Eine mikrofluidische Plattform zur Untersuchung der Rolle mechanischer Kompression bei Tumor-Immunzell-Interaktionen in einer extrazellulären 3D-Matrix

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Verwendung einer mikrofluidischen Plattform vor, um Tumor-Immun-Interaktionen in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung zu modellieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass natürliche Killerzellen (NK-Zellen) ihre anti-tumorale Aktivität unter mechanischer Kompression beibehielten.

Zusammenfassung

Mechanische Kräfte beeinflussen in erheblichem Maße die Fähigkeit von Immunzellen, Tumorzellen im Rahmen der zellbasierten Immuntherapie abzutöten. Um Tumorzellen zu eliminieren, müssen Immunzellen Kräfte auf die Zielzelle ausüben und einen immunologischen Synapsenkontakt bilden, über den zytotoxische Moleküle – einschließlich Granzym B – abgegeben werden. Trotz ihrer Bedeutung ist bisher nur unzureichend verstanden, wie mechanische Signale genutzt werden können, um die immunvermittelte Zerstörung von Tumorzellen zu verstärken. Diese Wissenslücke resultiert teilweise aus dem Mangel an geeigneten Werkzeugen, die in der Lage sind, Zellkulturen unter physiologisch realistischen Bedingungen gezielt mechanischen Belastungen auszusetzen. Hier beschreiben wir eine mikrofluidische Kompressionsvorrichtung, die statische oder dynamische Kompression auf in extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettete Tumorsphäroide ausüben kann und gleichzeitig die Echtzeit-Bildgebung von Tumor-Immun-Interaktionen mittels optischer Mikroskopie ermöglicht.

Die mikrofluidische Plattform besteht aus 12 Kammern (6 Kontroll- und 6 funktionelle). Jede Kammer enthält eine Zellkammer, die sich direkt unterhalb der Druckregelungseinheit befindet. Sphäroide, die in der ECM eingebettet sind, werden in der Zellkammer platziert. Mithilfe dieser Plattform untersuchten wir die Abtötungseffizienz natürlicher Killerzellen (NK-Zellen) gegenüber Brusttumorsphäroiden (MCF-7) unter definiertem mechanischem Druck. Die Ergebnisse zeigten, dass NK-Zellen unabhängig von mechanischem Druck in 1,5 mg/mL Kollagen die primären Verursacher des Zelltods in den Tumorsphäroiden blieben. Daher lässt sich vermuten, dass NK-Zellen ihre anti-tumorale Aktivität unter kompressiven Spannungen beibehalten können. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Nützlichkeit dieser Plattform zur Untersuchung der Rolle mechanischer Kräfte bei Tumor-Immun-Interaktionen. Laufende Studien zielen darauf ab, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die es Immunzellen ermöglichen, sich an kompressive Spannungen anzupassen. Die Erkenntnisse aus diesen Studien könnten einen aussichtsreichen therapeutischen Ansatz aufzeigen.

Einleitung

Die zellbasierte Krebsimmuntherapie ist ein therapeutischer Ansatz, der Immunzellen nutzt, um Krebszellen gezielt anzugreifen¹. Dieser Ansatz hat bei der Behandlung von Blutkrebserkrankungen bemerkenswerte Erfolge gezeigt^2,3,4. Bei soliden Tumoren konnte dieser Erfolg bisher jedoch noch nicht in gleichem Maße erreicht werden^5,6,7. Ein wesentlicher Grund für diese Einschränkung ist das immunsuppressive Tumormikromilieu (TME), das typisch für solide Tumore ist.

Das TME zeichnet sich durch spezifische mechanische Reize aus, die das zelluläre Verhalten regulieren können. Eine effektive Abtötung von Tumorzellen durch Immunzellen erfordert, dass diese Kräfte auf Zielzellen ausüben und eine immunologische Synapse bilden, über die zytotoxische Moleküle abgegeben werden⁸. Daher könnte das Verständnis darüber, wie mechanische Kräfte die Funktion von Immunzellen beeinflussen, neue therapeutische Ansätze erschließen, um die Wirksamkeit zellbasierter Immuntherapien gegen solide Tumore zu verbessern.

