Forschungsartikel

LINC00707-Silenzierung lindert Entzündung und oxidativen Stress in LPS-stimulierten BV2-Mikrogliazellen über die miR-145-5p/TRAF6-Achse bei Rückenmarksverletzung

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11. September 2026

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1Department of Nursing, Zhangjiakou First Hospital, 2Department of Orthopedics, Zhangjiakou First Hospital, 3Department of Pediatrics, Zhangjiakou First Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Expression von LINC00707 im Plasma ist bei Rückenmarkverletzungen erhöht und fördert mikrogliazellvermittelte Entzündung und oxidativen Stress über die miR-145-5p/TRAF6-Signalachse. Die Stilllegung von LINC00707 verringert diese pathologischen Reaktionen und unterstreicht damit dessen Potential als therapeutische Zielstruktur.

Zusammenfassung

Eine Rückenmarksverletzung (SCI) verursacht lebenslange Behinderungen, beeinträchtigt das Wohlbefinden erheblich und stellt eine beträchtliche sozioökonomische Belastung dar. Diese Studie untersuchte die Rolle von LINC00707 bei SCI durch die Regulation der miR-145-5p/TRAF6-Signalachse. Plasma-Proben von 30 gesunden Probanden und 75 Patienten mit SCI wurden mittels RT-qPCR auf die Expression von LINC00707, miR-145-5p und TRAF6 analysiert. Zusammenhänge zwischen den Plasmaspiegeln von LINC00707 und proinflammatorischen Faktoren wurden bei Patienten mit SCI bewertet. BV2-Mikrogliazellen wurden 100 ng/mL LPS ausgesetzt, und Faktoren im Zusammenhang mit Entzündung und oxidativem Stress wurden gemessen. Molekulare Wechselwirkungen wurden mittels eines Dual-Luciferase-Reporter-Assays untersucht. Eine logistische Regressionsanalyse diente zur Identifizierung von Faktoren, die mit der Expression von LINC00707 assoziiert sind. Die Plasmaspiegel von LINC00707 und TRAF6 waren bei Patienten mit SCI erhöht, während die Spiegel von miR-145-5p vermindert waren. Die Plasmaspiegel von LINC00707 korrelierten positiv mit den Plasmaspiegeln entzündungsfördernder Faktoren. LINC00707 fungierte als molekularer Schwamm für miR-145-5p, und TRAF6 war ein Zielgen von miR-145-5p. Die Hemmung von LINC00707 verringerte entzündungsfördernde Faktoren, pro-oxidative Substanzen und TRAF6-mRNA-Spiegel in BV2-Zellen. Die Hemmung von miR-145-5p führte zu gegenteiligen Effekten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine erhöhte Expression von LINC00707 mit der Schwere von SCI assoziiert ist und dass eine Reduktion von LINC00707 die mikroglia-vermittelte Entzündung und den oxidativen Stress durch Regulation der miR-145-5p/TRAF6-Signalachse abschwächen könnte.

Einleitung

Eine Rückenmarksverletzung (RMV) ist eine traumatische Erkrankung, die das Rückenmark, eine zentrale Komponente des zentralen Nervensystems, schädigt. Die RMV stört direkt die neuralen Leitbahnen zwischen Rückenmark und Gehirn und führt zu erheblichen Beeinträchtigungen der motorischen, sensorischen und autonomen Funktion1,2. Epidemiologische Studien berichten über eine jährliche Inzidenz von etwa 5 Fällen pro 100.000 Personen, wobei die erkrankungsbedingte Mortalität bis zu 16,7 % erreichen kann3,4. Eine kanadische Umfrage schätzte die lebenslangen Rehabilitationskosten pro Patient mit RMV auf bis zu 336.000 US-Dollar5. Die hohe Inzidenz, Mortalität und die erheblichen Kosten im Zusammenhang mit Diagnose, Behandlung und Rehabilitation machen die RMV zu einer bedeutenden klinischen Herausforderung, die verbesserte therapeutische Strategien erfordert.

Die pathologische Progression eines Rückenmarktraumas besteht aus zwei Phasen: der primären und der sekundären Verletzung. Die primäre Verletzung resultiert aus traumatischer mechanischer Kompression oder Zerstörung des Rückenmarkgewebes, während die sekundäre Verletzung durch pathologische Prozesse vermittelt wird, einschließlich Entzündung und oxidativem Stress6,7. Unter physiologischen Bedingungen trägt die mikrogliazellvermittelte Neuroinflammation zur Homöostase des zentralen Nervensystems bei8,9,10. Nach einem Rückenmarktrauma werden Mikrogliazellen jedoch übermäßig aktiviert und setzen große Mengen proinflammatorischer Mediatoren frei11,12. Diese Mediatoren führen zu einer übermäßigen Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), was neuronale Schäden und Zelltod verursacht und die sekundäre Rückenmarkverletzung verschlimmert13,14. Daher stellen die Unterdrückung einer übermäßigen Mikrogliaaktivierung und die Unterbrechung der entzündlichen Kaskade aussichtsreiche therapeutische Strategien zur Förderung der neurologischen Erholung und zur Verbesserung der Ergebnisse nach einem Rückenmarktrauma dar.

Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) sind eine Klasse nicht-kodierender RNAs, die länger als 200 Nukleotide sind und kein Protein-kodierendes Potenzial besitzen15. Anfänglich als transkriptionelles „Rauschen“ angesehen, werden lncRNAs heute als wichtige Regulatoren vielfältiger physiologischer und pathologischer Prozesse anerkannt16. Neuere Studien haben gezeigt, dass lncRNAs entscheidende Rollen bei neuronalen Verletzungen spielen. Die lange intergenische nicht-proteinkodierende RNA 707 (LINC00707) hat sich als wichtiger Regulator von Erkrankungen des Nervensystems herausgestellt. Frühere Studien berichteten, dass LINC00707 eine traumatische Hirnverletzung verstärkt, indem es die Mikroglia-vermittelte Entzündung potenziert17. Außerdem zeigten Zhu et al., dass die Stilllegung von LINC00707 die lipopolysaccharidinduzierte (LPS) Entzündung und Apoptose in PC12-Zellen signifikant abschwächt18. Diese Befunde liefern eine vorläufige theoretische Grundlage dafür, die Beteiligung von LINC00707 an einer Rückenmarksverletzung (SCI) zu untersuchen. Es bleibt jedoch unklar, ob LINC00707 die Mikroglia-vermittelte Entzündung während einer SCI reguliert.

LncRNAs wirken als molekulare Schwämme mithilfe des Mechanismus der kompetitiven endogenen RNA (ceRNA), indem sie Mikro-RNAs (miRNAs) binden und die Expression der nachgeschalteten Zielgene regulieren19. Dieses Regulationsmuster ist weit verbreitet an der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt. Bemerkenswerterweise ist miR-145-5p in Geweben mit Rückenmarkverletzung (SCI)20 und während LPS-induzierter Schädigungen21 signifikant herunterreguliert, und seine Überexpression verringert entzündliche und oxidativen Stressreaktionen in Mikroglia wirksam22. Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-assoziiertes Protein 6 (TRAF6) spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle in der Pathologie der SCI23,24,25. Ob jedoch LINC00707, miR-145-5p und TRAF6 koordinierte regulatorische Funktionen in der SCI ausüben, muss noch geklärt werden.

In der vorliegenden Studie war die Expression von LINC00707 in mit LPS stimulierten Mikrogliazellen signifikant hochreguliert. Daher vermuteten wir, dass LINC00707 als proinflammatorischer Regulator in der Mikroglia wirken könnte und dass eine Herunterregulation desselben die neuroinflammatorische Reaktion abschwächen und somit den pathologischen Verlauf einer Rückenmarksverletzung (SCI) verbessern könnte. Diese Studie untersuchte, ob LINC00707 die inflammatorischen Reaktionen der Mikroglia reguliert und zur Pathogenese der SCI beiträgt.

Protokoll

Die Studie wurde vom Ethikkomitee des Zhangjiakou First Hospital genehmigt (Genehmigungsnummer: 2024-KY-18). Alle Teilnehmer erhielten Informationen über die Studienziele und potenziellen Risiken und gaben vor der Einschreibung eine schriftliche Einwilligungserklärung ab. Venöse Blutproben wurden von gesunden Kontrollpersonen im Rahmen von Routineuntersuchungen sowie von Patienten mit SCI unmittelbar nach der Krankenhauseinweisung entnommen. Die Laboranalysen wurden durch das klinische Labor des Krankenhauses durchgeführt. Die in diesem Protokoll verwendeten Forschungsmittel sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

1. Probanden
Insgesamt 75 Patienten mit einer Rückenmarkverletzung (SCI) wurden zwischen Januar 2023 und Januar 2025 vom Zhangjiakou First Hospital rekrutiert. Die Einschlusskriterien waren eine mittels Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MRI) bestätigte Rückenmarkverletzung sowie ein Zeitraum von bis zu 12 Stunden zwischen Verletzungszeitpunkt und Krankenhauseinweisung. Die Ausschlusskriterien waren: Vorgeschichte einer Rückenmark- oder Hirnverletzung bzw. -operation innerhalb der letzten sechs Monate; schwere Herz-Kreislauf-Erkrankungen, einschließlich Myokardinfarkt oder Arrhythmie; Schwangerschaft oder Stillzeit; sowie maligne Tumore, Leber- oder Nierenfunktionsstörungen, schwere zerebrovaskuläre Erkrankungen oder Infektionskrankheiten.

