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Schnellbericht
Diese Studie legt nahe, dass Dimethylsulfoxid (DMSO) die silikainduzierte pulmonale Entzündung und Fibrose bei Mäusen lindern könnte. Transkriptomische und experimentelle Analysen deuten darauf hin, dass die schützenden Wirkungen eine Hemmung des IL-6/STAT3-Signalwegs und eine Herabregulation der MMP12-Expression beinhalten könnten, was potenzielle therapeutische Erkenntnisse für die Behandlung der Silikose liefert.
Diese Studie zielt darauf ab, die entzündungshemmenden und antifibrotischen Wirkungen von Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Mausmodell der Silikose zu untersuchen, um damit seinen potenziellen therapeutischen Wert zu erforschen.
Ein Mausmodell der Silikose wurde durch intranasale Applikation etabliert, und die DMSO-Behandlung erfolgte mittels intraperitonealer Injektion. Das Experiment wurde über einen Zeitraum von 1 Monat durchgeführt. Lungenproben wurden von allen Mäusen gewonnen; ein Teil davon wurde einer transkriptomischen Analyse unterzogen, und differentiell exprimierte Gene wurden mit dem limma-Paket identifiziert. Genontologie (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen wurden mit ClusterProfiler durchgeführt, um Genfunktionen und assoziierte Signalwege zu untersuchen. Die verbleibenden Proben wurden einer histopathologischen Beurteilung mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) und Masson-Trichrom-Färbung unterzogen, während eine Western-Blot-Analyse zur Validierung der transkriptomischen Ergebnisse durchgeführt wurde.
Diese Studie legt nahe, dass DMSO den fibrotischen Prozess bei Silikose durch Modulation der IL-6/STAT3-MMP12-Signalachse lindern könnte. Im silikainduzierten Mausmodell der Silikose milderte DMSO das krankheitsassoziierte Gewichtsverlust ab und verringerte die Kollagenablagerung. Die transkriptomische Analyse zeigte, dass DMSO die Aktivität mehrerer fibrosebezogener Signalwege unterdrückte, und identifizierte 51 Schlüsselgene, darunter MMP12, das signifikant herunterreguliert war. Die Western-Blot-Analyse bestätigte zudem eine verminderte MMP12-Expression, begleitet von deutlich reduzierten Spiegeln von IL-6 und p-STAT3, was darauf hindeutet, dass der IL-6/STAT3-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der MMP12-Expression spielen könnte.
DMSO kann entzündliche Reaktionen und pulmonale Fibrose bei der Silikose abschwächen, indem es die Aktivierung des IL-6/STAT3-Signalwegs hemmt und dadurch die Expression von MMP12 verringert.
Silikose ist eine der Hauptformen der berufsbedingten Pneumokoniose1, gekennzeichnet durch eine anhaltende pulmonale Entzündung und irreversible pulmonale Fibrose infolge einer langfristigen Exposition gegenüber Siliciumdioxid-Staub2,3. Die Pathogenese dieser Silikose ist äußerst komplex. Obwohl frühere Studien gezeigt haben, dass eine fehlerhafte Makrophagenaktivierung4, eine übermäßige Proliferation von Fibroblasten, der epithelial-mesenchymale Übergang sowie eine abnormale Ablagerung von Bestandteilen der extrazellulären Matrix (ECM) sind entscheidende Faktoren für die Entstehung von Fibrosen5,6Die zentralen molekularen Mechanismen, die dem entzündlich-fibrotischen Teufelskreis zugrunde liegen, sind noch nicht vollständig verstanden. Insbesondere die Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Umbildung der extrazellulären Matrix (ECM) und beim Fortschreiten der pathologischen Fibrose.7Unter diesen spielt die Matrix-Metalloprotease 12 (MMP12), die spezifisch von Makrophagen sezerniert wird, eine wichtige Rolle. Sie degradiert wichtige Bestandteile der extrazellulären Matrix wie Elastin, Fibronectin und Kollagen Typ IV und ist an der Pathogenese fibrotischer Erkrankungen, darunter der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung, beteiligt.8. Neuere Studien legen zudem nahe, dass von Makrophagen stammendes MMP12 die Fibrose durch Schädigung endothelialer Zellen im Verlauf der pulmonalen Fibrose weiter fördern könnte9.
