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Optimierte Methoden zur Untersuchung der entwicklungsbedingten Protein- und Transkriptexpression in ganzen Mäuseembryonen

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11. September 2026

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1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Cellular Imaging Core Facility, Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mausmodelle sind entscheidend für die Vertiefung unseres Verständnisses der embryonalen Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Färbung von Proteinen und Transkripten in ganz fixierten Mausembryonen sowie die quantitative dreidimensionale Analyse der resultierenden Färbung. Diese Techniken ermöglichen die Visualisierung und Analyse wichtiger entwicklungsbiologischer Zelltypen und Prozesse.

Zusammenfassung

Mausmodelle haben maßgeblich zur Vertiefung unseres Verständnisses der embryonalen Entwicklung beigetragen. Die Analyse der Expression und Lokalisation von Proteinen und Transkripten in Embryonen ist entscheidend, um die zellulären und molekularen Mechanismen, die der Entwicklung und Krankheit zugrunde liegen, aufzuklären. Herkömmliche Methoden zur Analyse von Transkripten und Proteinen in Mausembryonen weisen jedoch Grenzen auf. Die RNA-in-situ-Hybridisierung ermöglicht die Ganzpräparat-Färbung von Transkripten, bietet jedoch keine Multiplexing-Fähigkeit. Im Gegensatz dazu erlaubt das Einbetten und Schneiden von Embryonen eine multiplexe Zielstruktur-Färbung, allerdings nur in zwei Dimensionen (2D). In jüngerer Zeit wurden Techniken wie RNAscope und immunfluoreszenzbasierende Färbungen auf Ganzpräparate von Embryonen angewandt, wodurch eine Multiplex-Detektion von Zielstrukturen in drei Dimensionen (3D) möglich ist. Diese Methoden ermöglichen die Kartierung wesentlicher Interaktionen, Signalwege und Zelltypen, die für die embryonale Entwicklung notwendig sind, ohne die Einschränkungen herkömmlicher Techniken.

Hier beschreiben wir optimierte Methoden zur Ganzpräparat-Färbung fixierter Maus-Embryonen vom embryonalen Tag (E) 8,5 und E9,5 unter Verwendung von RNAscope oder Immunfluoreszenz. Beide Methoden ermöglichen die multiplexe Detektion von bis zu vier Zielstrukturen gleichzeitig in einem einzelnen Embryo. Wir stellen außerdem eine Methode vor, mit der die Immunfluoreszenz-Färbung mit RNAscope im selben Embryo kombiniert werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Transkripten während der Entwicklung sichtbar zu machen. Darüber hinaus beschreiben wir eine Pipeline zur konfokalen Bildgebung und 3D-Analyse der Zielexpression im gesamten Embryo sowie in definierten entwicklungsbedingten Zelltypen mithilfe der Zeiss Arivis Pro-Software. Zusammen ermöglichen diese Methoden eine umfassende Analyse multiplexer Protein- und Transkript-Zielstrukturen in 3D und stellen somit ein leistungsstarkes System zur Aufklärung zellulärer und molekularer Interaktionen in der frühen bis mittleren Embryogenese dar.

Einleitung

Mausmodelle haben wesentlich zum Fortschritt in der Entwicklungsbiologie beigetragen, da sie das Verständnis menschlich relevanter Entwicklungsprozesse in vivo ermöglichen, aufgrund der Homologie zwischen der Entwicklung von Maus und Mensch und der Möglichkeit, die Genexpression durch Schlüsseltechniken wie Cre-LoxP oder CRISPR/Cas9 zu modulieren1,2. Etwa 90 % der genomischen Regionen sind zwischen Mäusen und Menschen konserviert3, und Mäuse teilen viele Entwicklungsprozesse mit dem Menschen. Beispielsweise folgen sowohl Mäuse als auch Menschen einem ähnlichen Zeitplan der Embryogenese, einschließlich der Bildung einer Zygote, die sich zu einem Blastozysten entwickelt, gefolgt von Implantation und Gastrulation4. Darüber hinaus ist die Entwicklung der meisten Organe bei Mäusen und Menschen ähnlich. Beispielsweise durchlaufen sowohl das menschliche als auch das mausartige Herz eine ähnliche Abfolge von Herzschenkelung, Septierung der Vorhöfe und Ventrikel, Klappenbildung und Ausflusstraktbildung, um ein vierkammeriges Herz zu bilden5. Daher weisen sowohl das sich entwickelnde als auch das voll entwickelte Herz von Maus und Mensch eine erhebliche strukturelle Ähnlichkeit auf6,7.

Um die Vorgänge zu untersuchen, die bei der normalen und der pathologischen Entwicklung auftreten, wurden mehrere Techniken entwickelt, die eine räumliche Visualisierung wichtiger Proteine und Transkripte ermöglichen. Solche Techniken umfassen die Immunfluoreszenzfärbung und die RNA-in situ-Hybridisierung.

Die RNA-in-situ-Hybridisierung wurde erstmals 1969 von Gall und Pardue8 sowie John, Brinstall und Jones9 und 1970 von Buongiorno-Nardelli und Amaldi10 beschrieben. Sie dient der Untersuchung der Transkriptexpression in Geweben8. Kurz gesagt, werden Sonden ausgewählt, die eine komplementäre RNA-Sequenz zum gewünschten Ziel enthalten, und mit Markern zur Detektion versehen. Solche Marker umfassen radioaktive Markierungen, Biotin oder Digoxigenin. Fixierte Proben werden permeabilisiert, um das Eindringen der Sonde zu ermöglichen, anschließend hybridisiert man die Sonde an das Gewebe. Die Gewebe können dann entweder direkt abgebildet werden, falls sie radioaktiv markiert sind, oder die Marker mithilfe von Antikörpern, die mit alkalischer Phosphatase oder einem fluoreszierenden Farbstoff konjugiert sind, sichtbar gemacht werden. Die RNA-in-situ-Hybridisierung bietet den Vorteil, dass ganze Präparate für die 3D-Lokalisierung gefärbt werden können11. Allerdings ist sie in der Regel durch ihre begrenzte Multiplexfähigkeit auf mehr als zwei Ziele beschränkt, es sei denn, optimierte Techniken mit sehr spezifischen Anwendungen werden eingesetzt oder es wird auf die DNA-Hybridisierung zurückgegriffen, wie beispielsweise bei der M-FISH-Methode, die zur fluoreszenten Markierung von Chromosomen verwendet wird12,13.

Die Immunfluoreszenz, die erstmals 1941 von Coons et al.14,15 entwickelt wurde, ist eine Methode zum Nachweis von Zielproteinen in fixierten oder gefrorenen Proben. Kurz gesagt, werden Proben blockiert, um unspezifische Bindungen an nicht-zielgerichtete Gewebebereiche zu verringern. Anschließend werden die Proben mit einem primären Antikörper inkubiert, der spezifisch für ein Zielantigen ist. Primäre Antikörper können direkt mit einem fluoreszierenden Farbstoff oder Protein konjugiert sein oder mittels eines fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers erfasst werden, der gegen die Art gerichtet ist, in der der primäre Antikörper hergestellt wurde. Der Vorteil der Verwendung sekundärer Antikörper gegenüber direkt konjugierten primären Antikörpern liegt in der Signalverstärkung, was zu einer höheren Empfindlichkeit führt. Mehrere primäre Antikörper, die in verschiedenen Arten hergestellt wurden, können zur multiplexen Detektion von Zielstrukturen eingesetzt werden, wobei direkt konjugierte oder sekundäre Antikörper verwendet werden, die an Fluorophore mit unterschiedlichen Absorptions- und Emissionsspektren gekoppelt sind.

