Diese Studie legt nahe, dass Dimethylsulfoxid (DMSO) die silikainduzierte pulmonale Entzündung und Fibrose bei Mäusen lindern könnte. Transkriptomische und experimentelle Analysen deuten darauf hin, dass die schützenden Wirkungen eine Hemmung des IL-6/STAT3-Signalwegs und eine Herabregulation der MMP12-Expression beinhalten könnten, was potenzielle therapeutische Erkenntnisse für die Behandlung der Silikose liefert.
Schnellbericht
Potenzielle Beteiligung der IL-6/STAT3/MMP12-Signalkaskade an DMSO-vermittelten antifibrotischen Effekten bei experimenteller Silikose
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diese Studie zielt darauf ab, die entzündungshemmenden und antifibrotischen Wirkungen von Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Mausmodell der Silikose zu untersuchen, um damit seinen potenziellen therapeutischen Wert zu erforschen.
Ein Mausmodell der Silikose wurde durch intranasale Applikation etabliert, und die DMSO-Behandlung erfolgte mittels intraperitonealer Injektion. Das Experiment wurde über einen Zeitraum von 1 Monat durchgeführt. Lungenproben wurden von allen Mäusen gewonnen; ein Teil davon wurde einer transkriptomischen Analyse unterzogen, und differentiell exprimierte Gene wurden mit dem limma-Paket identifiziert. Genontologie (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen wurden mit ClusterProfiler durchgeführt, um Genfunktionen und assoziierte Signalwege zu untersuchen. Die verbleibenden Proben wurden einer histopathologischen Beurteilung mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) und Masson-Trichrom-Färbung unterzogen, während eine Western-Blot-Analyse zur Validierung der transkriptomischen Ergebnisse durchgeführt wurde.
Diese Studie legt nahe, dass DMSO den fibrotischen Prozess bei Silikose durch Modulation der IL-6/STAT3-MMP12-Signalachse lindern könnte. Im silikainduzierten Mausmodell der Silikose milderte DMSO das krankheitsassoziierte Gewichtsverlust ab und verringerte die Kollagenablagerung. Die transkriptomische Analyse zeigte, dass DMSO die Aktivität mehrerer fibrosebezogener Signalwege unterdrückte, und identifizierte 51 Schlüsselgene, darunter MMP12, das signifikant herunterreguliert war. Die Western-Blot-Analyse bestätigte zudem eine verminderte MMP12-Expression, begleitet von deutlich reduzierten Spiegeln von IL-6 und p-STAT3, was darauf hindeutet, dass der IL-6/STAT3-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der MMP12-Expression spielen könnte.
DMSO kann entzündliche Reaktionen und pulmonale Fibrose bei der Silikose abschwächen, indem es die Aktivierung des IL-6/STAT3-Signalwegs hemmt und dadurch die Expression von MMP12 verringert.
Einleitung
Silikose ist eine der Hauptformen der berufsbedingten Pneumokoniose1, gekennzeichnet durch eine anhaltende pulmonale Entzündung und irreversible pulmonale Fibrose infolge einer langfristigen Exposition gegenüber Siliciumdioxid-Staub2,3. Die Pathogenese dieser Silikose ist äußerst komplex. Obwohl frühere Studien gezeigt haben, dass eine fehlerhafte Makrophagenaktivierung4, eine übermäßige Proliferation von Fibroblasten, der epithelial-mesenchymale Übergang sowie eine abnormale Ablagerung von Bestandteilen der extrazellulären Matrix (ECM) sind entscheidende Faktoren für die Entstehung von Fibrosen5,6Die zentralen molekularen Mechanismen, die dem entzündlich-fibrotischen Teufelskreis zugrunde liegen, sind noch nicht vollständig verstanden. Insbesondere die Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Umbildung der extrazellulären Matrix (ECM) und beim Fortschreiten der pathologischen Fibrose.7Unter diesen spielt die Matrix-Metalloprotease 12 (MMP12), die spezifisch von Makrophagen sezerniert wird, eine wichtige Rolle. Sie degradiert wichtige Bestandteile der extrazellulären Matrix wie Elastin, Fibronectin und Kollagen Typ IV und ist an der Pathogenese fibrotischer Erkrankungen, darunter der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung, beteiligt.8. Neuere Studien legen zudem nahe, dass von Makrophagen stammendes MMP12 die Fibrose durch Schädigung endothelialer Zellen im Verlauf der pulmonalen Fibrose weiter fördern könnte9.