Gemäß den neurologischen Klassifizierungsstandards der American Spinal Injury Association (ASIA)26 wurden 75 Patienten mit Rückenmarkverletzung (SCI) in die Gruppen mit normaler neurologischer Funktion (n = 21), inkompletter SCI (n = 36) und kompletter SCI (n = 18) eingeteilt. Die Verteilung der Verletzungsstellen war wie folgt: zervikal, 36,0 %; thorakal, 30,7 %; und lumbal, 33,3 %. 30 gesunde Probanden, die der Studienpopulation hinsichtlich Alter und Geschlecht angeglichen waren, wurden zufällig rekrutiert, um als Kontrollgruppe zu dienen. Für alle Teilnehmer wurde die baseline-klinische Information erhoben. Die Einschlusskriterien für gesunde Personen waren: keine Vorgeschichte von Rückenmark- oder Hirntrauma, Operationen oder neurologischen Erkrankungen; keine Vorgeschichte chronisch-entzündlicher Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen oder Malignome; keine schwere kardiovaskuläre, hepatische oder renale Erkrankung; keine akute oder chronische Infektion innerhalb der letzten 4 Wochen; keine Schwangerschaft oder Stillzeit; sowie eine Anpassung von Alter und Geschlecht an die SCI-Gruppe.

Das Functional Independence Measure (FIM) wurde zur Beurteilung der funktionellen Unabhängigkeit im täglichen Leben eingesetzt. Die maximale FIM-Punktzahl beträgt 126. Tastsensibilität, Acmesthesie und motorische Werte wurden zur Bewertung der sensorischen und motorischen Funktion verwendet. Die maximale Punktzahl für Tastsensibilität und Acmesthesie betrug 112, die maximale motorische Punktzahl war 100. Niedrigere Werte weisen auf eine schwerwiegendere neurologische Beeinträchtigung hin.

2. Zellkultur, Modellerstellung und Transfektion
Immortalisierte murine Mikrogliazellen der Linie BV2 wurden vom Cell Resource Center des Shanghai Institute of Biotechnology bezogen. Die Zellen wurden in einem Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glucosespiegel kultiviert, das mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS), Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 U/mL) ergänzt war. Die Zellen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ gehalten.

Zur Modellerstellung wurden BV2-Zellen 24 h lang mit 0, 10, 20, 50, 100, 150 oder 200 ng/mL Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert. Die optimale LPS-Konzentration wurde anhand der experimentellen Ergebnisse ausgewählt.

Zur Transfektion wurden BV2-Zellen in 6-Well-Platten ausgesät und transfiziert, sobald sie die geeignete Konfluenz erreicht hatten. Ein Transfektionsreagenz wurde gemäß den Herstelleranweisungen mit 1,5 µL/Well verwendet. Nach 6 h wurde das Kulturmedium durch frisches Medium ersetzt, und die Zellen wurden weitere 24 h kultiviert. Der LINC00707-Knockdown-Konstrukt, der entsprechende negative Kontrollkonstrukt, das miR-145-5p-Oligonukleotid sowie das entsprechende Kontroll-Oligonukleotid wurden jeweils mit einer Konzentration von 50 nM pro Well eingesetzt. Alle Transfektionsexperimente wurden unabhängig voneinander mindestens 5-mal durchgeführt, mit jeweils 3 parallelen Wiederholungen pro unabhängigem Experiment. Die Daten wurden statistisch anhand der Ergebnisse von mindestens 5 unabhängigen Experimenten ausgewertet.

3. ELISA
Die Kulturüberstände transfizierter und mit LPS stimulierter BV2-Zellen wurden durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 min gesammelt, und die Konzentrationen von Interleukin-1β (IL-1β), IL-6 und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) wurden mithilfe der entsprechenden ELISA-Kits gemessen. Kurz gesagt, der Test wurde durch sequenzielle Inkubation mit einem biotinylierten Antikörper, einem HRP-Streptavidin-Konjugat und einem TMB-Substrat gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Die Absorption wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader aufgezeichnet. Die Zytokinkonzentrationen wurden anhand von Standardkurven bestimmt. Jede Probe wurde im Dreifachansatz gemessen, und es wurden 6 unabhängige Experimente durchgeführt.

4. Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
Die intrazellulären ROS-Spiegel in mit LPS stimulierten BV2-Zellen wurden mithilfe eines Assays zur Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies gemessen. Kurz gesagt wurden die Zellen 20 Minuten lang mit 10 µmol/L DCFH-DA bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand verworfen und die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, um überschüssige extrazelluläre Sonde zu entfernen. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Mikroplattenreader bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 525 nm gemessen. Die relativen ROS-Spiegel wurden anhand der Fluoreszenzintensität berechnet. Alle Proben wurden im Dreifachansatz analysiert, und das gesamte Experiment wurde unabhängig mindestens fünfmal wiederholt.

5. Nachweis von Malondialdehyd, Superoxiddismutase und Glutathion
Behandelte BV2-Zellen wurden gesammelt und Zellhomogenate hergestellt. Die Proben wurden bei 12.000 × g 10 min bei 4 °C um den Überstand zu erhalten. Handelsübliche Nachweiskits für Malondialdehyd (MDA), Superoxiddismutase (SOD) und Glutathion (GSH) wurden gemäß den Herstelleranweisungen verwendet, um deren Konzentrationen in den zellulären Überständen zu bestimmen. Alle Proben wurden im Dreifachansatz analysiert, und das gesamte Experiment wurde unabhängig mindestens fünfmal wiederholt.

6. Dual-Luciferase-Reporter-Assay
Die Abschnitte der 3' nichtcodierenden Region (3' UTR) von LINC00707 und TRAF6, die die vorhergesagten Bindungsstellen für miR-145-5p enthalten, sowie die entsprechenden mutierten Sequenzen wurden in den pmirGLO-Luciferase-Reporter-Vektor kloniert, um Wildtyp-(WT-LINC00707 und WT-TRAF6) und Mutanten-(MUT-LINC00707 und MUT-TRAF6) Reporter-Konstrukte zu erzeugen. BV2-Zellen wurden gemeinsam mit den Reporter-Konstrukten und miR-145-5p-Oligonukleotiden transfiziert und 24 h kultiviert. Anschließend wurden die Zellen gesammelt und die Aktivitäten von Feuer- und Renilla-Luciferase mittels eines Mikroplattenlesegeräts gemessen.

7. RT-qPCR
Gesamt-RNA wurde mithilfe eines RNA-Extraktionsreagenz gewonnen. Die RNA-Qualität wurde anhand des OD₂₆₀/OD₂₈₀-Verhältnisses beurteilt, wobei Werte zwischen 1,8 und 2,0 als akzeptabel galten. Etwa 1 µg Gesamt-RNA wurden mit einem Reverse-Transkriptionskit in cDNA umgeschrieben. Die Genexpression wurde mittels RT-qPCR unter Verwendung eines SYBR-Green-PCR-Mastermixes quantifiziert. Die Reverse Transkription erfolgte bei 42 °C für 15 min, gefolgt von der Inaktivierung der Reverse Transkriptase bei 95 °C für 3 min. Die synthetisierte cDNA wurde bis zur Analyse bei −20 °C gelagert. Die quantitative Echtzeit-PCR wurde durchgeführt mit einer Vor-Denaturierung bei 95 °C für 1 min, gefolgt von 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 5 s und Annealing sowie Extension bei 60 °C für 15 s. Fluoreszenzsignale wurden am Ende jedes Annealing- und Extension-Schritts erfasst. Die Schmelzkurvenanalyse erfolgte bei 95 °C für 15 s, gefolgt von 60 °C für 1 min. Die relativen Expressionsniveaus wurden nach der 2⁻ΔΔCt-Methode berechnet. GAPDH oder 5S diente als interne Referenz zur Normalisierung der Genexpression. Die Primersequenzen lauteten wie folgt: LINC00707, vorwärts 5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3' und rückwärts 5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'; miR-145-5p, vorwärts 5'-GCCGAGGTCCAGTTTTCCCA-3' und rückwärts 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'; TRAF6, vorwärts 5'-ATTACAACTGAGGTGCTTCT-3' und rückwärts 5'-GCATCTGGTTCTGTTATAGGA-3'; GAPDH, vorwärts 5'-ATCCCATCACCATCTTCCAGG-3' und rückwärts 5'-CGCCCCACTTGATTTTGG-3'; sowie 5S, vorwärts 5'-TCGTCTGATCTCGGAAGCTAA-3' und rückwärts 5'-AAGCCTACAGCACCCGGTAT-3'.

