Zellen/mL für Vero CCL-81, was etwa 15.000–18.000 Zellen pro 50 µL, oder 0,12 × 10⁶ Zellen/mL für HEK293A, entsprechend 6.000 Zellen pro 50 µL).
      HINWEIS: Diese Ansiedlungsdichten wurden zuvor als optimal für jedes Virus-Zell-Modell bestimmt. Eine korrekte Zellansiedlungsdichte ist entscheidend, da die Verwendung zu vieler oder zu weniger Zellen die Empfindlichkeit des Assays beeinträchtigen könnte.
  3. Entfernen Sie die Mikroplatte mit 50 µL des Assaymediums vom Gerät und überführen Sie es in die Sicherheitswerkbank zur Zellseeding.
  4. Abgeben 50 µL der Zellsuspension unter Verwendung einer Mehrkanalpipette im Umkehrpipettiermodus in jedes Wells der Platte, um Blasenbildung zu minimieren, wodurch das Endvolumen jedes Wells auf 100 µL.
6. Nach der Zellzugabe die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur im BSC stehen lassen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf dem Boden jedes Wells zu ermöglichen.
7. Bringen Sie die Platte in die Halterung des Geräts zurück, die sich im Inneren befindet. 37 °C Brutschrank mit 5 % CO₂₂.
  HINWEIS: Werden mehrere Platten verwendet, kennzeichnen Sie jede Platte eindeutig und stellen Sie sicher, dass sie in dieselbe Halterung zurückgestellt wird, die während der Hintergrundmessung verwendet wurde.
8. Wechseln Sie zu dem Layout Tab und öffnen Sie die Zelle Unterregisterkarte. Wählen Sie die geeigneten Wells aus und geben Sie die permissiven Zellen ein Name und Anzahlund klicken Sie auf Anwenden um die Informationen zu speichern. Zellinformationen können jederzeit während des Experiments eingegeben oder aktualisiert werden.
9. Schritt 2 hinzufügen zum Zeitplan Register mit den Standardeinstellungen für die Aufzeichnung (100 Durchläufe und ein 15-Minuten-Intervall) verwenden und dann auf Start um eine kontinuierliche, nächtliche Überwachung der Zelladhäsion und -proliferation zu starten.
  HINWEIS: Dieser Schritt dient als Qualitätskontrolle (QC) der Zellen vor der Virusinokulation. Da der Cell-Index (CI) die Zelladhäsion und -proliferation widerspiegelt, werden die während der 18–24 Stunden nach der Aussaat gewonnenen CI-Werte als zentrale QC-Metrik verwendet. Eine reproduzierbare Zellreaktion über verschiedene Experimente hinweg ist entscheidend für eine optimale Reproduzierbarkeit des Assays. Sowohl die Amplitude als auch die kinetischen Profile des CI sind zelltypspezifisch. Beispielsweise weisen gesunde Vero CCL-81-Zellen, die mit 18.000 Zellen/Vertiefung ausgesät wurden, nach einer Übernachtkultur typischerweise einen Cell Index von 6–8 auf, während gesunde HEK293A-Zellen, die mit 6.000 Zellen/Vertiefung ausgesät wurden, in der Regel einen Cell Index von 0,8–1,2 aufweisen.
Tag 1: Impedanzbasiertes Screening von antiviralen Wirkstoffen
HINWEIS: Vor der Durchführung des Screening-Assays sollte das Virus angemessen titriert werden, um die optimale Arbeitsverdünnung zu bestimmen. Dieser Schritt dient der Ermittlung einer Virus-Konzentration, die eine robuste und reproduzierbare Assay-Leistung ermöglicht und gleichzeitig benutzerdefinierten Anforderungen gerecht wird, beispielsweise der gewünschten Assay-Dauer. Beispielsweise im Antikörperneutralisationsprotokoll¹¹, wurde für den Neutralisationstest eine Multiplikation der Infektion (MOI) von 0,01 gewählt, da sie innerhalb von 40 Stunden nach der Inokulation einen vollständigen (100 %) zytopathischen Effekt (CPE) erzeugte. Im impedanzbasierten Test wird vollständiger CPE durch eine Reduktion des Zellindex oder des normalisierten Zellindex auf null angezeigt. Bei der Screeninguntersuchung antiviraler Substanzen wurde eine MOI von 1 verwendet, wobei innerhalb von 70 Stunden nach der Inokulation ein 100 %iger CPE beobachtet wurde. Das Protokoll zur Virus-Titration folgte etablierten Verfahren, die in einer früheren Publikation beschrieben wurden.