Diese Studie optimiert den Loop-vermittelten isothermen Amplifikations-(LAMP-)Test unter Verwendung von Aktivkohle und Bentonit zur Detektion pathogener Vibrio-Arten in Meeresfrüchten. Diese Vorbehandlung entfernt effektiv Reaktionsinhibitoren und ermöglicht im Vergleich zu herkömmlichen Methoden deutlich schnellere, empfindlichere und kostengünstigere Diagnosen.
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Forschungsartikel
Erhöhte Empfindlichkeit der Loop-Verstärkung unter Verwendung von Aktivkohle und Bentonit zur Detektion von Vibrio spp. in Fischereierzeugnissen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Vibrio die Gattung umfasst mehr als 100 Arten, von denen 12 als pathogen für den Menschen gelten; am häufigsten in Lebensmitteln nachgewiesene Arten sind V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, und V. alginolyticus. Das Hauptproblem bei der Identifizierung mittels konventioneller mikrobiologischer Methoden sind die hohen Kosten und die zeitaufwändige Diagnose. Die LAMP-Methode (Loop-vermittelte isothermale Amplifikation) wurde zur Identifizierung verwendet V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, und V. alginolyticus. Aktivkohle mit Bentonit (ACB) wurde verwendet, um Hemmstoffe zu entfernen und die Empfindlichkeit des Tests zu verbessern; es wurden pH-Werte von 6, 7 und 9 sowie verschiedene Kontaktzeiten zwischen der Probe und ACB getestet. Die Empfindlichkeit der LAMP-Methode wurde verbessert, wenn Aktivkohle und Bentonit zur Entfernung von Reaktionshemmstoffen in Proben von Garnelen, Fisch und Auster eingesetzt wurden. Die LAMP-Empfindlichkeit, der negative Vorhersagewert, der positive Vorhersagewert sowie die LAMP-Spezifität lagen bei allen getesteten Proben gleich oder über 90 %. Die LAMP-Methode könnte eine Alternative zur Identifizierung von V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, und V. alginolyticus bei Fischereierzeugnissen aufgrund der schnelleren Anwendung, höheren Empfindlichkeit und geringeren Kosten im Vergleich zur Standardmethode.
Einleitung
Arten der Vibrio Die Gattung ist in marinen Umgebungen weit verbreitet und kann in pathogener oder kommensaler Weise mit Fischen, Mollusken oder Krebstieren assoziiert sein. Es wurde berichtet, dass 12 Arten für den Menschen pathogen sein können, wobei Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificusund V. alginolyticus eine höhere Isolationshäufigkeit in fischwirtschaftlichen Erzeugnissen aufweisend. In den Vereinigten Staaten schätzen die Gesundheitsbehörden, dass Vibrio spp. verursachen jährlich mehr als 80.000 Infektionen1,2,3,4,5Die Isolierung von Vibrio spp. erfolgt mithilfe konventioneller Methoden, die eine Vorenanreicherung, Kultivierung in selektiven Medien sowie die Bestätigung durch biochemische und serologische Tests umfassen.6,7. Diese konventionellen Methoden sind durch die lange Zeit, die zur Isolierung des Erregers erforderlich ist (bis zu 5 Tage), sowie durch ihre geringe Auflösungsfähigkeit eingeschränkt, die häufig eine genaue Unterscheidung eng verwandter Arten innerhalb der Vibrio Gattung aufgrund ähnlicher phänotypischer und biochemischer Profile6,7,8.
Alternativ wurde die LAMP-Methode (Loop-vermittelte isothermale Amplifikation) als schnelle, genaue und kostengünstige molekularbiologische Technik zur Identifizierung von Krankheitserregern beschrieben9,10. Diese Methode ist deutlich kosteneffizienter und schneller als die konventionelle PCR, da sie keine aufwändige Ausrüstung wie Thermocycler erfordert9. Die LAMP-Methode ermöglicht in einem einzigen Schritt den Nachweis des Zielgens durch Beobachtung der Trübung im Reaktionsgefäß, die durch die Ausfällung von Magnesiumpyrophosphat verursacht wird, da dieses ein stabiles Reaktionsprodukt bei 65 °C – der für die LAMP-Technik verwendeten Temperatur – darstellt, sodass die Zunahme der Trübung mit der Menge der synthetisierten DNA korreliert und die Verwendung von Agarosegelen sowie Transillumination vermieden werden kann11,12,13,14,15.