8. Statistische Analyse
Die statistischen Analysen wurden mithilfe von statistischer Software durchgeführt. Die Normalverteilung der Daten wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test überprüft, wobei ein P > 0,05 auf eine Normalverteilung hindeutete. Normalverteilte Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben, während nicht normalverteilte Daten als Median (P25, P75) dargestellt wurden. Bei kontinuierlichen Variablen mit Normalverteilung erfolgten Vergleiche zwischen zwei Gruppen mittels des Student-t-Tests, und bei Vergleichen mehrerer Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA mit anschließendem Tukey-Post-hoc-Test verwendet. Für nicht normalverteilte Daten kam bei Zweigruppenvergleichen der Mann-Whitney-U-Test zum Einsatz, bei Mehrgruppenvergleichen der Kruskal-Wallis-Test. Der Chi-Quadrat-Test wurde zur Analyse kategorialer Variablen zwischen den Gruppen verwendet. Univariate und multivariate logistische Regressionsanalysen dienten der Bewertung klinischer Faktoren, die mit der LINC00707-Expression assoziiert waren. Kontinuierliche Variablen wurden am Median der Kohorte dichotomisiert (Gruppe mit hohem Wert = 1; Gruppe mit niedrigem Wert = 0). Variablen mit einem P < 0,05 in der univariaten logistischen Regressionsanalyse wurden in die multivariate logistische Regressionsanalyse einbezogen. Die Ergebnisse wurden als Odds Ratios (ORs) mit 95 % Konfidenzintervallen (CIs) angegeben, wobei ein OR > 1 auf eine positive Assoziation und ein OR < 1 auf eine negative Assoziation hindeutete. Alle Experimente zum Zellphänotyp umfassten mindestens vier unabhängige biologische Wiederholungen mit jeweils drei technischen Wiederholungen pro biologischer Wiederholung. Ein P < 0,05 galt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Die Plasmaspiegel von LINC00707 waren bei Patienten mit Rückenmarksverletzung (SCI) erhöht
Die klinischen Basischarakteristika von 30 gesunden Probanden und 75 Patienten mit Rückenmarksverletzung (SCI) wurden analysiert. Im Vergleich zu gesunden Probanden wiesen Patienten mit SCI deutlich niedrigere Werte für Tastsinn, Schmerzempfindung, motorische Funktion und das Functional Independence Measure (FIM) auf, was auf eine beeinträchtigte sensorische und motorische Funktion hindeutet. Außerdem waren die Serumspiegel proinflammatorischer Zytokine bei Patienten mit SCI im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen signifikant höher (Tabelle 1, P < 0,001), was auf eine verstärkte Entzündungsreaktion schließen lässt.

MerkmaleHSSCIP-Wert
(n=30)(n=75)
Alter (Jahre)45,83±10,0646,17±9,920,786
BMI (kg/m2)22,82±1,5723,94±1,290,69
Geschlecht (männlich, n)18410,619
Rauchen (n)11280,949
Alkoholkonsum (n)14330,804
ASIA-Klassifikation der SCI (n)/
Komplette SCI/18
Inkomplette SCI/36
Normale neuronale Funktion/21
Verletzungslevel der SCI (n, %)/
Halswirbelsäule/27 (36,0 %)
Brustwirbelsäule/23 (30,7 %)
Lendenwirbelsäule/25 (33,3 %)
Tastsensibilitätsscore/53,42±22,12
Schmerzempfindlichkeitsscore/53,39±24,68
Bewegungsscore/49,07±18,74
Functional Independence Measure-Score/71,33±19,41
IL-1β (pg/mL)1,47±0,5252,21±11,32<0,001
IL-6 (pg/mL)2,14±0,9788,47±23,52<0,001
TNF-α (pg/mL)2,84±1,1361,09±18,24<0,001
CRP (mg/L)1,42±0,6362,67±21,85<0,001
Abkürzungen: HS, Gesunder Proband; SCI, Rückenmarkverletzung; BMI, Body-Mass-Index; ASIA, American Spinal Injury Association; FIM, Functional Independence Measure; IL, Interleukin; TNF, Tumornekrosefaktor; CRP, C-reaktives Protein.

Tabelle 1: Vergleich der klinischen Basischarakteristika zwischen gesunden Probanden und Patienten mit Rückenmarkverletzung. Diese Tabelle vergleicht die demografischen Merkmale, neurologischen Funktionsscores, verletzungsbedingten Variablen und die Spiegel entzündungsfördernder Marker zwischen gesunden Probanden und Patienten mit Rückenmarkverletzung. Abkürzungen: HS, gesunde Probanden; SCI, Rückenmarkverletzung; ASIA, American Spinal Injury Association; FIM, Functional Independence Measure; IL, Interleukin; TNF, Tumornekrosefaktor; CRP, C-reaktives Protein.

Die Expression von LINC00707 im Plasma wurde mittels RT-qPCR quantifiziert. Im Vergleich zu gesunden Probanden wies die Expression von LINC00707 im Plasma bei Patienten mit Rückenmarksverletzung (SCI) signifikant erhöhte Werte auf (Abbildung 1A, P < 0,001). Eine ROC-Kurvenanalyse (Receiver Operating Characteristic) lieferte vorläufige Hinweise darauf, dass die Expression von LINC00707 einen gewissen Diskriminierungswert bei der Unterscheidung zwischen Patienten mit SCI und gesunden Probanden besitzen könnte (Abbildung 1B). Darüber hinaus stieg die Expression von LINC00707 im Plasma mit zunehmender klinischer Schwere der SCI an (Abbildung 1C, P < 0,001). Die Korrelationsanalyse zeigte, dass die Expression von LINC00707 im Plasma positiv mit den Konzentrationen von IL-1β (r = 0,635, P < 0,001), IL-6 (r = 0,612, P < 0,001), TNF-α (r = 0,675, P < 0,001) und C-reaktivem Protein (CRP; r = 0,611, P < 0,001) assoziiert war (Abbildung 1D–G). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine erhöhte Expression von LINC00707 mit entzündlichen Reaktionen bei Patienten mit SCI assoziiert ist.

Balkendiagramme zur Expressionsanalyse A, C; ROC-Kurve B; Korrelations-Streudiagramme D-G; wissenschaftlicher Datenvergleich.
Abbildung 1: Plasmakonzentration von LINC00707 und ihre Korrelationen mit entzündungsfördernden Plasmafaktoren. (A) Die Plasmakonzentration von LINC00707 war bei Patienten mit Rückenmarkverletzung (SCI) höher als bei gesunden Probanden. Die statistische Analyse erfolgte mittels eines unabhängigen t-Tests. (B) Die Analyse der Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurve lieferte einen ersten Hinweis darauf, dass die LINC00707-Expression zur Unterscheidung von Patienten mit SCI und gesunden Probanden nützlich sein könnte. (C) Die Plasmakonzentration von LINC00707 stieg mit zunehmender Schwere der SCI gemäß der Klassifikation der American Spinal Injury Association (ASIA). Die statistische Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließendem Tukey-HSD-Post-hoc-Test. (D–G) Die Plasmakonzentration von LINC00707 korrelierte positiv mit den Konzentrationen entzündungsfördernder Faktoren. Die statistische Analyse erfolgte mittels Pearson-Korrelationsanalyse. *P < 0,01 und **P < 0,001. Gesunde Probanden, n = 30; Patienten mit SCI, n = 75. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Faktoren, die mit der LINC00707-Expression assoziiert sind, wurden mittels univariater und multivariater logistischer Regression analysiert
Univariate und multivariate logistische Regressionsanalysen wurden durchgeführt, um Faktoren zu identifizieren, die mit der LINC00707-Expression assoziiert sind. Die univariate Analyse zeigte, dass die ASIA-Klassifikation des Rückenmarktraumas (OR = 3,912, 95 % CI: 1,792–8,537, P < 0,001), der FIM-Score (OR = 0,281, 95 % CI: 0,108–0,729, P = 0,009) und der CRP-Spiegel (OR = 4,600, 95 % CI: 1,724–12,271, P = 0,002) mit der LINC00707-Expression assoziiert waren. Nach Anpassung für potenzielle Störfaktoren zeigte die multivariate logistische Regression, dass die ASIA-Klassifikation des Rückenmarktraumas (OR = 2,598, 95 % CI: 1,088–6,203, P = 0,032), der FIM-Score (OR = 0,303, 95 % CI: 0,102–0,902, P = 0,032) und der CRP-Spiegel (OR = 3,202, 95 % CI: 1,024–10,015, P = 0,045) unabhängige Faktoren waren, die mit der LINC00707-Expression assoziiert sind (Tabelle 2). Eine schwerere ASIA-Klassifikation und erhöhte CRP-Spiegel waren mit einer höheren LINC00707-Expression assoziiert, während ein höherer FIM-Score mit einer niedrigeren LINC00707-Expression assoziiert war. Diese Assoziationen stützen weiterhin die Möglichkeit, dass LINC00707 in den pathologischen Prozess des Rückenmarktraumas eingreift.

