Methodenartikel

Eine mikrofluidische Plattform zur Untersuchung der Rolle mechanischer Kompression bei Tumor-Immunzell-Interaktionen in einer extrazellulären 3D-Matrix

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DOI:

10.3791/72929

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28. August 2026

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1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

Korrespondierende Autoren: Mingming Wu <mw272@cornell.edu>

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Verwendung einer mikrofluidischen Plattform vor, um Tumor-Immun-Interaktionen in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung zu modellieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass natürliche Killerzellen (NK-Zellen) ihre anti-tumorale Aktivität unter mechanischer Kompression beibehielten.

Zusammenfassung

Mechanische Kräfte beeinflussen in erheblichem Maße die Fähigkeit von Immunzellen, Tumorzellen im Rahmen der zellbasierten Immuntherapie abzutöten. Um Tumorzellen zu eliminieren, müssen Immunzellen Kräfte auf die Zielzelle ausüben und einen immunologischen Synapsenkontakt bilden, über den zytotoxische Moleküle – einschließlich Granzym B – abgegeben werden. Trotz ihrer Bedeutung ist bisher nur unzureichend verstanden, wie mechanische Signale genutzt werden können, um die immunvermittelte Zerstörung von Tumorzellen zu verstärken. Diese Wissenslücke resultiert teilweise aus dem Mangel an geeigneten Werkzeugen, die in der Lage sind, Zellkulturen unter physiologisch realistischen Bedingungen gezielt mechanischen Belastungen auszusetzen. Hier beschreiben wir eine mikrofluidische Kompressionsvorrichtung, die statische oder dynamische Kompression auf in extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettete Tumorsphäroide ausüben kann und gleichzeitig die Echtzeit-Bildgebung von Tumor-Immun-Interaktionen mittels optischer Mikroskopie ermöglicht.

Die mikrofluidische Plattform besteht aus 12 Kammern (6 Kontroll- und 6 funktionelle). Jede Kammer enthält eine Zellkammer, die sich direkt unterhalb der Druckregelungseinheit befindet. Sphäroide, die in der ECM eingebettet sind, werden in der Zellkammer platziert. Mithilfe dieser Plattform untersuchten wir die Abtötungseffizienz natürlicher Killerzellen (NK-Zellen) gegenüber Brusttumorsphäroiden (MCF-7) unter definiertem mechanischem Druck. Die Ergebnisse zeigten, dass NK-Zellen unabhängig von mechanischem Druck in 1,5 mg/mL Kollagen die primären Verursacher des Zelltods in den Tumorsphäroiden blieben. Daher lässt sich vermuten, dass NK-Zellen ihre anti-tumorale Aktivität unter kompressiven Spannungen beibehalten können. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Nützlichkeit dieser Plattform zur Untersuchung der Rolle mechanischer Kräfte bei Tumor-Immun-Interaktionen. Laufende Studien zielen darauf ab, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die es Immunzellen ermöglichen, sich an kompressive Spannungen anzupassen. Die Erkenntnisse aus diesen Studien könnten einen aussichtsreichen therapeutischen Ansatz aufzeigen.

Einleitung

Die zellbasierte Krebsimmuntherapie ist ein therapeutischer Ansatz, der Immunzellen nutzt, um Krebszellen gezielt anzugreifen1. Dieser Ansatz hat bei der Behandlung von Blutkrebserkrankungen bemerkenswerte Erfolge gezeigt2,3,4. Bei soliden Tumoren konnte dieser Erfolg bisher jedoch noch nicht in gleichem Maße erreicht werden5,6,7. Ein wesentlicher Grund für diese Einschränkung ist das immunsuppressive Tumormikromilieu (TME), das typisch für solide Tumore ist.

Das TME zeichnet sich durch spezifische mechanische Reize aus, die das zelluläre Verhalten regulieren können. Eine effektive Abtötung von Tumorzellen durch Immunzellen erfordert, dass diese Kräfte auf Zielzellen ausüben und eine immunologische Synapse bilden, über die zytotoxische Moleküle abgegeben werden8. Daher könnte das Verständnis darüber, wie mechanische Kräfte die Funktion von Immunzellen beeinflussen, neue therapeutische Ansätze erschließen, um die Wirksamkeit zellbasierter Immuntherapien gegen solide Tumore zu verbessern.

Ein charakteristisches mechanisches Merkmal des festen Tumormikroumfelds (TME) ist die Druckspannung, die das Tumormikroumfeld auf den wachsenden Tumor ausübt9,10. Bisher haben sich die meisten Untersuchungen zur Kompression auf die Auswirkungen auf das Verhalten von Tumorzellen konzentriert10,11. Erst kürzlich hat sich das Interesse darauf verlagert, wie die Kompression Immunzellen innerhalb des TME beeinflusst12. Folglich sind die Mechanismen, durch die Druckspannungen die Migration natürlicher Killerzellen (NK-Zellen), die Bildung des immunologischen Synapses sowie die zytotoxische Aktivität beeinflussen, bislang nur unzureichend verstanden und quantifiziert. Diese Wissenslücke stellt eine wesentliche Einschränkung beim Verständnis dessen dar, wie mechanische Signale im TME genutzt werden können, um die Immunerkennung von soliden Tumoren zu verbessern.

Eine wesentliche Hürde bei der Beantwortung dieser Frage ist das Fehlen experimenteller Plattformen, die kontrollierte und quantifizierbare Kompression in physiologisch relevanten 3D-Mikroumgebungen anwenden können, während gleichzeitig die Echtzeit-Bildgebung von Tumor-Immun-Interaktionen ermöglicht wird. Frühe experimentelle Ansätze zur Untersuchung kompressiver Spannungen bestanden darin, Sphäroide in Agarosegelen einzubetten13. Obwohl diese Methode die physikalische Einschränkung wirksam erfasste, eliminierte sie native Wechselwirkungen zwischen extrazellulärer Matrix (ECM) und Zellen. Dolega et al. wandten osmotischen Druck an, um kompressive Spannungen hervorzurufen; die Sphäroide befanden sich jedoch in Kulturmedium und wiesen daher weiterhin keinen ECM-Zellkontakt auf9. Pandey et al. nutzten einen Transwell-Einsatz und Gewichte, um Sphäroide, die in Kollagen eingebettet waren, zu komprimieren, wodurch die ECM-Zell-Wechselwirkungen erhalten blieben, jedoch die hochauflösende Bildgebung eingeschränkt wurde, die zur Quantifizierung der Beweglichkeit und zytotoxischen Aktivität von Immunzellen erforderlich ist14. Insgesamt verdeutlichen diese Einschränkungen die Notwendigkeit experimenteller Plattformen, die die Echtzeit-Bildgebung der morphologischen Reaktionen von Zellen auf Kompression innerhalb der Tumor-Mikroumgebung (TME) ermöglichen.

