Forschungsartikel

N-Lactoyl-phenylalanin verbessert die Herzfunktion in einem Mausmodell der diabetischen Kardiomyopathie durch Regulierung des Lipidstoffwechsels

21 Ansichten

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DOI:

10.3791/72633

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1. September 2026

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1Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 3Institute of Advanced Synthesis, School of Chemistry and Molecular Engineering, Nanjing Tech University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt in-vivo- und in-vitro-Ansätze, um zu untersuchen, wie N-Lactoyl-Phenylalanin die diabetische Kardiomyopathie, den kardialen Lipidstoffwechsel und die Cholesterinsynthese beeinflusst, wobei der Fokus auf dem Adenosinmonophosphat-aktivierten Proteinkinase-alpha-1/3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase-Signalweg liegt.

Zusammenfassung

Diabetische Kardiomyopathie (DCM) ist eine der schwerwiegendsten Komplikationen des Diabetes. N-Lactoyl-Phenylalanin (Lac-Phe), ein endogener Metabolit, kann die Gewichtsabnahme fördern und die Glukosehomöostase verbessern. Diese Studie sollte den therapeutischen Effekt von Lac-Phe auf die DCM untersuchen und den zugrundeliegenden Wirkmechanismus weiter aufklären. Mäuse mit Typ-2-Diabetes und DCM wurden mit Lac-Phe behandelt. Lac-Phe verbesserte die kontraktile Herzfunktion, milderte die pathologische Remodeling und verringerte die Lipidakkumulation im Herzen. In vitro wurden die Wirkungen von Lac-Phe in H9c2-Zellen untersucht, die mit hohem Glukosespiegel und Palmitinsäure stimuliert worden waren. Lac-Phe verringerte die Lipidakkumulation, indem es die Cholesterinsynthese in H9c2-Zellen senkte. Mechanistisch förderte Lac-Phe die Phosphorylierung und Aktivierung der adenosinmonophosphat-aktivierte Proteinkinase-alpha-1 (AMPKα1). Daraufhin phosphorylierte die aktivierte AMPKα1 ihr downstream liegendes Zielprotein, die 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMGCR), und hemmte es, was zu einer verminderten Cholesterinsynthese und letztlich zur Verbesserung des gestörten Lipidstoffwechsels in H9c2-Zellen führte. Diese Ergebnisse zeigen, dass Lac-Phe den Lipidstoffwechsel in H9c2-Zellen bei DCM über den AMPKα1/HMGCR-Signalweg verbessert, wodurch die kontraktile Herzfunktion gesteigert und die pathologische Remodeling abgeschwächt wird. Lac-Phe könnte einen potenziellen therapeutischen Ansatz für die diabetische Kardiomyopathie darstellen.

Einleitung

Diabetes ist eine Stoffwechselstörung, die durch anhaltende Hyperglykämie gekennzeichnet ist1. In den letzten zwei Jahrzehnten ist Diabetes weltweit zu einer der zehn häufigsten Todesursachen geworden, wobei jährlich mehr als sechs Millionen Menschen an Diabetes und dessen Komplikationen sterben2. Die diabetische Kardiomyopathie (DCM), eine kardiale pathologische Erkrankung, die durch Diabetes verursacht wird, stellt eine der schwerwiegendsten Komplikationen im Zusammenhang mit Diabetes dar3,4. Sie wirkt als unabhängiger Risikofaktor für Herzinsuffizienz und ist gekennzeichnet durch strukturelle und funktionelle Veränderungen des Myokards5,6, einschließlich kardialer Fibrose und Kardiomyozytenhypertrophie, die letztendlich sowohl zu diastolischer als auch zu systolischer Dysfunktion führen. Obwohl mehrere herkömmliche kardiovaskuläre Therapien wie β-Blocker, Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer und Angiotensin-II-Typ-1-Rezeptorblocker derzeit zur Behandlung der DCM eingesetzt werden7,8, bleibt ihre Wirksamkeit in der klinischen Anwendung suboptimal. Da die zugrundeliegenden Mechanismen der DCM bisher nicht ausreichend erforscht wurden9, existiert derzeit keine klare therapeutische Strategie zur gezielten Behandlung dieser Erkrankung10,11. Die klinischen Manifestationen der DCM verlaufen vom asymptomatischen Stadium mit diastolischer Dysfunktion in der frühen Phase bis hin zur systolischen Dysfunktion und klinischen Herzinsuffizienz im fortgeschrittenen Stadium und können sogar zum Tod führen12,13. Daher besteht ein dringender Bedarf, wirksame Behandlungsoptionen für diese Erkrankung zu erforschen und zu entwickeln.

Ein gestörter Lipidstoffwechsel ist ein wesentliches Merkmal der DCM14. Bei der DCM können erhöhte Konzentrationen freier Fettsäuren (FFAs) im Blut zu einer übermäßigen Aufnahme von Fettsäuren durch Kardiomyozyten führen15,16. Der Fettsäurestoffwechsel in Kardiomyozyten hängt hauptsächlich von der Fettsäureoxidation ab. Langfristig reicht die Fettsäureoxidation in Kardiomyozyten nicht aus, um alle aufgenommenen Fettsäuren vollständig abzubauen, wodurch überschüssige Fettsäuren und ihre Zwischenmetaboliten in den Kardiomyozyten anreichern17. Diese übermäßige Lipidbelastung induziert Lipotoxizität, stört die myokardiale Energieversorgung und fördert oxidativen Stress sowie entzündliche Reaktionen im Herzen, was letztlich zu schweren Schäden an den Kardiomyozyten führt18,19. Daher könnte eine aktive Regulierung des Herz-Lipidstoffwechsels ein potenzielles therapeutisches Ziel für die DCM darstellen20.

N-Lactoyl-Phenylalanin (Lac-Phe) ist ein endogener Metabolit, dessen Konzentration nach körperlicher Betätigung schnell ansteigt21. Mechanistisch wird Lac-Phe durch das zytosolische Enzym Carnosin-Dipeptidase 2 (CNDP2) synthetisiert, das Lactat und Phenylalanin kondensiert. Dieser biosynthetische Weg ist in vielen Zelltypen weit verbreitet, einschließlich Makrophagen, epithelialen Zellen und mesenchymalen Stammzellen, die nach körperlicher Aktivität Lac-Phe in den Kreislauf abgeben22. Es wurde gezeigt, dass die chronische Gabe von Lac-Phe die Nahrungsaufnahme senkt, Adipositas und Körpergewicht verringert sowie die Glukosehomöostase verbessert21. Eine aktuelle Studie hat ergeben, dass Lac-Phe die Fettstoffwechselfähigkeit von Mikroglia/Makrophagen nach einer Rückenmarkverletzung verbessern kann23. Interessanterweise deuten Studien darauf hin, dass sowohl die akute als auch die chronische Gabe von Metformin, einem Medikament der ersten Wahl bei Typ-2-Diabetes, die Lac-Phe-Spiegel erhöhen kann und dass Lac-Phe die anti-adipösen Wirkungen von Metformin vermittelt22. Darüber hinaus zeigten Sha et al. kürzlich, dass Lac-Phe den Tod von Herzmuskelzellen durch Linderung mitochondrialer Dysfunktion abschwächt und dadurch die durch transversale Aortenstenose (TAC) induzierte Herzinsuffizienz verbessert24. Prolongierte Hyperglykämie und Adipositas sind wichtige Faktoren, die zur Dysregulation des Lipidstoffwechsels bei DCM beitragen25. Insgesamt legt diese Evidenz nahe, dass Lac-Phe möglicherweise eine therapeutische Wirkung bei DCM haben könnte. Bislang wurde jedoch die spezifische Rolle von Lac-Phe bei DCM nicht untersucht.