Dimethylsulfoxid (DMSO), eine niedermolekulare Verbindung mit vielfältigen biologischen Aktivitäten10, hat bei mehreren entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Zystitis, entzündungshemmende Wirkungen gezeigt und ist von der amerikanischen Arzneimittelbehörde FDA zur Behandlung der interstitiellen Zystitis zugelassen11. Neuere Studien deuten darauf hin, dass DMSO die Progression der Fibrose in gewissem Maße verlangsamen kann, indem es die Freisetzung entzündungsfördernder Faktoren hemmt und die oxidativen Stressreaktionen reduziert12. Untersuchungen von Ingrid Elisia et al. berichteten, dass DMSO spezifisch die Aktivierung der ERK1/2-, p38-MAPK-, JNK- und PI3K/Akt-Signalwege in humanen Monozyten in Ganzblutmodellen hemmt und dadurch seine entzündungshemmende Wirkung entfaltet13.
Obwohl gezeigt wurde, dass die MMP-Familie eine entscheidende Rolle beim Fibroseprozess der Silikose spielt, haben keine Studien eindeutig nachgewiesen, ob DMSO den pathologischen Fortschritt der Silikose durch die Regulation der MMP-Expression beeinflussen kann. Daher stellt diese Studie die Untersuchung der entzündungshemmenden und antifibrotischen Wirkungen von DMSO in einem Mausmodell der Silikose dar, mit dem Ziel, das zentrale regulatorische Gen-Netzwerk und den molekularen Wirkmechanismus der DMSO-Intervention aufzuklären und theoretische Grundlagen für innovative, auf MMP basierende Behandlungsstrategien bereitzustellen.
Protokoll
Alle Tierversuche, die in dieser Studie durchgeführt wurden, wurden vom Ethikkomitee für Wissenschaft und Technologie der Universität für Wissenschaft und Technologie von Anhui (Genehmigungsnummer GZ2025-048) genehmigt und hielten strikt die chinesischen nationalen Standards für das Wohlergehen von Labortieren (GB/T 35892-2018) ein. Abbildung 1 zeigt den Studienaufbau.
Zubereitung der Lösungen
Herstellung der Kieselsäuresuspension:
Kristallines Siliziumdioxid (SiO₂, 80 %, Teilchengröße 1–5 µm) wurde durch Autoklavieren sterilisiert. Das sterile Siliziumdioxidpulver wurde anschließend in steriler Kochsalzlösung dispergiert, um eine Endkonzentration von 10 mg/mL zu erhalten, und die Suspension wurde unmittelbar vor der Applikation mit einem Ultraschallhomogenisator gründlich homogenisiert, um eine gleichmäßige Partikelsuspension sicherzustellen.
Herstellung der DMSO-Lösung:
Unter aseptischen Bedingungen wurde DMSO (≥99,9 %) mit steriler physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um eine etwa 10 %ige (V/V) DMSO-Lösung herzustellen, die durch Ultraschallbehandlung homogenisiert wurde. Jede Maus erhielt die DMSO-Lösung in einer Dosis von 0,9 g/kg, wie zuvor beschrieben14,15.
Experimentelle Tiere
Zweiunddreißig gesunde männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 8–12 Wochen wurden in dieser Studie verwendet und vor der Experimentierung eine Woche lang akklimatisiert. Die Mäuse wurden mithilfe einer computergenerierten Randomisierungsmethode zufällig vier Versuchsgruppen zugeordnet (n = 8 pro Gruppe): Kontrollgruppe, DMSO-Gruppe, Silica-Gruppe und Silica+DMSO-Gruppe. Die Stichprobengröße wurde basierend auf früheren Studien mit dem gleichen murinen Silikosemodell sowie auf unseren vorläufigen experimentellen Erfahrungen festgelegt, die zeigten, dass acht Tiere pro Gruppe ausreichten, um histopathologische und molekulare Unterschiede zwischen den Gruppen nachzuweisen. Die Tiere wurden unter standardisierten Laborbedingungen mit kontrollierter Temperatur, einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Wechsel und freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Humane Endpunkte wurden vor Studienbeginn festgelegt, und kein Tier erfüllte die vorab definierten Kriterien für eine vorzeitige Euthanasie.