Hier stellen wir ein Protokoll für eine mikrofluidische Kompressionsvorrichtung15 vor, die eine gezielte Anwendung von Druckspannung ermöglicht, wobei physiologisch relevante Wechselwirkungen zwischen extrazellulärer Matrix und Zellen erhalten bleiben und hochauflösende Live-Cell-Bildgebung von Immun-Tumor-Dynamiken unterstützt wird. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung der Gerätekomponenten (Abschnitt 1), den Zusammenbau des Geräts (Abschnitt 2) sowie die Bildgebung von Tumor-Immun-Wechselwirkungen (Abschnitt 3). Wir demonstrieren den Arbeitsablauf anhand eines NK-Zell-Killings-Assays an grün fluoreszierendem Protein (GFP)-markierten Tumorsphäroiden. Über diese Anwendung hinaus kann die Plattform leicht angepasst werden, um die Auswirkungen mechanischer Kräfte auf eine breite Palette von Zelltypen und zellulären Interaktionen in dreidimensionalen Mikroumgebungen zu untersuchen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Gerätekomponenten

  1. Oberflächenaktivierung der Probenladekammer
    1. Platzieren Sie eine Maske über der Probenladekammer (Schicht 1, L1), sodass nur die Vertiefungen freiliegen.
    2. Exponieren Sie die freigelegte Schicht 1 für 15 s Sauerstoff-Plasma unter Verwendung der Hochleistungseinstellung (45 W).
    3. Legen Sie Schicht 1 in eine Petrischale und führen Sie die folgenden Schritte in einem Sicherheitswerkbank durch.
    4. Behandeln Sie jede Vertiefung mit 10 µL von 1 % Polyethylenimin (PEI) für 10 min
    5. Entfernen Sie das PEI durch Vakuumabsaugung von den vier Ecken jedes Wells, um Kratzer auf der Glasoberfläche zu vermeiden.
    6. Waschen Sie die Vertiefungen mit 10 µL von gepufferter Kochsalzlösung (PBS), anschließend die Waschung durch Vakuumabsaugung von der Seite entfernen.
    7. Behandeln Sie die Vertiefungen mit 10 µL 30 min mit 0,1 % Glutaraldehyd, anschließend den Glutaraldehyd durch Vakuumabsaugung an den Ecken entfernen.
    8. Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBS, wobei nach jedem Spülgang die Flüssigkeit aus den Ecken entfernt wird.
    9. Wickeln Sie die Petrischale mit Schicht 1 in Aluminiumfolie ein und lassen Sie sie über Nacht im Sicherheitswerkbank.
  2. Sterilisation des Metallrahmens
    1. Tauchen Sie die 38 mm × 88-mm-Metallrahmen und die zwölf M2,5-Schrauben mit Flachkopf über Nacht in 70 %igem Ethanol.
  3. Priming des Druckregelgeräts
    1. Setzen Sie die Druckregelungseinheit 30 s lang einer Sauerstoff-Plasma-Behandlung im Hochleistungsmodus (45 W) aus.
    2. Tauchen Sie die Druckregelungseinheit mit den Merkmalen nach unten in entionisiertes (DI) Wasser ein und lassen Sie sie über Nacht stehen, um die Kanäle und Kammern der Druckregelungseinheit mit Wasser zu füllen.
    3. Am nächsten Tag das Druckregelgerät aus dem entionisierten Wasser, in dem es eingetaucht war, entfernen.
    4. Füllen Sie ein Mikrofluidik-Reservoir mit 50 mL entionisiertem Wasser.
      HINWEIS: Das mikrofluidische Reservoir besteht aus einem 50 mL konischen Reagenzglas mit einem speziell angefertigten Deckel, der zwei Schlauchanschlüsse enthält: eine pneumatische Schlauchleitung und eine Fluidzufuhrleitung.
    5. Verbinden Sie eine mit Luft gefüllte Spritze mit der pneumatischen Schlauchleitung.
    6. Drücken Sie den Spritzenkolben langsam herunter, um das Reservoir unter Druck zu setzen und destilliertes Wasser durch die Fluidzufuhrleitung zu leiten, bis die Leitung gefüllt ist und Wasser anfängt, aus der Röhre zu tropfen.
    7. Schließen Sie den vorgefüllten, tropfenden Flüssigkeitszufuhrschlauch über das Polycarbonat-Manifold an den 1,5-mm-Anschluss an der Rückseite der Druckregelungseinheit an.
    8. Lassen Sie die Druckregelungseinheit und die Verteileranordnung 2 h an der Luft trocknen. Sobald sie vollständig trocken sind, sind die Druckregelungseinheit und die Verteileranordnung bereit für den nächsten Schritt.