Dimethylsulfoxid (DMSO), eine niedermolekulare Verbindung mit vielfältigen biologischen Aktivitäten10, hat bei mehreren entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Zystitis, entzündungshemmende Wirkungen gezeigt und ist von der amerikanischen Arzneimittelbehörde FDA zur Behandlung der interstitiellen Zystitis zugelassen11. Neuere Studien deuten darauf hin, dass DMSO die Progression der Fibrose in gewissem Maße verlangsamen kann, indem es die Freisetzung entzündungsfördernder Faktoren hemmt und die oxidativen Stressreaktionen reduziert12. Untersuchungen von Ingrid Elisia et al. berichteten, dass DMSO spezifisch die Aktivierung der ERK1/2-, p38-MAPK-, JNK- und PI3K/Akt-Signalwege in humanen Monozyten in Ganzblutmodellen hemmt und dadurch seine entzündungshemmende Wirkung entfaltet13.
Obwohl gezeigt wurde, dass die MMP-Familie eine entscheidende Rolle beim Fibroseprozess der Silikose spielt, haben keine Studien eindeutig nachgewiesen, ob DMSO den pathologischen Fortschritt der Silikose durch die Regulation der MMP-Expression beeinflussen kann. Daher stellt diese Studie die Untersuchung der entzündungshemmenden und antifibrotischen Wirkungen von DMSO in einem Mausmodell der Silikose dar, mit dem Ziel, das zentrale regulatorische Gen-Netzwerk und den molekularen Wirkmechanismus der DMSO-Intervention aufzuklären und theoretische Grundlagen für innovative, auf MMP basierende Behandlungsstrategien bereitzustellen.
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Alle Tierversuche, die in dieser Studie durchgeführt wurden, wurden vom Ethikkomitee für Wissenschaft und Technologie der Universität für Wissenschaft und Technologie von Anhui (Genehmigungsnummer GZ2025-048) genehmigt und hielten strikt die chinesischen nationalen Standards für das Wohlergehen von Labortieren (GB/T 35892-2018) ein. Abbildung 1 zeigt den Studienaufbau.
Zubereitung der Lösungen
Herstellung der Kieselsäuresuspension:
Kristallines Siliziumdioxid (SiO₂, 80 %, Teilchengröße 1–5 µm) wurde durch Autoklavieren sterilisiert. Das sterile Siliziumdioxidpulver wurde anschließend in steriler Kochsalzlösung dispergiert, um eine Endkonzentration von 10 mg/mL zu erhalten, und die Suspension wurde unmittelbar vor der Applikation mit einem Ultraschallhomogenisator gründlich homogenisiert, um eine gleichmäßige Partikelsuspension sicherzustellen.
Herstellung der DMSO-Lösung:
Unter aseptischen Bedingungen wurde DMSO (≥99,9 %) mit steriler physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um eine etwa 10 %ige (V/V) DMSO-Lösung herzustellen, die durch Ultraschallbehandlung homogenisiert wurde. Jede Maus erhielt die DMSO-Lösung in einer Dosis von 0,9 g/kg, wie zuvor beschrieben14,15.
Experimentelle Tiere
Zweiunddreißig gesunde männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 8–12 Wochen wurden in dieser Studie verwendet und vor der Experimentierung eine Woche lang akklimatisiert. Die Mäuse wurden mithilfe einer computergenerierten Randomisierungsmethode zufällig vier Versuchsgruppen zugeordnet (n = 8 pro Gruppe): Kontrollgruppe, DMSO-Gruppe, Silica-Gruppe und Silica+DMSO-Gruppe. Die Stichprobengröße wurde basierend auf früheren Studien mit dem gleichen murinen Silikosemodell sowie auf unseren vorläufigen experimentellen Erfahrungen festgelegt, die zeigten, dass acht Tiere pro Gruppe ausreichten, um histopathologische und molekulare Unterschiede zwischen den Gruppen nachzuweisen. Die Tiere wurden unter standardisierten Laborbedingungen mit kontrollierter Temperatur, einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Wechsel und freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Humane Endpunkte wurden vor Studienbeginn festgelegt, und kein Tier erfüllte die vorab definierten Kriterien für eine vorzeitige Euthanasie.