Herstellung des Silikose-Modells und pharmakologische Intervention
Die Silikose wurde durch eine einzige intranasale Applikation von 60 µL steriler kristalliner Kieselsäuresuspension (10 mg/mL) induziert. Nach Einleitung der Anästhesie wurden die Mäuse in Rückenlage gebracht. Sobald tiefes und langsames Atmen beobachtet wurde, wurden 60 µL der Kieselsäuresuspension tropfenweise vorsichtig in die Nasenlöcher appliziert, sodass die Suspension spontan in die Lungen eingeatmet werden konnte16. Mäuse der DMSO-Applikationsgruppe erhielten zweimal wöchentlich mit einem Abstand von 3–4 Tagen intraperitoneale Injektionen einer DMSO-Lösung mit fester Dosis über einen aufeinanderfolgenden Monat. Die Mäuse der verbleibenden Gruppen wurden identisch behandelt, jedoch mit einem gleichen Volumen steriler Kochsalzlösung. Während des gesamten Experiments erfolgte eine tägliche Überwachung des Körpergewichts. Am 30. Tag nach der Modellierung wurden alle Mäuse getötet und die Lungengewebe unter sterilen Bedingungen entnommen. Die Tötung erfolgte durch Halswirbelbruch nach intraperitonealer Verabreichung von Tribromeethanol (0,2 mL/10 g) zur Einleitung der Anästhesie. Teil der Lungengewebe wurde zur Transkriptomsequenzierung in flüssigem Stickstoff konserviert. Ein Teil des Gewebes wurde 48 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, bevor eine pathologische Färbung durchgeführt wurde, und das verbleibende Gewebe wurde für nachfolgende molekularbiologische Experimente bei -80 °C gelagert. Alle Tierversuche entsprachen den institutionellen Richtlinien für Tierversuche.
Die histopathologische Bewertung, einschließlich der Ashcroft-Fibroseskala, wurde unabhängig voneinander von zwei Untersuchern durchgeführt, die hinsichtlich der Zuordnung zu den Versuchsgruppen nicht informiert waren.
Pathologische Untersuchung der Lunge
Fest fixierte Lungengewebe wurden entwässert, transparentiert und in Paraffinblöcke eingebettet, anschließend in 5 µm dicke Schnitte aufgeteilt.
Hämatoxylinstaining und Eosin (HE)-Färbung: Die Schnitte wurden 3–5 min mit Hämatoxilin gefärbt, in saurer Lösung differenziert, unter fließendem Wasser gebläut und anschließend 5 min mit Eosin kontragefärbt. Nach der Dehydrierung mittels aufsteigendem Alkohol wurden die Schnitte in Xylol geklärt und mit neutralem Harz verschlossen17.
Massons Dreifachfärbung: Die Schnitte wurden nacheinander mit Hämalum, Lichtringrot–Säurefuchsins, Phosphormolybdensäure und Hellgrün gefärbt. Nach der sauren Differenzierung wurden die Schnitte dehydriert, in Xylol geklärt und mit neutralem Harz eingedeckt18,19.
Transkriptomsequenzierung
Maus-Lungengewebe aus den vier Versuchsgruppen wurden unmittelbar nach der Tötung entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz gemäß den Herstelleranweisungen extrahiert. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurden bestimmt, und die RNA-Integrität wurde mithilfe eines Bioanalyzer mit integrierter Software bewertet. Proben mit RIN-Werten über 8,0 galten als akzeptabel. Die Bibliotheksherstellung umfasste die Anreicherung von poly(A)-mRNA mittels Oligo(dT)-Beads, RNA-Fragmentierung, cDNA-Synthese, Adapterligation und PCR-Amplifikation. Die Sequenzierung wurde auf einer Illumina-Plattform durchgeführt und erzeugte pro Probe etwa 6,2–6,4 Gb an bereinigten Daten. Alle in dieser Studie generierten Rohsequenzierungsdaten wurden in der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE311671 hinterlegt.