Ein charakteristisches mechanisches Merkmal des festen Tumormikroumfelds (TME) ist die Druckspannung, die das Tumormikroumfeld auf den wachsenden Tumor ausübt^9,10. Bisher haben sich die meisten Untersuchungen zur Kompression auf die Auswirkungen auf das Verhalten von Tumorzellen konzentriert^10,11. Erst kürzlich hat sich das Interesse darauf verlagert, wie die Kompression Immunzellen innerhalb des TME beeinflusst¹². Folglich sind die Mechanismen, durch die Druckspannungen die Migration natürlicher Killerzellen (NK-Zellen), die Bildung des immunologischen Synapses sowie die zytotoxische Aktivität beeinflussen, bislang nur unzureichend verstanden und quantifiziert. Diese Wissenslücke stellt eine wesentliche Einschränkung beim Verständnis dessen dar, wie mechanische Signale im TME genutzt werden können, um die Immunerkennung von soliden Tumoren zu verbessern.

Eine wesentliche Hürde bei der Beantwortung dieser Frage ist das Fehlen experimenteller Plattformen, die kontrollierte und quantifizierbare Kompression in physiologisch relevanten 3D-Mikroumgebungen anwenden können, während gleichzeitig die Echtzeit-Bildgebung von Tumor-Immun-Interaktionen ermöglicht wird. Frühe experimentelle Ansätze zur Untersuchung kompressiver Spannungen bestanden darin, Sphäroide in Agarosegelen einzubetten¹³. Obwohl diese Methode die physikalische Einschränkung wirksam erfasste, eliminierte sie native Wechselwirkungen zwischen extrazellulärer Matrix (ECM) und Zellen. Dolega et al. wandten osmotischen Druck an, um kompressive Spannungen hervorzurufen; die Sphäroide befanden sich jedoch in Kulturmedium und wiesen daher weiterhin keinen ECM-Zellkontakt auf⁹. Pandey et al. nutzten einen Transwell-Einsatz und Gewichte, um Sphäroide, die in Kollagen eingebettet waren, zu komprimieren, wodurch die ECM-Zell-Wechselwirkungen erhalten blieben, jedoch die hochauflösende Bildgebung eingeschränkt wurde, die zur Quantifizierung der Beweglichkeit und zytotoxischen Aktivität von Immunzellen erforderlich ist¹⁴. Insgesamt verdeutlichen diese Einschränkungen die Notwendigkeit experimenteller Plattformen, die die Echtzeit-Bildgebung der morphologischen Reaktionen von Zellen auf Kompression innerhalb der Tumor-Mikroumgebung (TME) ermöglichen.

Hier stellen wir ein Protokoll für eine mikrofluidische Kompressionsvorrichtung¹⁵ vor, die eine gezielte Anwendung von Druckspannung ermöglicht, wobei physiologisch relevante Wechselwirkungen zwischen extrazellulärer Matrix und Zellen erhalten bleiben und hochauflösende Live-Cell-Bildgebung von Immun-Tumor-Dynamiken unterstützt wird. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung der Gerätekomponenten (Abschnitt 1), den Zusammenbau des Geräts (Abschnitt 2) sowie die Bildgebung von Tumor-Immun-Wechselwirkungen (Abschnitt 3). Wir demonstrieren den Arbeitsablauf anhand eines NK-Zell-Killings-Assays an grün fluoreszierendem Protein (GFP)-markierten Tumorsphäroiden. Über diese Anwendung hinaus kann die Plattform leicht angepasst werden, um die Auswirkungen mechanischer Kräfte auf eine breite Palette von Zelltypen und zellulären Interaktionen in dreidimensionalen Mikroumgebungen zu untersuchen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Gerätekomponenten