Die Nachweisempfindlichkeit dieser Krankheitserreger kann durch die Eliminierung von Reaktionsinhibitoren wie Proteasen, Calciumionen, Glykogen und Lipiden verbessert werden, die die Bst-Polymerase hemmen oder an das DNA-Ziel binden und somit die Amplifikation verhindern13,16,17,18,19,20. Es wurde berichtet, dass die Kombination von Aktivkohle mit Bentonit (ACB) eine hohe Effizienz bei der Beseitigung von Amplifikationsinhibitoren aufweist, wodurch die Empfindlichkeit des Escherichia coli-Nachweises in Austernproben erhöht wird. Zudem sinken die Kosten, da ACB günstiger ist als der Einsatz kommerzieller Kits21.
In dieser Arbeit schlagen wir vor, die LAMP-Methode zu optimieren, indem Aktivkohle und Bentonit verwendet werden, um die Empfindlichkeit bei der Identifizierung von V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus und V. alginolyticus direkt aus Fischereierzeugnissen zu erhöhen. Diese optimierte Methode bietet praktische Anleitungen für die routinemäßige Überwachung und Qualitätskontrolle in der Lebensmittelindustrie und eignet sich besonders gut für die schnelle Diagnose von Krankheitserregern, da sie die langwierigen Voranreicherungsschritte vermeidet. Hinsichtlich ihrer erwarteten Leistung zeigt die Methode eine hervorragende Empfindlichkeit (über 98 %) und Spezifität (100 %) in Matrizes wie Fisch und Garnelen. Ein wesentlicher Nachteil besteht jedoch darin, dass das ACB-System bei stark kontaminierten Proben aus der Herkunft, beispielsweise Auster, nicht sämtliche störenden organischen Substanzen vollständig entfernen kann, was die Empfindlichkeit des Nachweises leicht verringern kann (94–98 %).
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Protokoll
Diese Studie umfasste keine menschlichen Probanden oder Wirbeltiere; daher war eine institutionelle ethische Genehmigung nicht erforderlich. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
1. Verwendete Bakterienstämme und DNA-Extraktion
Die Stämme Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 und V. alginolyticus ATCC 17749 wurden 24 h bei 37 °C in Brain-Heart-Infusion-(BHI-)Brühe mit 2 % NaCl angezogen. Die Stämme Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 und Salmonella Typhimurium ATCC 14028 wurden als negative Kontrollen in BHI-Brühe ohne Natriumchlorid 24 h bei 37 °C kultiviert. Zur DNA-Extraktion wurde eine Übernachtkultur 6 min bei 25 °C mit 16.000 × g in einer Zentrifuge zentrifugiert. Das Überstandsvolumen wurde vorsichtig abdekantiert, um das Zellpellet nicht zu stören, und das Pellet wurde durch Pipettieren gründlich in 500 μL TAE-Pufferlösung (Tris-Acetat-EDTA, pH 8) resuspendiert. Die Suspension wurde 6 min lang zum Lyse der Zellen gekocht und anschließend unmittelbar 5 min lang auf Eis abgekühlt. Eine abschließende Zentrifugation diente der Abtrennung zellulärer Bestandteile, wodurch ein klarer Überstand entstand, der die extrahierte DNA enthielt und danach als Vorlage zur Amplifikation mittels LAMP22,23 diente.
2. LAMP-Verfahren
Die in der LAMP verwendeten Primer (Tabelle 1wurden getestet, um die Spezifität bei der Identifizierung zu bestätigen V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificusund V. alginolyticus. Die Identifizierung jedes einzelnen Vibrio Arten mittels LAMP wurde in Reaktionsgefäßen durchgeführt, indem ein Endvolumen von 25 μL der Mischung enthaltend: 1.6 μM jeweils eines der Primer, 1,4 mM eines Gemischs aus dNTP, 6 mM MgSO4, 800 mM Betain, 8 U von Bst DNA-Polymerase und 5 μL von Matrizen-DNA. Die Reaktionsmischung wurde vorsichtig vermischt und in einem Wasserbad bei 65 °C 60 min. Nach der Inkubationszeit wurden die Amplifikationsprodukte auf einem 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt. Die Amplifikationsprodukte wurden anschließend mit 1 μL eines fluoreszierenden DNA-Farbstoffs im Verdünnungsverhältnis 1:100 und Sichtbarmachung mittels Blaulicht-Transillumination. Eine weitere Technik zur Bestimmung eines positiven Testergebnisses bei der Identifizierung des Erregers bestand darin, 4 μL von Hydroxynaphtholblau (HNB, 125 μM) zu den Reaktionsröhrchen hinzuzufügen und die Farbänderung mit bloßem Auge zu beobachten. Ein positives Ergebnis zeigte sich durch die Bildung einer blauen Farbe, ein negatives durch eine violette Farbe.24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, und Salmonella Typhimurium ATCC 14028 wurden als negative Kontrollen für die LAMP-Methode verwendet. Die bei der LAMP erzielten Amplifikate wurden in einem Agarosegel getrennt und mittels eines Transilluminators sichtbar gemacht. Die resultierenden Bilder wurden mit der MS 1D Analysis Software aufgenommen und digitalisiert.