Saubere Reads wurden mit dem STAR-Aligner an das Referenzgenom von Mus musculus (mm8) ausgerichtet. Die Genexpressionslevel wurden als rohe Read-Anzahlen quantifiziert. Die differentielle Expressionsanalyse wurde mit dem limma-Paket in R durchgeführt. Vor der linearen Modellierung wurden die Rohzähldaten mithilfe der voom-Funktion transformiert, um die Mittelwert-Varianz-Beziehung abzuschätzen und Präzisionsgewichte zu erzeugen. Die rohen P-Werte wurden mittels der Benjamini-Hochberg-Methode (BH) auf Mehrfachvergleiche korrigiert, und Gene mit einem |log₂FoldChange| > 1,5 und einer falschen Entdeckungsrate (FDR) < 0,05 galten als differentiell exprimiert. Funktionelle Anreicherungsanalysen wurden mit dem clusterProfiler-Paket in R durchgeführt. Die Genontologie-(GO-)Anreicherungsanalyse diente der Identifizierung signifikant angereicherter Kategorien biologischer Prozesse (BP), zellulärer Komponenten (CC) und molekularer Funktionen (MF), während die Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG) zur Identifizierung signifikant angereicherter Signalwege herangezogen wurde. Die Signifikanz der Anreicherung wurde mittels eines hypergeometrischen Tests bewertet, und die P-Werte wurden mittels der Benjamini-Hochberg-Methode auf Mehrfachvergleiche korrigiert. GO-Terme und KEGG-Wege mit einem adjustierten P-Wert (padj) < 0,05 galten als signifikant angereichert20,21,22,23.
Nachweis per Western Blot
Frisches Mauslungen-Gewebe wurde gesammelt und mit einem geeigneten Volumen an Radioimmunpräzipitations-Assay-(RIPA-)Lysepuffer homogenisiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand gesammelt und die Proteinkonzentration mit einem BCA-Protein-Assay-Kit bestimmt. Die Proben wurden anschließend mit Pufferpuffern gemischt und 10 min bei 100 °C erhitzt. Die Proteintrennung erfolgte auf 10%igen Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(SDS-PAGE-)Gelen bei einem Strom von 200 V über 30 min. Anschließend wurden die Proteine elektrophoretisch auf Polyvinylidenfluorid-(PVDF-)Membranen mit einem konstanten Strom von 300 mA über 30 min übertragen. Die Membran wurde mit 5%iger Magermilch blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen β-Aktin (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) und MMP12 (1:800) inkubiert. Am folgenden Tag wurde die Membran mit TBST gewaschen und für 1 h bei Raumtemperatur mit sekundärem Antikörper inkubiert, gefolgt von weiteren Waschschritten mit TBST. Die Proteinbanden wurden mithilfe eines chemilumineszenten Substrats sichtbar gemacht, und die Proteinquantifizierung wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt.
Die Western-Blot-Analyse wurde mit drei unabhängigen biologischen Wiederholungen aus jeder experimentellen Gruppe durchgeführt. Proteinproben wurden aus einzelnen Maus-Lungen-Geweben hergestellt, wobei jede biologische Wiederholung ein unabhängiges Tier repräsentierte.
Statistische Analyse
Alle experimentellen Daten wurden mit GraphPad Prism 9.5 analysiert. Vorab wurden Tests auf Normalverteilung und Varianzhomogenität durchgeführt. Für den Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde der t-Test nach Student verwendet, für den Vergleich mehrerer Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA in Kombination mit dem post-hoc-Test nach Tukey angewandt. Ein P-Wert ≤ 0,05 galt als statistisch signifikant.
Ergebnisse
DMSO lindert Silika-induzierte pulmonale Fibrose bei Mäusen (Abbildung 2)
Um die Auswirkungen von DMSO auf pathologische Prozesse und Gewebeveränderungen in der Lunge an einem Silikosemodell zu bewerten, wurden vier experimentelle Gruppen eingerichtet (Abbildung 2A). Die Veränderungen des Körpergewichts wurden über einen Zeitraum von einem Monat überwacht.
Die Ergebnisse zeigten, dass Mäuse in der Silikose-Gruppe einen kontinuierlichen Gewichtsverlust aufwiesen, während die Silica+DMSO-Gruppe zunächst einen Gewichtsverlust zeigte, dem nach der DMSO-Behandlung eine Erholung folgte (Abbildung 2F). Nach 30 Tagen Silika-Exposition wurden Lungengewebe entnommen und mittels HE-Färbung (Abbildung 2B) sowie Masson-Trichrom-Färbung (Abbildung 2C) auf entzündliche und fibrotische Veränderungen untersucht. Die pulmonale Fibrose wurde an HE-gefärbten Schnitten nach der Ashcroft-Methode24 bewertet, wobei sich eine niedrigere Fibrosescore in der Silica+DMSO-Gruppe im Vergleich zur Silica-Gruppe ergab (Abbildung 2D). Die Masson-Färbung zeigte zudem, dass die Ablagerung von Kollagenfasern in der Silica-Gruppe ausgedehnt und dicht war und etwa 40 % der Lungengewebsfläche einnahm, was höher war als die in der Kontrollgruppe beobachteten 10 % (Abbildung 2E), was darauf hindeutet, dass die Silika-Exposition eine schwere pulmonale Fibrose induziert hatte. Im Gegensatz dazu war die Kollagenablagerung in der Silica+DMSO-Gruppe auf 20 % reduziert, was darauf hindeutet, dass DMSO die silikainduzierte pulmonale Fibrose möglicherweise durch Hemmung einer übermäßigen Kollagenakkumulation abschwächen kann.