1. Oberflächenaktivierung der Probenladekammer
   1. Platzieren Sie eine Maske über der Probenladekammer (Schicht 1, L1), sodass nur die Vertiefungen freiliegen.
   2. Exponieren Sie die freigelegte Schicht 1 für 15 s Sauerstoff-Plasma unter Verwendung der Hochleistungseinstellung (45 W).
   3. Legen Sie Schicht 1 in eine Petrischale und führen Sie die folgenden Schritte in einem Sicherheitswerkbank durch.
   4. Behandeln Sie jede Vertiefung mit 10 µL von 1 % Polyethylenimin (PEI) für 10 min
   5. Entfernen Sie das PEI durch Vakuumabsaugung von den vier Ecken jedes Wells, um Kratzer auf der Glasoberfläche zu vermeiden.
   6. Waschen Sie die Vertiefungen mit 10 µL von gepufferter Kochsalzlösung (PBS), anschließend die Waschung durch Vakuumabsaugung von der Seite entfernen.
   7. Behandeln Sie die Vertiefungen mit 10 µL 30 min mit 0,1 % Glutaraldehyd, anschließend den Glutaraldehyd durch Vakuumabsaugung an den Ecken entfernen.
   8. Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBS, wobei nach jedem Spülgang die Flüssigkeit aus den Ecken entfernt wird.
   9. Wickeln Sie die Petrischale mit Schicht 1 in Aluminiumfolie ein und lassen Sie sie über Nacht im Sicherheitswerkbank.
2. Sterilisation des Metallrahmens
   1. Tauchen Sie die 38 mm × 88-mm-Metallrahmen und die zwölf M2,5-Schrauben mit Flachkopf über Nacht in 70 %igem Ethanol.
3. Priming des Druckregelgeräts
   1. Setzen Sie die Druckregelungseinheit 30 s lang einer Sauerstoff-Plasma-Behandlung im Hochleistungsmodus (45 W) aus.
   2. Tauchen Sie die Druckregelungseinheit mit den Merkmalen nach unten in entionisiertes (DI) Wasser ein und lassen Sie sie über Nacht stehen, um die Kanäle und Kammern der Druckregelungseinheit mit Wasser zu füllen.
   3. Am nächsten Tag das Druckregelgerät aus dem entionisierten Wasser, in dem es eingetaucht war, entfernen.
   4. Füllen Sie ein Mikrofluidik-Reservoir mit 50 mL entionisiertem Wasser.
      HINWEIS: Das mikrofluidische Reservoir besteht aus einem 50 mL konischen Reagenzglas mit einem speziell angefertigten Deckel, der zwei Schlauchanschlüsse enthält: eine pneumatische Schlauchleitung und eine Fluidzufuhrleitung.
   5. Verbinden Sie eine mit Luft gefüllte Spritze mit der pneumatischen Schlauchleitung.
   6. Drücken Sie den Spritzenkolben langsam herunter, um das Reservoir unter Druck zu setzen und destilliertes Wasser durch die Fluidzufuhrleitung zu leiten, bis die Leitung gefüllt ist und Wasser anfängt, aus der Röhre zu tropfen.
   7. Schließen Sie den vorgefüllten, tropfenden Flüssigkeitszufuhrschlauch über das Polycarbonat-Manifold an den 1,5-mm-Anschluss an der Rückseite der Druckregelungseinheit an.
   8. Lassen Sie die Druckregelungseinheit und die Verteileranordnung 2 h an der Luft trocknen. Sobald sie vollständig trocken sind, sind die Druckregelungseinheit und die Verteileranordnung bereit für den nächsten Schritt.