In dieser Studie fanden wir heraus, dass die exogene Verabreichung von Lac-Phe an Mäuse mit diabetischer Kardiomyopathie die kontraktile Herzfunktion wirksam verbesserte und die kardiale pathologische Remodeling reduzierte. Wir stellten fest, dass Lac-Phe die Herzfunktion bei Mäusen mit DCM durch die Regulation einer gestörten Lipidstoffwechselbalance verbesserte. Lac-Phe verringerte die Ansammlung von Lipidtröpfchen (LD) in Kardiomyozyten von Mäusen mit DCM und senkte den Cholesteringehalt im Herzen. Mechanistisch förderte Lac-Phe die Phosphorylierung und Aktivierung der adenosinmonophosphat-aktivierten Proteinkinase-alpha-1 (AMPKα1), wodurch die Phosphorylierung der 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMGCR) begünstigt wurde. Die Phosphorylierung von HMGCR verringert ihre Aktivität, was zu einer verminderten Cholesterinproduktion führt und somit die Störung des Lipidstoffwechsels in Kardiomyozyten verbessert. Diese Ergebnisse liefern eine theoretische Grundlage für die potenzielle Behandlung der DCM mit Lac-Phe.

Protokoll

The animal study protocol was approved by the Institutional Ethics Committee of Nanjing Drum Tower Hospital (Approval Number: 2025AE1065, 26 September 2025) and was conducted in accordance with the guidelines outlined in the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition), published by the National Institutes of Health of the United States.

Animals

Thirty 5-week-old male C57BL/6J mice were used in this study. After 1 week of adaptive feeding, all mice were housed with access to food and water under an alternating 12 h day-night cycle at a temperature of 22°C ± 2°C and humidity of 40%–60%. An HFD combined with low-dose STZ was used to establish the DCM mouse model (Figure 1A). Four weeks after initiation of high-fat diet (HFD; 60% fat, 20% protein, and 20% carbohydrate) feeding, mice were fasted overnight and subsequently administered streptozotocin (STZ; 8 mg/mL dissolved in citrate buffer, pH 4.5) via intraperitoneal injection at a dosage of 35 mg/kg/day for three consecutive days. Control group mice were fed a control diet (10% fat, 20% protein, and 70% carbohydrate) and received equivalent volumes of citrate buffer. Following 15 additional weeks of high-fat diet maintenance, mice meeting both criteria, random blood glucose of ≥13.3 mmol/L and left ventricular ejection fraction (LVEF) of <55%, were defined as successfully established DCM models. These validated DCM mice were numbered and randomly assigned to the DCM and DCM + Lac-Phe groups using a random number table. Approximately half of the mice failed to develop the model; these animals were euthanized in accordance with animal ethics requirements. In brief, mice were divided into three groups: Control, DCM, and DCM + Lac-Phe (n = 10 for each group). All 10 mice per group underwent echocardiography, body weight measurement, and OGTT. Following the 28-day treatment period, hearts were collected for subsequent analyses. There were 10 mice in each group. Of these, three mice per group were used for transcriptome sequencing, three were used for transmission electron microscopy and histological staining, and three were used for protein expression analysis. The remaining mouse in each group was reserved as a backup. After successful establishment of the DCM model, Lac-Phe was dissolved in normal saline to a final concentration of 10 mg/mL. Mice in the DCM + Lac-Phe group received intraperitoneal Lac-Phe at 50 mg/kg/day in an injection volume of 5 mL/kg, once daily for 28 consecutive days. Mice in the Control and DCM groups were administered an equivalent volume of normal saline as vehicle control.

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Figure 1. Lac-Phe improves cardiac function and pathological remodeling in mice with diabetic cardiomyopathy. (A) Schematic of the HFD/STZ-induced DCM mouse model and Lac-Phe treatment protocol. (B) Body weights of mice in the Control, DCM, and DCM + Lac-Phe groups during the 4-week treatment period; n = 10 per group. (C) Oral glucose tolerance test (OGTT) in the indicated groups; n = 10 per group. (D) Representative echocardiographic images at 0, 2, and 4 weeks of treatment. (E,F) Quantification of left ventricular ejection fraction (LVEF) (E) and fractional shortening (FS) (F); n = 10 per group. (G) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained heart sections. Scale bar = 1 mm. (H,I) Representative Masson’s trichrome staining of heart sections (H) and quantification of fibrotic area (I); n = 3 per group. Scale bar = 50 μm. (J,K) Representative wheat germ agglutinin (WGA) staining of heart sections (J) and quantification of relative cardiomyocyte area (K); n = 3 per group. Scale bar = 20 μm. Data are presented as the mean ± standard deviation. P < 0.05, **P < 0.001. Please click here to view a larger version of this figure.

Cardiac function

Following anesthesia with isoflurane inhalation, mice were secured in a supine position on a temperature-controlled platform (37°C). Left ventricular dimensions and mitral valve blood flow velocity during diastole and systole were measured using an echocardiography machine equipped with a 40 MHz transducer, from which LVEF and shortening fraction (FS) were calculated. Three consecutive cardiac cycles were collected from each mouse.

Cell treatment

H9c2 cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin–streptomycin at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO₂. Cells were passaged every 2–3 days upon reaching 70%–80% confluence. For experiments, cells were seeded in 10 cm dishes and then divided into three groups: Control, high glucose/palmitic acid (HG/PA), and HG/PA + Lac-Phe. Cells in the HG/PA and HG/PA + Lac-Phe groups were first exposed to 0.25 mM palmitic acid and 50 mM glucose for 24 h. Thereafter, cells in the HG/PA + Lac-Phe group were treated with 10 μg/mL Lac-Phe for an additional 24 h while HG/PA exposure was maintained; cells in the HG/PA group received an equivalent volume of PBS under the same HG/PA conditions. In the p-AMPK inhibition experiments, 10 μM AMPK-IN-3 (dissolved in DMSO) was added simultaneously with Lac-Phe for 24 h, and the corresponding control groups received an equal volume of DMSO. For the atorvastatin experiments, H9c2 cells under HG/PA conditions were treated with 10 μM atorvastatin for 24 h, either alone or in combination with 10 μg/mL Lac-Phe.