Die Transkriptomanalyse identifiziert differentiell exprimierte Gene, die mit der DMSO-Behandlung bei silikabehandelten Mäusen assoziiert sind
Um die entzündungshemmenden und antifibrotischen Wirkungen von Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Silikosemodell zu untersuchen, wurde eine transkriptomische Sequenzierung an Lungengewebeproben durchgeführt, die von experimentellen Mäusen gesammelt wurden (Abbildung 3). Differenziell exprimierte Gene (DEGs) wurden mithilfe des limma-Algorithmus identifiziert, wobei die Selektionskriterien als |log2(Fold Change)| > 1,5 und ein korrigierter P-Wert (False Discovery Rate [FDR]) < 0,05 definiert wurden.
Die Transkriptomanalyse zeigte, dass die Gruppe mit Silica im Vergleich zur Kontrollgruppe 132 signifikant unterschiedlich exprimierte Gene aufwies (Abbildung 3A), darunter 117 Gene, die hochreguliert waren, und 15 Gene, die herunterreguliert waren. Insbesondere Gene wie Saa3 und MMP12 waren deutlich hochreguliert. Dieses Expressionsmuster wurde durch die hierarchische Cluster-Heatmap-Analyse weiter bestätigt (Abbildung 3C), die konsistente Genexpressionsprofile über die einzelnen Proben hinweg zeigte.
Im Vergleich zwischen den Gruppen Silica+DMSO und Silica wurden insgesamt 3.054 signifikant differentiell exprimierte Gene identifiziert (Abbildung 3B), darunter 1.399 hochregulierte und 1.655 herunterregulierte Gene. Die entsprechende Heatmap (Abbildung 3D) zeigte erhebliche transkriptomische Veränderungen nach DMSO-Behandlung, mit einer deutlichen Herunterregulation von Genen wie Lcn2 und MMP12. Insbesondere Schlüsselgene, die in der Silica-Gruppe hochreguliert waren, wie MMP12, Saa3 und Spp1, wiesen in der Silica+DMSO-Gruppe eine starke Herunterregulation auf. Diese Ergebnisse legen nahe, dass DMSO silikosebedingte Pathologien möglicherweise abschwächen kann, indem es die Expression proinflammatorischer und profibrotischer Mediatoren unterdrückt.
Die IL-6/STAT3/MMP12-Signalachse könnte an den schützenden Wirkungen von DMSO bei der durch Siliciumdioxid induzierten pulmonalen Fibrose beteiligt sein
Um die Beziehungen zwischen differentiell exprimierten Genen (DEGs) zu untersuchen, wurde basierend auf den transkriptomischen Daten ein Geninteraktionsnetzwerk erstellt (Abbildung 4A). MMP12 scheint eine zentrale Position innerhalb des Netzwerks einzunehmen. Um mögliche Assoziationen auf Proteinebene genauer zu untersuchen, wurde mithilfe der STRING-Datenbank ein vorhergesagtes Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) generiert (Abbildung 4B). Die STRING-Analyse deutete auf mögliche funktionelle Assoziationen zwischen MMP12 und mehreren zentralen DEGs hin, darunter IL-6, STAT3, SPP1 und MMP19. Da STRING Belege aus verschiedenen Quellen integriert, handelt es sich bei diesen Assoziationen um vorhergesagte funktionelle Beziehungen.