3. Behandlung von Proben von Austern, Garnelen und Fisch zur Eliminierung von Vibrio-Arten, die in den Proben natürlich vorkommen
Zehn Austernproben, 10 Garnelenproben und 10 Fischproben mit einem ungefähren Gewicht von jeweils 200 g wurden beschafft. Um natürlicherweise vorkommende Vibrio-Zellen zu entfernen, wurde die zuvor veröffentlichte Methodik21 angewandt. Fünfzig Gramm (50 g) jeder Probe wurden abgewogen und mechanisch in einem Rührmixer bei 260 U/min für 1 Minute homogenisiert, wodurch eine einheitliche Gewebesuspension entstand, die anschließend 72 h bei -70 °C gelagert wurde. Danach wurden die Proben vollständig in einem Wasserbad bei 40 °C aufgetaut und mit 300 mL Phosphat-Puffer-Salzlösung (0,85 % NaCl, pH 9) gewaschen. Um sicherzustellen, dass das vorherige Verfahren Vibrio in den Proben erfolgreich eliminiert hatte, wurde die in Kapitel 9 des Bacteriological Analytical Manual der Food and Drug Administration7 angegebene Vorenanreicherungsmethode durchgeführt. Die Salzlösung, die die Probe enthielt, wurde durch 450 mL alkalische Peptonwasserlösung (APW, pH 9) ersetzt. Anschließend wurden serielle Verdünnungen in APW bis zu einer 10⁻3-Verdünnung sorgfältig hergestellt und 24 h inkubiert. Schließlich wurde eine Aliquotprobe aus jedem Reagenzglas auf ein selektives Medium aus Thiosulfat-Citrat-Galle-Saccharose (TCBS)-Agar ausgestrichen und 24 h bei 37 °C inkubiert, um das Fehlen charakteristischer Vibrio-Kolonien visuell zu bestätigen. Alle Tests wurden im Dreifachansatz durchgeführt.
4. Herstellung von Aktivkohle mit Bentonit (ACB) und Bewertung der zellulären Wiederherstellung
Um die Bedingungen zu bestimmen, unter denen ACB am effizientesten Inhibitoren in Proben von Fischereierzeugnissen absorbiert, während eine minimale Absorption der Zielzellen beibehalten wird, wurde die veröffentlichte Methodik21 befolgt, um den optimalen pH-Wert und die Kontaktzeit zwischen ACB und Lebensmittelproben zu ermitteln. Aktivkohle wurde gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 55 °C getrocknet. Anschließend wurden 32,6 g Aktivkohle mit 3,04 g Bentonit vermischt, 24 Stunden lang kontinuierlich bei 150 U/min gerührt, um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen, bei 55 °C getrocknet und sterilisiert, wodurch ein feines, homogenes, trockenes ACB-Pulver entstand. Um die Zellrückgewinnung nach dem Mischen von Vibrio-Zellen mit der Aktivkohle-Bentonit-Mischung (ACB) zu bewerten, wurden die Stämme separat in BHI-Brühe mit 2 % NaCl bis zu einer Zelldichte von 1,5 × 104 KBE/mL angezogen. Danach wurden jeweils 1 mL jeder Vibrio-Stammprobe separat in 100 mL Phosphatpuffer (PBS, 0,85 % NaCl), der auf pH 4, 6 und 9 eingestellt war, injiziert. Die bakterielle Suspension wurde dann mit 4,6 g der vorbereiteten ACB-Mischung versetzt und 15, 30 und 60 Minuten lang bei 150 U/min gerührt, um den Kontakt zu ermöglichen. Nach jeder vorgegebenen Kontaktzeit wurde eine 0,1-mL-Aliquotprobe vorsichtig entnommen, auf TCBS-Agar ausgestrichen und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert, bevor die Koloniezählung durchgeführt wurde.