Herstellung des Silikose-Modells und pharmakologische Intervention
Die Silikose wurde durch eine einzige intranasale Applikation von 60 µL steriler kristalliner Kieselsäuresuspension (10 mg/mL) induziert. Nach Einleitung der Anästhesie wurden die Mäuse in Rückenlage gebracht. Sobald tiefes und langsames Atmen beobachtet wurde, wurden 60 µL der Kieselsäuresuspension tropfenweise vorsichtig in die Nasenlöcher appliziert, sodass die Suspension spontan in die Lungen eingeatmet werden konnte16. Mäuse der DMSO-Applikationsgruppe erhielten zweimal wöchentlich mit einem Abstand von 3–4 Tagen intraperitoneale Injektionen einer DMSO-Lösung mit fester Dosis über einen aufeinanderfolgenden Monat. Die Mäuse der verbleibenden Gruppen wurden identisch behandelt, jedoch mit einem gleichen Volumen steriler Kochsalzlösung. Während des gesamten Experiments erfolgte eine tägliche Überwachung des Körpergewichts. Am 30. Tag nach der Modellierung wurden alle Mäuse getötet und die Lungengewebe unter sterilen Bedingungen entnommen. Die Tötung erfolgte durch Halswirbelbruch nach intraperitonealer Verabreichung von Tribromeethanol (0,2 mL/10 g) zur Einleitung der Anästhesie. Teil der Lungengewebe wurde zur Transkriptomsequenzierung in flüssigem Stickstoff konserviert. Ein Teil des Gewebes wurde 48 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, bevor eine pathologische Färbung durchgeführt wurde, und das verbleibende Gewebe wurde für nachfolgende molekularbiologische Experimente bei -80 °C gelagert. Alle Tierversuche entsprachen den institutionellen Richtlinien für Tierversuche.
Die histopathologische Bewertung, einschließlich der Ashcroft-Fibroseskala, wurde unabhängig voneinander von zwei Untersuchern durchgeführt, die hinsichtlich der Zuordnung zu den Versuchsgruppen nicht informiert waren.
Pathologische Untersuchung der Lunge
Fest fixierte Lungengewebe wurden entwässert, transparentiert und in Paraffinblöcke eingebettet, anschließend in 5 µm dicke Schnitte aufgeteilt.
Hämatoxylinstaining und Eosin (HE)-Färbung: Die Schnitte wurden 3–5 min mit Hämatoxilin gefärbt, in saurer Lösung differenziert, unter fließendem Wasser gebläut und anschließend 5 min mit Eosin kontragefärbt. Nach der Dehydrierung mittels aufsteigendem Alkohol wurden die Schnitte in Xylol geklärt und mit neutralem Harz verschlossen17.
Massons Dreifachfärbung: Die Schnitte wurden nacheinander mit Hämalum, Lichtringrot–Säurefuchsins, Phosphormolybdensäure und Hellgrün gefärbt. Nach der sauren Differenzierung wurden die Schnitte dehydriert, in Xylol geklärt und mit neutralem Harz eingedeckt18,19.
Transkriptomsequenzierung
Maus-Lungengewebe aus den vier Versuchsgruppen wurden unmittelbar nach der Tötung entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz gemäß den Herstelleranweisungen extrahiert. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurden bestimmt, und die RNA-Integrität wurde mithilfe eines Bioanalyzer mit integrierter Software bewertet. Proben mit RIN-Werten über 8,0 galten als akzeptabel. Die Bibliotheksherstellung umfasste die Anreicherung von poly(A)-mRNA mittels Oligo(dT)-Beads, RNA-Fragmentierung, cDNA-Synthese, Adapterligation und PCR-Amplifikation. Die Sequenzierung wurde auf einer Illumina-Plattform durchgeführt und erzeugte pro Probe etwa 6,2–6,4 Gb an bereinigten Daten. Alle in dieser Studie generierten Rohsequenzierungsdaten wurden in der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE311671 hinterlegt.
Saubere Reads wurden mit dem STAR-Aligner an das Referenzgenom von Mus musculus (mm8) ausgerichtet. Die Genexpressionslevel wurden als rohe Read-Anzahlen quantifiziert. Die differentielle Expressionsanalyse wurde mit dem limma-Paket in R durchgeführt. Vor der linearen Modellierung wurden die Rohzähldaten mithilfe der voom-Funktion transformiert, um die Mittelwert-Varianz-Beziehung abzuschätzen und Präzisionsgewichte zu erzeugen. Die rohen P-Werte wurden mittels der Benjamini-Hochberg-Methode (BH) auf Mehrfachvergleiche korrigiert, und Gene mit einem |log₂FoldChange| > 1,5 und einer falschen Entdeckungsrate (FDR) < 0,05 galten als differentiell exprimiert. Funktionelle Anreicherungsanalysen wurden mit dem clusterProfiler-Paket in R durchgeführt. Die Genontologie-(GO-)Anreicherungsanalyse diente der Identifizierung signifikant angereicherter Kategorien biologischer Prozesse (BP), zellulärer Komponenten (CC) und molekularer Funktionen (MF), während die Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG) zur Identifizierung signifikant angereicherter Signalwege herangezogen wurde. Die Signifikanz der Anreicherung wurde mittels eines hypergeometrischen Tests bewertet, und die P-Werte wurden mittels der Benjamini-Hochberg-Methode auf Mehrfachvergleiche korrigiert. GO-Terme und KEGG-Wege mit einem adjustierten P-Wert (padj) < 0,05 galten als signifikant angereichert20,21,22,23.