Histological staining

After 28 days of Lac-Phe administration, mouse hearts were harvested and immersion-fixed in 4% paraformaldehyde (pH 7.4) for 24 h. Fixed cardiac tissues were paraffin-embedded and sectioned into 6-μm-thick slices. Tissue sections were stained with hematoxylin and eosin, wheat germ agglutinin, and Masson’s trichrome. All staining procedures were performed strictly following the manufacturers’ protocols. Whole-slide imaging was performed at 20× magnification using a high-resolution brightfield microscope equipped with a digital camera system.

Western blot analysis

Protein concentration was determined using the Bradford assay. Tissue lysates were resolved by SDS-PAGE on 10% (w/v) acrylamide gels and electrophoretically transferred to polyvinylidene difluoride membranes. Nonspecific binding sites were blocked with 5% bovine serum albumin for 2 h at room temperature. Membranes were then incubated overnight at 4°C with primary antibodies (diluted 1:1,000), followed by six washes with TBST (5 min each) on a shaker. The membranes were then incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (diluted 1:5,000) for 2 h at room temperature, followed by another six washes with TBST (5 min each). Protein bands were visualized using an enhanced chemiluminescence reagent kit. Quantification of western blot results was performed by densitometric analysis using ImageJ software. All antibodies used in this study are listed in the Table of Materials.

Transcriptomics

Total RNA was isolated from cardiac tissue of C57BL/6J mice using TRIzol Reagent and RNeasy mini kits. RNA quality was evaluated using a 2100 bioanalyzer, demonstrating high RNA purity and integrity. RNA-seq libraries were prepared according to the VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit and sequenced using an Illumina NovaSeq 6000 System (single-read, 150 bp). Differentially expressed genes were identified using DESeq2, with an adjusted P value < 0.05 and an absolute log₂ fold change > 1 considered statistically significant. Gene Ontology (GO) enrichment analysis was conducted on differentially expressed genes, and the significance of enrichment of differentially expressed genes in GO terms was calculated using the hypergeometric distribution algorithm.

Oil Red O staining and LD540 lipid staining

Cardiac tissue was embedded in OCT compound and then cut into 10-μm-thick sections. The frozen sections were equilibrated at room temperature for 30 min and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min. After washing with PBS, the sections were placed in 60% isopropyl alcohol for 15 s and covered with Oil Red O working solution for 30 min. The sections were then treated with 60% isopropyl alcohol for 15 s and washed three times with PBS. For LD540 lipid staining, H9c2 cells were washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min at room temperature. The cells were then incubated with 10 μM LD540 for 30 min at room temperature.

Transmission electron microscopy (TEM)

Fresh mouse heart tissues were cut into 1–2 mm3 pieces, fixed in electron microscope fixative at 4°C for 4 h, then washed with double-distilled water and immersed in ethanol solutions of progressively increasing concentrations. The samples were embedded, sectioned, and then observed under a transmission electron microscope.

Total cholesterol (TC) content

Total cholesterol (TC) levels in serum and H9c2 cell samples were measured using the Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kit according to the manufacturer’s instructions.

Oral Glucose Tolerance Test (OGTT)

Mice were fasted for 14 h (from 19:00 to 9:00) and gavaged with glucose (20% stock, 2 g/kg). Blood glucose levels were determined using blood collected from the tail vein at 0, 15, 30, 60, and 120 min after gavage.

Cell counting kit-8 (CCK-8) measurement

CCK-8 was used to measure cell viability. H9c2 cells were seeded into 96-well plates at an initial density of 3 × 104 cells/well. After treatment with different concentrations of Lac-Phe under HG/PA conditions for 24 h, 10 μL of the kit reagent was added to 100 μL of culture medium per well, followed by incubation at 37°C for 4 h. The absorbance was measured at 450 nm using a multimode microplate reader to obtain the optical density (OD) value.

Molecular docking

The crystal structures of Lac-Phe and AMPKα1 were downloaded from PubChem26. The molecular docking process was carried out using CB-DOCK227.

Statistical analysis

All echocardiographic measurements, histological staining, and image quantifications were performed by investigators blinded to group assignment. All data analyses were performed using Prism and SPSS 20.0. Each experiment was repeated at least three times, and the data were presented as the mean ± standard deviation. Homogeneity of variance was assessed using Levene’s test. Normality was confirmed by graphical inspection of residuals. Comparisons among multiple groups were conducted using one-way analysis of variance, followed by Tukey's post hoc test for pairwise comparisons. For OGTT data, two-way repeated-measures ANOVA was used, with group as the between-subjects factor and time as the within-subjects factor, followed by Bonferroni's post hoc test. P < 0.05 was considered statistically significant.

Ergebnisse

Lac-Phe improves cardiac function in diabetic cardiomyopathy mice

We induced DCM in C57BL/6J mice using an HFD combined with STZ injections (Figure 1A) and randomly assigned the successfully established DCM mice to an untreated group (DCM group) and a Lac-Phe treatment group, with control C57BL/6J mice serving as the negative control. According to the study by Li et al.21, we selected 50 mg/kg as the therapeutic dose of Lac-Phe. After successful model establishment, the Lac-Phe treatment group received four weeks of exogenous Lac-Phe injections, while the untreated group received injections of an equivalent volume of saline. Compared with the DCM group, mice with diabetic cardiomyopathy treated with Lac-Phe exhibited a significant reduction in body weight after four weeks (Figure 1B). OGTT revealed that, compared with the negative control group, mice in the DCM group had significantly elevated blood glucose levels at all measured time points, indicating impaired glucose tolerance. In contrast, DCM mice treated with Lac-Phe showed improved glucose tolerance (Figure 1C). Echocardiographic analysis revealed that, compared with negative control mice, mice with DCM exhibited significantly reduced LVEF and FS (Figure 1D–F). Treatment with Lac-Phe increased LVEF and FS in DCM mice. Histopathological analysis using H&E staining showed pathological hypertrophy in the cardiac tissue of DCM mice compared with control mice (Figure 1G). Lac-Phe treatment markedly alleviated myocardial hypertrophy. Masson’s trichrome staining further demonstrated that Lac-Phe significantly alleviated myocardial fibrosis in DCM hearts (Figure 1H,I). WGA staining indicated that Lac-Phe significantly reduced the cross-sectional area of cardiomyocytes in DCM hearts (Figure 1J,K). These experiments demonstrate that exogenous administration of Lac-Phe effectively improves cardiac function and ameliorates pathological remodeling in mice with DCM.