2. Zusammenbau des Geräts

  1. Herstellung von kollagenen Zellverbänden
    1. Entfernen und trocknen Sie den Metallrahmen und die Schrauben aus der 70%igen Ethanol-Lösung.
    2. In der Sicherheitswerkbank drei 600 µL Mikroröhrchen auf Eis. Beschriften Sie die Röhrchen wie folgt: "N" (Neutralisation) "sp" (MCF-7-Sphäroide) und "sp+NK" (MCF-7-Sphäroide mit NK-Zellen)
    3. Bereiten Sie die Neutralisationsmischung zu, indem Sie 10× das erforderliche Volumen von Medium 199 (M199) und Natriumhydroxid (NaOH) zu dem "N" Röhrchen
    4. Übertragen Sie das geeignete Volumen der M199:NaOH-Mischung in die "sp" und "sp+NK" Röhrchen, um eine endgültige 1 zu erreichen× Konzentration.
    5. Tumorsphäroide gewinnen und bei 141 × g zentrifugieren × g für 3 min, um den Sphäroiden Zeit zu geben, sich am Boden des Röhrchens abzusetzen.
      HINWEIS: Tumorsphäroide von ungefähr 200 µm mit Durchmesser wurden unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Agarose-Mikrotröpfchen-Plattform erzeugt16. Kurz gesagt, 3 × 106 MCF-7-Zellen wurden in eine 36 × 36-Agarose-Mikrobrunnenanordnung, bestehend aus Brunnen 200 µm im Durchmesser und 200 µm in die Tiefe und anschließend sieben Tage lang kultiviert, um die in den Experimenten verwendeten Tumorsphäroide zu erzeugen.
    6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Sphäroide in 200 µL von 50:50 MCF-7/NK komplettem Medium (Tabelle 1 und Tabelle 2).
    7. Sammeln Sie die NK-Zellen in einem 50-mL-Kegelrohr, zentrifugieren Sie bei 141 × g 4 min lang und zählen Sie die Zellen.
      HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der NK-Zellen sollte betragen >85 % am Tag des Experiments.
    8. Resuspendieren Sie das resultierende Pellet in 200 µL des vollständigen NK-Mediums.
    9. Geben Sie das entsprechende Volumen der Kollagen-Stammlösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen.
    10. Geben Sie das geeignete Volumen der Zellsuspension zu jedem Reagenzglas hinzu, um ein Endvolumen von 200 µL mit 1,5 mg/mL Kollagen
      HINWEIS: Die "sp" Suspension enthält nur Tumorsphäroide, während die "sp+NK" Suspension enthält Tumorsphäroide und 1,5 × 106 NK-Zellen
    11. Vorsichtig durch Pipettieren mischen, um eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Kollagen zu gewährleisten und die Bildung von Blasen zu minimieren.
  2. Gerätezusammenbau und Zellbeladung
    1. Legen Sie Schicht 1 in den getrockneten Metallrahmen.
    2. Laden Sie 9 µL der Kollagenmischung in jede Vertiefung.
    3. Richten Sie die Druckregelungseinheit und die Verteileranordnung mit den Zellkammern in Schicht 1 unter Verwendung eines Mikroskops aus.
    4. Setzen Sie die getrockneten Schrauben durch das Verteilerstück und in den Metallrahmen ein, um die Druckregelungseinheit und Schicht 1 zwischen dem Verteilerstück und dem Metallrahmen zu befestigen.
    5. Platzieren Sie das zusammengebaute Gerät in einem 37 °C, 5 % CO₂₂ Inkubator für 45 min, um die Kollagenpolymerisation zu ermöglichen.
    6. Geben Sie 50:50 MCF-7/NK vollständiges Zellkulturmedium über die vier Medienanschlüsse hinzu.

3. Bildgebung von Tumor-Immun-Interaktionen

  1. Platzieren Sie das montierte Gerät im auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop befestigten Objekttisch-Inkubator für die Live-Cell-Bildgebung.
    ANMERKUNG: Der Objekttisch-Inkubator hält während der gesamten Bildgebung eine Temperatur von 37 °C und eine Luftfeuchtigkeit von etwa 50 % aufrecht.
  2. Platzieren Sie eine sekundäre Gehäusebox über das montierte Gerät, um die innere Umgebung während des gesamten Bildgebungszeitraums bei 37 °C, 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO₂ zu halten.
  3. Verbinden Sie das Gerät mithilfe des pneumatischen Schlauchs mit dem Druckregler.
  4. Nehmen Sie Hellfeld- und GFP-Bilder der Tumorsphäroide vor der Kompression auf, um eine Beurteilung der Sphäroid-Deformation nach der Kompression zu ermöglichen.
  5. Wenden Sie während des gesamten Bildgebungszeitraums einen konstanten Druck von 120 mbar an.
    ANMERKUNG: Die Software des Druckreglers ermöglicht es dem Benutzer, das Druckprofil und die während des Experiments angewendete Druckstärke festzulegen. Ergänzende Abbildung 1 enthält ein Schema des Druckregelungssystems.
  6. Beginnen Sie mit der Zeitrafferaufnahme, indem Sie alle 10 Minuten über einen Zeitraum von 18 Stunden Hellfeld- und GFP-Bilder aufnehmen.
    ANMERKUNG: Die Bilder wurden in der mittleren Z-Ebene jedes Tumorsphäroids mithilfe eines 20×-Objektivs an einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Hellfeld- und GFP-Fluoreszenzbilder wurden mit Belichtungszeiten von 200,1 ms bzw. 298,9 ms aufgenommen.

Ergebnisse

Für die folgenden Experimente wurde ein mikrofluidisches Kompressionsgerät15 verwendet, um Tumor-Immun-Interaktionen in einem physiologisch relevanten dreidimensionalen Mikromilieu zu modellieren und gleichzeitig statische sowie dynamische Kompressionen auf Tumorsphäroide auszuüben (Abbildung 1). Die Bestandteile des Geräts (Abbildung 1A1) und deren Montagereihenfolge (Abbildung 1A2) sind in Abbildung 1A dargestellt. Der Metallrahmen dient als Grundlage des Geräts, wobei die Zellkammer-Schicht (L1) innerhalb des Rahmens positioniert ist. Die Druckregelungseinheit, bestehend aus den plasma-bonded verbundenen Schichten L2 und L3, wird oberhalb von L1 platziert, gefolgt vom Verteiler (Abbildung 1A2). Gemeinsam bilden L1 und die Druckregelungseinheit das funktionelle mikrofluidische Gerät und sind zwischen Metallrahmen und Verteiler mit Schrauben fixiert. Der Verteiler enthält Einlassöffnungen für fluidische Schläuche zur Druckzufuhr zum Gerät sowie Medienreservoirs, die Langzeit-Experimente mit Live-Cell-Imaging ermöglichen.