ElementeEindimensionale RegressionsanalyseMultivariate Regressionsanalyse
OR95% CIP-WertOR95% CIP-Wert
Alter 1.1760.475-2.9140.725
Geschlecht1.3030.524-3.2400.57
ASIA-Klassifikation der SCI 3.9121.792-8.537<0.0012.5981.088-6.2030.032
ASIA-Klassifikation der SCI0.5880.497-1.4800.582
Tastsensibilitätsscore0.850.343-2.1050.725
Akästhesiescore0.8540.345-2.1190.734
Bewegungsscore0.3920.153-1.0060.051
FIM-Score0.2810.108-0.7290.0090.3030.102-0.9020.032
IL-1β1.1810.475-2.9350.72
IL-6 1.4530.585-3.6080.42
TNF-α1.3040.526-3.2330.567
CRP 4.61.724-12.2710.0023.2021.024-10.0150.045
Abkürzungen: OR, Odds Ratio; CI, Konfidenzintervall; ASIA, American Spinal Injury Association; FIM, Funktionsunabhängigkeitsmaß; IL, Interleukin; TNF, Tumornekrosefaktor; CRP, C-reaktives Protein.

Tabelle 2: Logistische Regressionsanalyse von Faktoren, die mit der LINC00707-Expression assoziiert sind. Diese Tabelle zeigt die univariate und multivariate logistische Regressionsanalyse, die verwendet wurde, um klinische Faktoren zu identifizieren, die mit der LINC00707-Expression bei Patienten mit Rückenmarkverletzung assoziiert sind. Die Ergebnisse werden als Odds Ratios mit 95 % Konfidenzintervallen und entsprechenden P-Werten dargestellt. Abkürzungen: OR, Odds Ratio; CI, Konfidenzintervall; ASIA, American Spinal Injury Association; FIM, Functional Independence Measure; IL, Interleukin; TNF, Tumornekrosefaktor; CRP, C-reaktives Protein.

Die Herunterregulierung von LINC00707 milderte Entzündungen und oxidativen Stress in mit LPS stimulierten BV2-Zellen ab
BV2-Zellen wurden mit ansteigenden Konzentrationen von LPS (0, 10, 20, 50, 100, 150 oder 200 ng/mL) behandelt. Die RT-qPCR-Analyse zeigte, dass die Expression von LINC00707 nach Behandlung mit 100, 150 und 200 ng/mL LPS signifikant anstieg (Abbildung 2A, P < 0,001, n = 6). Basierend auf diesen Ergebnissen und früheren Berichten27˒28 wurde eine LPS-Konzentration von 100 ng/mL zur Erstellung des in vitro-SCI-Modells ausgewählt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die Expression von LINC00707 in mit LPS stimulierten BV2-Zellen signifikant erhöht. Die Transfektion mit si-LINC00707 unterdrückte die Expression von LINC00707 effektiv (Abbildung 2B, P < 0,001, n = 6).

Die Auswirkungen einer LINC00707-Reduktion auf Entzündung und oxidativen Stress wurden anschließend untersucht. Die LPS-Stimulation führte zu einer signifikanten Erhöhung der Sekretion von IL-1β (Abbildung 2C, P < 0,001, n = 5), IL-6 (Abbildung 2D, P < 0,001, n = 5) und TNF-α (Abbildung 2E, P < 0,001, n = 5) sowie der intrazellulären ROS-Spiegel (Abbildung 2F, P < 0,001, n = 6) und des MDA-Gehalts (Abbildung 2G, P < 0,001, n = 5). Im Gegensatz dazu verringerte die LPS-Stimulation signifikant die Spiegel der antioxidativen Marker SOD (Abbildung 2H, P < 0,001, n = 6) und GSH (Abbildung 2I, P < 0,001, n = 5). Die Stilllegung von LINC00707 reduzierte signifikant die Sekretion proinflammatorischer Zytokine und die Spiegel pro-oxidativer Stressmarker, während sie gleichzeitig die antioxidativen Spiegel in LPS-stimulierten BV2-Zellen wiederherstellte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Absenkung von LINC00707 die LPS-induzierten entzündlichen Reaktionen und den oxidativen Stress in BV2-Zellen abschwächt.

Balkendiagrammreihe zur Analyse der Zytokinausprägung und biochemischer Parameter im LPS-induzierten Experiment.
Abbildung 2: Auswirkungen der LINC00707-Reduktion auf Entzündung und oxidativen Stress in LPS-stimulierten BV2-Zellen. BV2-Zellen wurden mit 100 ng/mL Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert. (A) Die LINC00707-Expression wurde mittels RT-qPCR in BV2-Zellen gemessen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von LPS behandelt wurden. (B) Die LINC00707-Expression war in der LPS-Gruppe erhöht und sank nach Transfektion mit si-LINC00707. (C–E) ELISA-Ergebnisse zeigten, dass die Sekretion proinflammatorischer Faktoren in der LPS-Gruppe erhöht und nach LINC00707-Knockdown verringert war. (F–G) Die Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der Malondialdehyd (MDA)-Gehalt waren in der LPS-Gruppe erhöht und nach LINC00707-Knockdown reduziert. (H–I) Die Aktivität der Superoxiddismutase (SOD) und die Konzentration reduzierten Glutathions (GSH) waren in der LPS-Gruppe vermindert und nach LINC00707-Knockdown erhöht. **P < 0,001; ns, nicht signifikant. n ≥ 5. Die statistische Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukey’s HSD als post-hoc-Test. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

LINC00707 fungiert als molekularer Schwamm für miR-145-5p
Um den molekularen Mechanismus der biologischen Funktion von LINC00707 zu untersuchen, wurde die ENCORI-Datenbank verwendet, um potenzielle Ziel-miRNAs vorherzusagen. Die bioinformatische Analyse identifizierte komplementäre Bindungssequenzen zwischen LINC00707 und miR-145-5p (Abbildung 3A). Doppel-Luciferase-Reporterassays zeigten, dass die Luciferase-Aktivität im WT-LINC00707-Konstrukt signifikant durch das miR-145-5p-Mimetikum verringert und durch den miR-145-5p-Inhibitor erhöht wurde. Im Gegensatz dazu hatte keiner der Behandlungen einen Einfluss auf die Luciferase-Aktivität im MUT-LINC00707-Konstrukt (Abbildung 3B, P < 0,001, n = 4), was die direkte Interaktion zwischen LINC00707 und miR-145-5p bestätigt.

Die RT-qPCR-Analyse zeigte, dass die Expression von miR-145-5p im Plasma bei Patienten mit SCI im Vergleich zu gesunden Probanden signifikant verringert war (Abbildung 3C, P < 0,001). Zusätzlich war die Expression von LINC00707 negativ mit der Expression von miR-145-5p korreliert (Abbildung 3D, P < 0,001), und die Plasmaspiegel von miR-145-5p nahmen mit zunehmender Schwere der SCI progressiv ab (Abbildung 3E, P < 0,001). In vitro war die Expression von miR-145-5p in LPS-stimulierten BV2-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen signifikant reduziert, während die Herunterregulierung von LINC00707 die Expression von miR-145-5p wiederherstellte (Abbildung 3F, P < 0,001, n = 6). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass LINC00707 als konkurrierende endogene RNA (ceRNA) fungiert, indem es miR-145-5p bindet und dadurch dessen Expression während des pathologischen Fortschritts der SCI reguliert.