Lac-Phe ameliorates dysregulated lipid metabolism in DCM

To further elucidate the mechanism of Lac-Phe in DCM, we performed transcriptomic analysis of mouse cardiac tissues. Following data acquisition, GO and KEGG pathway analyses were conducted. GSEA of the fatty acid metabolic process and KEGG pathway enrichment analysis indicated alterations in pathways related to lipid metabolism (Figure 2A,B). To further investigate how Lac-Phe functions in the hearts of DCM mice, we conducted TEM analysis (Figure 2C,D) to examine whether Lac-Phe treatment altered the ultrastructural morphology of the hearts of DCM mice. TEM imaging revealed a significant increase in LD density within the hearts of DCM mice compared with control mice, whereas Lac-Phe administration effectively reduced this LD density. Given the established significance of lipid metabolism dysregulation in DCM, we further assessed cardiac lipid accumulation using Oil Red O staining (Figure 2E,F). Histological analysis demonstrated markedly increased lipid accumulation in the hearts of DCM mice, whereas Lac-Phe treatment reduced this lipid accumulation. Lac-Phe treatment also reduced the TC level in the serum of DCM mice (Figure 2G). To select an appropriate dose of Lac-Phe for the in vitro experiments, we employed the CCK-8 assay to measure the viability of H9c2 cells treated with various concentrations of Lac-Phe under HG/PA conditions (Figure 2H). H9c2 cells treated with Lac-Phe at a concentration of 10 μg/mL under HG/PA conditions exhibited the highest survival rate among the tested concentrations. Thus, we selected 10 μg/mL Lac-Phe for the subsequent experiments. H9c2 cells exposed to HG/PA showed significant lipid accumulation, as demonstrated by LD540 staining and fluorescence quantification (Figure 2I,J), and TC content was also increased (Figure 2K). Lac-Phe treatment reversed these changes, significantly reducing both lipid accumulation and TC levels in H9c2 cells. Collectively, these experimental findings demonstrate that Lac-Phe effectively attenuates cardiac lipid accumulation and ameliorates lipid metabolism dysregulation in DCM mice and reduces lipid accumulation and TC levels in HG/PA-treated H9c2 cells.

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Figure 2. Lac-Phe ameliorates dysregulated lipid metabolism in diabetic cardiomyopathy. (A) Gene set enrichment analysis (GSEA) of the fatty acid metabolic process in the Control and DCM groups. (B) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis comparing the DCM and DCM + Lac-Phe groups. (C) Representative transmission electron microscopy (TEM) images of cardiac tissues, with red arrows indicating lipid droplets (LDs). Scale bar = 2 μm. (D) Quantification of the mean number of LDs per 100 μm2; n = 3 per group. (E,F) Representative Oil Red O staining of cardiac tissues (E) and quantification of the relative Oil Red O-positive area (F); n = 3 per group. Scale bar = 20 μm. (G) Relative total cholesterol (TC) levels in serum from the indicated groups; n = 3 per group. (H) Cell viability measured by the CCK-8 assay in H9c2 cells treated with 0, 1, 5, 10, or 20 μg/mL Lac-Phe under HG/PA conditions. (I,J) Representative LD540 staining of H9c2 cells (I) and quantification of mean LD540 fluorescence intensity (J); n = 3 per group. Scale bars = 200 μm. (K) TC levels in H9c2 cells from the indicated groups; n = 3 per group. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Please click here to view a larger version of this figure.

Lac-Phe increases HMGCR phosphorylation in the hearts of DCM mice and H9c2 cells

To identify potential targets through which Lac-Phe improves lipid metabolism, we screened DCM-associated proteins using GeneCards28 and predicted proteins potentially interacting with Lac-Phe using SwissTargetPrediction29 (Figure 3A). By comparing the results, we identified six potential target genes (Figure 3B). Analysis of these six genes revealed that HMGCR is a core regulator of cholesterol metabolism and also plays a central role in DCM (Figure 3C)30. To determine whether Lac-Phe regulates lipid metabolism via HMGCR, we first examined the p-HMGCR/HMGCR ratio in mouse hearts. Western blot analysis revealed that the p-HMGCR/HMGCR ratio was decreased in the hearts of DCM mice, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 3D,E). These findings are consistent with increased HMGCR phosphorylation and reduced HMGCR activity following Lac-Phe treatment. In vitro experiments showed that, under HG/PA conditions, the p-HMGCR/HMGCR ratio was decreased in H9c2 cells, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 3F,G). These results demonstrate that Lac-Phe increases HMGCR phosphorylation in the hearts of DCM mice and in HG/PA-treated H9c2 cells, supporting the involvement of HMGCR in the effects of Lac-Phe on lipid metabolism.

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Figure 3. Lac-Phe increases HMGCR phosphorylation in the hearts of mice with diabetic cardiomyopathy and in H9c2 cells. (A) Venn diagram showing the overlap between DCM-associated proteins and predicted Lac-Phe-associated proteins. (B) Six overlapping proteins associated with DCM and Lac-Phe. (C) Protein-protein interaction network showing HMGCR within the network of DCM-associated proteins. (D,E) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in cardiac tissues from the indicated groups (D) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (E); n = 3 per group. (F,G) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in H9c2 cells from the indicated groups (F) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (G); n = 3 per group. β-Tubulin was used as the loading control. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05. Please click here to view a larger version of this figure.

Lac-Phe combined with atorvastatin improves lipid metabolism in H9c2 cells

To further evaluate the effect of Lac-Phe on lipid metabolism via HMGCR, we used atorvastatin as a control. In vitro experiments showed that, under HG/PA conditions, combined treatment with Lac-Phe and atorvastatin produced a greater reduction in lipid accumulation than atorvastatin treatment alone. LD540 staining and fluorescence quantification demonstrated that combined treatment with Lac-Phe and atorvastatin reduced LD accumulation in H9c2 cells (Figure 4A,B). TC content measurement showed a similar effect (Figure 4C). Western blot analysis showed that combined treatment with Lac-Phe and atorvastatin significantly increased the p-HMGCR/HMGCR ratio (Figure 4D,E). These results indicate that combined Lac-Phe and atorvastatin treatment is associated with reduced lipid accumulation and TC levels and increased HMGCR phosphorylation in H9c2 cells.

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Figure 4. Lac-Phe combined with atorvastatin improves lipid metabolism in H9c2 cells. (A,B) Representative LD540 staining of H9c2 cells from the indicated treatment groups (A) and quantification of mean LD540 fluorescence intensity (B); n = 3 per group. Scale bar = 200 μm. (C) Total cholesterol (TC) levels in H9c2 cells from the indicated treatment groups; n = 3 per group. (D,E) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in H9c2 cells from the indicated treatment groups (D) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (E); n = 3 per group. β-Tubulin was used as the loading control. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001. Please click here to view a larger version of this figure.