Die Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um die Proteinausprägungsniveaus von IL-6, STAT3, p-STAT3 und MMP12 zu quantifizieren (Abbildung 4C–F). Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Proteinausprägungsniveaus von IL-6 und p-STAT3 in der Silica-Gruppe signifikant erhöht waren und die MMP12-Proteinausprägung ebenfalls einen Trend zu einer gesteigerten Expression aufwies. Nach Behandlung mit DMSO waren die Ausprägungsniveaus dieser drei Proteine signifikant verringert. Bemerkenswerterweise blieb die Gesamtausprägung des STAT3-Proteins in allen experimentellen Gruppen relativ konstant.
VERFÜGBARKEIT VON DATEN:
Alle in dieser Studie generierten Rohsequenzierungsdaten wurden in der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE311671 hinterlegt. Die Rohbilder der Studie sind in einem ergänzenden Ordner verfügbar (Zusatzdatei 1).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Studiendesigns. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2: DMSO lindert pulmonale Fibrose bei Mäusen mit Silikose. (A) Schematisches Diagramm des experimentellen Designs. Pfeile in verschiedenen Farben repräsentieren unterschiedliche Applikationsregime. (B) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von Lungengewebe. Bei einer Vergrößerung von 200× beträgt die Maßstabsleiste 50 µm; bei einer Vergrößerung von 400× beträgt die Maßstabsleiste 20 µm. (C) Masson-Färbung von Lungengewebe (blau: Kollagenfasern; rot: Muskelfasern). Bei einer Vergrößerung von 200× beträgt die Maßstabsleiste 50 µm; bei einer Vergrößerung von 400× beträgt die Maßstabsleiste 20 µm. (D) Fibrosescores verschiedener Gruppen basierend auf HE-Färbungsergebnissen. n = 8, P ≤ 0,0001. (E) Relativer Kollagenanteil in der Masson-Färbung des Lungengewebes verschiedener Gruppen. n = 8, P ≤ 0,0001. (F) Körpergewichtsveränderungen der Mäuse innerhalb von 30 Tagen. Die Daten sind als Mittelwert ±± SEM dargestellt. Der Vergleich mehrerer Datensätze erfolgte mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA), und Post-hoc-Tests wurden nach der Tukey-Methode durchgeführt. n = 8, P(Zeit) ≤ 0,0001, P(Gruppe) ≤ 0,0001. N: Kontrollgruppe; S: Silikagruppe; SD: Silika + DMSO-Gruppe; D: DMSO-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Die Transkriptomsequenzierung zeigt die Genregulation durch DMSO bei der Linderung von Silikose. (A,B) Vulkandiagramm der differentiell exprimierten Gene zwischen der Silica- (S-)Gruppe und der Kontroll- (N-)Gruppe sowie zwischen der Silica + DMSO- (SD-)Gruppe und der Silica- (S-)Gruppe. (C,D) Heatmap der Silica- (S-)Gruppe im Vergleich zur Kontroll- (N-)Gruppe und der Silica + DMSO- (SD-)Gruppe im Vergleich zur Silica- (S-)Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4: DMSO reduziert die Proteinausprägung von IL-6 und STAT3. (A) Netzwerkdiagramm signifikant differenziell exprimierter Gene. (B) STRING-Netzwerkinteraktionsdiagramm von MMP12 und verwandten Genen. (C–F) Western-Blot-Analyse der Proteinausprägung von β-Actin, IL-6, MMP12, STAT3 und p-STAT3. Grauwertanalyse von β-Actin, IL-6 (*P = 0.0257, *P = 0.0195), MMP12 (**P = 0.0013, *P = 0.0318), STAT3 (P = 0.3205, P = 0.2347) und p-STAT3 (*P = 0.0123, **P = 0.0096) mittels Western Blot. Die Immunoblot-Analyse wurde dreifach durchgeführt (n = 3). N: Kontrollgruppe; S: Siliciumdioxid-Gruppe; SD: Siliciumdioxid + DMSO-Gruppe; D: DMSO-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Zusatzdatei 1: Rohdaten dieser Studie.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Die Silikose bleibt eine der schwerwiegendsten berufsbedingten Lungenerkrankungen weltweit, gekennzeichnet durch anhaltende Entzündungen und fortschreitende pulmonale Fibrose, die die Lungenfunktion und die Lebensqualität der Patienten erheblich beeinträchtigen25. In dieser Studie untersuchen wir anhand eines durch Siliciumdioxid induzierten murinen Modells systematisch die möglichen schützenden Wirkungen von Dimethylsulfoxid (DMSO) im frühen Stadium. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Behandlung mit DMSO die Infiltration entzündlicher Zellen verringert und fibrotische Gewebeveränderungen abschwächt, was darauf hindeutet, dass DMSO im frühen Verlauf der Silikose eine modulierende Rolle ausüben könnte. Frühere experimentelle Studien haben gezeigt, dass DMSO schützende Effekte gegen pulmonale Fibrose sowohl bei Ratten als auch bei Mäusen entfaltet. Haschek et al. berichteten, dass DMSO fibrotische Veränderungen in experimentellen Tiermodellen abschwächt, obwohl die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen unklar blieben26. In Übereinstimmung mit diesen Befunden legen unsere transkriptomischen und proteinexprimierenden Analysen weiterhin nahe, dass DMSO die siliciumdioxidinduzierte pulmonale Fibrose durch Modulation entzündlicher Signalwege lindern könnte, wodurch zusätzliche Einblicke in die mögliche antifibrotische Wirkung gewonnen werden.