2. Zusammenbau des Geräts

1. Herstellung von kollagenen Zellverbänden
   1. Entfernen und trocknen Sie den Metallrahmen und die Schrauben aus der 70%igen Ethanol-Lösung.
   2. In der Sicherheitswerkbank drei 600 µL Mikroröhrchen auf Eis. Beschriften Sie die Röhrchen wie folgt: "N" (Neutralisation) "sp" (MCF-7-Sphäroide) und "sp+NK" (MCF-7-Sphäroide mit NK-Zellen)
   3. Bereiten Sie die Neutralisationsmischung zu, indem Sie 10× das erforderliche Volumen von Medium 199 (M199) und Natriumhydroxid (NaOH) zu dem "N" Röhrchen
   4. Übertragen Sie das geeignete Volumen der M199:NaOH-Mischung in die "sp" und "sp+NK" Röhrchen, um eine endgültige 1 zu erreichen× Konzentration.
   5. Tumorsphäroide gewinnen und bei 141 × g zentrifugieren × g für 3 min, um den Sphäroiden Zeit zu geben, sich am Boden des Röhrchens abzusetzen.
      HINWEIS: Tumorsphäroide von ungefähr 200 µm mit Durchmesser wurden unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Agarose-Mikrotröpfchen-Plattform erzeugt¹⁶. Kurz gesagt, 3 × 10⁶ MCF-7-Zellen wurden in eine 36 × 36-Agarose-Mikrobrunnenanordnung, bestehend aus Brunnen 200 µm im Durchmesser und 200 µm in die Tiefe und anschließend sieben Tage lang kultiviert, um die in den Experimenten verwendeten Tumorsphäroide zu erzeugen.
   6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Sphäroide in 200 µL von 50:50 MCF-7/NK komplettem Medium (Tabelle 1 und Tabelle 2).
   7. Sammeln Sie die NK-Zellen in einem 50-mL-Kegelrohr, zentrifugieren Sie bei 141 × g 4 min lang und zählen Sie die Zellen.
      HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der NK-Zellen sollte betragen >85 % am Tag des Experiments.
   8. Resuspendieren Sie das resultierende Pellet in 200 µL des vollständigen NK-Mediums.
   9. Geben Sie das entsprechende Volumen der Kollagen-Stammlösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen.
   10. Geben Sie das geeignete Volumen der Zellsuspension zu jedem Reagenzglas hinzu, um ein Endvolumen von 200 µL mit 1,5 mg/mL Kollagen
       HINWEIS: Die "sp" Suspension enthält nur Tumorsphäroide, während die "sp+NK" Suspension enthält Tumorsphäroide und 1,5 × 10⁶ NK-Zellen
   11. Vorsichtig durch Pipettieren mischen, um eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Kollagen zu gewährleisten und die Bildung von Blasen zu minimieren.
2. Gerätezusammenbau und Zellbeladung
   1. Legen Sie Schicht 1 in den getrockneten Metallrahmen.
   2. Laden Sie 9 µL der Kollagenmischung in jede Vertiefung.
   3. Richten Sie die Druckregelungseinheit und die Verteileranordnung mit den Zellkammern in Schicht 1 unter Verwendung eines Mikroskops aus.
   4. Setzen Sie die getrockneten Schrauben durch das Verteilerstück und in den Metallrahmen ein, um die Druckregelungseinheit und Schicht 1 zwischen dem Verteilerstück und dem Metallrahmen zu befestigen.
   5. Platzieren Sie das zusammengebaute Gerät in einem 37 °C, 5 % CO₂₂ Inkubator für 45 min, um die Kollagenpolymerisation zu ermöglichen.
   6. Geben Sie 50:50 MCF-7/NK vollständiges Zellkulturmedium über die vier Medienanschlüsse hinzu.

3. Bildgebung von Tumor-Immun-Interaktionen

1. Platzieren Sie das montierte Gerät im auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop befestigten Objekttisch-Inkubator für die Live-Cell-Bildgebung.
   ANMERKUNG: Der Objekttisch-Inkubator hält während der gesamten Bildgebung eine Temperatur von 37 °C und eine Luftfeuchtigkeit von etwa 50 % aufrecht.
2. Platzieren Sie eine sekundäre Gehäusebox über das montierte Gerät, um die innere Umgebung während des gesamten Bildgebungszeitraums bei 37 °C, 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO₂ zu halten.
3. Verbinden Sie das Gerät mithilfe des pneumatischen Schlauchs mit dem Druckregler.
4. Nehmen Sie Hellfeld- und GFP-Bilder der Tumorsphäroide vor der Kompression auf, um eine Beurteilung der Sphäroid-Deformation nach der Kompression zu ermöglichen.
5. Wenden Sie während des gesamten Bildgebungszeitraums einen konstanten Druck von 120 mbar an.
   ANMERKUNG: Die Software des Druckreglers ermöglicht es dem Benutzer, das Druckprofil und die während des Experiments angewendete Druckstärke festzulegen. Ergänzende Abbildung 1 enthält ein Schema des Druckregelungssystems.
6. Beginnen Sie mit der Zeitrafferaufnahme, indem Sie alle 10 Minuten über einen Zeitraum von 18 Stunden Hellfeld- und GFP-Bilder aufnehmen.
   ANMERKUNG: Die Bilder wurden in der mittleren Z-Ebene jedes Tumorsphäroids mithilfe eines 20×-Objektivs an einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Hellfeld- und GFP-Fluoreszenzbilder wurden mit Belichtungszeiten von 200,1 ms bzw. 298,9 ms aufgenommen.