Analyse der Genexpression; miR-145-5p, Luciferase-Assay, Korrelationsdiagramm; Balkendiagramme, Sequenzalignierungen.
Abbildung 3. LINC00707 fungiert als molekularer Schwamm für miR-145-5p. (A) Die ENCORI-Datenbank prognostizierte komplementäre Bindesequenzen zwischen LINC00707 und miR-145-5p. (B) Ein Dual-Luciferase-Reporter-Assay bestätigte die Interaktion zwischen LINC00707 und miR-145-5p. Die statistische Analyse erfolgte mittels zweifaktorieller ANOVA, gefolgt vom Tukey’schen HSD-Post-hoc-Test. (C) Die RT-qPCR zeigte, dass die Expression von miR-145-5p im Plasma bei Patienten mit SCI vermindert war. Die statistische Analyse wurde mit einem t-Test für unabhängige Stichproben durchgeführt. (D) Die Expression von LINC00707 war bei Patienten mit SCI negativ mit der Expression von miR-145-5p korreliert. Die statistische Analyse erfolgte mittels Pearson-Korrelationsanalyse. (E) Die Expression von miR-145-5p im Plasma nahm mit zunehmender Schwere der Rückenmarksverletzung gemäß der ASIA-Klassifikation ab. Die statistische Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA, gefolgt von Tukey’s HSD post-hoc-Test. (F) Die Expression von miR-145-5p war in der LPS-Gruppe verringert, stieg nach Transfektion mit si-LINC00707 an und nahm nach Transfektion mit dem miR-145-5p-Inhibitor wieder ab. Die statistische Analyse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, gefolgt von Tukeys HSD-Post-hoc-Test. P < 0,05, *P < 0,01 und **P < 0,001; ns, nicht signifikant. Gesunde Probanden, n = 30; Patienten mit SCI, n = 75; Zellkulturversuche, n ≥ 4. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Hemmung von miR-145-5p verstärkte Entzündung und oxidativen Stress in LPS-stimulierten BV2-Zellen
Um die Rolle von miR-145-5p zu untersuchen, wurden BV2-Zellen mit einem miR-145-5p-Hemmer oder dem entsprechenden negativen Kontrollmittel transfiziert. Anschließend wurden die Spiegel entzündungsfördernder Zytokine und Marker des oxidativen Stresses bestimmt. Im Vergleich zur negativen Kontrollgruppe des Hemmers erhöhte die Hemmung von miR-145-5p signifikant die Sekretion von IL-1β (Abbildung 4A, P < 0,001, n = 5), IL-6 (Abbildung 4B, P < 0,001, n = 5) und TNF-α (Abbildung 4C, P < 0,001, n = 5). Zusätzlich stiegen die intrazellulären ROS-Spiegel (Abbildung 4D, P < 0,001, n = 6) und der MDA-Gehalt signifikant an (Abbildung 4E, P < 0,001, n = 5), während die Konzentrationen von SOD (Abbildung 4F, P < 0,001, n = 6) und GSH (Abbildung 4G, P < 0,001, n = 5) signifikant abnahmen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hemmung von miR-145-5p die schützenden Effekte der LINC00707-Reduktion auf die durch LPS induzierte Entzündung und den oxidativen Stress in BV2-Zellen aufhebt.

Balkendiagramme zum Vergleich der Proteinausprägung mit LPS-Behandlung in einer Gen-Inhibitionsstudie.
Abbildung 4: Auswirkungen der Hemmung von miR-145-5p auf Entzündung und oxidativen Stress in BV2-Zellen. (A–C) Die ELISA-Analyse zeigte, dass die Sekretion proinflammatorischer Faktoren nach Transfektion mit dem miR-145-5p-Inhibitor signifikant anstieg. (D–E) Die Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der Malondialdehyd-(MDA-)Gehalt stiegen nach Transfektion mit dem miR-145-5p-Inhibitor signifikant an. (F–G) Die Aktivität der Superoxiddismutase (SOD) und die Glutathion-(GSH-)Spiegel waren nach Transfektion mit dem miR-145-5p-Inhibitor signifikant vermindert. **P < 0,001. n ≥ 5. Die statistische Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA, gefolgt vom Tukey’schen HSD-Post-hoc-Test. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

TRAF6 wurde als Zielgen von miR-145-5p identifiziert
Die miRDB-Datenbank prognostizierte TRAF6 als potenzielles Ziel von miR-145-5p. Komplementäre Bindesequenzen zwischen der 3′-UTR von TRAF6 und miR-145-5p wurden identifiziert (Abbildung 5A). Doppelluciferase-Reporterassays zeigten, dass die Luciferase-Aktivität im WT-TRAF6-Konstrukt signifikant durch das miR-145-5p-Mimetikum verringert und durch den miR-145-5p-Inhibitor erhöht wurde. Im Gegensatz dazu beeinflusste keiner der beiden Behandlungen die Luciferase-Aktivität im MUT-TRAF6-Konstrukt (Abbildung 5B, P < 0,001, n = 4), was bestätigt, dass TRAF6 ein direktes Ziel von miR-145-5p ist.

Die RT-qPCR-Analyse zeigte, dass die Expression von TRAF6-mRNA im Plasma bei Patienten mit SCI signifikant erhöht war (Abbildung 5C, P < 0,001). Die TRAF6-Expression war negativ mit der Expression von miR-145-5p korreliert (Abbildung 5D, P < 0,001), und die Plasmaspiegel von TRAF6-mRNA stiegen mit der Schwere der SCI an (Abbildung 5E, P < 0,001). In vitro war die TRAF6-Expression in LPS-stimulierten BV2-Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht, nahm jedoch nach der Absenkung von LINC00707 signifikant ab (Abbildung 5F, P < 0,001, n = 6). Umgekehrt führte die Hemmung von miR-145-5p zu einer Wiederherstellung der TRAF6-Expression (Abbildung 5G, P < 0,001, n = 6). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass LINC00707 die TRAF6-Expression über den miR-145-5p-Signalweg reguliert.

Diagramm der Genexpressionregulation mit miR-145-5p-Interaktion; beinhaltet Gleichungen, Diagramme, Daten.
Abbildung 5: TRAF6 ist ein Zielgen von miR-145-5p. (A) Die miRDB-Datenbank prognostizierte komplementäre Bindungssequenzen zwischen TRAF6 und miR-145-5p. (B) Ein Dual-Luciferase-Reporter-Assay bestätigte die Targeting-Beziehung zwischen TRAF6 und miR-145-5p. Die statistische Analyse erfolgte mittels zweifaktorieller ANOVA, gefolgt vom Tukey’schen HSD-Post-hoc-Test. (C) Die RT-qPCR zeigte, dass die Expression von TRAF6 im Plasma bei Patienten mit SCI erhöht war. Die statistische Analyse erfolgte mittels t-Test für unabhängige Stichproben. (D) Die Expression von TRAF6 im Plasma korrelierte negativ mit der Expression von miR-145-5p im Plasma bei Patienten mit SCI. Die statistische Analyse erfolgte mittels Pearson-Korrelationsanalyse. (E) Die Expression von TRAF6 im Plasma stieg mit zunehmender Schweregrad der SCI gemäß der ASIA-Klassifikation an. Die statistische Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA, gefolgt vom Tukey’schen HSD-Post-hoc-Test. (F) Die Expression von TRAF6 war in LPS-stimulierten BV2-Zellen erhöht und nahm nach Knockdown von LINC00707 ab. Die statistische Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA, gefolgt vom Tukey’schen HSD-Post-hoc-Test. (G) Die Expression von TRAF6 stieg nach Hemmung von miR-145-5p an. Die statistische Analyse erfolgte mittels einfaktorieller ANOVA, gefolgt vom Tukey’schen HSD-Post-hoc-Test. P < 0,05, *P < 0,01 und **P < 0,001; ns, nicht signifikant. Gesunde Probanden, n = 30; Patienten mit SCI, n = 75; Zellexperimente, n ≥ 4. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

VERFÜGBARKEIT VON DATEN:
Die im Rahmen der vorliegenden Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im Zenodo-Repository verfügbar: https://doi.org/10.5281/zenodo.21470454.

Diskussion

Die Rückenmarksverletzung (RMV) ist eine schwere traumatische Erkrankung des zentralen Nervensystems, die zu einer Beeinträchtigung oder vollständigen Unterbrechung der neuralen Leitung durch das Rückenmark führt und lebenslange motorische, sensorische und autonome Funktionsstörungen sowie tiefgreifende physiologische und psychologische Folgen verursacht29˒30. Die Schwere dieser Beeinträchtigungen nimmt in der Regel mit dem Ausmaß der RMV zu. In der vorliegenden Studie war die Expression von LINC00707 im Plasma von Patienten mit RMV erhöht und positiv mit den Spiegeln zirkulierender pro-inflammatorischer Zytokine korreliert, was auf eine mögliche Beteiligung von LINC00707 an der mit RMV assoziierten Entzündung und oxidativen Belastung hindeutet. Basierend auf diesen klinischen Befunden untersuchten wir weiter die regulatorische Rolle von LINC00707 bei Entzündung und oxidativem Stress in LPS-behandelten BV2-Zellen im Kontext der RMV-Pathogenese.