Lac-Phe increases AMPKα1 phosphorylation

To further explore the molecular mechanism by which Lac-Phe regulates HMGCR, we reanalyzed the mouse cardiac transcriptome data. Through KEGG analysis of the transcriptomic data, we identified 160 differentially enriched pathways between the DCM and Control groups and 89 differentially enriched pathways between the DCM and DCM + Lac-Phe groups (Figure 5A). Sixty pathways overlapped between these two comparisons. From these 60 overlapping pathways, we selected the AMPK pathway. AMPK plays a critical role in regulating lipid metabolism in DCM31. Furthermore, AMPK is upstream of HMGCR (Figure 5B). We hypothesized that Lac-Phe might regulate HMGCR by modulating AMPK, ultimately improving lipid metabolism. To test this hypothesis, we first performed molecular docking of AMPKα1 and Lac-Phe using CB-DOCK2. The molecular docking results showed that the best-ranked predicted binding conformation between Lac-Phe and AMPKα1 had an affinity of −7.6 kcal/mol (Figure 5C). These results suggest a potential interaction between Lac-Phe and AMPKα1 but do not establish direct intracellular binding. To determine whether Lac-Phe affects the AMPK pathway in DCM, we examined AMPKα1 phosphorylation in the hearts of DCM mice. Western blot analysis revealed that the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio was decreased in the hearts of DCM mice, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 5D,E). In vitro experiments showed that, under HG/PA conditions, the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio was decreased in H9c2 cells, whereas Lac-Phe treatment increased this ratio (Figure 5F,G). These findings indicate that Lac-Phe increases AMPKα1 phosphorylation in DCM mouse hearts and HG/PA-treated H9c2 cells.

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Figure 5. Lac-Phe increases AMPKα1 phosphorylation in the hearts of mice with diabetic cardiomyopathy and in H9c2 cells. (A) Venn diagram showing the overlap between pathway enrichment results for the DCM/Control and DCM + Lac-Phe/DCM comparisons. (B) Schematic illustrating AMPK and HMGCR phosphorylation and the associated inhibition of cholesterol synthesis. (C) Predicted three-dimensional molecular docking interaction between Lac-Phe and AMPKα1; binding affinity = −7.6 kcal/mol. (D,E) Representative western blot images of p-AMPKα1 and AMPKα1 in cardiac tissues from the indicated groups (D) and quantification of the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (E); n = 3 per group. (F,G) Representative western blot images of p-AMPKα1 and AMPKα1 in H9c2 cells from the indicated groups (F) and quantification of the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (G); n = 3 per group. GAPDH was used as the loading control. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01. Please click here to view a larger version of this figure.

AMPK inhibition attenuates Lac-Phe-mediated HMGCR phosphorylation and improvement of lipid metabolism in H9c2 cells

We then added a p-AMPK inhibitor to H9c2 cells receiving Lac-Phe treatment. The p-AMPK inhibitor decreased the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (Figure 6A,B) and reduced the p-HMGCR/HMGCR ratio (Figure 6C,D). These findings indicate that inhibition of AMPK phosphorylation is accompanied by reduced HMGCR phosphorylation during Lac-Phe treatment. The p-AMPK inhibitor also diminished the effect of Lac-Phe on lipid metabolism. LD540 staining and fluorescence quantification showed increased lipid accumulation in H9c2 cells treated with the p-AMPK inhibitor compared with cells receiving Lac-Phe without AMPK inhibition (Figure 6E,F). TC levels in H9c2 cells also increased following AMPK inhibition (Figure 6G). These results collectively support the involvement of AMPKα1/HMGCR signaling in the effects of Lac-Phe on lipid metabolism. Lac-Phe increased AMPKα1 phosphorylation, which was associated with increased HMGCR phosphorylation and reduced lipid accumulation and TC levels. Inhibition of AMPK attenuated these effects in H9c2 cells, supporting the hypothesis that Lac-Phe improves lipid metabolism through regulation of the AMPKα1/HMGCR pathway.

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Figure 6. AMPK inhibition attenuates the effects of Lac-Phe on HMGCR phosphorylation and lipid accumulation in H9c2 cells. (A,B) Representative western blot images of p-AMPKα1 and AMPKα1 in H9c2 cells treated with HG/PA, Lac-Phe, and/or AMPK-IN-3 as indicated (A) and quantification of the p-AMPKα1/AMPKα1 ratio (B); n = 3 per group. (C,D) Representative western blot images of p-HMGCR and HMGCR in H9c2 cells from the indicated treatment groups (C) and quantification of the p-HMGCR/HMGCR ratio (D); n = 3 per group. GAPDH and β-tubulin were used as loading controls in (A) and (C), respectively. (E,F) Representative LD540 staining of H9c2 cells from the indicated treatment groups (E) and quantification of mean LD540 fluorescence intensity (F); n = 3 per group. Scale bar = 200 μm. (G) Total cholesterol (TC) levels in H9c2 cells from the indicated treatment groups; n = 3 per group. Data are presented as the mean ± standard deviation. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Please click here to view a larger version of this figure.

Collectively, the findings from the in vivo and in vitro experiments support a proposed mechanism whereby Lac-Phe increases AMPKα1 and HMGCR phosphorylation, which is associated with reduced cholesterol levels and lipid accumulation and improved cardiac function and pathological remodeling in DCM. The proposed AMPKα1/HMGCR pathway underlying the effects of Lac-Phe is summarized schematically in Figure 7.

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Figure 7. Proposed mechanism by which Lac-Phe improves lipid metabolism in diabetic cardiomyopathy through the AMPK/HMGCR pathway. Schematic illustrating the proposed mechanism whereby Lac-Phe promotes AMPKα1 phosphorylation, followed by HMGCR phosphorylation, which is associated with reduced lipid droplet accumulation and lipotoxicity in diabetic cardiomyopathy. AMPK, AMP-activated protein kinase; HMGCR, HMG-CoA reductase; LD, lipid droplet. Please click here to view a larger version of this figure.

Data Availability:

The raw data supporting the findings of this study have been deposited in Zenodo and are publicly available at https://zenodo.org/records/21991371 

Diskussion

In dieser Studie liefern wir Hinweise auf eine therapeutische Wirkung von Lac-Phe bei DCM. Lac-Phe verbesserte die kardiale Remodelung und kardiale Dysfunktion bei DCM, während es die Cholesterinproduktion in Kardiomyozyten verringerte und das Ungleichgewicht des Lipidstoffwechsels verbesserte. Mechanistisch gesehen erhöhte Lac-Phe die Phosphorylierung von AMPKα1. Anschließend war die erhöhte Phosphorylierung von AMPKα1 mit einer erhöhten Phosphorylierung und Hemmung seines downstream liegenden Zielproteins HMGCR assoziiert, was zu einer Verringerung der Cholesterinsynthese und letztlich zur Verbesserung des Ungleichgewichts des Lipidstoffwechsels in Kardiomyozyten führte. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass Lac-Phe den kardialen Lipidstoffwechsel bei DCM über den AMPK/HMGCR-Signalweg verbessert. Eine schematische Übersicht der wichtigsten Ergebnisse und des vorgeschlagenen Wirkmechanismus ist in Abbildung 7 dargestellt.