Nachweis per Western Blot
Frisches Mauslungen-Gewebe wurde gesammelt und mit einem geeigneten Volumen an Radioimmunpräzipitations-Assay-(RIPA-)Lysepuffer homogenisiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand gesammelt und die Proteinkonzentration mit einem BCA-Protein-Assay-Kit bestimmt. Die Proben wurden anschließend mit Pufferpuffern gemischt und 10 min bei 100 °C erhitzt. Die Proteintrennung erfolgte auf 10%igen Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(SDS-PAGE-)Gelen bei einem Strom von 200 V über 30 min. Anschließend wurden die Proteine elektrophoretisch auf Polyvinylidenfluorid-(PVDF-)Membranen mit einem konstanten Strom von 300 mA über 30 min übertragen. Die Membran wurde mit 5%iger Magermilch blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen β-Aktin (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) und MMP12 (1:800) inkubiert. Am folgenden Tag wurde die Membran mit TBST gewaschen und für 1 h bei Raumtemperatur mit sekundärem Antikörper inkubiert, gefolgt von weiteren Waschschritten mit TBST. Die Proteinbanden wurden mithilfe eines chemilumineszenten Substrats sichtbar gemacht, und die Proteinquantifizierung wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt.
Die Western-Blot-Analyse wurde mit drei unabhängigen biologischen Wiederholungen aus jeder experimentellen Gruppe durchgeführt. Proteinproben wurden aus einzelnen Maus-Lungen-Geweben hergestellt, wobei jede biologische Wiederholung ein unabhängiges Tier repräsentierte.
Statistische Analyse
Alle experimentellen Daten wurden mit GraphPad Prism 9.5 analysiert. Vorab wurden Tests auf Normalverteilung und Varianzhomogenität durchgeführt. Für den Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde der t-Test nach Student verwendet, für den Vergleich mehrerer Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA in Kombination mit dem post-hoc-Test nach Tukey angewandt. Ein P-Wert ≤ 0,05 galt als statistisch signifikant.
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DMSO lindert Silika-induzierte pulmonale Fibrose bei Mäusen (Abbildung 2)
Um die Auswirkungen von DMSO auf pathologische Prozesse und Gewebeveränderungen in der Lunge an einem Silikosemodell zu bewerten, wurden vier experimentelle Gruppen eingerichtet (Abbildung 2A). Die Veränderungen des Körpergewichts wurden über einen Zeitraum von einem Monat überwacht.
Die Ergebnisse ze...
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Die Silikose bleibt eine der schwerwiegendsten berufsbedingten Lungenerkrankungen weltweit, gekennzeichnet durch anhaltende Entzündungen und fortschreitende pulmonale Fibrose, die die Lungenfunktion und die Lebensqualität der Patienten erheblich beeinträchtigen25. In dieser Studie untersuchen wir anhand eines durch Siliciumdioxid induzierten murinen Modells systematisch die möglichen schützenden Wirkungen von Dimethylsulfoxid (DMSO) im frühen Stadium. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darau...
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Die Autoren haben keine Offenlegungspflichten.
Die Autoren danken der Plattform der Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. sowie Professor Deyong Ge und Lei Xu für ihre technische Unterstützung.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE | Servicebio | G2177 | |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Servicebio | G2026 | |
| C57BL/6J-Mäuse | Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. | Nr.: SCXY(Su)2011-0003 | |
| krystallines Siliziumdioxid | Sigma Aldrich | Nr. S5631 | |
| DMSO | Servicebio | GC203006 | |
| IL-6 | Affinity Biosciences | DF6087 | |
| Ladepuffer | Bioteke | P0015L | |
| MMP12 | Servicebio | GB115475 | |
| p-STAT3 | Servicebio | GB150001 | |
| RIPA-Lysispuffer | Servicebio | G2002 | |
| Sekundärantikörper | Servicebio | GB23303 | |
| Magermilch | Servicebio | GC310001 | |
| STAT3 | Servicebio | GB11176 | |
| β-Actin | Servicebio | GB11001 |
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