LINC00707 ist an einer Vielzahl biologischer Prozesse durch die Regulation mehrerer Signalwege beteiligt31. Neben der Regulation von Zellproliferation, Apoptose, Migration und Invasion wurde gezeigt, dass LINC00707 an entzündlichen Reaktionen und oxidativem Stress teilnimmt18˒32˒33. Frühere Studien berichteten über erhöhte LINC00707-Expression in Lungen34, Brust35, Zervix36 und Leberkrebs37, wo es den Krankheitsverlauf durch Regulation downstream liegender molekularer Zielstrukturen fördert. Darüber hinaus fördert die Stilllegung von LINC00707 die osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen des Knochenmarks durch Regulation von miR-103a-3p38. Zou et al. zeigten weiter, dass LINC00707 entzündliche Reaktionen, die durch LPS in MRC-5-Zellen induziert werden, verstärkt und somit seine proinflammatorische Rolle unterstützt33. Im Einklang mit diesen Befunden zeigte die vorliegende Studie, dass die Expression von LINC00707 in LPS-stimulierten BV2-Zellen signifikant erhöht war, während die Verringerung von LINC00707 die Produktion proinflammatorischer Zytokine und Marker des oxidativen Stresses reduzierte. Diese Ergebnisse stützen weiter die Beteiligung von LINC00707 an entzündlichen Reaktionen und am oxidativen Stress.

LINC00707 wurde außerdem als eine konkurrierende endogene RNA (ceRNA) beschrieben, die in mehreren pathologischen Zuständen, einschließlich rheumatischer Herzkrankheit39, Blasenkrebs40 und osteogener Differenzierung41, durch die Regulation von miR-145-5p wirkt. Frühere Studien haben gezeigt, dass miR-145-5p schützende Wirkungen bei der Rückenmarkverletzung (SCI) entfaltet, indem es Entzündungsreaktionen und oxidativen Stress unterdrückt42˒43 sowie Angiogenese und neuronale Regeneration fördert44˒45. Im Einklang mit diesen Beobachtungen zeigte die vorliegende Studie, dass die Expression von miR-145-5p im Plasma von Patienten mit SCI sowie in LPS-stimulierten BV2-Zellen vermindert war. Es wurde weiterhin bestätigt, dass LINC00707 direkt mit miR-145-5p interagiert und dass die Stilllegung von LINC00707 die Expression von miR-145-5p wiederherstellt. Zudem kehrte die Hemmung von miR-145-5p die schützenden Effekte des LINC00707-Knockdowns auf entzündliche Reaktionen und oxidativen Stress um. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass LINC00707 zur Progression der SCI beitragen könnte, indem es die durch miR-145-5p vermittelten entzündlichen und oxidativen Stressreaktionen reguliert.

Frühere Studien haben gezeigt, dass TRAF6 eine wichtige Rolle bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems spielt46. Hinweise deuten außerdem darauf hin, dass die Hemmung von TRAF6 die Rückenmarkverletzung (SCI) signifikant verbessern kann47˒48. Die vorliegende Studie identifizierte TRAF6 zudem als direktes Zielgen von miR-145-5p. Die Expression von TRAF6 war bei Patienten mit Rückenmarkverletzung sowie in durch LPS stimulierten BV2-Zellen signifikant erhöht. Außerdem verringerte die Herunterregulierung von LINC00707 die TRAF6-Expression, während die Hemmung von miR-145-5p die TRAF6-Expression wiederherstellte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass LINC00707 die TRAF6-Expression während der Rückenmarkverletzung möglicherweise über miR-145-5p regulieren könnte.

Diese Studie legt nahe, dass LINC00707 die Mikroglia-vermittelten entzündlichen Reaktionen und oxidativen Stressschäden während einer Rückenmarkverletzung (SCI) durch die Regulation der miR-145-5p/TRAF6-Signalachse beeinflussen könnte. Dieses Ergebnis stimmt mit einer früheren Arbeit von Zhu et al. überein, die zeigten, dass die Herunterregulation von LINC00707 die durch LPS induzierte Entzündung und Apoptose in PC-12-Zellen verringerte; der zugrundeliegende Mechanismus in ihrer Studie betraf jedoch die miR-30a-5p/Neurod1-Achse18. Insgesamt deuten diese Befunde darauf hin, dass LINC00707 möglicherweise nicht über ein einzelnes miRNA-Ziel, sondern vielmehr über unterschiedliche miRNA-Netzwerke in einer zelltypabhängigen Weise wirkt und somit zu den pathologischen Prozessen der SCI beiträgt.

Diese Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens wurde lediglich die mRNA-Expression von TRAF6 untersucht, während die Proteinebene nicht analysiert wurde. Zukünftige Studien sollten eine Validierung auf Proteinebene, beispielsweise mittels Western Blot-Analyse, einbeziehen, um die regulatorische Beziehung zwischen LINC00707, miR-145-5p und TRAF6 weiter zu charakterisieren. Zweitens wurde die Studie ausschließlich auf zellulärer Ebene unter Verwendung eines mit LPS stimulierten BV2-Mikroglia-Modells durchgeführt, ohne eine in vivo-Validierung. Angesichts der Komplexität des mikroumgebenden Milieus bei Rückenmarkverletzungen (SCI) könnten die vorliegenden Ergebnisse die pathophysiologischen Bedingungen in vivo möglicherweise nicht vollständig widerspiegeln. Ob LINC00707 in Tiermodellen der SCI ähnliche proinflammatorische Effekte entfaltet, muss noch bestätigt werden. Zukünftige Studien werden Tiermodelle der SCI etablieren, um die regulatorische Rolle von LINC00707 und deren zugrundeliegende molekulare Mechanismen zu validieren. Drittens weisen unsere Ergebnisse zwar darauf hin, dass LINC00707 über den miR-145-5p/TRAF6-Signalweg die Entzündungsreaktion beeinflusst, es ist jedoch unklar, ob LINC00707 ausschließlich als Sponge für bestimmte miRNAs fungiert oder auch direkt an bestimmte Proteine bindet. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um diese mechanistischen Details aufzuklären. Viertens basierte die ROC-Kurvenanalyse auf Daten eines einzigen medizinischen Zentrums und einer relativ geringen Anzahl von Patienten. Dies könnte eine Verzerrung verursacht haben, wodurch die Ergebnisse vorläufig bleiben. Größere, multizentrische Studien mit einer höheren Zahl an Patienten sind notwendig, um das diagnostische Potenzial der identifizierten Biomarker zu bestätigen.

Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass LINC00707 einen potenziellen, explorativen Plasmabiomarker und therapeutischen Ansatzpunkt für das Rückenmarksyndrom (SCI) darstellen könnte. Die Übertragung dieser Ergebnisse in klinische Anwendungen erfordert jedoch mehrere zusätzliche Schritte. Zunächst sollte der potenzielle Differenzierungswert von LINC00707 im Plasma in größeren, multizentrischen Kohorten, unabhängigen Validierungskohorten sowie in relevanten Kontrollgruppen mit Trauma oder Entzündungen evaluiert werden. Die klinische Beurteilung und radiologische Untersuchung bleiben die primären Methoden zur Diagnose einer SCI. Zweitens sollte das therapeutische Potenzial der gezielten Beeinflussung von LINC00707 in Tiermodellen untersucht werden, um Wirksamkeit und Sicherheit zu bewerten. Letztendlich könnte die Modulation des LINC00707/miR-145-5p/TRAF6-Signalwegs einen neuartigen Ansatz zur Verringerung von Neuroinflammation und oxidativem Stress bei Patienten mit SCI bieten, obwohl noch erheblicher Forschungsaufwand nötig ist, um die Lücke zwischen Labor und klinischer Anwendung zu schließen.