Komponenten und Diagramm des mikrofluidischen Geräts; Kompression der Zellkammer; Ergebnisse des GFP-Zellversuchs.
Abbildung 1: Mikrofluidisches Kompressionsgerät zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und Tumorsphäroiden unter mechanischer Kompression. (A1) Fotografie der Komponenten, die für den Geräteaufbau benötigt werden, von links nach rechts dargestellt: Verteiler, Druckregelungseinheit (L2 + L3), Zellkammerebene (L1) und Metallrahmen. (A2) 3D-Schema der Gerätekomponenten, von oben nach unten dargestellt: Verteiler, Druckregelungseinheit (L2 + L3), Zellkammerebene (L1) und Metallrahmen. Die PDMS-Schichten L2 und L3 sind durch Plasma-Bonding verbunden und bilden die Druckregelungseinheit, die oberhalb der Zellkammer positioniert ist. Der Verteiler und der Metallrahmen sichern das zusammengesetzte Gerät. (B1) Querschnittsschema einer Kompressionseinheit vor und nach der Kompression. In der Zellkammer befinden sich im ECM eingebettete Tumorsphäroide und NK-Zellen. Der anfängliche Abstand zwischen der Unterseite von L1 und der Unterseite von L2 vor der Kompression wird als h bezeichnet. Bei Anlegen von Druck an die Druckregelungseinheit verformt sich L2 nach unten, wodurch der PDMS-Kolben das Tumorsphäroid komprimiert. Die nach der Kompression nach unten gerichtete Verschiebung von L2 wird als Δh bezeichnet. (B2) Überlagerte Hellfeld- und GFP-Bilder eines MCF-7-Tumorsphäroids mit NK-Zellen vor (links) und nach (rechts) der Kompression. MCF-7-Zellen sind mit GFP markiert, während NK-Zellen nicht markiert sind. Repräsentative NK-Zellen sind blau umkreist, während gelbe Linien die Ränder der Tumorsphäroide markieren. Maßstab = 50 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Sobald der mikrofluidische Kompressionsapparat zusammengesetzt ist, kann er zur Kompression von Tumorsphäroiden verwendet werden, wie in Abbildung 1B veranschaulicht. Hier werden die in Kollagen eingebetteten Tumorsphäroide zusammen mit NK-Zellen in die Zellkammer (L1) eingeführt. Durch Anlegen von Druck auf die Druckkammer (L3) wird die verformbare Membranschicht (L2) nach unten ausgelenkt, wodurch der Polydimethylsiloxan-(PDMS-)Kolben Druckkräfte auf das Sphäroid überträgt. Die Druckkammer wird über eine externe Druckquelle gesteuert. Weitere Einzelheiten zur Konstruktion, Herstellung und Charakterisierung des mikrofluidischen Kompressionsapparats wurden bereits in einer anderen Studie veröffentlicht15.

Wir definieren den Abstand zwischen dem Boden der Zellkammer (L1) und dem Boden der verformbaren Membran (L2) als h (Abbildung 1B1, linkes Panel). Vor der Kompression beträgt dieser Abstand 200 µm. Durch die Anwendung eines Fluid-Drucks an die Druckregelungseinheit verformt sich die Membran nach unten, wodurch der Abstand h um Δh verringert wird (Δh; Abbildung 1B1, rechtes Panel) und dadurch der in Kollagen eingebettete Tumorsphäroid komprimiert wird. In diesem System ist die Druckdehnung definiert als Δh/h, wobei h der anfängliche Abstand zwischen L1 und L2 vor der Kompression ist und Δh die nach unten gerichtete Verschiebung von L2 nach der Kompression darstellt. Die Membranverschiebung wurde zuvor kalibriert, indem fluoreszierende Kügelchen, die am Boden von L2 hafteten, visualisiert wurden. Eine detaillierte Beschreibung des Kalibrierungsverfahrens und der Berechnung der Druckdehnung ist in einer früheren Studie17 zu finden. Ein Beispiel für eine Kalibrierungskurve ist in Abbildung S2 dargestellt.

Abbildung 1B2 zeigt eine repräsentative zusammengeführte Hellfeld- und GFP-Aufnahme eines MCF-7-Sphäroids mit in 1,5 mg/mL Kollagen eingebetteten NK-Zellen vor (linkes Panel) und nach Kompression (rechtes Panel). Die Grenzen des Tumorsphäroids wurden gelb markiert. Nach der Kompression zeigte das Sphäroid eine Zunahme der projizierten Fläche, was auf eine Verformung als Reaktion auf die erfolgreiche Anwendung mechanischer Belastung hinweist. Für alle in dieser Arbeit präsentierten Experimente verwendeten wir eine Kompressionsdehnung von Δh/h = 50 % Wir stellen fest, dass der Sphäroiddurchmesser zwischen 140 liegt µm zu 200 µmDies bedeutet, dass die tatsächliche Kompressionsdehnung des Sphäroids geringfügig unter 50 % liegt. Zusatzvideo 1 und Zusatzvideo 2 zeigen repräsentative X-Y-Z-Stapel, die im GFP-Fluoreszenzkanal einer in 1,5 mg/mL Kollagen eingebetteten MCF-7-Sphäroiden vor und nach Anwendung einer 50 %igen Druckdehnung aufgenommen wurden

Die mikrofluidische Kompressionsvorrichtung wurde verwendet, um die Auswirkungen von NK-Zellen, Kompression und deren Kombination auf den Zelltod von Tumorsphäroiden zu untersuchen (Abbildung 2). Möglich wird dies durch das Design der Vorrichtung, die 12 Kulturkammern enthält. Davon können sechs Kammern einer Kompression ausgesetzt werden, während die übrigen sechs als unkompri­mierte Kontrollen dienen. Diese Anordnung ermöglicht vier experimentelle Bedingungen (Abbildung 2A): Sphäroide allein ohne Kompression (sp), Sphäroide mit NK-Zellen, jedoch ohne Kompression (+NK), Sphäroide, die einer Kompression unterzogen werden (+comp), sowie Sphäroide, die sowohl Kompression als auch NK-Zellen ausgesetzt sind (+comp+NK).