¹²Falls infektiöse Viren im Assay verwendet werden, müssen alle relevanten Sicherheitsvorkehrungen eingehalten werden. Verweisen Sie auf den Abschnitt zur Sicherheitsanleitung für den Umgang mit infektiösen Viren.
1. Bereiten Sie das Virus in der vorbestimmten Konzentration vor und stellen Sie serielle Verdünnungen des Antikörpers oder antiviralen Wirkstoffs im Assay-Medium her.
2. Für Neutralisationsassays mit monoklonalen Antikörpern mischen Sie 60 µL von Virus bei 4× die endgültige Testkonzentration mit 60 µL von Antikörpern bei 4× die endgültige Testkonzentration und inkubieren bei 37 °C für 1 h vor der Zugabe zu den permissiven Zellen. Nach dem Mischen liegen das Virus und der Antikörper bei 2 vor× ihre endgültigen Testkonzentrationen. Im Gegensatz dazu ist für Antiviralscreening-Assays keine Vorinkubation von Virus und Verbindung erforderlich.
3. Wechseln Sie zu dem Layout Registerkarte und wählen Sie die Behandlung Reiter, um Behandlungsinformationen zu antiviralen Wirkstoffen in die entsprechenden Wells einzugeben.
4. Wählen Sie die Wells für die gleiche Behandlung aus und geben Sie dann die Name der Wirkstoffe und geben Sie den Startpunkt ein Verdünnung oder Konzentration. Zum Beispiel, wenn die Ausgangskonzentration ist 10 µg/mL, eingeben 10 und auswählen µg/mL als das „Einheit„. Eingabe 3 als das Verdünnungsfaktor und geben Sie die Richtung der Verdünnung (z. B. von Oben nach Unten).
  HINWEIS: Nach dem Anklicken von Anwenden, werden die Konzentrationen oder Verdünnungen der antiviralen Wirkstoffe automatisch anhand der eingegebenen Plattenlayout-Informationen berechnet, gespeichert und in den entsprechenden Wells angezeigt. Die berechneten Werte werden ebenfalls für die nachfolgende Datenanalyse abgespeichert. Eingabe von Virusinformationen (z. B. Name und Verdünnungist optional, da der Assay einen einzigen festen MOI für alle mit Virus behandelten Vertiefungen verwendet.
5. Weisen Sie die nur mit Virus behandelten Vertiefungen als positive Kontrollen zu, indem Sie die entsprechenden Vertiefungen auswählen und auswählen Positivkontrolle unter Muldenart.
6. Weisen Sie nicht infizierte Wells als negative Kontrollen zu, indem Sie den oben beschriebenen Schritt befolgen und überprüfen Negativer Kontrollansatz unter Muldenart.
  HINWEIS: Korrekte Zuordnung der nur mit Virus behandelten und der nicht infizierten Wells als Positivkontrolle und Negativer Kontrollansatzbzw. unter Verwendung des Muldenart die Einstellung ist entscheidend, da die CI-Werte dieser Wells für alle berechnungen zur Neutralisierung verwendet werden (z. B. %Neutralisierung). Für berechnungen bezüglich des ZPE (z. B. %ZPE) sind ausdrücklich festgelegte negative Kontrollwells erforderlich. Bei Antikörperneutralisationstests wird dringend empfohlen, sowohl positive als auch negative Kontrollantikörper auf derselben Platte mitzuführen, um eine korrekte datenbasierte interpretation zu gewährleisten. Diese Kontrollantikörper sollten jedoch als Proben unter Muldenart.
7. Wenn der Test bereit für die Zugabe des antiviralen Wirkstoffs ist, drücken Sie die Aktuellen Schritt abbrechen Schaltfläche, um die verbleibenden Messungen in Schritt 2 zu überspringen und zum nächsten Schritt fortzufahren.