Insgesamt waren die Expressionen von LINC00707 und TRAF6 im Plasma erhöht, während die Expression von miR-145-5p bei Patienten mit SCI sowie in LPS-stimulierten BV2-Zellen verringert war. Die Herunterregulation von LINC00707 milderte entzündliche Reaktionen und oxidativen Stress über die miR-145-5p/TRAF6-Signalachse ab, was darauf hindeutet, dass dieser Regulationsweg ein potenzielles therapeutisches Ziel für SCI darstellen könnte.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Medizinische Wissenschaftsforschungsprojekt von Hebei (Zuschussnummer 20251479) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5-mL-MikrozentrifugenröhrchenKIRGENKG2211Polypropylen-Schnappdeckelröhrchen, DNase/RNase-frei, nicht pyrogen, maximale Zentrifugalkraft 20.000 × g, zur Lagerung von RNA-/Probenproben und Zentrifugation.
6-Loch-ZellkulturplatteCorning3516TC-behandelte Polystyrolplatte mit flachem Boden, steril und einzeln verpackt; Brunnenkapazität beträgt 16,8 mL mit einer Wachstumsfläche von 9,5 cm²
BlutentnahmenadelBecton, Dickinson and Company367283BD Vacutainer Einweg-Blutentnahmenadel. Doppelspitze Nadelkonstruktion, wobei eine Spitze für die Venenpunktion und die andere zur Verbindung mit dem Halter und Vakuumröhrchen für die Mehrfachröhrchenentnahme dient. Mit Silikon beschichtet, um die Patientenunannehmlichkeiten während der Einstichphase zu minimieren.
BlutentnahmeröhrchenBecton, Dickinson and Company367605BD Vacutainer Vakuum-Blutentnahmeröhrchen. Unterschiedlich farbcodierte Verschlüsse weisen auf verschiedene Zusätze hin, die bestimmten Laboruntersuchungen entsprechen.
BV2 immortalisierte Maus-Mikroglia-ZelllinieZellressourcenzentrum des Instituts für Biotechnologie in ShanghaiRRID: CVCL_0182Immortalisierte murine Mikroglia-Zelllinie, die stabil mikroglia-spezifische Marker (Iba1, CD11b, F4/80) exprimiert. Nach LPS-Stimulation sekretieren BV2-Zellen proinflammatorische Zytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) und akkumulieren intrazelluläres ROS, MDA, um eine inflammatorische Mikroglia-Aktivierung nach einer Verletzung des Rückenmarks in vivo nachzuahmen. Die Zellen werden in DMEM mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS und 1× Penicillin-Streptomycin, aufrechterhalten bei 37 °C mit 5 % CO₂2 beheizter Brutschrank mit befeuchteter Atmosphäre; umgeimpft, wenn 70 % erreicht sind–80 % Konfluenz, um eine Überaktivierung zu vermeiden.
Cell Malondialdehyd (MDA) TestkitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-4-2Mikroplattenbasiertes farbmetrisches Kit zur quantitativen Bestimmung von zellulärem Malondialdehyd, einem Marker der Lipidperoxidation. MDA reagiert unter Erwärmung mit Thiobarbitursäure (TBA) zu roten Addukten; die Absorption wird bei 532 nm mittels Mikroplatten-Spektrophotometer gemessen. Optimiert für Zelllysat-Proben, Hochdurchsatz-Analyse in 96-Well-Format, linearer Quantifizierungsbereich erfasst niedrige bis moderate Grade der Lipidoxidation in Mikrogliazellen.
CO2 InkubatorThermo Scientific3111Beheizter CO₂-Inkubator mit Wassergehäuse2 Brutkasten mit 184 L Innenvolumen, IR CO2 Sensor, HEPA-Luftfiltersystem zur Minimierung mikrobieller Kontamination. Hält ein stabiles Kultivierungsmilieu bei 37 °C, 5 % CO₂2 und gesättigte Luftfeuchtigkeit für die Langzeit-Kultur adhärenter Zellen.
Dual-Luciferase-Reporter-Gen-Assay-KitBeyotime BiotechnologyRG028Dieses Dual-Luciferase-Kit ermöglicht die sequenzielle quantitative Detektion von Firefly-Luciferase und Renilla-Luciferase in Zelllysaten. Zunächst wird das Signal der Firefly-Luciferase mittels Luciferin-Substrat gemessen; das anschließend verwendete Detektionsreagenz für Renilla enthält einen starken Quencher, der das Firefly-Luciferase-Signal unterdrückt >99,9 % Rest-Feuerfliegen-Lumineszenz, wodurch eine reine Renilla-Signalabfrage mit Coelenterazin-Substrat gewährleistet wird. Das Kit enthält einen speziellen Zelllysepuffer zur Lyse adhärenter Zellen, der mit einem Luminometer für 96-Loch-Mikrotiterplatten kompatibel ist. Das Feuerfliegen-Reagenz liegt als vorgemischte Flüssigkeit zur direkten Verwendung vor; die Lumineszenzwerte von Feuerfliege und Renilla werden nacheinander erfasst, um die normalisierte relative Luciferase-Aktivität (Verhältnis Feuerfliege/Renilla) zur Validierung von ceRNA-Zielsequenzen zu berechnen.
Dulbeccos modifiziertes Eagle-MediumGibco11995065DMEM ist ein weit verbreitetes Basalmedium zur Unterstützung des Wachstums vieler verschiedener Säugetierzellen. Diese Formulierung enthält hohen Glucosespiegel, L-Glutamin, Phenolrot und Natriumpyruvat. Es erfordert eine Supplementierung, üblicherweise mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS), und eine 5 %–10 % CO2 Umgebung, um den physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten.
Fötales RinderserumJEDES GRÜN13011-8611Premiumqualität FBS, geringer Endotoxingehalt, Mykoplasma-frei & bakteriophagen-negativ, zu DMEM zu 10 % (v/v) zugegeben, um das Zellwachstum zu unterstützen.
GraphPad Prism Version 9GraphPad Software, San Diego, CA, USANASoftware zur wissenschaftlichen Grafik und statistischen Analyse, spezialisiert auf Daten aus In-vitro-Zellversuchen. Alle Rohdaten von qPCR, ELISA, oxidativem Stress sowie Absorptionswerte der Dual-Luciferase-Lumineszenz wurden in Prism 9 importiert, um die Normalverteilung zu überprüfen, parametrische bzw. nichtparametrische Gruppenvergleiche durchzuführen, sämtliche quantitativen Abbildungen zu erstellen, den Mittelwert zu berechnen ± SD, exakte P-Werte und 95 % Konfidenzintervalle sowie Export von hochauflösenden (300 dpi) Abbildungen, die den Anforderungen für die Veröffentlichung in wissenschaftlichen Zeitschriften genügen. Die ursprünglichen .prism-Projektdateien sämtlicher Diagramme werden gemäß Vorgabe im öffentlichen Datenarchiv hinterlegt.
IBM SPSS Statistics Version 26.0IBM Corporation, Armonk, NY, USANAUmfangreiches statistisches Softwarepaket zur Sortierung der Basisdaten klinischer Proben, zur Normalverteilungsprüfung (Shapiro-Wilk-Test), zum unabhängigen/zwei­stichigen t-Test sowie zur einwegigen Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey’sowie Korrektur für multiple Vergleiche, nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test und Berechnung exakter P-Werte und 95 % Konfidenzintervalle für alle quantitativen Datensätze aus humanen und zellulären Experimenten. Alle klinischen Patientendaten zu Demographie und Laborergebnissen wurden innerhalb dieser Plattform verarbeitet und analysiert.
IL-1β SimpleStep ELISA-KitAbcamab255730Dieses Einwasch-Sandwich-färbemessende ELISA-Kit verwendet eine proprietäre SimpleStep-Technologie, wodurch der gesamte Nachweisvorgang innerhalb von 90 Minuten abgeschlossen wird. Es ermöglicht die quantitative Bestimmung von Ratten-Interleukin-1β in Zellkulturüberständen, Serum, EDTA-/Citrat-/Heparin-Plasmaproben. Die Nachweisempfindlichkeit beträgt 26,58 pg/mL, mit einem linearen Quantifizierungsbereich von 54,69–3500 pg/mL. Es wird eine vorgebeschichtete, unterbrechbare Mikrotiterplatte mit 8 Vertiefungen pro Streifen mitgeliefert. Die Absorptionswerte werden mit einem Mikrotiterplatten-Reader bei 450 nm erfasst, um IL-1 zu quantifizieren.β Konzentration
IL-6 SimpleStep ELISA KitAbcamab234570Ein sandwichfarbmetrisches SimpleStep-ELISA-Kit, optimiert für den quantitativen Nachweis von Ratten-Interleukin-6 (IL-6) in Zellkulturüberständen, Serum sowie Citrat/EDTA/Heparin-Plasmaproben. Das Kit verwendet eine Ein-Schritt-Inkubation und einen Einwaschschritt, wodurch die gesamte Testdauer auf 90 Minuten verkürzt wird, mit einer Nachweisempfindlichkeit von 43 pg/mL und einem linearen Quantifizierungsbereich von 125 pg/mL bis 8000 pg/mL. Enthalten ist eine vorausbeschichtete, unterbrechbare Mikrotiterplatte mit 8 Mulden pro Streifen. Die Absorptionswerte werden mit einem Mikrotiterplatten-Spektrophotometer bei 450 nm gemessen, um die endgültige IL-6-Konzentration zu berechnen.