Ein Ungleichgewicht des Lipidstoffwechsels ist einer der Schlüsselfaktoren, die zu myokardialen Schäden bei DCM beitragen15. Eine übermäßige Lipidakkumulation in Kardiomyozyten führt zu Lipotoxizität, was eine Dysfunktion der Kardiomyozyten und eine pathologische kardiale Remodeling verursacht16. Lang anhaltende Hyperglykämie und Adipositas sind wichtige Faktoren, die zu Störungen des Lipidstoffwechsels führen25. Lac-Phe wurde als endogener Wirkstoff identifiziert, der die Nahrungsaufnahme effektiv reduzieren, Adipositas und Körpergewicht senken sowie die Glukosehomöostase verbessern kann21. Neuere Berichte zeigen außerdem, dass Lac-Phe den Lipidstoffwechsel in Mikroglia/Makrophagen während einer Rückenmarkverletzung regulieren kann23, wodurch belegt wird, dass Lac-Phe den Lipidstoffwechsel auch in einem anderen Krankheitsmodell beeinflusst. Als endogener Metabolit hat die Rolle von Lac-Phe bei Stoffwechselerkrankungen erhebliches Interesse geweckt. Die Rolle von Lac-Phe bei DCM ist jedoch bisher noch nicht vollständig untersucht worden. Unsere Studie enthüllte eine Funktion von Lac-Phe im Lipidstoffwechsel von Kardiomyozyten bei DCM. Durch transkriptomische Analysen fanden wir heraus, dass die Behandlung mit Lac-Phe mit Veränderungen in stoffwechselbezogenen Wegen im Zusammenhang mit Lipiden in den Herzen von DCM-Mäusen assoziiert war. Die Fettrot-O-Färbung und die TEM-Beobachtungen bestätigten eine verminderte Lipidakkumulation in den Herzen von DCM-Mäusen nach Behandlung mit Lac-Phe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Lac-Phe kardioprotektive Effekte bei DCM entfaltet, indem es die kardiale Lipidakkumulation verringert und das pathologische Remodeling abschwächt. In-vitro-Experimente zeigten zudem, dass die Gabe von Lac-Phe die Lipidakkumulation in H9c2-Zellen unter HG/PA-Bedingungen linderte.

HMGCR ist ein NADPH-abhängiges, geschwindigkeitsbestimmendes Enzym im Mevalonat-Stoffwechselweg30. HMGCR katalysiert die Umwandlung von HMG-CoA in Mevalonat, einen entscheidenden Schritt in der Cholesterinbiosynthese30,31,32. HMGCR stellt ein therapeutisches Ziel dar, das für kardiovaskuläre Erkrankungen und diabetische Kardiomyopathie (DCM) von Relevanz ist33. Klinisch ist die Hemmung von HMGCR eine etablierte Strategie zur Verringerung des kardiovaskulären Risikos34. Unsere experimentellen Daten zeigen, dass Lac-Phe die Phosphorylierung von HMGCR im Herzen von Mäusen mit Typ-2-Diabetes erhöht, was mit einer Hemmung der HMGCR-Aktivität und einer verminderten Cholesterinsynthese übereinstimmt. In-vitro-Studien zeigten zudem, dass die Gabe von Lac-Phe die Phosphorylierung von HMGCR in H9c2-Zellen unter Bedingungen mit hohem Glukosespiegel und Palmitat (HG/PA) erhöhte, begleitet von gesenkten Cholesterinspiegeln. Die Kombination von Lac-Phe mit dem cholesterinsenkenden Wirkstoff Atorvastatin führte unter den untersuchten experimentellen Bedingungen zu stärkeren Effekten als Atorvastatin allein. In H9c2-Zellen, die mit Atorvastatin behandelt wurden, führte die Zugabe von Lac-Phe zu einer erhöhten Phosphorylierung von HMGCR und einer verminderten Lipidakkumulation. Diese Ergebnisse untermauern die Machbarkeit, über Lac-Phe gezielt die Phosphorylierung von HMGCR anzusteuern, um die Cholesterinproduktion zu senken und das Lipidstoffwechselgleichgewicht bei DCM wiederherzustellen. Ob Lac-Phe jedoch eine sichere und wirksame therapeutische Strategie für Patienten mit DCM darstellen könnte, bedarf weiterer Untersuchungen.

AMPK, ein Schlüsselenzym im mitochondrialen Energiestoffwechsel, steht im Mittelpunkt der Erforschung metabolischer Erkrankungen wie Diabetes35,36. Durch die Regulation von Phosphorylierung und Dephosphorylierung spielt AMPK eine zentrale Rolle im Herz-Lipidstoffwechsel. Phosphoryliertes AMPK repräsentiert seine aktive Form37. p-AMPK fördert den Eintritt von Fettsäuren in die Mitochondrien für die Fettsäureoxidation (FAO), indem es CPT-1 reguliert38. In Übereinstimmung mit früheren Studien39 zeigten unsere Ergebnisse, dass eine erhöhte AMPK-Phosphorylierung mit einer gesteigerten HMGCR-Phosphorylierung und einer verminderten Cholesterinsynthese assoziiert war. Bei Mäusen mit durch STZ und HFD induzierter DCM kann anhaltende Hyperglykämie zu Veränderungen der p-AMPK-Spiegel im Herzen führen40. Im frühen Stadium von Diabetes, wenn die Herzfunktion noch unverändert ist, können die p-AMPK-Spiegel im Herzen unbeeinflusst bleiben10,37,41. Bei fortgeschrittenem Diabetes mit anhaltender Hyperglykämie über mehr als 8 Wochen beginnt die pathologische Herzzellumgestaltung und die p-AMPK-Spiegel können abnehmen10. Die Aufrechterhaltung der AMPK-Aktivierung wurde als wirksame Strategie zur Prävention von DCM vorgeschlagen10,42. Metformin, ein weit verbreitetes Medikament zur Behandlung von Typ-2-Diabetes, wurde als Aktivator des AMPK-Wegs gezeigt, hat jedoch laut Berichten eine neutrale Wirkung auf das Herz43,44. Interessanterweise kann sowohl akute als auch chronische Gabe von Metformin die Lac-Phe-Spiegel erhöhen22. Diese Beobachtungen legen die Möglichkeit nahe, dass Lac-Phe an metabolischen Signalwegen im Zusammenhang mit der AMPK-Aktivierung beteiligt sein könnte; die vorliegende Studie belegt jedoch nicht, dass exogenes Lac-Phe eine spezifischere oder sicherere Wirkung als Metformin entfaltet.