DMSO, ein polarer aprotischer Lösungsmittel mit hoher Gewebedurchlässigkeit27, weist gut dokumentierte entzündungshemmende und schmerzlindernde Eigenschaften auf und wurde bereits bei verschiedenen entzündungsbedingten Erkrankungen eingesetzt, darunter interstitielle Zystitis, rheumatoide Arthritis und Arthrose28,29,30. Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass DMSO die pulmonale Fibrose und Lungenschädigungen in experimentellen Tiermodellen abschwächt, was darauf hindeutet, dass DMSO schützende Wirkungen gegen fibrotische Lungenerkrankungen besitzt, möglicherweise aufgrund seiner entzündungshemmenden und radikalfängenden Eigenschaften26. Auf molekularer Ebene wurde berichtet, dass DMSO die NF-κB- und MAPK-Signalwege hemmt, was zu einer verminderten IL-6-Expression in mit LPS stimulierten RAW264.7-Makrophagen führt31. Bemerkenswerterweise können hohe Dosen von DMSO systemische Toxizität verursachen, wobei Schäden an mehreren Organen bei Dosen über 8 g/kg beschrieben wurden14; daher wurde ein Protokoll mit niedriger Dosis und wiederholter Verabreichung gewählt, um therapeutische Effekte und Toxizität abzuwägen.
Durch die Integration transkriptomischer und histopathologischer Analysen stellten wir fest, dass die Behandlung mit DMSO die pulmonale Entzündung und Fibrose bei silikabehandelten Mäusen abschwächte, begleitet von einer Herunterregulation der IL-6-Expression. Die transkriptomische Profilierung zeigte zudem eine Verringerung der MMP12-Expression nach DMSO-Behandlung. MMP12, das hauptsächlich von Makrophagen32 sezerniert wird, ist an der fibrotischen Progression von Silikose, COPD und bleomycininduzierten Lungenverletzungen beteiligt, und zwar durch die Regulation pro-fibrotischer Signalwege wie TGF-β1, EGR1 und CYR6133,34,35. In der vorliegenden Studie legt die beobachtete Herunterregulation von MMP12 dessen potenzielle Beteiligung an den antiinflammatorischen und antifibrotischen Wirkungen der DMSO-Behandlung nahe. Bedeutend ist, dass MMP12 den Abbau übermäßiger extrazellulärer Matrixablagerungen während der Rückbildung der Fibrose fördert und somit die Gewebeumgestaltung und Narbenbeseitigung unterstützt36.