Zeitraffer-Mikroskopie der GFP-Intensität; Graph, Streudiagramm mit normalisierter GFP-Datenanalyse.
Abbildung 2: Mechanische Kompression moduliert die von NK-Zellen vermittelte Abtötung von Tumorsphäroiden. (A) Zeitraffer-Fluoreszenzbilder von MCF-7-Sphäroiden, eingebettet in 1,5 mg/mL Kollagen unter vier Bedingungen: Sphäroid-allein-Kontrolle (sp), Sphäroide mit NK-Zellen (+NK), Sphäroide mit Kompression (+comp) und Sphäroide mit sowohl Kompression als auch NK-Zellen (+comp+NK). Die GFP-Fluoreszenz markiert lebensfähige MCF-7-Tumorzellen. Die gelbe Umrandung zeigt den interessierenden Bereich (ROI), der anhand des Bildes nach 18 h definiert und auf alle Zeitpunkte zur Quantifizierung der Fluoreszenz angewendet wurde. Die gesamte GFP-Fluoreszenzintensität innerhalb des ROI wurde gemessen und für die nachfolgende Analyse verwendet. Maßstab = 50 µm. (B) Gesamte GFP-Fluoreszenzintensität eines einzelnen Sphäroids über die Zeit unter vier Bedingungen. Jede farbige Linie stellt die gesamte Fluoreszenzintensität eines einzelnen Sphäroids dar, normalisiert auf die Intensität zum Zeitpunkt t = 0. Die schwarze Linie zeigt die Polynomapproximation zweiter Ordnung der aus sieben unter Kontrollbedingungen kultivierten Sphäroiden gewonnenen Fluoreszenzintensitätsdaten und diente als Referenz zur Berechnung des Tumorzellverlusts in (C). (C) Der normalisierte GFP-Verlust für die Bedingungen +comp, +NK und +comp+NK wurde berechnet, indem die GFP-Intensität zum Zeitpunkt t = 18 h jedes einzelnen Sphäroids von der Referenzlinie des Sphäroid-allein-Versuchs (sp) subtrahiert wurde. Jeder Datenpunkt repräsentiert somit den normalisierten GFP-Verlust eines einzelnen Sphäroids. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Die Wirkungen von NK-Zellen, Kompression und ihrer Kombination auf Tumorsphäroide können anhand der repräsentativen Bilder von MCF-7-Sphäroiden in 1,5 mg/mL Kollagen veranschaulicht werden (Abbildung 2A). Da die zur Erzeugung der Tumorsphäroide verwendeten MCF-7-Zellen mit GFP markiert waren, konnte die Tumorzellviabilität durch Veränderungen der GFP-Fluoreszenz überwacht werden. GFP- und Hellfeldaufnahmen wurden alle 10 Minuten über einen Zeitraum von 18 Stunden mithilfe eines invertierten Epifluoreszenzmikroskops aufgenommen. Auffällig war, dass Sphäroide, die einer Kompression ausgesetzt wurden, eine größere projizierte Fläche aufwiesen als nicht komprimierte Sphäroide, was die erfolgreiche Übertragung der mechanischen Belastung von der verformbaren Membran auf das Tumorsphäroid bestätigt. Im Zeitverlauf zeigte sich ein fortschreitender Verlust der GFP-Fluoreszenz unter den Bedingungen +NK und +comp+NK (Abbildung 2A), was auf eine von NK-Zellen vermittelte Abtötung von Tumorzellen hinweist.

Wir verwenden den Verlust der GFP-Fluoreszenz als Maß für den Tod von Tumorzellen. Die in dieser Studie verwendeten GFP-markierten MCF-7-Zellen wurden durch lentivirale Transduktion erzeugt. Kurz gesagt, wurde ein lentiviraler Vektor verwendet, um eine Expressionskassette für ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP), die durch den Elongationsfaktor-1α (EF1α)-Promotor angetrieben wird, zusammen mit einem durch den Rous-Sarkomvirus-(RSV)-Promotor gesteuerten Puromycin-Resistenzgen einzuführen. Nach der Infektion wurden die lentiviralen Expressionskassetten in die genomische DNA der MCF-7-Zellen integriert, was zu einer stabilen GFP-Expression führte. Anschließend wurde eine Puromycin-Selektion durchgeführt, um nicht transduzierte Zellen auszuschließen. Die GFP-Markierung der MCF-7-Zellen ermöglichte es, die Tumorzellviabilität durch die Überwachung zeitlicher Änderungen der GFP-Fluoreszenzintensität zu quantifizieren (Abbildung 2B). Ein starker Zusammenhang zwischen dem Verlust der GFP-Fluoreszenz und etablierten Markern des Zelltods, einschließlich des Lebend/Tot-Markers Propidiumiodid (PI) und des apoptotischen Markers Annexin-V, wurde bereits früher nachgewiesen18, wodurch der Verlust der GFP-Fluoreszenz als Surrogatmaß für den Tod von Tumorzellen validiert ist.

Um die Auswirkungen der vier experimentellen Bedingungen auf die Tumorzellviabilität zu quantifizieren, wurde die gesamte GFP-Fluoreszenzintensität jedes Tumorsphäroids zu jedem Zeitpunkt gemessen, die Hintergrundfluoreszenz subtrahiert und der Wert auf den Ausgangswert normiert (Abbildung 2B). Die gesamte Sphäroid-Fluoreszenz wurde innerhalb eines vordefinierten Bildausschnitts (ROI) berechnet. Dieser ROI wurde manuell durch Umzeichnung der Grenze des Tumorsphäroids im Bild nach 18 h ermittelt (gelbe Kontur im 18-h-Panel, Abb. 2A) mithilfe eines internen MATLAB-Skripts. Die gesamte Fluoreszenzintensität innerhalb dieses ROIs wurde dann für jeden Zeitpunkt berechnet und durch Subtraktion der durchschnittlichen Hintergrundfluoreszenz korrigiert, die aus einem separaten, an anderer Stelle im Bild gewählten ROI ermittelt wurde. Die resultierenden, hintergrundkorrigierten Fluoreszenzwerte wurden anschließend auf die anfängliche Fluoreszenzintensität des Sphäroids normiert.

Jede farbige Kurve stellt die normalisierte GFP-Intensität eines einzelnen Sphäroids unter einer bestimmten experimentellen Bedingung in Abbildung 2B dar. Die Kurve wird durch eine Polynom-Approximation zweiter Ordnung an die experimentellen Daten erhalten. Die violetten Kurven repräsentieren Sphäroide, die allein einer Kompression ausgesetzt waren (+comp, Abbildung 2B), die roten Kurven stellen Sphäroide mit NK-Zellen dar (+NK, Abbildung 2B), und die blauen Kurven zeigen Sphäroide, die sowohl Kompression als auch NK-Zellen ausgesetzt waren (+comp+NK, Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu ist die schwarze Kurve die Polynom-Approximation zweiter Ordnung der Daten von sieben Sphäroiden, die unter der alleinigen Sphäroid-Bedingung als Kontrolle kultiviert wurden (sp, Abbildung 2B). In Abbildung 2B werden der Übersichtlichkeit halber nur die polynomiell angepassten Daten, jedoch nicht die experimentellen Datenpunkte dargestellt. Auffällig ist, dass die GFP-Fluoreszenzintensität unter den Bedingungen alleiniges Sphäroid (sp) und Sphäroid + Kompression (+comp) im Zeitverlauf einen allgemeinen Anstieg zeigt (Abbildung 2B), was mit einer fortgesetzten Tumorzellvermehrung oder Aufrechterhaltung der Vitalität übereinstimmt. Im Gegensatz dazu zeigen die Bedingungen +NK und +comp+NK einen progressiven Abfall der GFP-Fluoreszenzintensität (Abbildung 2B), was auf Zelltod der Tumorzellen hinweist.