8. Klicken Sie auf die Platte entsperren Schaltfläche, dann nehmen Sie die Platte aus der Halterung und stellen Sie sie in den Sicherheitswerkbank (BSC).
9. Vorsichtig dispensieren 100 µL der Virus-Antikörper-Mischung oder Virus-Antiviralum-Mischung in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, wodurch ein endgültiges Brunnenvolumen von 200 µL. Der Inokulum enthält Virus und Antikörper oder antivirale Substanz in einer Konzentration von 2× ihre endgültigen Testkonzentrationen, die durch Zugabe zu den Zellen auf die endgültigen Arbeitskonzentrationen verdünnt werden.
10. Nachdem die Platte in die Halterung zurückgebracht wurde, navigieren Sie zu der Zeitplan Registerkarte und Schritt 3 hinzufügen. Geben Sie die Anzahl der Aufnahmen und das Intervalll zwischen den Durchläufen. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtdauer eines Durchlaufs (Anzahl der Durchläufe × Intervall) die erwartete Behandlungsdauer überschreitet. Klicken Sie auf Start um die Datenaufnahme fortzusetzen und den Assay weiterzuführen.
  HINWEIS: Die Festlegung eines separaten Arbeitsschritts (z. B. Schritt 3) nach der Zugabe des antiviralen Wirkstoffs erleichtert die eindeutige Identifizierung der Überwachungsphase nach der Behandlung. Programmieren Sie jeden Schritt (mit Ausnahme von Schritt 1) stets so, dass er länger läuft als die erwartete Dauer des Assays. Sobald die programmierte Laufzeit erreicht ist, stellt das Gerät die Aufnahme von Messwerten ein, was zum Ausfall von Messzeitpunkten führt.
Tag 1 und danach: Datenanalyse
1. Um die Echtzeitaufzeichnung und/oder Analyse zellulärer Reaktionen während der Datenaufnahme zu überprüfen, navigieren Sie zu Datenanalyse Registerkarte aus, wählen Sie einen bestimmten Zeitpunkt oder ein Zeitintervall aus und fügen Sie anschließend die Vertiefungen hinzu, die in die Analyse einbezogen und im Diagramm dargestellt werden sollen.
2. Wählen Sie Parameter aus der Y-Achse Dropdown-Menü. Wenn Normalisierter Zellindex (NCI) ausgewählt ist, geben Sie das an Normalisierungszeit, den Zeitpunkt unmittelbar vor der Behandlung, aus der Dropdown-Liste Zeitpunkt aus. %CPE oder %Neutralisierung kann auch ausgewählt werden, indem die entsprechende Option im Dropdown-Menü der Y-Achse gewählt wird.
  HINWEIS: Das Gerät verwendet einen dimensionslosen Parameter, den Zellindex (Cell Index, CI), zur Darstellung der Impedanz. Zur Beurteilung von Behandlungsunterschieden unter Minimierung der inhärenten Variation von Brunnen zu Brunnen wird der normalisierte Zellindex (Normalized Cell Index, NCI) empfohlen.
3. Wechseln Sie zu dem Parameter Abschnitt über die Datenanalyse zur Berechnung und Erstellung verschiedener Arten von Abbildungen, wie beispielsweise Balkendiagrammen und Dosis-Wirkungs-Kurven mittels vierparametrischer logistischer (4PL, variabler Slope) Regressionsanalyse zu einem bestimmten Zeitpunkt (z. B. zum Halbzeit- oder Endpunkt des Assays). Alternativ die IC₅₀ abgeleitet von der Fläche unter der Kurve (AUC) des Cell Index oder des normalisierten Cell Index nach der Behandlung liefert ein Maß für die gesamte Dosis-Wirkungs-Beziehung von antiviralen Wirkstoffen über den gesamten Behandlungszeitraum.
4. Am Ende des Tests klicken Sie auf Pausieren, dann drücken Sie die Platte entsperren Taste. Entfernen Sie die Platte aus der Halterung und elektronisch Freisetzung es über der Platte Menü.