Herkömmliche Techniken wie die RNA-in-situ-Hybridisierung und die Immunfluoreszenz weisen Einschränkungen auf. Typischerweise ermöglicht die RNA-in-situ-Hybridisierung lediglich den Nachweis eines einzelnen Zielmoleküls in einer Probe, wodurch die Untersuchung von Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen und Signalwegen stark eingeschränkt ist. Außerdem wird die Immunfluoreszenz traditionell an Gewebeschnitten statt an Ganzpräparaten durchgeführt, was die räumliche Auflösung auf zwei Dimensionen begrenzt. Neuere Techniken konzentrieren sich auf die multiplexe Detektion von Zielstrukturen in dreidimensionalen Systemen. Die Optimierung von Immunfluoreszenz-Protokollen hat die Anwendung dieser Methode an Ganzpräparaten ermöglicht16. Darüber hinaus wurden Techniken entwickelt, die den multiplexen Nachweis von Transkripten unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Sonden ähnlich der Immunfluoreszenz erlauben.

RNAscope wurde erstmals 2012 von Wang et al. beschrieben. Es basiert auf der RNA-in-situ-Hybridisierungstechnologie17, die eine räumliche Identifizierung von Transkripten in fixierten Proben ermöglicht. Kurz gesagt, werden fixierte Proben permeabilisiert, wodurch die Infiltration von Zielsonden ermöglicht wird, die an komplementäre Transkriptsequenzen binden. RNAscope-Sonden weisen eine „Doppel-Z-Struktur“ auf, die aus einem Bereich besteht, der spezifisch für eine 18–25 Basenpaare lange Region der Ziel-RNA ist, einem Schwanzbereich mit 14 Basenpaaren und einem Spacer-Bereich, der zwei „Z-Sonden“ miteinander verbindet. Beide Schwanzbereiche bilden gemeinsam eine 28 bp lange Region, die durch einen Präamplifikator gebunden wird. Gebundene Z-Sonden-Paare werden anschließend durch die Bindung einer Reihe von Amplifikatoren, die an Stellen auf dem Präamplifikator binden, amplifiziert. Die Amplifikatoren können gezielt mit markierten Sonden, die mit fluoreszierenden Markern oder Meerrettichperoxidase (HRP) versehen sind, angezeigt werden. Der Gedanke hinter der Doppel-Z-Struktur der Sonden besteht darin, die Amplifikation ungebundener Sonden zu verhindern und somit unspezifische Amplifikation zu reduzieren, während die Verwendung mehrerer Amplifikatoren die Empfindlichkeit erhöht. Der Vorteil von RNAscope gegenüber der RNA-in-situ-Hybridisierung liegt in der Möglichkeit, die Detektion von Transkripten in einer einzelnen Probe durch die Verwendung unterschiedlicher fluoreszierender Marker multiplexfähig zu gestalten. RNAscope wurde häufig in formalinfixierten, paraffineingebetteten Schnitten von Proben eingesetzt, wodurch die räumliche Detektion von Transkripten in 2D ermöglicht wurde18. Neuere Studien beschreiben die Ganzpräparat-Färbung mittels RNAscope in Maus-Embryonen, die eine 3D-Analyse wesentlicher Entwicklungsprozesse erlaubt19.

Hier beschreiben wir optimierte Methoden zur Ganzpräparat-Färbung fixierter E8.5- und E9.5-Maus-Embryonen mittels RNAscope-in situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz. Dieses Protokoll stellt eine überarbeitete Methode zur Kombination von Immunfluoreszenz und RNAscope vor, die erfolgreich für Ganzpräparate von E8.5/E9.5-Embryonen ist, die Hinzufügung eines weiteren Farbkanals zur Ganzpräparat-RNAscope-Färbung ermöglicht, indem eine vierte RNAscope-Sonde in Kombination mit dem Opal-780-Fluorophor verwendet wird, und eine breit anwendbare Methode zur Analyse gefärbter Embryonen detailliert beschreibt. Diese Methoden können genutzt werden, um das Verständnis zentraler Entwicklungsprozesse wie Zellmigration und Signalwege weiter voranzutreiben, indem eine multiplexe Visualisierung von bis zu vier Protein- und Transkript-Zielen durch Immunfluoreszenz-Färbung und RNAscope sowie eine quantitative 3D-Analyse in Ganzpräparaten von E8.5/E9.5-Maus-Embryonen während der Entwicklung ermöglicht wird.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß dem britischen Tierschutzgesetz (Scientific Procedures) von 1986 durchgeführt und von der Tierversuchskommission der University of Oxford sowie vom Innenministerium (Projektlizenz PP7967396) genehmigt.

1. Dissektion, Dehydrierung und Lagerung von E8,5- und E9,5-Maus-Embryonen

  1. Schwangeren Weibchen mit einer genehmigten Methode am Tag E8.5 oder E9.5 der Trächtigkeit entnehmen.
    HINWEIS: Die Mäuse in dieser Studie wurden durch Halsbruch getötet, wobei der Tod durch Exsanguination bestätigt wurde. Die Exsanguination erfolgt durch einen Schnitt in die Ventrikel zur Förderung der Blutung. Andere Methoden, wie beispielsweise die Inhalation von CO2, können verwendet werden, wurden jedoch in diesem Protokoll nicht getestet.
  2. Öffnen Sie zuerst den Bauch, indem Sie durch die Haut und anschließend durch die Bauchwand schneiden.
    HINWEIS: Benetzen Sie die Mäuse mit 70 %igem Ethanol, um Schuppen und bakterielle Kontamination zu reduzieren. Beim Öffnen der Bauchdecke ist es wichtig, diese zunächst vom Abdomen wegzuziehen und dann eine kleine Inzision vorzunehmen. Schneiden Sie die Bauchdecke V-förmig ein und vermeiden Sie versehentliche Verletzungen der Gebärmutter.
  3. Entfernen Sie die Gebärmutter, indem Sie dort schneiden, wo die Gebärmutter auf die Vagina trifft. Schneiden Sie bei beiden Uterushörnern die Gebärmutter vom Bauchfett ab und führen Sie kleine Einschnitte durch, bis Sie den Eierstock erreichen.
    HINWEIS: Es ist empfehlenswert, die Position jedes Embryos innerhalb der Gebärmutter zu notieren. Isolieren Sie den Eierstock zusammen mit der Gebärmutter, um die Orientierung beizubehalten.
  4. Schneiden Sie einzeln ein Embryo aus dem Uterushorn innerhalb des umgebenden Uterus aus und legen Sie es in eine Schale, die 1 enthält× Hanks’ Basissalzlösung mit 5 mM EDTA
  5. Mit feinen Pinzetten vorsichtig die Gebärmutter vom Embryo, Plazenta und dem die beiden umgebenden Decidua ablösen.
  6. Identifizieren Sie die Stelle, an der die Plazenta auf den Teil des mütterlichen Deciduagewebes trifft, das den Embryo umgibt; zwischen diesen beiden Abschnitten sollte ein geringer Farbunterschied bestehen. Trennen Sie den Embryo vorsichtig ab, indem Sie durch das mütterliche Deciduagewebe schneiden, um die Plazenta zu lösen und den Embryo freizulegen.
  7. Lösen Sie das Embryo vorsichtig innerhalb seines Dottersacks aus dem umgebenden Gewebe. Entfernen Sie mit feinen Pinzetten den Dottersack, der das Embryo umgibt. Entfernen Sie die Amnionhaut. Zählen Sie die Somiten, um das genaue embryonale Entwicklungsstadium zu bestimmen.
    HINWEIS: Das Dottersack umgibt das Embryo und ist dicker sowie undurchsichtiger. Das Amnion ist dünn, durchsichtig und liegt eng am Embryo an. Es muss sorgfältig entfernt werden, um eine ausreichende Penetration von Sonden/Antikörpern in nachfolgenden Schritten zu gewährleisten. Bei älteren Embryonen kann mit feinen Pinzetten ein Loch im Kopfbereich erzeugt werden, um eine Ansammlung der Sonde in den sich entwickelnden Hirnventrikeln zu verhindern. An dieser Stelle ist es wichtig, so viel wie möglich vom Dottersack zu entfernen. Reste des Dottersacks zeigen eine starke Autofluoreszenz, wenn sekundäre Antikörper gegen Maus verwendet werden.
  8. Optional: Den Dottersack zur Genotypisierung durch Waschen in 500 µL von PBS oder 70 % Ethanol, je nach downstream Genotypisierung, in einem 1,5-mL-Eppendorf-Röhrchen, um verunreinigendes Blut zu entfernen. Halten Sie den Dottersack mit feiner Pinzette in der PBS und bewegen Sie ihn manuell, um ihn zu schütteln. Nehmen Sie den gewaschenen Dottersack und geben Sie ihn in ein sauberes 1,5-mL-Eppendorf-Röhrchen oder eine Genotypisierungsplatte. Lagern Sie bis zu 4 Wochen bei -20 °C oder fortfahren mit der bevorzugten DNA-Extraktionsmethode.
  9. Unter Verwendung einer 2-mL-Niederdruck-Polyethylen-(LDPE-)Pasteurpipette das Embryo vorsichtig aufsaugen und in ein 2-mL-Rundboden-Eppendorf-Gefäß überführen, das 1 mL frisch hergestelltes oder gefrorenes Lagerbestand 4 % Paraformaldehyd (PFA) enthält, wobei darauf zu achten ist, so wenig Dissektionsmedium wie möglich dem PFA zuzusetzen.
    HINWEIS: Beim Dissektieren von E9,5-Embryonen das Ende der Pasteurpipette schräg abschneiden, um die Öffnungsgröße zu vergrößern. Dies ist wichtig, um Schäden am Embryo während des Pipettierens zu vermeiden. Die Verwendung von rundbodigen 2-mL-Eppendorf-Röhrchen ist entscheidend, um zu verhindern, dass der Embryo am Röhrchenboden hängen bleibt, und um eine einfachere Rückgewinnung zu ermöglichen. Wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen von PFA vermeiden.
    ACHTUNG: PFA ist toxisch und krebserregend. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) und atmen Sie es nicht ein oder nehmen Sie es nicht auf. Pulverförmiges PFA ist bei Inhalation gefährlich; daher muss es in einem Abzug vorbereitet werden.
  10. Inkubieren Sie das Embryo in 4 % PFA für 16–24 h bei 4 °C unter sanftem Schwenken, wobei die Röhrchen im rechten Winkel zur Schwenkrichtung stehen.
  11. Den Embryo durch Waschungen in einer Methanolreihe dehydrieren. Unter Verwendung von LDPE-Pasteurpipetten und darauf achten, den Embryo nicht aufzupipettieren, PFA abnehmen und 1 mL PBS hinzufügen. 10 min bei Raumtemperatur (RT) mit sanftem Schwenken waschen, wobei die Röhrchen in 90° zur Schwingebene. Wiederholen Sie dies für die Waschschritte mit 25 %, 50 %, 75 % und 2× 100 % Methanol in PBS
  12. Ersetzen Sie die letzte 100 % Methanol-Waschung durch 1,5 mL frisches 100 % Methanol und lagern Sie bei -20 °C.
    HINWEIS: Proben können jahrelang bei -20 °CAchten Sie darauf, Verdunstung zu vermeiden.
    ACHTUNG: Methanol ist entzündlich und toxisch. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und lagern Sie es in einem Schrank für entzündliche Flüssigkeiten. Nicht einatmen oder verschlucken.