In unserer Studie war die AMPKα1-Phosphorylierung im Spätstadium des DCM-Modells deutlich verringert, wie in Abbildung 5D,E gezeigt, ein Befund, der mit früheren Untersuchungen übereinstimmt42. Die transkriptomische Analyse zeigte Veränderungen des AMPK-Signalwegs in den Herzen von mit Lac-Phe behandelten Typ-2-Diabetiker-Mäusen, und die Western-Blot-Analyse zeigte eine erhöhte AMPKα1-Phosphorylierung nach Lac-Phe-Behandlung. Molekulares Docking deutete auf eine mögliche Interaktion zwischen Lac-Phe und AMPKα1 hin, was mit einer kürzlich veröffentlichten Studie übereinstimmt23. Wichtig ist jedoch, dass molekulares Docking allein keine direkte intrazelluläre Bindung zwischen Lac-Phe und AMPKα1 belegt. In-vitro-Experimente zeigten, dass die Behandlung mit dem AMPK-Inhibitor die AMPKα1-Phosphorylierung unterdrückte und mit einer verminderten HMGCR-Phosphorylierung einherging. Nach Zugabe des AMPK-Inhibitors wurden die Wirkungen von Lac-Phe abgeschwächt, was mit einer erhöhten Lipidakkumulation und einem gesteigerten Cholesteringehalt in H9c2-Zellen einherging. Insgesamt unterstützen diese Ergebnisse die Beteiligung des AMPKα1/HMGCR-Signalwegs an den Effekten von Lac-Phe auf den Lipidstoffwechsel. Lac-Phe erhöhte die AMPKα1-Phosphorylierung, was mit einer erhöhten HMGCR-Phosphorylierung, niedrigeren Cholesterinspiegeln und verminderter Lipidakkumulation assoziiert war; die Hemmung von AMPK schwächte diese Effekte ab.

Diese Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens wurden alle Tierversuche an männlichen Mäusen durchgeführt. Obwohl wir die therapeutische Wirkung von Lac-Phe bei DCM in männlichen C57BL/6J-Mäusen nachweisen konnten, ist das Geschlecht ein wichtiger Faktor, der kardiovaskuläre Erkrankungen beeinflusst45. Daher ist unklar, ob Lac-Phe dieselben Effekte auch bei weiblichen Mäusen hervorruft. Zweitens wurde die Transkriptomsequenzierung an Gesamtherzproben durchgeführt, wodurch zelltypspezifische Veränderungen im Herzen nach Lac-Phe-Behandlung möglicherweise übersehen wurden. Die Einzelzellsequenzierung könnte tiefere Einblicke in die zelluläre und molekulare Heterogenität der beobachteten Effekte ermöglichen46,47 und stellt einen alternativen Ansatz zur weiteren Untersuchung dieser Hypothese dar. Schließlich konnten wir aufgrund der technischen Grenzen des in dieser Studie verwendeten Ultraschallgeräts die diastolische Herzfunktion bei Mäusen nicht bewerten. Weitere Studien sind daher erforderlich, um die therapeutischen Wirkungen von Lac-Phe auf die DCM zu klären, potenzielle geschlechtsabhängige Effekte zu bewerten, zelltypspezifische Reaktionen zu untersuchen, die diastolische Funktion zu beurteilen und die zugrundeliegenden Mechanismen der beobachteten Effekte weiter aufzuklären. Zusammenfassend liefert diese Studie Hinweise darauf, dass Lac-Phe ein potenzieller endogener Metabolit von Interesse für die Behandlung der DCM sein könnte. Darüber hinaus stützen unsere Ergebnisse einen vorgeschlagenen Mechanismus, bei dem Lac-Phe die Lipidakkumulation in Kardiomyozyten während der DCM über den AMPKα1/HMGCR-Weg reduziert. Insbesondere erhöhte Lac-Phe die Phosphorylierung von AMPKα1, die mit einer erhöhten Phosphorylierung von HMGCR, einer verminderten Cholesterinsynthese und Lipidakkumulation sowie einer Verbesserung des pathologischen Remodelings assoziiert war. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die molekulare Interaktion zwischen Lac-Phe und AMPKα1 zu klären und die möglichen translationalen Anwendungen dieser Ergebnisse zu bestimmen.

Offenlegungen

Interessenkonflikt:

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir möchten den Forschern und Mitarbeitern des Klinischen Kollegs des Nanjing Drum Tower Hospitals und des Anschlusskrankenhauses der Medizinischen Fakultät der Nanjing-Universität für ihre technische Unterstützung herzlich danken. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (Förderkennzeichen 81870291 und 82300384), der Chinesischen Stiftung für postdoktorale Wissenschaft (Förderkennzeichen 2023M731625) sowie der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Jiangsu (Förderkennzeichen BK20220175) finanziert. Wir danken außerdem dem Institut für Fortgeschrittene Synthese der Nanjing Tech University für die zur Verfügung gestellten Ressourcen und die kooperative Unterstützung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AMPK-IN-3 (p-AMPK-Inhibitor)MedChemExpress (MCE)HY-132921Wird bei AMPK-Inhibitionsexperimenten in einer Konzentration von 10 μM verwendet, um die AMPK-Signalübertragung in mit Lac-Phe behandelten Zellen zu hemmen.
Amplex Red Cholesterin- und Cholesterylester-Assay-KitBeyotimeS0211SWird zur Bestimmung der Gesamtcholesterinwerte in Serum- und H9c2-Zellproben verwendet.
Anti-AMPKα1Cell Signaling Technology2532; RRID: AB_330331Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von AMPKα1.
Anti-GAPDHCell Signaling Technology5174; RRID: AB_10622025Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von GAPDH.
Anti-HMGCRAbcamab174830; RRID: AB_2749818Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von HMGCR.
Anti-p-AMPKα1 (Thr172)Cell Signaling Technology2535; RRID: AB_331250Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von phosphoryliertem AMPKα1.
Anti-p-HMGCR (Ser872)Abcamab124350Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von phosphoryliertem HMGCR.
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gekoppelter AntikörperCell Signaling Technology7074; RRID: AB_2099233Wird für die Western-Blot-Detektion in einer Verdünnung von 1:5.000 verwendet.
Anti-β-TubulinCell Signaling Technology2128; RRID: AB_823664Primärantikörper für die Western-Blot-Analyse von β-Tubulin.
AtorvastatinMedChemExpress (MCE)HY-17379Wird allein oder in Kombination mit Lac-Phe verwendet, um die Effekte auf Lipidakkumulation, Gesamtcholesterinspiegel und HMGCR-Phosphorylierung in mit HG/PA behandelten H9c2-Zellen zu untersuchen.
RinderserumalbuminSigma-AldrichA7906Wird in einer Konzentration von 5 % verwendet, um unspezifische Bindungen während der Western-Blot-Analyse zu blockieren.
Bradford-Assay-Reagenz/KitThermo Fisher Scientific23200Wird zur Bestimmung der Proteinkonzentration vor der Western-Blot-Analyse verwendet.
C57BL/6J-Mäuse (5 Wochen alt, männlich)Model Animal Research Center of Nanjing UniversityN/VWurden verwendet, um das durch HFD/STZ induzierte Mausmodell der diabetischen Kardiomyopathie zu etablieren.
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)SharebioSB-CCK8SWird verwendet, um die Lebensfähigkeit von H9c2-Zellen nach Behandlung zu messen.
CitratpufferEigenherstellungN/VWird bei pH 4,5 hergestellt und dient zum Lösen von STZ sowie als entsprechendes Fahrzeugkontrollmittel.
Kontrollnahrung (10 % Fett, 20 % Protein, 70 % Kohlenhydrate)Research Diets, Inc.D12450JWird als Nahrung für Mäuse der Kontrollgruppe verwendet.
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichN/VWird für die HG/PA-Zellbehandlung und für den oralken Glukosetoleranztest verwendet.
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD2650Wird als Lösungsmittel für AMPK-IN-3 und als entsprechendes Fahrzeugkontrollmittel verwendet.
Dulbecco’s modifiziertes Eagle’s MediumGibco, Thermo Fisher Scientific11965092Wird als Basalkulturmedium für H9c2-Zellen verwendet.
Echokardiographiegerät mit 40-MHz-WandlerFUJIFILM VisualSonicsVevo 3100 LT; 40-MHz-WandlerWird verwendet, um die Dimensionen des linken Ventrikels und die Blutflussgeschwindigkeit an der Mitralklappe zu messen sowie LVEF und FS abzuleiten.
Elektronenmikroskopie-FixiermittelServiceBioG1102Wird verwendet, um frisches Herzmuskelgewebe von Mäusen für die Transmissionselektronenmikroskopie zu fixieren.
ÄthanolSigma-AldrichE7023Wird in schrittweise steigenden Konzentrationen zur Dehydrierung während der Probenvorbereitung für die Transmissionselektronenmikroskopie verwendet.
Fötales RinderserumGibco, Thermo Fisher Scientific10099141Wird in einer Konzentration von 10 % zur Supplementierung des Kulturmediums für H9c2-Zellen verwendet.
H9c2-ZelllinieSunncellRRID: CVCL_0286Wird als in-vitro-Kardiomyozytenmodell für HG/PA- und Lac-Phe-Behandlungsversuche verwendet.
Hämatoxylin- und Eosin-FärbungServiceBioG1005-1/2Wird für die histologische Beurteilung von Herzmuskelgewebe verwendet.
Diät mit hohem Fettgehalt (60 kcal % Fett)Research Diets, Inc.D12492Wird zusammen mit niedrig dosiertem STZ verwendet, um das Mausmodell der diabetischen Kardiomyopathie zu etablieren.
Hellfeldmikroskop mit hoher AuflösungLeicaDM2500Wird für die Ganzpräparat-Aufnahme von gefärbtem Herzmuskelgewebe bei einer 20×-Vergrößerung verwendet.
ImageJNational Institutes of HealthN/VWird für die dichtometrische Quantifizierung der Western-Blot-Ergebnisse verwendet.
IsfluranSigma-Aldrich792632Wird zur Anästhesie während der Echokardiographie bei Mäusen verwendet.
IsopropanolSigma-AldrichI9516Wird in einer Konzentration von 60 % während der Oil-Red-O-Färbung von gefrorenen Herzgewebeschnitten verwendet.
LD540-LipidfarbstoffBeyotimeC2050S-1Wird in einer Konzentration von 10 μM zur Färbung intrazellulärer Lipide verwendet.
Masson’s Trichrom-FärbungServiceBioG1006Wird für die histologische Färbung von Herzmuskelgewebe verwendet.
N-Lactoyl-Phenylalanin (Lac-Phe)MedChemExpress (MCE)HY-146098Wird DCM-Mäusen verabreicht und zur Behandlung von H9c2-Zellen verwendet, die HG/PA ausgesetzt waren.
Oil-Red-O-ArbeitslösungServiceBioG1015-100MLWird zur Färbung von Lipiden in gefrorenen Schnitten von Herzmuskelgewebe verwendet.
Omni-ECL-Effizientes Licht-Chemilumineszenz-KitEpiZymeSQ203LWird zur chemilumineszenten Visualisierung von Proteinbanden nach dem Western Blot verwendet.
PalmitinsäureSigma-AldrichP0500Wird in einer Konzentration von 0,25 mM zusammen mit hohem Glukosegehalt verwendet, um das HG/PA-behandelte H9c2-Zellmodell zu etablieren.
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Wird als 4 %ige Lösung hergestellt und dient zur Fixierung von Herzmuskelgewebe und Zellen vor histologischen oder Lipidfärbungen.
Penicillin-StreptomycinGibco, Thermo Fisher Scientific15140122Wird im H9c2-Zellkulturmedium in einer Konzentration von 1 % verwendet.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10010023Wird zum Waschen während Färbeprozeduren und als entsprechendes Fahrzeugkontrollmittel in Zellbehandlungsversuchen verwendet.
PrismGraphPad SoftwareVersion 8.0Wird für die statistische Analyse experimenteller Daten verwendet.
PVDF-Transfermembran, 0,45 μmThermo Fisher Scientific88518Wird für den elektrophoretischen Proteintransfer während der Western-Blot-Analyse verwendet.
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Wird zur Isolierung/Reinigung von Gesamt-RNA aus Herzmuskelgewebe von Mäusen verwendet.
Natriumchloridlösung, 0,9 % (physiologische Kochsalzlösung)Sigma-AldrichS8776Wird zum Lösen von Lac-Phe und als Fahrzeugkontrollmittel für Kontroll- und DCM-Mäuse verwendet.
SPSSIBMVersion 20.0Wird für die statistische Analyse experimenteller Daten verwendet.
Streptozotocin (STZ)Sigma-AldrichS0130Wird zusammen mit HFD-Fütterung verabreicht, um das Mausmodell der diabetischen Kardiomyopathie zu etablieren.
TBS-Tween-20-Puffer (20×)Thermo Fisher Scientific28360Wird zum Waschen der Membranen nach Inkubation mit Primär- und Sekundärantikörpern während der Western-Blot-Analyse verwendet.
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583Wird zum Einbetten von Herzmuskelgewebe vor der Herstellung gefrorener Schnitte für die Oil-Red-O-Färbung verwendet.
TransmissionselektronenmikroskopHITACHIHT7800Wird verwendet, um ultrastrukturelle Veränderungen im Herzmuskelgewebe von Mäusen zu untersuchen.
TRIzol-ReagenzInvitrogen15596026Wird zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Herzmuskelgewebe von Mäusen verwendet.
VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep KitVazymeNR616-01Wird zur Herstellung von RNA-seq-Bibliotheken für die transkriptomische Analyse verwendet.
Weizenkeimagglutinin (WGA)ServiceBioW7024Wird für die histologische Beurteilung von Herzmuskelgewebe verwendet.

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CholesterinsyntheseAMPK AktivierungHMGCR Inhibitionpathologisches RemodelingGlukosehom ostase
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