3. Sicherheitshinweise für den Umgang mit infektiösen Viren

Tragen Sie die richtige PSA mit doppelter Handschuhtragung, Gesichtsschutz und Laborkittel. Dies wird dringend empfohlen beim Umgang mit Viren.
Handhaben Sie virushaltige Materialien und geben Sie diese ausschließlich innerhalb eines funktionierenden Sicherheitswerksbank (BSC) in Platten.
Transportieren Sie Virusgefäße und alle Platten, die Viren enthalten, zum und vom BSC stets in einem verschlossenen Biosicherheitsbehälter.
Sprühen Sie vor und nach der Handhabung virushaltiger Materialien im BSC alle Innenflächen gründlich mit einem Desinfektionsmittel ein und lassen Sie dieses 5 Minuten einwirken, um eine vollständige Virusinaktivierung sicherzustellen. Wischen Sie die Flächen danach sauber und desinfizieren Sie sie anschließend mit 70 %igem Ethanol, um eventuelle Desinfektionsmittelrückstände zu entfernen.
Nach Abschluss des impedanzbasierten antiviralen Screening-Assays nehmen Sie alle Platten vom Gerät und transportieren Sie diese in einem verschlossenen Biosicherheitsbehälter direkt in eine saubere Sicherheitswerksbank (BSC).
Bereiten Sie eine frische 20 %ige Bleichmittel-Lösung vor und geben Sie diese in jedes Loch der Assay-Platten. Lassen Sie das Bleichmittel 10 Minuten einwirken, bevor Sie es aus allen Löchern absaugen und die Platten entsorgen.
Entkontaminieren Sie alle Assay-Platten, serologischen Pipetten, Pipettenspitzen, Röhrchen und anderen Einwegkunststoffe, die möglicherweise mit dem Virus in Kontakt gekommen sind, mit Bleichmittel und entsorgen Sie sie in dafür vorgesehene Bioabfallbeutel.
Sprühen Sie nicht-entsorgbare Kunststoffgegenstände wie Röhrchenhalter und Pipetten mit einem Desinfektionsmittel ein und wischen Sie sie ab.

Ergebnisse

Markierungsfreie, echtzeitige Impedanzmessung zeigt virusinduzierte zytopathische Effekte und antivirale Schutzwirkung
Wie in Abbildung 2A dargestellt, wurden HEK293A-Wirtszellen in eine mikroelektrodenintegrierte 96-Well-Platte mit einer Dichte von 6.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät¹³. Nach einer 24-stündigen Inkubation wurde Adenovirus Typ 5 bei einem MOI von 1 in An- oder Abwesenheit von antiviralen Substanzen zugegeben. Die zellulären Reaktionen auf die Virusinfektion und die antivirale Behandlung wurden kontinuierlich mittels echtzeitiger, markierungsfreier Impedanzmessungen überwacht. In Abwesenheit des Virus proliferierten die Zellen während des gesamten 80-stündigen Beobachtungszeitraums kontinuierlich und erreichten die Konfluenz, was durch einen stetigen Anstieg der Impedanz gefolgt von einer Plateaubildung angezeigt wurde. Die Infektion mit Adenovirus erlaubte zunächst ein Zellwachstum von etwa 20 Stunden, danach wurde ein ausgeprägter zytopathischer Effekt (CPE) beobachtet, der bis etwa 65 Stunden postinfektion zu einem raschen Abfall des Impedanzsignals auf den Ausgangswert führte. Die Behandlung mit Stavudin (50 µM) oder Ribavirin (20 µM) hatte nur einen geringen Einfluss auf den virusinduzierten CPE, wobei die Impedanzkurven denen der ausschließlich virusinfizierten Zellen stark ähnelten. Ganciclovir (50 µM) zeigte eine moderate antivirale Wirkung, erkennbar an einer teilweisen Wiederherstellung des normalisierten Zellindex. Im Gegensatz dazu dämpften Cidofovir (50 µM) und Brincidofovir (1 µM) den CPE deutlich und führten zu Impedanzprofilen, die denen der nicht infizierten Negativkontrollzellen ähnelten. Bemerkenswerterweise beeinflusste keine der Substanzen in vorläufigen Studien die Zellindexwerte im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten Kontrollen bei den getesteten Konzentrationen signifikant (Daten nicht gezeigt).