2. Färbung von Ganzpräparaten von E8,5- und E9,5-Embryonen für Proteine mittels Immunfluoreszenz

HINWEIS: Alle Waschschritte erfolgen mit einem Volumen von 1 mL in einem 2 mL Rundboden-Eppendorf-Gefäß. Führen Sie die 1-mL-Waschschritte mit sanftem Schwenken durch, wobei die Gefäße um 90° zur Schwenkebene geneigt sind. Entfernen und ersetzen Sie die Flüssigkeit mit einer 2-mL-LDPE-Pasteurpipette, wobei darauf geachtet werden muss, dass der Embryo nicht angesaugt wird. Bei Verwendung von E9,5-Embryonen sollte die Spitze der Pasteurpipette abgeschnitten werden, um Schäden am Embryo im Fall einer versehentlichen Aufnahme zu vermeiden. Verdünnen Sie Methanol in PBS. Die Embryonen können einzeln oder gemeinsam in einem Gefäß mit bis zu 12 gepoolten Embryonen gefärbt werden. Für E9,5-Embryonen: In einem einzigen Gefäß können bis zu zwei Bedingungen gefärbt werden. Werden mehrere Bedingungen verwendet, schneiden Sie den Schwanz einer der Gruppen ab, damit sie bei der Bildaufnahme unterschieden werden können.

  1. Holen Sie die Embryonen aus der Lagerung bei -20 °C und lassen Sie sie 10–20 min bei Raumtemperatur (RT) von 20–26 °C temperieren. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen eine ähnliche Somitenanzahl aufweisen, um einen Vergleich ähnlicher Entwicklungsstadien zu gewährleisten.
  2. Bleichen und permeabilisieren Sie die Embryonen 2 h lang in einer Lösung aus 100 % Methanol:Dimethylsulfoxid (DMSO):30 % Wasserstoffperoxid im Verhältnis 4:1:1.
    ACHTUNG: Wasserstoffperoxid ist ätzend und reizend. Es kann schwere Augenschäden verursachen und ist schädlich, wenn es verschluckt wird. Bei Kontakt mit den Augen spülen Sie mehrere Minuten lang mit Wasser nach. Wasserstoffperoxid stellt eine Gefahr für aquatische Organismen dar; entsorgen Sie es über eine zugelassene Entsorgungseinrichtung. Tragen Sie geeignete PSA, einschließlich Augenschutz. Nicht einnehmen.
  3. Heizen Sie den Wärmeblock auf 98 °C vor und bereiten Sie den Citrat-Enthüllungspuffer durch Verdünnen von 100 µL Citrat-Enthüllungspuffer in 10,7 mL destilliertem Wasser vor.
  4. Rehydrieren Sie die Proben durch Spülen in 70 % Methanol, anschließendes Waschen in 50 % Methanol, 25 % Methanol und schließlich in PBS jeweils 10 min bei RT unter Schütteln.
  5. Heizen Sie den Citrat-Enthüllungspuffer mithilfe des vorgeheizten Wärmeblocks mindestens 20 Minuten lang auf 98 °C vor. Waschen Sie die Embryonen anschließend 3 × 10 min bei RT im Citrat-Enthüllungspuffer.
  6. Nach den Waschungen bei RT geben Sie den vorgeheizten Citrat-Enthüllungspuffer zu den Embryonen und erhitzen sie im Wärmeblock 10 min bei 98 °C. Entfernen Sie die Probe von der Hitzequelle und lassen Sie sie mindestens 40 min abkühlen.
    HINWEIS: Verwenden Sie den Citrat-Enthüllungspuffer nicht zur Antigenfreisetzung bei E8.5-Embryonen, da dies zur Dissoziation der Embryonen führen kann. Embryonen können im Citrat-Enthüllungspuffer klebrig werden; halten Sie die Waschungen daher ruhig, um Schäden durch Verklumpung zu vermeiden.
  7. Waschen Sie die Embryonen 3 × 10 min in PBS + 0,1 % Triton-X bei RT unter Schütteln. Blockieren Sie die Embryonen 16–24 h in mindestens 150 µL/Probe PBS + 0,1 % Triton-X + 10 % normales Eselserum bei 4 °C unter Schütteln.
  8. Bereiten Sie die primären Antikörper vor, indem Sie diese 1 h vor der Zugabe zu den Embryonen in den empfohlenen Konzentrationen in PBS + 0,1 % Triton-X + 10 % normales Eselserum verdünnen und bei 4 °C lagern.
  9. Entfernen Sie die Blockierungslösung von den Embryonen und geben Sie mindestens 150 µL/Probe der verdünnten Antikörperlösung hinzu. Inkubieren Sie 1–3 Tage bei 4 °C unter Schütteln.
    HINWEIS: Primäre Antikörper können multiplex verwendet werden, solange jeder Antikörper in einer anderen Spezies hergestellt wurde. Die Verwendung von Antikörpern, die in Mäusen hergestellt wurden, und anschließender anti-maus sekundärer Antikörper kann zu intensiver unspezifischer Färbung führen. Alternativ können in einigen Fällen primäre Antikörper derselben Spezies multiplex eingesetzt werden, wenn die primären Antikörper unterschiedliche Isotypen aufweisen und mit isotypspezifischen sekundären Antikörpern kombiniert werden.
  10. Spülen Sie die Embryonen in PBS + 0,1 % Triton-X und waschen Sie sie anschließend 6 × 30 min in PBS + 0,1 % Triton-X bei RT.
  11. Blockieren Sie den sekundären Antikörper, indem Sie die geeigneten fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper und DAPI (oder einen alternativen Kernmarker) 1 h vor der Zugabe zu den Embryonen in den empfohlenen Konzentrationen in 0,1 % Triton-X + 10 % normales Eselserum verdünnen und bei 4 °C im Dunkeln lagern.
  12. Entfernen Sie die Waschlösung, geben Sie die verdünnte Lösung des sekundären Antikörpers zu den Embryonen und inkubieren Sie 16–24 h bei 4 °C unter Schütteln im Dunkeln.
    HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper vom F(ab)-Fragment-Typ anstelle ganzer Antikörper. F(ab)-Fragmente sind kleiner und weisen daher eine bessere Gewebedurchdringung auf; das Fehlen der Fc-Region trägt zudem zur Verringerung unspezifischer Hintergrundsignale bei.
  13. Spülen Sie die Embryonen in PBS + 0,1 % Triton-X und waschen Sie sie anschließend 6 × 30 min in PBS + 0,1 % Triton-X bei RT unter Schütteln im Dunkeln. Lagern Sie sie bis zu 4 Wochen in PBS + 0,1 % Triton-X bei 4 °C im Dunkeln.