5. Bewertung der Nachweisgrenze von V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus und V. alginolyticus in Austern-, Garnelen- und Fischproben, die mit aktiviertem Kohlenstoff und Bentonit behandelt wurden
Jede der in dieser Studie verwendeten Vibrio-Arten wurde in BHI-Brühe kultiviert, und ihre Zelldichten wurden mithilfe eines Spektrophotometers exakt auf 1,5 × 104, 7,5 × 103, 3,8 × 103, 1,5 × 103, 7,5 × 102, 3 × 102, 1,5 × 102 und 76 KBE/mL (A600 nm ~0,25) eingestellt. Anschließend wurden jeweils 1 mL der Vibrio-Kulturen verwendet, um 50 g jeder Probe (Austern, Fisch, Garnelen) zu infizieren, die zuvor behandelt worden waren, um jegliches Vorhandensein von Vibrio auszuschließen. Die infizierten Proben wurden in einem Rührmixer bei 360 U/min für 30 s homogenisiert und mit 450 mL APW (pH 6) verdünnt. Das Gemisch wurde anschließend bei 260 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, um große Partikel abzutrennen. Der resultierende Überstand wurde in Kolben abgegossen, die 23 g ACB enthielten, 15 min bei 150 U/min gerührt, um Inhibitoren zu binden, und mittels Filterpapier filtriert, wodurch ein klares Eluat ohne große Partikel erhalten wurde. Dieses Eluat wurde danach bei 16.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, wodurch sich ein sichtbares Zellpellet am Boden des Röhrchens bildete, das anschließend zur DNA-Extraktion verwendet wurde. Jede Vibrio-Art wurde mittels der LAMP-Methode identifiziert. Als negative Kontrollen dienten Proben, die mit Stämmen von Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 und Salmonella Typhimurium ATCC 14028 infiziert wurden. Die Reaktionsmischung wurde 60 min in einem Wasserbad bei 65 °C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Amplifikationsprodukte in einem 1,5 %igen Agarosegel aufgetrennt und mit einem fluoreszierenden DNA-Farbstoff angefärbt. Die Gele wurden auf einem Transilluminator mit blauem Licht sichtbar gemacht. Schließlich wurden zur Detektion mit bloßem Auge 4 μL Hydroxynaphtholblau (125 μM) zu jedem Röhrchen hinzugefügt24.
6. Bestimmung des positiven Vorhersagewerts, negativen Vorhersagewerts, der Spezifität und Sensitivität der LAMP-Methode
Die Empfindlichkeit, Spezifität und Vorhersagewerte der LAMP-Methode wurden anhand von 30 Proben (10 Garnelen-, 10 Austern- und 10 Fischproben) bestimmt. Jede Probe wurde mit der für jede Art von Vibrio festgelegten minimal nachweisbaren Konzentration kontaminiert. Um die prozentualen Werte für Empfindlichkeit und Spezifität sowie den negativen Vorhersagewert (NPV) und den positiven Vorhersagewert25 zu ermitteln, wurde eine Kontingenztafel verwendet, um die während der Experimente erhaltenen echten Positiven (TP), echten Negativen (TN), falsch Positiven (FP) und falsch Negativen (FN) zusammenzufassen. (Tabelle 2). Anhand dieser Daten wurden folgende Formeln angewandt:
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Ergebnisse
Verwendete Bakterienstämme und die DNA-Extraktion
Die DNA wurde erfolgreich aus allen pathogenen Stämmen und negativen Kontrollstämmen extrahiert, um als Vorlage für die nachgeschalteten LAMP-Assays verwendet zu werden.
LAMP-Verfahren
Die in dieser Arbeit verwendeten Primer waren spezifisch für die Amplifikation des molekularen Zielbereichs in jeder Vibrio-Art. Die Amplifikationsprodukte, die mittels LAMP erhalten wurden, wenn Vibrio-...
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Diskussion
Diese Studie etabliert optimierte Bedingungen zur Empfindlichkeitssteigerung der LAMP (loop-mediated isothermal amplification) zum Nachweis von V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus und V. vulnificus in kontaminierten Meeresfrüchteproben. Durch den Verzicht auf die traditionelle Voranreicherung wird die Diagnosezeit erheblich verkürzt und ermöglicht einen äußerst effizienten und schnellen Ansatz zum direkten Nachweis von Krankheitserregern in Fischereiprodukten.
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Offenlegungen
Die Autoren geben keine Wettbewerbsinteressen an.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Aktivkohle | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonit | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betain | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Transilluminator von Bio-Image Systems | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Bst-DNA-Polymerase | New England Biolabs | M0374 | |
| Zentrifuge (Modell J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| dNTP-Gemisch | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Hydroxynaphtholblau | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| MS 1D Analysis Software | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Spektralphotometer (Modell 6300) | Jenway | 630531 | |
| Stomacher Circulator (Modell 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae no O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Whatman-Papier | Whatman | 1001-055 |
Referenzen
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