In einem impedanzbasierten Antikörperneutralisationstest wurden Vero CCL-81-Zellen mit einer Dichte von 18.000 Zellen pro Vertiefung in einer mikroelektrodenintegrierten 96-Loch-Platte ausgesät und vor der Infektion 24 Stunden kultiviert. Am Tag des Tests wurden monoklonale Antikörper vor der Zugabe zu den Zellen 1 Stunde lang mit rVSV–LASV bei einem MOI von 0,01 voinkubiert. Es wurden unterschiedliche Neutralisationsprofile für die getesteten monoklonalen Antikörper (mAKs) beobachtet. Der Übersichtlichkeit halber zeigt Abbildung 2B repräsentative Ergebnisse von Antikörpern mit starker, teilweiser oder keiner Neutralisationsaktivität. Nicht-neutralisierende Antikörper induzierten einen vollständigen zytopathischen Effekt (CPE), wobei die Impedanzkurven mit denen der Virus-allein-Kontrollen übereinstimmten. Antikörper mit intermediärer neutralisierender Aktivität reduzierten die virusinduzierte Zytotoxizität teilweise, was zu einem verminderten, aber nachweisbaren CPE führte. Im Gegensatz dazu inhibierten vollständig neutralisierende Antikörper den CPE vollständig und hielten Impedanzsignale aufrecht, die mit denen unbehandelter Zellkontrollen vergleichbar waren. Insgesamt ermöglichten diese Impedanzprofile eine klare Unterscheidung zwischen nicht-neutralisierenden, teilweise neutralisierenden und vollständig neutralisierenden monoklonalen Antikörpern.