3. Färbung von Ganzpräparaten von E8,5- und E9,5-Embryonen für Transkripte mittels RNAscope

HINWEIS: Alle Waschschritte erfolgen mit einem Volumen von 1 mL in einer 2-mL-Eppendorf-Röhrchen. Führen Sie die 1-mL-Waschschritte mit sanftem Schwenken durch, wobei die Röhrchen um 90° zur Schwenkebene stehen. Entfernen und ersetzen Sie die Flüssigkeit mit einer 2-mL-LDPE-Pasteurpipette, wobei darauf geachtet werden muss, dass der Embryo nicht angesaugt wird. Bei Verwendung von E9,5-Embryonen sollte das Ende der Pasteurpipette abgeschnitten werden, um eine Beschädigung des Embryos im Falle eines versehentlichen Ansaugens zu vermeiden. Methanol sollte mit PBS verdünnt werden. Schalten Sie den Hybridisierungsofen vor Arbeitsbeginn auf 40 °C ein, und legen Sie feuchtes Gewebe auf den Boden. Die Embryonen können einzeln oder in einem Röhrchen mit bis zu 12 gepoolten Embryonen gefärbt werden. Bei E9,5-Embryonen: Bis zu 2 Bedingungen können in einem einzigen Röhrchen gefärbt werden. Falls mehrere Bedingungen verwendet werden, schneiden Sie den Schwanz einer der Gruppen ab, damit sie bei der Bildaufnahme unterschieden werden können.

  1. Bereiten Sie den Arbeitsplatz, die Pipetten und das Rack vor, indem Sie diese mit 70 %igem Ethanol und anschließend mit einer RNase-Entkontaminationslösung reinigen.
  2. Rehydrieren Sie die Embryonen durch eine abgestufte Methanolreihe, die in PBS mit 75 %, 50 %, 25 %, PBS und PBS + 0,1 % Tween 20 verdünnt ist, jeweils 5 Minuten pro Schritt mit sanftem Schwenken.
  3. Permeabilisieren Sie die Embryonen, indem Sie sie in etwa 75 µL (3 Tropfen) Protease III für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit aufrechtem Schwenken inkubieren.
    ANMERKUNG: Die Permeabilisierungszeit kann je nach embryonalem Stadium/Größe optimiert werden. 20 Minuten eignen sich gut für E8,5-/E9,5-Embryonen, aber längere Inkubationszeiten können erforderlich sein, um tiefere Strukturen in E9,5-Embryonen sichtbar zu machen. Zu lange Permeabilisierungsschritte können zur Dissoziation der Embryonen führen.
  4. Waschen Sie die Embryonen 3 × 5 Minuten in PBS + 0,01 % Tween 20.
  5. Bereiten Sie die RNAscope-Sonden vor, indem Sie etwa 150 µL (ca. 6 Tropfen) pro Röhrchen C1-Sonden in ein Eppendorf-Röhrchen geben. Verdünnen Sie alle C2–C4-Sonden in der C1-Sonde im Verhältnis 1:50 und inkubieren Sie sie vor der Anwendung auf den Embryonen 10 Minuten bei 40 °C in einem Hybridisierungs-Ofen im aufrechten Zustand.
    ANMERKUNG: Bei jedem Satz RNAscope-Sonden in einem Experiment steht „C“ für die Kanalzuordnung. Eine C1-Sonde ist erforderlich, da alle anderen Sonden in der C1-Sonde verdünnt werden. Stellen Sie sicher, dass pro Mischung nur eine Sonde pro Kanalbezeichnung verwendet wird. Sonde-Mischungen können mindestens einmal wiederverwendet werden, wenn sie bei 4 °C bis zu 6 Wochen gelagert werden.
  6. Entfernen Sie die letzte Waschung und geben Sie 150 µL Sondenmischung zu jedem Röhrchen mit Embryonen hinzu. Inkubieren Sie 16–24 Stunden bei 40 °C im aufrechten Zustand im Hybridisierungs-Ofen.
  7. Entfernen Sie die Sondenmischung und waschen Sie in 0,2× Salin-Natrium-Citrat (SSC)-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur.
  8. Fixieren Sie die Embryonen nach der Inkubation in 4 % PFA bei Raumtemperatur mit sanftem Schwenken, wobei die Röhrchen im 90°-Winkel zur Schwingebene stehen.
  9. Waschen Sie in 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur.
  10. Inkubieren Sie die Proben in etwa 150 µL (6 Tropfen)/Röhrchen Amp1-Reagenz für 30 Minuten bei 40 °C im Hybridisierungs-Ofen, wobei die Röhrchen aufrecht gehalten werden.
  11. Waschen Sie in 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur.
  12. Inkubieren Sie die Proben in etwa 150 µL (6 Tropfen)/Röhrchen Amp2-Reagenz für 30 Minuten bei 40 °C im Hybridisierungs-Ofen, wobei die Röhrchen aufrecht gehalten werden.
  13. Waschen Sie in 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur.
  14. Inkubieren Sie die Proben in etwa 150 µL (6 Tropfen)/Röhrchen Amp3-Reagenz für 15 Minuten bei 40 °C im Hybridisierungs-Ofen, wobei die Röhrchen aufrecht gehalten werden.
  15. Waschen Sie in 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur.
  16. Inkubieren Sie in 150 µL (6 Tropfen) HRP-C1 für 15 Minuten bei 40 °C im aufrechten Zustand im Hybridisierungs-Ofen. Waschen Sie anschließend in 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur.
  17. Inkubieren Sie die Proben mit einem in TSA-Puffer verdünnten Fluorophor für 30 Minuten bei 40 °C im Hybridisierungs-Ofen, wobei die Röhrchen aufrecht gehalten werden.
    ANMERKUNG: RNAscope-Fluorophore können mit verschiedenen Sonden verwendet werden. TSA-vivid 570 ist am hellsten, gefolgt von TSA-vivid 650 und dann TSA-vivid 520. Wählen Sie die Fluorophore basierend auf der erwarteten Sondenmenge aus.
  18. Waschen Sie in 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur.
  19. Im Dunkeln inkubieren Sie die Proben in etwa 150 µL (6 Tropfen)/Röhrchen HRP-Blocker-Reagenz für 15 Minuten bei 40 °C im Hybridisierungs-Ofen, wobei die Röhrchen aufrecht gehalten werden.
  20. Waschen Sie in 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur.
    ANMERKUNG: Das Protokoll kann hier für 16–24 Stunden unterbrochen werden, indem die Embryonen bei Raumtemperatur in der letzten Waschung belassen werden.
  21. Wiederholen Sie die Schritte 3.16–3.20 für jede der Sonden C2–C4, falls verwendet, wobei HRP-C1 je nach Bedarf durch HRP-C2/C3/C4 ersetzt wird. Verwenden Sie für jede einzelne Sonde einen anderen Fluorophor.
    ANMERKUNG: Bei Verwendung von C4-Sonden ist das RNAscope 4-plex-Zusatzkit und der Opal 780-Fluorophor erforderlich. Opal 780 sollte nur bei Multiplexing mit vier Sonden verwendet werden und immer als letzter Fluorophor eingesetzt werden, da er anfällig für Abbau ist. Bei der Auswahl der Fluorophore ist es wichtig, die Fähigkeiten der verwendeten Mikroskopieplattform zu berücksichtigen. Stellen Sie immer sicher, dass das Bildgebungssystem geeignete Anregungswellenlängen, Emissionsfilter und Detektor-Empfindlichkeit für alle verwendeten Sonden aufweist. Bei Färbung mit Opal 780 ersetzen Sie die Schritte 3.17–3.19 durch folgende:
    1. Inkubieren Sie die Proben in 150 µL/Röhrchen TSA-DIG (1:100 in TSA-Puffer verdünnt) für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schwenken.
    2. Waschen Sie in 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur.
    3. Im Dunkeln inkubieren Sie die Proben in etwa 150 µL (6 Tropfen)/Röhrchen HRP-Blocker-Reagenz für 15 Minuten bei 40 °C im Hybridisierungs-Ofen, wobei die Röhrchen aufrecht gehalten werden.
    4. Waschen Sie in 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur.
    5. Inkubieren Sie die Proben in 150 µL/Röhrchen Opal Polaris 780, verdünnt in Antikörperverdünnungspuffer/Blocker, für 45 Minuten bei 40 °C im Hybridisierungs-Ofen, wobei die Röhrchen aufrecht gehalten werden.
  22. Im Dunkeln inkubieren Sie die Proben in etwa 150 µL DAPI, verdünnt in 0,2 × SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 (Arbeitskonzentration 1 µg/mL), für 16–24 Stunden bei 4 °C mit sanftem Schwenken, wobei die Röhrchen aufrecht gehalten werden.
  23. Waschen Sie in 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 für 3 × 8 Minuten bei Raumtemperatur. Lagern Sie die Proben kurzfristig in PBS bei 4 °C.