Ergebnisse

Für die folgenden Experimente wurde ein mikrofluidisches Kompressionsgerät¹⁵ verwendet, um Tumor-Immun-Interaktionen in einem physiologisch relevanten dreidimensionalen Mikromilieu zu modellieren und gleichzeitig statische sowie dynamische Kompressionen auf Tumorsphäroide auszuüben (Abbildung 1). Die Bestandteile des Geräts (Abbildung 1A1) und deren Montagereihenfolge (Abbildung 1A2

Diskussion

Diese Methode beschreibt die Verwendung einer mikrofluidischen Kompressionsvorrichtung, um die Auswirkungen von Druckspannung auf Tumor-Immun-Interaktionen zu untersuchen. Mit diesem System lässt sich gezielter mechanischer Druck auf Tumorsphäroide ausüben, die in einer dreidimensionalen Kollagenmatrix eingebettet sind. Das Glas-Substrat, das die Basis der Zellkammer (L1) bildet, ermöglicht hochauflösende Live-Cell-Bildgebung und macht die Plattform somit besonders geeignet für Studien, die darauf abzielen, die Motilität...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 N NaOH	Sigma-Aldrich	79724	7 µL
10× M199-Medium	Sigma-Aldrich	M0650	200 µL
2-Mercaptoethanol	ThermoFisher	313500100
Luftkompressor	Elveflow	Jun-Air Model 3 Compressor
Automatisierte X-Y-Mikroskopbühne	Applied Scientific Instrumentation	MS-2000
CCD-Kamera	Hamamatsu Photonics	ORCA-R2
Fötales Rinderserum (FBS)	GeminiBio	S11150
Fluidzufuhrschläuche	Elveflow	PTFE-Schlauch-Ersatzrolle	1/16 Zoll Außendurchmesser
Fluoreszenzlichtquelle	Excelitas Technologies	X-Cite series 120 PC unit
Folsäure	Sigma	F7876
Glutaraldehyd	EM Sciences	16019	0,10 %
Harrick-Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-001-HP	Einstellung auf hohe Leistung (45 W)
Pferdeserum (HS)	ThermoFisher	16050-122
Invertiertes Epi-Fluoreszenzmikroskop	Olympus	IX81	20x-Objektiv (NA = 0,25), betrieben mit der Olympus-CellSens-Software
Maske	Artus	10 Blatt Aluminium-Zwischenlage	Stärke beträgt 0,0125 Zoll (0,75 mm)
MCF-7/GFP (Puromycin)-stabile Zelllinie	GenTarget Inc	SC050-G
Metallrahmen	Individuell angefertigt	Individuell angefertigt
Mikrofluidik-Reservoir	Elveflow	50 mL Mikrofluidik-Reservoir
Mikroskop	Olympus	CKX41	4x-Objektiv              (NA = 0,1)
Myo-Inositol	Sigma	I7508
NK-92 MI	ATCC	CRL-2407
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	ThermoFisher	10010072
Pneumatischer Schlauch	Elveflow	Klare Eingangsleitung aus PUR-Polyether	4 mm Außendurchmesser
Polyethylenimin (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	1 %
Druckregler	Elveflow	OB1 NK4	Betrieben mit der Elveflow Smart Interface-Software
Rattenschwanz-Kollagen Typ I	Corning	354249	31,3 µL einer 9,6 mg/mL-Stammlösung aus Kollagen
Schrauben	Phillips	M2,5 Pan-Kopf	12 Schrauben
Stufeninkubator	Precision Plastic	Individuell angefertigt
Spritze	Becton Dickinson	303134	In Kombination mit einem männlichen Luer-Integralverschluss mit 3/32 Zoll Außendurchmesser-Buchse von Elveflow
α-MEM-Medien	ThermoFisher	12561056