Makrophagen sind zentrale Treiber der proinflammatorischen Zytokinproduktion bei silikabedingter Silikose37. Aktivierte Makrophagen sezernieren IL-6 und TNF-α, die zur Entzündung und Fibrose beitragen38. IL-6 bindet den gp130-Rezeptorkomplex, um den JAK–STAT-Signalweg, insbesondere STAT3, zu aktivieren, wodurch das Makrophagenphänotyp und pro-fibrotische Prozesse beeinflusst werden39,40,41,42. In dieser Studie verringerte die DMSO-Behandlung die Expressionsniveaus von IL-6, STAT3 und MMP12 signifikant, was darauf hindeutet, dass DMSO die IL-6/STAT3-Achse modulieren und indirekt MMP12 herunterregulieren könnte. Frühere Studien haben gezeigt, dass die IL-6–STAT3-Achse eine entscheidende regulatorische Rolle in verschiedenen Modellen der pulmonalen Fibrose spielt und ihre anhaltende Aktivierung eng mit der Schwere der Fibrose und dem Fortschreiten der Erkrankung assoziiert ist43,44. STAT3 wurde als wichtiger Signalvermittler vorgeschlagen, der entzündliche Reaktionen mit fibrotischem Umbau verknüpft, und seine Aktivierung könnte MMP12 regulieren, wodurch die transkriptionelle Aktivität verstärkt wird45. Zudem ist die STAT3-Signalübertragung an der Makrophagenpolarisation beteiligt und fördert den Übergang von Makrophagen vom proinflammatorischen M1-Phänotyp zum profibrotischen M2-Phänotyp46,47, während M2-Makrophagen eine der primären zellulären Quellen von MMP12 darstellen48. Die gleichzeitige Herunterregulierung von STAT3 und MMP12, die in der vorliegenden Studie beobachtet wurde, legt daher nahe, dass DMSO die MMP12-Expression zumindest teilweise durch Modulation der STAT3-Signalübertragung verringern könnte. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die vorliegende Studie hauptsächlich darauf ausgelegt war, potenzielle molekulare Mechanismen basierend auf transkriptomischen Profilierungen in Kombination mit in-vivo-Validierung zu identifizieren. Obwohl die koordinierten Veränderungen von IL-6, STAT3 und MMP12 die Beteiligung der IL-6/STAT3/MMP12-Signalachse an den antifibrotischen Wirkungen von DMSO unterstützen, belegen die derzeitigen Daten keinen direkten kausalen Zusammenhang zwischen der Aktivierung von STAT3 und der Regulation von MMP12. Weitere mechanistische Studien sind daher erforderlich, um die direkten regulatorischen Interaktionen innerhalb dieses Signalwegs weiter aufzuklären.
Diese Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens basieren die Schlussfolgerungen dieser Studie auf transkriptomischen Profilierungen in Kombination mit histopathologischen und Proteinexpressionsanalysen in einem murinen Modell der Silikose. Obwohl diese Befunde die Beteiligung der IL-6/STAT3/MMP12-Signalachse unterstützen, belegen sie keinen direkten kausalen Zusammenhang zwischen der Aktivierung von STAT3 und der Regulation von MMP12. Zweitens wurden keine mechanistischen Validierungen durchgeführt, einschließlich makrophagenbasierter in vitro-Studien und Rescue-Experimente mittels genetischer oder pharmakologischer Modulation des IL-6/STAT3-Signalwegs und von MMP12. Außerdem wurde keine positive antifibrotische Kontrolle einbezogen, was den direkten Vergleich von DMSO mit etablierten Therapien einschränkt. Zukünftige Studien, die mechanistische Validierungen sowie klinisch relevante antifibrotische Wirkstoffe wie Pirfenidon oder Nintedanib einbeziehen, werden den molekularen Wirkmechanismus und das therapeutische Potenzial von DMSO bei der Silikose weiter klären.
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass DMSO die makrophagenvermittelte Entzündung und Fibrose bei silikabedingter Silikose abschwächt, möglicherweise durch Modulation der IL-6/STAT3/MMP12-Signalachse. Diese Befunde liefern vorläufige Hinweise darauf, dass die IL-6/STAT3/MMP12-Signalachse an den antifibrotischen Wirkungen von DMSO beteiligt sein könnte, und stellen MMP12 als potenzielles molekulares Ziel für zukünftige Untersuchungen heraus.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Offenlegungspflichten.
Danksagungen
Die Autoren danken der Plattform der Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. sowie Professor Deyong Ge und Lei Xu für ihre technische Unterstützung.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE | Servicebio | G2177 | |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Servicebio | G2026 | |
| C57BL/6J-Mäuse | Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. | Nr.: SCXY(Su)2011-0003 | |
| krystallines Siliziumdioxid | Sigma Aldrich | Nr. S5631 | |
| DMSO | Servicebio | GC203006 | |
| IL-6 | Affinity Biosciences | DF6087 | |
| Ladepuffer | Bioteke | P0015L | |
| MMP12 | Servicebio | GB115475 | |
| p-STAT3 | Servicebio | GB150001 | |
| RIPA-Lysispuffer | Servicebio | G2002 | |
| Sekundärantikörper | Servicebio | GB23303 | |
| Magermilch | Servicebio | GC310001 | |
| STAT3 | Servicebio | GB11176 | |
| β-Actin | Servicebio | GB11001 |
Referenzen
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