4. Kombinierte RNAscope- und Immunfluoreszenz-Färbung in Ganzpräparaten von E8.5-Embryonen

  1. Folgen Sie den Schritten 3.1–3.21 des RNAscope-Protokolls.
    HINWEIS: Eine Verkürzung der Dauer des Permeabilisierungsschritts im RNAscope-Protokoll kann die Leistung der Antikörper bei der Immunfluoreszenz verbessern.
  2. Waschen Sie die Proben 16–24 h in 1 mL 0,2× SSC-Puffer + 0,1 % Tween 20 bei Raumtemperatur unter Schütteln.
  3. Folgen Sie den Schritten 2.7–2.12 des Immunfluoreszenz-Protokolls.

5. Vorbereitung von Ganzpräparaten von Embryonen zur Bildgebung mittels punktscannender oder Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie

  1. Nach der Färbung das Embryo vorsichtig mit einer LDPE-Pasteurpipette aufnehmen und in eine Mehrkammer-Bildgebungsschiebe oder eine Hohlraumplatte überführen, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Embryo nicht austrocknet. Bei Bedarf das Embryo gewünscht ausrichten, wobei darauf zu achten ist, die Probe nicht zu beschädigen.
    HINWEIS: Hohlraumplatten sind vorteilhaft, um die Ausrichtung der Embryonen sicherzustellen, können jedoch zu einer Kompression der Embryonen und Gewebeschäden führen. Mehrkammer-Bildgebungsschieben schonen die Embryonen, können jedoch zu Variationen in der Bildgebungsausrichtung führen und Artefakte am Rand der Kammer verursachen.
  2. Optional – Gewebeklärung: Klären Sie das Gewebe, indem Sie die letzte Waschung vorsichtig vom Embryo entfernen und bis zu 200 µL CUBIC-R-Lösung in die Bildgebungsschale bei Raumtemperatur hinzufügen. Belassen Sie das Embryo mindestens 40 Minuten lang in einer einzigen Inkubation mit CUBIC-R, bevor Sie die Bildgebung durchführen. Geklärte Proben sollten in derselben CUBIC-R-Lösung abgebildet werden, die für die Inkubation verwendet wurde.
    ACHTUNG: CUBIC-R ist giftig bei Inhalation und kann Augen- und Hautreizungen verursachen. Vermeiden Sie Inhalation und tragen Sie geeignete PSA beim Umgang.
    HINWEIS: Embryonen werden kurz nach Kontakt mit CUBIC-R vollständig transparent. Fügen Sie CUBIC-R erst nach der Ausrichtung direkt in die Bildgebungsschale hinzu, und achten Sie darauf, das Embryo nicht zu verlieren. Eine teilweise Umkehrung der Klärung tritt ein, wenn CUBIC-R vom Embryo entfernt und durch PBS ersetzt wird.
  3. Falls keine Gewebeklärung durchgeführt wird, füllen Sie die Kammern mit PBS auf, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht zu trocken werden. Bei Verwendung einer Hohlraumplatte decken Sie die Probe mit einem #1,5-Deckglas ab. Setzen Sie einen Deckel auf die Mehrkammer-Bildgebungsschiebe.
    HINWEIS: Embryonen können mit einer Vielzahl von Lichtmikroskopen abgebildet werden. Aufgrund der Probendicke ist es wichtig, ein Mikroskop auszuwählen, das in geeigneter Tiefe abbilden kann. Wählen Sie ein Objektiv, das für die gewünschte Struktur geeignet ist. Ein 10x-Objektiv mit niedriger numerischer Apertur liefert eine gute Übersicht über die gesamte Embryofärbung, aber ein Objektiv mit höherer Vergrößerung und numerischer Apertur kann erforderlich sein, um kleinere oder tiefere Strukturen hochauflösend darzustellen. Embryonen können sich manchmal in der Bildgebungsschale bewegen und dadurch Fehler verursachen, weshalb es wichtig ist, die Bildgebungsdauer soweit wie möglich zu verkürzen.

6. Analyse der Kerne hinsichtlich Anzahl und Signalintensität

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Analyse von Kernen mithilfe von Zeiss Arivis Pro; ähnliche Analysen sind möglicherweise mit alternativen Bildanalyseprogrammen durchführbar. Es eignet sich am besten für Proben, die auf den Zellkern beschränkt sind, z. B. Transkripte oder nukleäre Proteine. Bei der Analyse nicht-nukleärer Proteine kann es sinnvoll sein, einen Farbstoff zur Visualisierung der Zellstruktur zu verwenden, z. B. CellMask, der Zellmembranen anfärbt, und die Expression von Markern innerhalb der gesamten Zelle zu untersuchen.