Der kumulative Verlust an Tumorzellen wurde quantifiziert, indem die angepasste, normalisierte GFP-Fluoreszenzintensität jedes Sphäroides unter einer gegebenen Bedingung (+comp, +NK oder +comp+NK) von der Kontrollbedingung nach 18 h subtrahiert wurde (Abbildung 2C). Dadurch repräsentiert jeder Datenpunkt den normalisierten GFP-Verlust eines einzelnen Sphäroids im Vergleich zur alleinigen Sphäroid-Kontrolle (Abbildung 2C). Demnach spiegelt die Bedingung +comp den allein durch Kompression verursachten GFP-Verlust wider (lila, Abbildung 2C), die Bedingung +NK den allein durch NK-Zellen verursachten GFP-Verlust (rot, Abbildung 2C), und die Bedingung +comp+NK den durch die kombinierte Wirkung von Kompression und NK-Zellen verursachten GFP-Verlust (blau, Abbildung 2C). Die Bedingung +comp wies den geringsten GFP-Verlust auf (Abbildung 2C), was darauf hindeutet, dass Kompression allein nur einen minimalen Effekt auf die Vitalität der Sphäroide hatte. Im Gegensatz dazu zeigten sowohl die Bedingungen +NK als auch +comp+NK einen signifikant stärkeren GFP-Verlust als die Bedingung +comp (Abbildung 2C), was darauf hinweist, dass NK-Zellen die primären Auslöser des Tumorzelltods sind. Obwohl die Bedingung +comp+NK im Durchschnitt einen stärkeren GFP-Verlust aufwies als die Bedingung +NK, erreichte dieser Unterschied keine statistische Signifikanz (Abbildung 2C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Kompression die von NK-Zellen vermittelte Abtötung von Tumorzellen nicht beeinträchtigt. Insgesamt zeigen diese Befunde, dass das mikrofluidische Kompressionsgerät erfolgreich eingesetzt werden kann, um die unabhängigen und kombinierten Effekte von Kompression und NK-Zellen auf die Vitalität von Tumorsphäroiden in einer physiologisch relevanten 3D-Umgebung zu quantifizieren.

Im Gegensatz dazu können suboptimale Ergebnisse auftreten, wenn (1) Sphäroide außerhalb der Kolbenbegrenzung liegen, (2) Sphäroide zu nahe an der Kolbenbegrenzung positioniert sind und (3) mehrere Sphäroide innerhalb eines Sphäroid-Durchmessers voneinander entfernt liegen (Abbildung 3). In diesen Fällen sollten die entsprechenden Felder von der Analyse ausgeschlossen werden.

Effekt der Zellkompression; Hellfeld, GFP-Fluoreszenz; vorher und nachher; Ergebnisse der 18-stündigen Zeitraffermikroskopie.
Abbildung 3: Repräsentatives Beispiel einer Bildsequenz von Sphäroiden, die von der Analyse ausgeschlossen wurden. Dargestellt sind Zeitraffer-Aufnahmen im Hellfeld (BF), GFP-Fluoreszenz und überlagerte Bilder von MCF-7-Sphäroiden mit NK-Zellen in 1,5 mg/mL Kollagen vor (linke Spalte) und nach Kompression (rechte Spalte). Die Aufnahmen vor der Kompression wurden 20 Minuten vor der Druckanwendung und 10 Minuten vor Beginn der Zeitrafferaufnahmen angefertigt. Anschließend wurden alle 10 Minuten Bilder über einen Zeitraum von 18 Stunden aufgenommen, wobei 0 Stunden dem ersten Bild unmittelbar nach der Kompression entsprechen und 18 Stunden das Ende des Experiments markieren. Der blaue Pfeil zeigt die Kante des PDMS-Kolbens (L2) an. Dieses Bildfeld wurde von der Analyse ausgeschlossen, da sich zwei Sphäroide innerhalb des Kompressionsbereichs befanden und zu nahe an der Kolbengrenze lagen. Daher konnten die Deformation der Sphäroide und die GFP-Fluoreszenzintensität während der Kompression nicht zuverlässig quantifiziert werden. Maßstab = 50 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

(1) Sphäroide außerhalb der Kolbengrenze erfahren keine Kompression, da der Druck nur innerhalb des Kolbenbereichs aufgebracht wird. Diese Sphäroide sollten daher sowohl aus den komprimierten als auch aus den Kontrollbedingungen ausgeschlossen werden. (2) Sphäroide, die auf oder nahe der Kolbengrenze positioniert sind (Abbildung 3, oberer Sphäroid), sollten ausgeschlossen werden, da der Sphäroid einer nicht gleichmäßigen mechanischen Belastung ausgesetzt ist. (3) Sphäroide, die sich innerhalb eines Sphäroid-Durchmessers von benachbarten Sphäroiden befinden, sollten ausgeschlossen werden (Abbildung 3). Die enge räumliche Nähe zwischen Sphäroiden erschwert die Quantifizierung der GFP-Fluoreszenzintensität, da die Region von Interesse (ROI) anhand des letzten Zeitpunkts definiert wird. Im Laufe der Zeit können die Grenzen der Sphäroide ununterscheidbar werden, was es schwierig macht, eine ROI abzugrenzen, die genau nur einen einzelnen Sphäroid umfasst. Diese Probleme können minimiert werden, indem sichergestellt wird, dass die Sphäroide während des Beladens des Geräts zentral innerhalb des Kompressionsbereichs positioniert sind. Eine sorgfältige Beachtung der Verteilung, Positionierung der Sphäroide und der Geräteeinstellung ist entscheidend, um eine gleichmäßige Kompression zu erreichen und zuverlässige, reproduzierbare experimentelle Ergebnisse zu erzielen.

KomponentenKonzentration
α-MEM-Medien
Fetales Rinderserum (FBS)10%
Penicillin/Streptomycin1%

Tabelle 1: Vollständiges MCF-7-Medium.