LightCycler-Mehrfachbrunnenplatte 96, weißRoche LifeScience, Schweiz4729692001Halbseitig abgedeckte weiße Polypropylen-Reaktionsplatten mit 96 Vertiefungen, speziell optimiert für das Echtzeit-PCR-Gerät LightCycler 96. Die weißen Wandungen der Vertiefungen verringern störende Hintergrundfluoreszenz und verstärken die Signale durch verbesserte Reflexion, wodurch die Nachweisempfindlichkeit für schwach exprimierte Transkripte erhöht wird. Ein einheitliches Design mit dünnen Wänden gewährleistet eine gleichmäßige Wärmeleitfähigkeit über alle Vertiefungen hinweg und ist kompatibel mit Reaktionsvolumina zwischen 10 und 50 μL. DNase-/RNase-frei und pyrogenfrei für RNA-abgeleitete cDNA-Amplifikationsassays.
LipofectamineTM 3000 TransfektionsreagenzThermo Fisher ScientificL3000015Lipid-Nanopartikel-Transfektionsreagenz in Kombination mit dem P3000 Enhancer ermöglicht eine hocheffiziente siRNA-/Plasmid-Transfektion in BV2-Mikrogliazellen mit geringer Zytotoxizität.
lnRcute lncRNA Erststrang-cDNA-Synthese-KitTIANGENKR202-02Dieses Kit ist speziell für die Reverse Transkription von langer, nicht-kodierender RNA (lncRNA) mit geringer Expression, variablen GC-Gehalt und komplexen sekundären Strukturen optimiert. Es enthält einen separaten gDNA-Entfernungspuffer zur Eliminierung genomischer DNA-Kontamination vor der reversen Transkription sowie einen speziellen lnR-RT-Primer-Mix zur Anreicherung vollständiger lncRNA-Vorlagen. Die modifizierte Reverse Transkriptase ermöglicht eine effiziente Synthese langer cDNA-Stränge aus Gesamt-RNA in einer Menge von 10 ng bis 2 ng.
lnRcute lncRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green)TIANGENFP402Ein spezieller, auf SYBR Green basierender qPCR-Premix zur Quantifizierung von lncRNAs. Die antikörpervermittelte Hot-Start-DNA-Polymerase gewährleistet eine hohe Amplifikationsspezifität; H-Konkurrenzkomponenten reduzieren Störungen durch sekundäre Strukturen bei lncRNA-Vorlagen mit hohem GC-Gehalt. Kompatibel mit cDNA, die mit dem lnRcute lncRNA Reverse Transcription Kit erzeugt wurde, und geeignet zur Quantifizierung der relativen Expression von lncRNAs mit geringer Abundanz.
miR-145-5p-OligonukleotideGeneralbiol (Wuhan, China)NASynthetisches miR-145-5p-Mimetikum, Inhibitor und entsprechende negativ-kontrolloligonukleotide zur Modulation der miR-145-5p-Aktivität in BV2-Zellen. Verwendet in Expressions-, Entzündungs-, oxidativem Stress- und Dual-Luciferase-Reporterassays.
miRcute Plus miRNA Erste-Strang-cDNA-KitTIANGENKR211-02Verwendet eine kombinierte Poly(A)-Schwanz-verlängerung und Reverse Transkription in einer einzigen Reaktionsröhre, um den experimentellen Arbeitsablauf zu vereinfachen. Die Enzymmischung enthält E. coli-Poly(A)-Polymerase, RNase-H-defiziente Reverse Transkriptase und einen RNase-Inhibitor und zielt spezifisch auf reife, einzelsträngige miRNAs ab, wodurch Amplifikationsstörungen durch prä-miRNAs mit Haarnadelschleifenstrukturen vermieden werden. Geeignet für miRNA, die aus Zelllysaten, Plasma und Gewebeproben extrahiert wurde.
miRcute Plus miRNA qPCR Nachweiskit (SYBR Green)TIANGENFP411SYBR Green-Vormischung, optimiert für die Quantifizierung reifer miRNAs, perfekt abgestimmt auf miRcute-Umkehrtranskriptionsprodukte. Das Puffersystem verbessert die Primer-Annealing-Effizienz für kurze miRNA-Amplicons und liefert stabile Fluoreszenzsignale sowie hohe Empfindlichkeit zur Detektion schwach exprimierter miRNAs. U6 snRNA wird üblicherweise als interne Referenz für die Normalisierung verwendet.
Penicillin-Streptomycin-Lösung (100×)Beyotime BiotechnologyC0222Sterile gefilterte Mischung mit 10.000 U/mL Penicillin und 10 mg/mL Streptomycin; Arbeitsverdünnung 1:100 im Kulturmedium zur Verhinderung bakterieller Kontamination.
Kit für die Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies mit VerdünnungsmittelBeyotime BiotechnologyS0034MDieses Kit verwendet die fluoreszierende Sonde DCFH-DA zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). DCFH-DA durchdringt die Zellmembran und wird durch intrazelluläre Esterasen zu DCFH hydrolysiert, das durch ROS oxidiert wird und dabei die fluoreszierende Substanz DCF bildet. Das Verfahren ist kompatibel mit 96-Well-Mikroplatten und einem Fluoreszenz-Mikroplattenreader für die Hochdurchsatzdetektion (Ex = 488 nm, Em = 525 nm). Es wird mit einem speziellen Verdünnungspuffer für die Sonde sowie dem positiven Kontrollreagenz Rosup geliefert, um die Stabilität der Färbesignale zu gewährleisten, und eignet sich zur Detektion oxidativen Stresses in adhärenten BV2-Mikrogliazellen ohne Zelllyse.
Reduktionsmittel-Glutathion (GSH)-TestkitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA006-1-2Farbmetrisches Mikroplattenkit zur Bestimmung von reduziertem Glutathion (GSH), dem zentralen intrazellulären Antioxidans. GSH reagiert mit Dithionitrobenzoesäure (DTNB) unter Bildung eines gelben chromogenen Produkts, dessen Extinktion bei 405 nm im Mikroplattenreader gemessen wird. Das Kit überträgt die etablierte Röhrchenmethode auf eine hochdurchsatzfähige Detektion in 96-Well-Mikroplatten zur Analyse des Antioxidansgehalts in Zelllysaten.
si-LINC00707GenePharma (Shanghai, China)NAKleiner interferierender RNA, der zur Verringerung der LINC00707-Expression in BV2-Zellen konzipiert ist. Wird für Funktionsverlust-Experimente verwendet, um die Auswirkungen der LINC00707-Knockdown auf entzündliche Reaktionen, oxidativen Stress, die Expression von miR-145-5p und die Expression von TRAF6 zu untersuchen.
si-LINC00707 NCGenePharma (Shanghai, China)NANicht-zielgerichtete, kleine interferierende RNA, verwendet als negativer Kontrollstamm für die si-LINC00707-Transfektion. Dient zur Kontrolle unspezifischer Effekte des Transfektionsverfahrens und der Exposition gegenüber siRNA.
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)TIANGEN4992777Universelles SYBR Green Quantitative PCR-Premix für die relative mRNA-Quantifizierung, enthaltend Hot-Start-Taq-Polymerase, dNTPs, SYBR Green I und ROX-Referenzfarbstoff zur Fluoreszenznormalisierung. Geringe unspezifische Amplifikation, stabile Amplifikationseffizienz, breit anwendbar für die mRNA-Quantifizierung von Zielgenen (TRAF6, GAPDH etc.).
Thermo Scientific™ Sorvall™ ST 8 Small Benchtop ZentrifugeThermo Scientific75200709Die klassische Wahl für klinische Laboratorien, die bis zu 24 bearbeiten kann × 5/7-mL-Blutentnahmeröhrchen gleichzeitig. Die R-Serie ist eine gekühlte Version, die Proben, die eine Zentrifugation bei niedriger Temperatur erfordern, besser schützen kann.
TIANScript II First-Strand cDNA Synthesis KitTIANGENGKR107-02Entwickelt für die allgemeine mRNA-Rücktranskription zur Erzeugung von langen cDNA-Strängen mit bis zu 12 kb. Ausgestattet mit sowohl Oligo(dT)15- als auch Random-Hexamer-Primern für flexible Priming-Strategien. Die modifizierte M-MLV-Rücktranskriptase durchläuft effizient mRNA-Regionen mit hohem GC-Gehalt und komplexen sekundären Strukturen und ist breit einsetzbar für nachfolgende mRNA-qPCR-Amplifikationen.
TNF-α SimpleStep ELISA KitAbcamab236712Ein schnelles, mit nur einem Waschschritt optimiertes SimpleStep-Sandwich-ELISA-Kit zur quantitativen Bestimmung von Ratten-Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) im Zellkulturüberstand, Serum und verschiedenen Plasma­proben. Die gesamte Testdauer beträgt 90 min bei einer extrem hohen Empfindlichkeit von 1,04 pg/mL und einem linearen Nachweisbereich von 15,63 pg/mL bis 1000 pg/mL. Ausgestattet mit abnehmbarem 8×12-Loch-Vorbeschichtete Platte; OD-Werte bei 450 nm werden für endgültiges TNF-α quantitative Berechnung
Testkit für gesamt-Superoxiddismutase (T-SOD)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-3-2WST-1-chromogenes Mikroplattenkit zur Bestimmung der gesamten enzymatischen SOD-Aktivität. SOD eliminiert Superoxidanionradikale und hemmt die Reduktion von WST-1. Die Extinktion wird bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, um die Aktivität zu berechnen. Geeignet für Zellhomogenate, Serum und Gewebeproben, mit stabiler Farbentwicklung und hoher Wiederholbarkeit zur Bewertung der antioxidativen Kapazität.
TRIzol-ReagenzThermo Fisher Scientific15596018Einstufiges monophasisches Phenol-Guanidin-Isothiocyanat-Reagenz zur Isolierung von Gesamt-RNA aus kultivierten Mikrogliazellen; extrahiert gleichzeitig DNA und Protein aus identischen Proben.

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