Quantifizierung und Charakterisierung der antiviralen Aktivität
Nachdem die Fähigkeit des impedanzbasierten RTCA-Assays gezeigt wurde, „Hits“ aus einer Bibliothek von Wirkstoffen und monoklonalen Antikörpern (mAK) zu identifizieren, zielte die Studie darauf ab, die Wirksamkeit der führenden Verbindungen und Antikörper zu charakterisieren. Eine schrittweise Erhöhung der Konzentration des antiviralen Wirkstoffs Brincidofovir von 15,6 nM auf 1.000 nM führt zu einer stufenweisen Zunahme des Impedanzsignals; je höher die Wirkstoffkonzentration, desto stärker verhalten sich die Zellen wie die nicht infizierte Kontrolle (Abbildung 3A). Außerdem führte die Behandlung mit Brincidofovir allein nur bei der höchsten getesteten Konzentration (1100 nM) zu einer geringfügigen Erhöhung des NCI. Bei Konzentrationen unterhalb von 1100 nM nahm der NCI jedoch moderat ab, wobei der Effekt nicht dosisabhängig war. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Wiederherstellung des Zellindex ausschließlich auf der antiviralen Wirkung des Wirkstoffs beruhte und nicht auf einer direkten Steigerung der Zellproliferation oder -adhärenz (Abbildung 3B). Die Darstellung der Fläche unterhalb des normalisierten Zellindex (AUC) in Abhängigkeit von der Brincidofovir-Konzentration ergibt die Dosis-Wirkungs-Kurve, die eine hervorragende Anpassung liefert (R² von 0,99) und einen IC₅₀-Wert von 265 nM anzeigt (Abbildung 3C). Im Antikörperneutralisationsassay berechnete die Systemsoftware am Ende des Assays (ca. 50 h nach Behandlung) automatisch die Neutralisierungsprozente für jede mAK-Konzentration, woraus anschließend die IC₅₀-Werte abgeleitet wurden. Wie in Abbildung 3D dargestellt, zeigten im Gegensatz zum negativen Kontrollantikörper rANDV-5 die anderen drei mAK, r37.2D, r25.1C und r12.1F, eine hohe antivirale Potenz mit IC₅₀-Werten von jeweils 4.315 ng/mL, 83 ng/mL oder 232 ng/mL¹⁴^,¹⁵.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs für den impedanzbasierten antiviralen Screening-Test. Tag 0, Schritt 1: Permissiven Zellen wurden in Mikroplatten ausgesät, und das Zellwachstum wurde in der Gerätehalterung innerhalb eines 37 °C warmen Inkubators mit 5 % CO₂ für etwa 24 Stunden kontinuierlich überwacht. Tag 1, Schritt 2: Das Virus wurde bei einer festgelegten MOI sowie in seriellen Verdünnungen antiviraler Wirkstoffe vorbereitet. Bei Antikörperneutralisationstests wurde das Virus vor der Zugabe zum Zellkulturmedium für 1 Stunde bei 37 °C mit Antikörpern voinkubiert. Schritt 3: Die Virus-Antivirumittel-Gemische wurden den Zellen zugegeben. Ab Tag 1 und danach, Schritt 4: Der virusinduzierte zytopathische Effekt (CPE) wurde über mehrere Tage hinweg kontinuierlich mittels impedanzbasierter Messungen überwacht. Schritt 5: Die Daten wurden entweder in Echtzeit oder nach Abschluss des Tests ausgewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Echtzeitüberwachung der antiviralen Aktivität mittels impedanzbasierter Cell-Index-Messungen. (A) Bewertung der antiviralen Wirkstoff-Screening mittels Impedanzanalyse. Alle Verbindungen wurden bei 50 µM getestet, mit Ausnahme von Ribavirin (20 µM) und Brincidofovir (1 µM) in Gegenwart von Adenovirus Typ 5 bei einem MOI von 1. Die Daten sind als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen Ansätzen dargestellt. Die Abbildung ist angelehnt an Zhang et al.¹³. (B) Impedanzbasierte Neutralisationsprüfung für monoklonale Antikörper. Typische Cell-Index-Profile sind dargestellt für monoklonale Antikörper mit keiner Neutralisation (vollständige CPE, rot), teilweiser Neutralisation (teilweise CPE, orange) oder starker Neutralisation (keine nachweisbare CPE, schwarz). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Quantifizierung der antiviralen Aktivität mittels Impedanz. (A) Dynamische Veränderungen des Echtzeit-normalisierten Zellindex nach Behandlung mit steigenden Konzentrationen von Brincidofovir in Kombination mit einer Infektion durch Adenovirus Typ 5 bei einem MOI von 1. (B) Dynamische Veränderungen des Echtzeit-normalisierten Zellindex nach Behandlung mit steigenden Konzentrationen von Brincidofovir allein. (C) Die Fläche unter den Impedanzkurven wurde als Funktion von Brincidofovir aufgetragen, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erhalten. (A) und (C) wurden aus Zhang et al.¹³ adaptiert. (D) Repräsentative Neutralisationskurven für den rekombinanten VSV–LASV-Linie IV (Josiah) für die monoklonalen Antikörper r37.2D, r25.1C, r12.1F und rANDV-5, wobei letzterer als negativer Kontrollantikörper dient. Die monoklonalen Antikörper 37.2D, 25.1C, 12.1F und ANDV-5 wurden rekombinant basierend auf bestehender Literatur hergestellt (siehe Abschnitt Ergebnisse). Die dargestellten Daten zeigen repräsentative Kurven aus zwei unabhängigen Experimenten und sind als Mittelwert ± SD aus drei technischen Wiederholungen angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Wie alle zellbasierten Assays erfordert der RTCA-Antiviren-Screening-Assay eine Optimierung für jedes Virus-Zell-System. Da der Assay virusinduzierte zytopathische Effekte (CPE) über Impedanzänderungen detektiert, ist er abhängig von einem permissiven Zellmodell, das virale Replikation und messbare CPE unterstützt. Viren, die keine impedanzdetektierbaren CPE hervorrufen, eignen sich möglicherweise nicht für diesen Ansatz; in solchen Fällen können alternative Methoden wie die FRNT verwendet werden, sofern virus-spezifische Antikörper verfügbar sind. Eine weitere wichtige Überlegung ist, dass Veränderungen des Zellindex nicht ausschließlich durch virusinduzierte Zytolyse verursacht werden. Änderungen in Zellmorphologie, Adhäsion, Proliferation und Anheftung können ebenfalls die Impedanzsignale beeinflussen und die Beurteilung antiviraler Aktivität möglicherweise verfälschen. Daher sollten die Wirkungen antiviraler Wirkstoffe auf den Zellindex in Vorstudien oder mithilfe geeigneter Wirkstoff-kontrollierter Ansätze evaluiert werden. In der vorliegenden Studie wurden, um die Anzahl der pro Platte getesteten Wirkstoffe zu maximieren, Kontrollen mit antiviralen Wirkstoffen allein vor dem Screening-Assay durchgeführt, um die Baseline-Effekte jedes Kandidaten in Abwesenheit einer Virusinfektion zu ermitteln. Die Assay-Leistung wird außerdem durch Faktoren wie Zellansaatdichte, Zeitpunkt der Virusinokulation und Mediumbedingungen beeinflusst, die das Zellwachstum, die virale Replikation, die Entwicklung von CPE sowie die Reproduzierbarkeit des Assays beeinträchtigen können⁷^,¹⁰^,¹⁶. Daher ist eine systematische Optimierung für eine robuste und zuverlässige, auf RTCA basierende antivirale Screening-Methode unerlässlich.