  1. Konvertieren Sie die Bilddateien mithilfe des Zeiss Arivis SIS-Konverters ins SIS-Format. Öffnen Sie den Konverter und wählen Sie „Dateien hinzufügen“, dann „Ordner durchsuchen“. Wählen Sie den Quellbildordner aus. Wählen Sie die 1-zu-1-Konvertierung. Geben Sie das Ausgabeverzeichnis an und klicken Sie auf „Konvertierung starten“.
  2. Importieren Sie SIS-Dateien in Zeiss Arivis Pro, indem Sie „Datei“, dann „Öffnen“ auswählen und anschließend die gewünschte SIS-Datei auswählen.
  3. Bereiten Sie die Daten für die Pipeline-Analyse vor, indem Sie die Bilder drehen. Wählen Sie dazu „Daten“ und dann „Transformationsgalerie“. Wählen Sie die Funktion „Drehung“ und drehen Sie das Embryo, sodass der Bereich von Interesse in eine starre rechteckige Box ausgerichtet werden kann.
  4. Bereiche von Interesse zuschneiden, indem Sie „Daten“ und dann „Transformationsgalerie“ auswählen und die Option „Zuschneiden“ wählen. Ziehen Sie die Ränder, um auf einen Bereich von Interesse zuzuschneiden, und klicken Sie auf „OK“.
    HINWEIS: Bei der Kopfregion von E8,5-Embryonen den Bereich auf den Kopf zuschneiden, wobei das Bild an der Kerbe nahe der Ohrblase abgeschnitten wird. Bei der Herzregion von E8,5-Embryonen den Bereich von unterhalb der Kerbe nahe der Ohrblase bis zum unteren Ende des Herztubes zuschneiden. Bei der Beschneidung rotierter Bilder die schwarzen Bereiche, die als Artefakt der Rotation entstehen, ausschneiden.
  5. Starten Sie eine neue Pipeline, indem Sie nacheinander „Analysis“ und „Analysis Panel“ auswählen. Wählen Sie anschließend „new pipeline“.
  6. Eingabe-ROI: ROI auf „aktueller Bildsatz“ setzen, Kanäle auf „Alle Kanäle“ und Skalierung auf „100 %“ festlegen. Sicherstellen, dass „Z einschließen“ ausgewählt ist.
    HINWEIS: Bilder können verkleinert werden (z. B. auf 50 %), wenn sie zu groß sind oder die Verarbeitung zu langsam erfolgt; dies reduziert die Auflösung der Bilder.
  7. Finden Sie die Kerne (Marker #1) mithilfe des Blob-Finder-Tools: Wählen Sie „Operation hinzufügen“ und anschließend „Blob finder“. Wählen Sie im Kanal den Kanal aus, der den Kernmarker enthält. Stellen Sie den Durchmesser ein auf 6 µm und optimieren Sie die Wahrscheinlichkeitsschwelle basierend auf der Färbungsintensität. Kerne in der Ebene sollten mit geeignetem Abstand zwischen den Kernen erkannt werden. Legen Sie die Teilungsempfindlichkeit fest. 55 % ist ein angemessener Wert für die meisten Proben. Stellen Sie „Normalisierung“ auf den ersten Zeitpunkt ein. Vergeben Sie einen Ausgabename, z. B. Blob Finder (Kerne). Erkannte Objekte können angezeigt werden, indem Sie das „Auge“-Symbol in der oberen Leiste der Operation auswählen.
  8. Finden Sie die Expression von Marker #2 mithilfe des Blob-Finder-Tools: Wählen Sie „Operation hinzufügen“ und anschließend „Blob finder“. Wählen Sie im Kanal den Kanal aus, der den Kernmarker enthält. Stellen Sie den Durchmesser ein auf 6 µm und optimieren Sie die Wahrscheinlichkeitsschwelle basierend auf der Färbungsintensität. „Blobs“, die für Marker #2 in der Ebene positiv sind, sollten mit geeigneter Trennung erkannt werden. Legen Sie die Teilungsempfindlichkeit fest. 55 % ist ein angemessener Wert für die meisten Proben. Stellen Sie „Normalisierung“ auf den ersten Zeitpunkt ein. Vergeben Sie einen Ausgabename, z. B. Blob Finder (Kanal 2). Erkannte Objekte können angezeigt werden, indem das „Auge“-Symbol in der oberen Leiste der Operation ausgewählt wird.
  9. Finden Sie die Expression von Marker #3 mithilfe des Blob-Finder-Tools: Wählen Sie „Operation hinzufügen“ und anschließend „Blob finder“. Wählen Sie im Kanal den Kanal aus, der den Kernmarker enthält. Stellen Sie den Durchmesser ein auf 6 µm und optimieren Sie die Wahrscheinlichkeitsschwelle basierend auf der Färbungsintensität. ‚Blobs‘, die für Marker #3 in der Ebene positiv sind, sollten mit geeigneter Trennung erkannt werden. Stellen Sie die Teilungsempfindlichkeit ein. 55 % ist ein angemessener Wert für die meisten Proben. Stellen Sie „Normalisierung“ auf µ first Zeitpunkt. Ausgabename festlegen, z. B. Blob Finder (Kanal 3). Die erkannten Objekte können visualisiert werden, indem das „Auge“-Symbol in der oberen Leiste der Operation ausgewählt wird.
  10. Optional: Volumenfilter – Wenn bei der Bildgebung viel Artefaktmaterial vorhanden ist, kann ein Volumenfilter zur Entfernung von Artefakten verwendet werden. Wählen Sie „Operation hinzufügen“ und anschließend „Objektmerkmalsfilter“. Setzen Sie die Eingabe auf „Blob finder (Kerne)“ (oder einen anderen Namen aus Schritt 6.7). Wählen Sie bei „ist Typ“ die Option „beliebig“. Wählen Sie im Dropdown-Menü „Volumen (volume)“ aus und stellen Sie den Wert ein auf > 6 µm3. Wählen Sie „Filter hinzufügen“. Wählen Sie im Dropdown-Menü Volumen (volume) aus und stellen Sie den Wert ein auf <3000 µm3Geben Sie einen Namen für die Ausgabe an, z. B. „nuclei“. Führen Sie die Pipeline bis zu dieser Stelle aus, indem Sie im Modul die Schaltfläche mit den drei Linien auswählen und auf „Pipeline bis hierher ausführen“ klicken.
    HINWEIS: Volumenfilter können bei Bedarf auch für die anderen Kanäle verwendet werden. Optimieren Sie die „größer als“- und „kleiner als“-Werte, um sicherzustellen, dass alle positiven Objekte ausgewählt werden, jedoch Ausschuss ausgeschlossen bleibt.
  11. Um Kerne zu identifizieren, die für einen weiteren Marker positiv sind, verwenden Sie das Schnittmengen-Werkzeug. Wählen Sie „Operation hinzufügen“ und suchen Sie das Werkzeug „Kompartimente“. Fügen Sie im ersten Dropdown-Feld die Kerne-Ausgabe ein (z. B. Blob Finder (Kerne) oder die volumenfilterten „Kerne“) und stellen Sie sicher, dass die Schaltfläche links neben dem Feld ausgewählt ist. Wählen Sie im eingeblendeten Dropdown-Feld den gewünschten Kanal aus (z. B. Blob Finder (Kanal 2)). Benennen Sie die Ausgabe, z. B. „Kerne mit Kanal 2“. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle gewünschten Marker.
  12. Um Kerne zu finden, die für 2 oder mehrere andere Marker positiv sind, wählen Sie „Operation hinzufügen“ und suchen Sie das Werkzeug „Objektmerkmalsfilter“. Stellen Sie den Eingang auf den Kernmarker ein (z. B. „Kerne“, Typ = beliebig) und fügen Sie nach „Hat Kennzeichen“ die Filter aus dem vorherigen Schritt hinzu, z. B. „Kerne mit Kanal 2“ und „Kerne mit Kanal 3“. Benennen Sie die Ausgabe, z. B. „Kerne mit Kanal 2 und Kanal 3“. Führen Sie die Pipeline bis zu diesem Punkt aus.
  13. Erstellen Sie benutzerdefinierte Merkmale zur Zählung von Kernen, indem Sie das Tabellensymbol in der oberen Leiste auswählen, auf „erstellen“ klicken und dann „Objektanzahl“ wählen. Geben Sie dem Merkmal eine geeignete Bezeichnung (z. B. Kernanzahl) und wählen Sie im Tag-Menü die gewünschte Ausgabe zur Quantifizierung (z. B. Kerne). Wiederholen Sie diesen Schritt für jede zu quantifizierende Gruppe.
  14. Erstellen Sie Objektgruppen, indem Sie „Add operation“ und anschließend „Create object groups“ auswählen. Wählen Sie in den Eingaben jede der Gruppen aus, die in den Analysen verwendet werden sollen. Benennen Sie die Ausgaben als „Create object groups“. Führen Sie die Pipeline bis zu diesem Punkt aus.
  15. Zusammenfassende Zählungen exportieren, indem Sie „Operation hinzufügen“ und dann „Objektmerkmale exportieren“ auswählen. Wählen Sie unter Eingaben „Objektgruppen erstellen“. Wählen Sie ein Verzeichnis zum Speichern der Daten aus. Der Modus ist „Einzelne Tabelle“. Klicken Sie auf „Merkmale“ und wählen Sie die in Schritt 6.13 erstellten benutzerdefinierten Merkmale aus.
  16. Exportieren Sie die Kerndetails, indem Sie „Operation hinzufügen“ und anschließend „Objektmerkmale exportieren“ auswählen. Wählen Sie unter Eingaben die in Schritt 6.7 (bzw. 6.10, falls ein Volumenfilter verwendet wird) erstellte Kerndetektion aus. Wählen Sie ein Verzeichnis zum Speichern der Daten. Der Modus ist „Einzelne Tabelle“. Klicken Sie auf Merkmale und wählen Sie „Intensitäten“ für jeden Kanal (#1, #2, #3 usw.) sowie weitere gewünschte zu exportierende Merkmale aus, z. B. Volumen (volume).
  17. Speichern Sie Objekte, indem Sie die für die Visualisierung/Analyse benötigten Objekte im Feld „Objekte speichern“ auswählen.
  18. Speichern Sie die Pipeline, indem Sie alle Schritte rückgängig machen, die drei Zeilen oben rechts auswählen und auf „Export“ klicken. Wählen Sie „Ordner“, in dem die „Pipeline“ gespeichert werden soll, und speichern Sie.
  19. Um eine Pipeline im Batch-Modus auszuführen, laden Sie Arivis erneut. Wählen Sie in der oberen Leiste „Analyse“ und anschließend „Batch-Analyse“. Wählen Sie im Fenster die in Schritt 6.18 gespeicherte Pipeline aus. Unter „Dateien“ wählen Sie die für die Analyse vorgesehenen Dateien aus und bestätigen mit „OK“. Nach dem Laden können unerwünschte Ansichten gelöscht werden. Wählen Sie „OK“. Wählen Sie im nächsten Bildschirm das Verzeichnis zum Speichern der Daten aus. Klicken Sie auf „Ausführen“. Die Daten werden automatisch im ausgewählten Ausgabeverzeichnis gespeichert.