KomponentenKonzentration
α-MEM-Medien
Myo-Inositol0.2 mM
2-Mercaptoethanol0.1 mM
Fötales Kälberserum (FBS)12,50 %
Folsäure0,02 mM
Pferdeserum (HS)12,50 %
Penicillin/Streptomycin1 %

Tabelle 2: Vollständiges NK-Medium.

Abbildung 1 (Zusatzmaterial): Schema des Druckregelungssystems. Ein Luftkompressor liefert Druckluft (bis zu 20 psi) an den Druckregler. Der Druckregler steuert den an den Druckbehälter abgegebenen Luftdruck entsprechend den benutzerdefinierten Einstellungen. Der Regler hat einen maximalen Betriebsdruck von 200 mbar, eine Druckstabilität von 0,005 % der vollen Skala (FS), eine Druckauflösung von 0,003 % FS und eine Ansprechzeit von 9 ms, wodurch eine genaue und reproduzierbare Druckregelung ermöglicht wird. Der Regler ist über eine universelle serielle Schnittstelle (USB) mit einem Computer verbunden, sodass der Benutzer mithilfe der beiliegenden Software die Größe und das Profil des angelegten Drucks programmieren kann. Die Software unterstützt mehrere Kompressionswellenformen, darunter konstante, sinusförmige, dreieckige und periodische Kompression. In diesem Schema ist der Druck auf 120 mbar eingestellt, und Druckluft mit diesem Druck wird über das pneumatische Rohr an den unter Druck stehenden Behälter geleitet. Der unter Druck stehende Behälter enthält 50 mL entionisiertes (DI-)Wasser und dient dazu, pneumatischen Druck in fluidischen Druck umzuwandeln. Sobald der Behälter unter Druck steht, treibt er Fluid über eine Fluidzuleitung zur Druckregelungseinheit der mikrofluidischen Kompressionsvorrichtung (siehe Abbildung 1 für Details der Vorrichtung), wo der fluidische Druck verwendet wird, um die Tumorsphäroide zu komprimieren. Beachten Sie, dass Fluid­druck verwendet wird, um Luftblasen in der PDMS-Vorrichtung zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Abbildung 2: Kalibrierungskurve für die mikrofluidische Kompressionsvorrichtung, die den Zusammenhang zwischen Kolbenverschiebung (, µm) und dem auf die Druckregelkammer angewendeten Druck (KPa) zeigt. Experimentelle Messwerte sind als Punkte dargestellt, während die durchgezogene Linie der COMSOL-Simulation entspricht. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus acht unabhängigen experimentellen Messungen an, sind jedoch zu klein, um sichtbar zu sein. Diese Abbildung ist mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry aus Suh et al.15 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Supplementärvideo 1: X-Y-Z-Stapel eines GFP-markierten MCF-7-Sphäroids vor der Kompression. Das Sphäroid wurde in 1,5 mg/mL Kollagen innerhalb der mikrofluidischen Kompressionsvorrichtung eingebettet und mittels des GFP-Fluoreszenzkanals mit einer z-Schrittweite von 1 µm abgebildet. Anschließend wurde der Kontrast mit ImageJ verbessert. Maßstabsbalken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweitertes Video 2: Es wurde eine Druckspannung von 50 % (Δh/h = 50 %) auf das in 1,5 mg/mL Kollagen eingebettete, mit GFP markierte MCF-7-Sphäroid ausgeübt. Nach der Kompression wurde ein X–Y-Z-Stack im GFP-Fluoreszenzkanal mit einer Schrittweite von 1 µm aufgenommen und in ImageJ zur Kontrastverbesserung verarbeitet. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese Methode beschreibt die Verwendung einer mikrofluidischen Kompressionsvorrichtung, um die Auswirkungen von Druckspannung auf Tumor-Immun-Interaktionen zu untersuchen. Mit diesem System lässt sich gezielter mechanischer Druck auf Tumorsphäroide ausüben, die in einer dreidimensionalen Kollagenmatrix eingebettet sind. Das Glas-Substrat, das die Basis der Zellkammer (L1) bildet, ermöglicht hochauflösende Live-Cell-Bildgebung und macht die Plattform somit besonders geeignet für Studien, die darauf abzielen, die Motilität, Infiltration und zytotoxische Aktivität von Immunzellen zu quantifizieren. Wichtig ist, dass das System die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen erhält und gleichzeitig eine präzise Kontrolle der mechanischen Umgebung ermöglicht. Im Gegensatz dazu erfordern viele bestehende experimentelle Ansätze zur Untersuchung von Druckspannung einen Kompromiss zwischen ECM-vermittelten zellulären Interaktionen9,13 und hochauflösender Bildgebung14.

In der vorliegenden Studie wurden NK-Zellen und MCF-7-Brusttumorsphäroide als Modellsystem verwendet. Allerdings ist die mikrofluidische Kompressionsvorrichtung nicht auf diese Zelltypen beschränkt. Bislang wurde die Plattform erfolgreich auf mehrere Brustzellmodelle angewandt, einschließlich MDA-MB-231-Brusttumorsphäroide und MCF-10A-Brustsphäroide15,17. Die Plattform kann leicht angepasst werden, um Tumor-Immun-Interaktionen in einer Vielzahl weiterer Tumormodelle zu untersuchen, darunter Gehirn- und Lungen-Tumorsphäroide. Ebenso ist die Plattform mit einer breiten Palette von Immunzellpopulationen über NK-Zellen hinaus kompatibel und ermöglicht Untersuchungen verschiedener Tumor-Immun-Interaktionen unter mechanischer Kompression. Darüber hinaus beschränkt sich die Vorrichtung nicht auf Sphäroid-basierte Studien und kann für Einzelzell-Experimente angepasst werden. Zusammen machen diese Merkmale die Plattform zu einem vielseitigen Werkzeug, um zu untersuchen, wie mechanische Kräfte das zelluläre Verhalten in einer breiten Palette biologischer und krankheitsbezogener Kontexte regulieren.