Nachdem die optimalen Testbedingungen festgelegt wurden, erfordert die erfolgreiche Durchführung impedanzbasierter Echtzeit-Antivirenassays eine gleichmäßige Zellaussaat, gesunde Zellen und stabile Testbedingungen. Eine hohe Variabilität von Brunnen zu Brunnen wird häufig durch eine ungleichmäßige Zellverteilung oder ungenaues Pipettieren verursacht; daher sollten Zellsuspensionen vor der Aussaat gründlich gemischt werden, und die Platten nach der Aussaat 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen werden, um eine einheitliche Zellansiedlung zu fördern und Randeffekte zu verringern. Mindestens drei Wiederholungen pro Behandlungsgruppe werden empfohlen, während zusätzliche Wiederholungen für negative (nicht infizierte) und positive (nur Virus) Kontrollen dringend empfohlen werden, da diese Werte als Referenzpunkte für die Berechnungen von %ZPE und %Neutralisation über alle Behandlungsbedingungen hinweg dienen. Falls die virusinduzierte ZPE schwach oder inkonsistent ist, sollte die Qualität des Virusstamms und der Zustand der permissiven Zelllinie überprüft werden. Um die Virusinfektiosität zu erhalten, sollten wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen vermieden werden, indem für jedes Experiment eimalig verwendbare Virusaliquote hergestellt werden. Schließlich wird dringend die Verwendung einer Zellbank empfohlen, die permissive Zellen bei einer konstanten Passagezahl enthält, um die experimentelle Variabilität zu minimieren und die Reproduzierbarkeit des Assays zu verbessern. Falls der Zellindex, der unmittelbar vor der Infektion gemessen wird (typischerweise etwa 24 h nach der Aussaat), unterhalb des etablierten Referenzwerts für die permissive Zelllinie liegt und somit auf eine suboptimale Zellgesundheit oder -vermehrung hindeutet, sollte das Experiment abgebrochen werden. In solchen Fällen sollte ein neues Gefäß mit kryokonservierten Zellen aufgetaut und der antivirale Screening-Assay wiederholt werden.

Wenn der antivirale Screening-Test unter gut kontrollierten, optimierten Bedingungen durchgeführt wird, wie durch die hier präsentierten Screening-Daten belegt, kann der impedanzbasierte Test die Echtzeit-Reduktion des zytopathischen Effekts (CPE) durch antivirale Wirkstoffe genau quantifizieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Ansätzen, die auf arbeitsintensiven Endpunkt-Messungen beruhen, ermöglicht die kontinuierliche und nichtinvasive Impedanzmessung eine longitudinale Überwachung des gesamten Spektrums virusinduzierter zellulärer Schäden sowie der kinetischen Profile antiviraler Reaktionen. Diese Fähigkeit zur Echtzeit-Messung erleichtert die Identifizierung optimaler zeitlicher Fenster zur Detektion nicht nur früh einsetzender, sondern auch verzögerter antiviraler Effekte, die von konventionellen Endpunkt-Assays möglicherweise übersehen werden.