Ein Überblick über den Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt.

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Abbildung 1: Protokoll für Immunfluoreszenz- und RNAscope-Färbung. Schematische Darstellung der Schlüsselphasen der Embryogewinnung, Immunfluoreszenz, RNAscope, kombinierten Immunfluoreszenz und RNAscope, Probenaufnahme und Analyse. Farbige Felder entsprechen verschiedenen Protokollstufen. Erstellt in BioRender. Sparrow, D. (2026) https://BioRender.com/q6rmax8 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

E8,5-Embryonen wurden gemäß diesem Protokoll mittels Immunfluoreszenz gefärbt, um die Anzahl der wandernden Neuralleistenzellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus zu analysieren. Die Proben wurden mit Antikörpern gegen PHH3 zur Visualisierung der G2/M-Phase des Zellzyklus und gegen SOX10 zur Visualisierung wandernder Neuralleistenzellen gefärbt. Anschließend wurden geeignete sekundäre Antikörper verwendet. Die Kerne wurden mit DAPI angefärbt. Die Aufnahmen der Proben erfolgten mit einem Olympus SpinSR Spinning-Disk-Konfokalmikroskop und einem 10x-Objektiv (NA = 0,4). Die Bilder wurden mit einer Hamamatsu Orca Fusion BT Kamera und einer 50 µm Pinhole-Spindisk aufgenommen. Die Bilder wurden als Z-Stapel mithilfe der Tile-und-Stitch-Funktion mit einem Z-Abstand von 1,99 µm erfasst. Die Delamination der Neuralleistenzellen und ihre anschließende Migration durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) erfordert, dass sich die prämigratorischen Neuralleistenzellen in der S- oder G2/M-Phase des Zellzyklus befinden20. Hier können wir Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus, gekennzeichnet durch PHH3-Färbung (grün), innerhalb der Population wandernder Neuralleistenzellen, markiert durch SOX10 (magenta), sichtbar machen (Abbildung 2A). Die Anzahl wandernder Neuralleistenzellen in der G2/M-Phase in Kontroll- und behandelten Embryonen kann quantifiziert werden, um festzustellen, ob die Behandlung die Anzahl der migratorischen Neuralleistenzellen in der G2/M-Phase beeinflusst und somit möglicherweise auch die Delamination der Neuralleiste durch EMT stört. Einige Embryonen wiesen einen anhängenden Rest des Dottersacks nach der Dissektion auf (Abbildung 2A’, roter Pfeil). Der verbliebene Dottersack reagiert empfindlich auf die Färbung mit anti-maus-spezifischen sekundären Antikörpern, was in dieser Probe häufig auftritt, da der anti-PHH3-Antikörper in Maus hergestellt wurde. Daher fluoresziert der gesamte Dottersack stark mit dem an den anti-maus-Antikörper gekoppelten Fluorophor. In diesem extremen Fall könnte die unspezifische Färbung die Quantifizierung von PHH3 beeinträchtigen; daher sollte diese Probe von der Analyse ausgeschlossen werden. Außerdem führt die Verwendung von anti-maus-Antikörpern bei E8,5-Embryonen zu einer unspezifischen „Streifen“-Färbung neben dem Herztubus (Abbildung 2A’, roter Pfeil). Dieser Bereich sollte bei der Quantifizierung des Signals eines in Maus hergestellten primären Antikörpers berücksichtigt werden.

E9,5-Embryonen wurden gemäß diesem Protokoll mittels Immunfluoreszenz gefärbt, um die Struktur der Blutgefäße und die Verteilung kardialer Vorläuferzellen zu untersuchen. Die Proben wurden mit Antikörpern gegen ISLET1 (ISL1) zur Visualisierung des zweiten Herzfeldes, SOX10 zur Visualisierung migrierender neuraler Crest-Zellen, ENDOMUCIN (EMCN) zur Visualisierung venöser und kapillarer endothelialer Zellen sowie entsprechenden sekundären Antikörpern markiert. Die Kerne wurden mit DAPI angefärbt. Zur Verbesserung der Abbildungstiefe wurde eine Gewebedurchsichtigung durchgeführt. Die Aufnahmen der Proben erfolgten mit einem Olympus-SpinSR-Spindisk-Mikroskop und einem 10x-Objektiv (NA = 0,4). Bei E9,5 ist die Migration kardialer neuraler Crest-Zellen erkennbar, die zum Aortenbogen beitragen (SOX10, gelb), sowie die Vorläuferzellen des zweiten Herzfeldes (ISL1, grün), die Anteile des Vorhofs, des Ausflusstrakts und des linken Ventrikels bilden21 (Abbildung 2B). Eine Störung der kardialen Vorläuferzellen ist eine zentrale Ursache angeborener Herzfehler22,23. Mithilfe dieser Methode können wir die Anordnung und Anzahl kardialer Vorläuferzellen sichtbar machen. Der nächste Schritt bestünde darin, die Musterbildung kardialer Vorläuferzellen zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen zu vergleichen, um festzustellen, ob unsere Intervention die Migration stört oder zum Verlust wichtiger Zelltypen führt.