Ein weiterer Vorteil dieses Systems ist die präzise Kontrolle über die Stärke und das Muster der auf die Proben angewendeten Kompression. In der vorliegenden Studie wurde über die gesamte Versuchsdauer eine statische Druckdehnung von 50 % angelegt. Der Dehnungsgrad kann jedoch je nach experimentellem Ziel leicht angepasst werden. Zusätzlich können mithilfe des externen Druckregelsystems dynamische Kompressionsverfahren mit verschiedenen Wellenformen, einschließlich Rechteck- und sinusförmiger Wellen, auf die Sphäroide angewendet werden. Die Rechteck-Kompression umfasst abwechselnde Phasen von Kompression und Druckentlastung17, während die sinusförmige Kompression eine schrittweise Zunahme und Abnahme der Kompression im Zeitverlauf beinhaltet15. In Kombination mit quantitativer Bildgebung und prädiktiver Modellierung können diese Möglichkeiten genutzt werden, um den Einfluss dynamischer Kompression auf die Effizienz der Immunzell-vermittelten Zerstörung von Zielzellen zu untersuchen.

Es sei darauf hingewiesen, dass diese Kompressionsvorrichtung ursprünglich zur Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Tumoren entwickelt wurde17. Durch die Integration eines in situ-Kraftsensors und einer Polyacrylamid(PAA)-Gelschicht unterhalb des Tumorsphäroids können die mechanischen Eigenschaften des Sphäroids, wie Steifheit und viskoelastische Eigenschaften, quantitativ bestimmt werden15,17. Diese Modifikation erweitert die Anwendbarkeit der Plattform, sodass nicht nur kompressive Belastung modelliert, sondern auch das mechanische Tumorverhalten direkt gemessen werden kann.

Insgesamt bietet die mikrofluidische Kompressionsvorrichtung ein breites Anwendungsspektrum, von der Messung mechanischer Eigenschaften von Sphäroiden bis hin zur Untersuchung von Tumor-Immun-Interaktionen in einer mechanisch modulierenden Umgebung. Es sind jedoch mehrere entscheidende Schritte für einen erfolgreichen Betrieb der Vorrichtung erforderlich. Tumorsphäroide sollten nahe dem Zentrum jedes Wells positioniert werden, um eine gleichmäßige Kompression sicherzustellen. Die Druckregelungseinheit muss korrekt mit der Zellkammer-Schicht (L1) ausgerichtet sein, um eine präzise Übertragung des Drucks zu gewährleisten. Beim Aufsetzen der Druckregelungseinheit auf L1 können Luftblasen eingeschlossen werden, was die Bildqualität und die experimentellen Ergebnisse negativ beeinflussen kann. Um dieses Problem zu vermeiden, ist darauf zu achten, dass beim Befüllen der Kollagenmischung keine Blasen entstehen, und jeweils 8 µL Kollagenmischung in jedes Well gegeben werden sollten, um die Kammer leicht zu überfüllen, bevor die Druckregelungseinheit platziert wird. Dies trägt dazu bei, einen vollständigen Kontakt zwischen den Schichten sicherzustellen und die Wahrscheinlichkeit eingeschlossener Luft zu verringern.

Zusammenfassend ermöglicht dieses Gerät eine kontrollierte Modellierung von Druckspannung in einer physiologisch relevanten dreidimensionalen Kollagenmatrix, die Tumor-Immun-Interaktionen unterstützt. Diese Plattform bietet ein Werkzeug, um zu untersuchen, wie statische und dynamische mechanische Kräfte die immunvermittelte Zerstörung von Tumorzellen und das Tumorverhalten im Tumormikromilieu regulieren. Derzeit identifizieren wir den molekularen Mechanismus, der der mechanischen Modulation der immunvermittelten Tumorzellabtötung zugrunde liegt. Diese Studien könnten zu potenziellen neuen therapeutischen Wirkstoffzielen führen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Offenlegungspflichten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch eine Förderung des National Cancer Institute (Förderkennzeichen R01CA221346), durch das Lance R. Collins-Stipendium des College of Engineering der Cornell University an FM sowie durch das Cornell Provost’s Fund for Research Resilience an FM unterstützt. Ein Teil dieser Arbeit wurde am Cornell NanoScale Facility durchgeführt, einem Mitglied der National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), das durch die National Science Foundation (Förderkennzeichen NNCI-2025233) unterstützt wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 N NaOHSigma-Aldrich797247 µL
10× M199-MediumSigma-AldrichM0650200 µL
2-MercaptoethanolThermoFisher313500100
LuftkompressorElveflowJun-Air Model 3 Compressor
Automatisierte X-Y-MikroskopbühneApplied Scientific InstrumentationMS-2000
CCD-KameraHamamatsu PhotonicsORCA-R2
Fötales Rinderserum (FBS)GeminiBioS11150
FluidzufuhrschläucheElveflowPTFE-Schlauch-Ersatzrolle1/16 Zoll Außendurchmesser
FluoreszenzlichtquelleExcelitas Technologies X-Cite series 120 PC unit
FolsäureSigmaF7876
GlutaraldehydEM Sciences 160190,10 %
Harrick-PlasmareinigerHarrick PlasmaPDC-001-HPEinstellung auf hohe Leistung (45 W)
Pferdeserum (HS)ThermoFisher16050-122
Invertiertes Epi-FluoreszenzmikroskopOlympusIX8120x-Objektiv (NA = 0,25), betrieben mit der Olympus-CellSens-Software
MaskeArtus10 Blatt Aluminium-ZwischenlageStärke beträgt 0,0125 Zoll (0,75 mm)
MCF-7/GFP (Puromycin)-stabile ZelllinieGenTarget IncSC050-G
MetallrahmenIndividuell angefertigt Individuell angefertigt 
Mikrofluidik-ReservoirElveflow50 mL Mikrofluidik-Reservoir 
Mikroskop OlympusCKX414x-Objektiv              (NA = 0,1)
Myo-InositolSigmaI7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
Penicillin/StreptomycinGibco 15140122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ThermoFisher 10010072
Pneumatischer SchlauchElveflowKlare Eingangsleitung aus PUR-Polyether4 mm Außendurchmesser
Polyethylenimin (PEI)Sigma-AldrichP31431 %
DruckreglerElveflowOB1 NK4Betrieben mit der Elveflow Smart Interface-Software
Rattenschwanz-Kollagen Typ I Corning35424931,3 µL einer 9,6 mg/mL-Stammlösung aus Kollagen
SchraubenPhillipsM2,5 Pan-Kopf12 Schrauben
StufeninkubatorPrecision PlasticIndividuell angefertigt
SpritzeBecton Dickinson303134In Kombination mit einem männlichen Luer-Integralverschluss mit 3/32 Zoll Außendurchmesser-Buchse von Elveflow
α-MEM-MedienThermoFisher12561056

Referenzen

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