Darüber hinaus bietet das hier beschriebene RTCA-Protokoll im Vergleich zu herkömmlichen Methoden einen schnelleren und erheblich vereinfachten Arbeitsablauf für die antivirale Wirkstoffprüfung. Der Test erfordert lediglich einen initialen Zellansaat, gefolgt von der Zugabe von Virus in Gegenwart oder Abwesenheit antiviraler Wirkstoffe. Weitere Handgriffe oder Nachbearbeitungsschritte nach dem Test sind nicht erforderlich. Die Versuchsdurchführung und Datenanalyse werden zusätzlich durch das speziell angepasste Virologie-Softwaremodul des Systems vereinfacht, das die automatische Berechnung von in der VRNT üblicherweise verwendeten Parametern ermöglicht, darunter %CPE, %Neutralisierung sowie die höchste Verdünnung oder niedrigste Konzentration eines antiviralen Wirkstoffs, die einen vom Anwender definierten Neutralisierungsgrad erreicht. Insgesamt ermöglichen diese Vorteile eine schnelle und parallele Prüfung einer deutlich größeren Anzahl von Testbedingungen (Wirkstoffvergleiche, erweiterte Verdünnungsreihen usw.) als mit herkömmlichen Methoden üblicherweise möglich ist.

Obwohl der hier beschriebene Test in einem 96-Loch-Plattenformat entwickelt wurde, kann er unter den oben beschriebenen geeigneten Testbedingungen an ein 384-Loch-Plattenformat angepasst werden. Zur Unterstützung dieses hochdurchsatzfähigen, impedanzbasierten Tests kann ein automatisiertes impedanzbasiertes RTCA-System eingesetzt werden, das die gleichzeitige Bearbeitung von bis zu vier 384-Loch-Platten ermöglicht.

Neben der antiviralen Wirkstoffprüfung kann diese RTCA-Methode auch auf Kombinationstherapiestudien, Serologie und Untersuchungen zur viralen Immunflucht angewendet werden. Durch die Messung der Fähigkeit therapeutischer Antikörper oder immunologischer Seren, virusinduzierte zytopathische Effekte (CPE) zu verhindern, ermöglicht der Test eine markerfreie, Echtzeit-Bewertung der neutralisierenden Aktivität und schützenden Immunantworten nach Infektion oder Impfung. Außerdem können durch den Vergleich der Neutralisierungsprofile verschiedener Virusvarianten Veränderungen der Anfälligkeit im Zusammenhang mit Immunflucht aufgezeigt werden. In Kombination mit der genomischen Sequenzierung kann dieser Ansatz die Identifizierung von antikörperresistenten Varianten erleichtern und die Entwicklung von Impfstoffen, Antikörpertherapeutika und antiviralen Strategien der nächsten Generation unterstützen.

Offenlegungen

J.E.C. hat Beratungstätigkeiten für Moderna und Merck durchgeführt, ist Gründer von IDBiologics und erhält Lizenzgebühren von UpToDate. Das Labor von J.E.C. erhielt während der Durchführung der Studie unabhängige Forschungsvereinbarungen von IDBiologics.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse U19 AI181979 und U19AI181930 des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der US National Institutes of Health unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Adenovirus-GFP	Vector Biolabs	1060
Brincidofovir (CMX001)	AdooQ	A13326
CaviCide	Metrex	13-5024	Desinfektionsmittel
Cidofovir	Selleck	S1516
Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
E-Plate 96	Agilent	5232368001	96-Well-Platte mit integrierten Mikroelektroden
Fetales Rinderserum	Avantor	97068-085
Ganciclovir-Natrium	Selleck	S5065
HEK293A-Zelle	Thermo Fisher Scientific	R70507
Mehrfachkanal-Viaflo	INTEGRA	VIAFLO 96
Penicillin-Streptomycin-Lösung	Gibco	10378016
Phosphatpufferlösung (1x)	HyClone	SH30256.01
Rekombinante mAK	Crowe-Labor	N/V
Ribavirin	Selleck	S2504
rVSV-LASV (Lin IV)	Crowe-Labor	N/V
Stavudin	Selleck	S1398
0,25 % Trypsin, 0,53 mM EDTA (1x)	ATCC	30-2101
12-Kanal-Reagenzreservoirs	VistaLab Technologies	3054-1011
Vero CCL-81	ATCC	CCL-81
Virologiemodul	Agilent	S2807-90089
xCELLigence RTCA MP-System	Agilent	380601040

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

impedanzbasiertes Screening zytopathische Effekte Echtzeit berwachung Zellkultur Monolayer Virusinfektions Assay Hochdurchsatz Screening antivirale Wirksamkeit monoklonale Antik rper Zellviabilit t