Um den Zusammenhang zwischen dem Entwicklungsstadium der Neuralleistenzellen und der Wnt-Signalübertragung zu bestimmen, wurden Embryonen vom Tag E8.5 gemäß diesem Protokoll mittels RNAscope gefärbt, um Neuralleistenzellen in verschiedenen Phasen der Migration und Differenzierung sowie einen Marker für die Wnt-Signalübertragung zu untersuchen. Sonden, die die Neuralplattenbegrenzung anzeigen, aus der die Neuralleistenzellen hervorgehen (Msx1), migrierende Neuralleistenzellen (Sox10) und die Differenzierung der Neuralleistenzellen (Dlx2), wurden verwendet und mit einer Sonde verglichen, die die Wnt-Signalübertragung anzeigt (Sp5). Zur Visualisierung der Sonden kamen die Fluorophore TSA-vivid 520, 570 und 650 sowie Opal 780 zum Einsatz. Die Proben wurden mit einem Evident FV4000-Mikroskop bei einem 10x-Objektiv (NA=0.4), einer Lochblende von 144 µm und einer Pixelgröße von 621 nm abgebildet. Die Aufnahmen erfolgten mithilfe der Tile-and-Stitch-Funktion als Z-Stapel mit einem Z-Abstand von 4,32 µm. Die Neuralplattenbegrenzung (Msx1, grün) und migrierende Neuralleistenzellen (Sox10, magenta) nehmen im Kopfbereich unterschiedliche Regionen ein, wobei sich eine geringe Überlappung zeigt, wenn die Zellen mit der Migration aus dem Neuralrohr beginnen (Abbildung 3A). Einige Bereiche migrierender Neuralleistenzellen zeigen eine räumliche Übereinstimmung mit Dlx2 (cyan), was darauf hindeutet, dass sich einige Zellen bereits der kraniofazialen Differenzierung nähern (Abbildung 3A). Die Wnt-Signalübertragung (Sp5, gelb) ist in Bereichen der Neuralplattenbegrenzung nachweisbar, was von Bedeutung ist, da eine Modulation der Wnt-Signalübertragung für die Delamination und Differenzierung der Neuralleistenzellen erforderlich ist24,25, aber auch in einem separaten Bereich neben den migrierenden Neuralleistenzellen (Abbildung 3A).

Weitere Färbungen sollten den Zusammenhang zwischen der Migration neuraler Crestzellen und der Wnt-Signalübertragung bei E9.5 untersuchen, indem Marker für den Zustand der neuralen Crestzellen und der Wnt-Signalübertragung gefärbt wurden. Sonden, die die Grenze der Neuralplatte (Msx1) und migrierende neurale Crestzellen (Sox10) anzeigen, wurden verwendet und mit einer Sonde verglichen, die die Wnt-Signalübertragung anzeigt (Sp5). Zur Visualisierung der Sonden kamen TSA-vivid 520, 570 und 650 Fluorophore zum Einsatz. Die Proben wurden mit einem Olympus SpinSR Spinning-Disk-Mikroskop mit einem 10x-Objektiv (NA = 0,4) abgebildet. Hier sehen wir die Grenze der Neuralplatte (Msx1, grün), die sich von den migrierenden neuralen Crestzellen (Sox10, magenta) unterscheidet (Abbildung 3B). Die Wnt-Signalübertragung (Sp5, gelb) ist stark im dorsalen Bereich des Embryos sichtbar, wo trunkale neurale Crestzellen delaminieren, sowie in bestimmten Kopfbereichen, um den 1sten und 2nden Kiemenbogen, unterhalb des Abflusstrakts und innerhalb der otischen Vesikel (Abbildung 3B). Der Vergleich der räumlichen Musterung neuraler Crestzellen und der Wnt-Signalübertragung zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen mittels dieser Methode würde es uns ermöglichen, festzustellen, ob unsere Intervention die Delamination und Migration neuraler Crestzellen stört und ob eventuelle Störungen auf Veränderungen der Wnt-Signalübertragung zurückzuführen sind.

Um den Zellzyklusstatus von Zellen in der Grenzzone der Neuralplatte zu bestimmen, haben wir dieses Protokoll verwendet, um Immunfluoreszenz- und RNAscope-Färbungen zu kombinieren. Eine RNAscope-Sonde, die die Grenzzone der Neuralplatte markiert (Msx1), wurde eingesetzt. Die Proben wurden mit Antikörpern gegen PHH3 und PCNA gefärbt, um die G2/M- und S-Phase des Zellzyklus sichtbar zu machen. Weiterhin wurden die Embryonen mit geeigneten sekundären Antikörpern versetzt. Die Kerne wurden mit DAPI angefärbt. Die Aufnahmen der Proben erfolgten entweder mit einem Olympus SpinSR Spinning-Disk-Mikroskop und einem 10x-Objektiv (NA = 0,4) (Abbildung 4A,B) oder mit einem Evident FV4000 Konfokalmikroskop, ausgestattet mit einem 10x-Objektiv (NA = 0,4), einer 127 µm großen Pinhole und einer Pixelgröße von 311 nm (Abbildung 4B’). Hier sind Zellen sowohl in der G2/M-Phase (PHH3, gelb) als auch in der S-Phase (PCNA, magenta) erkennbar, die sich mit der Grenzzone der Neuralplatte überlappen (Abbildung 4A). Mithilfe dieser Methode können wir den Anteil der Zellen innerhalb der Grenzzone der Neuralplatte in jeder Phase des Zellzyklus quantifizieren und ermitteln, ob diese Anteile durch unsere Behandlungsgruppen verändert werden. Auffällig bei diesem Embryo sind Löcher, die durch Beschädigungen während der Dissektion infolge übermäßiger Manipulation mit feinen Pinzetten entstanden sind. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, bei der Dissektion besondere Vorsicht walten zu lassen, um Schäden zu vermeiden, insbesondere am E8,5-Zeitpunkt, wenn die Embryonen besonders empfindlich sind.

Die Kombination von RNAscope und Immunfluoreszenz kann zu einer schwächeren Färbung des RNAscope-Probes führen als die alleinige Durchführung von RNAscope. Wenn dies mit einem Primärantikörper kombiniert wird, der mit einem benachbarten Fluorophor sehr hell fluoresziert (z. B. Fluorescein und Cy3), kann dies zu einer Signalüberlagerung (Bleed-through) vom helleren auf den schwächeren Kanal führen (Abbildung 4B). Dies lässt sich vermeiden, indem eine verdünntere Konzentration des sehr hellen Antikörpers verwendet wird, Fluorophore gewählt werden, die spektral stärker voneinander getrennt sind, oder die Bildaufnahmeparameter an den Proben angepasst werden. Spinning-Disk-Mikroskope ermöglichen eine sehr schnelle Bildaufnahme von Embryonen, jedoch verwenden sie Bandpass-Emissionsfilter mit festen Emissionsfenstern, sodass die Detektionsfenster nicht dynamisch verengt werden können, um sie an spezifische Fluorophore anzupassen. Bei einem punktscannenden Mikroskop, z. B. Evident FV4000, kann der Bediener das Detektionsfenster mit Nanometerpräzision verengen, wodurch die Signalüberlagerung reduziert werden kann, wenn Fluorophore eingesetzt werden, deren Emissionsspektren sich leicht überlappen (Abbildung 4B’).

Um festzustellen, welcher Anteil der Zellen in E8,5-Embryonen sich in verschiedenen Phasen des Zellzyklus befindet, verwendeten wir dieses Protokoll, um den Anteil der Kerne und die Signalintensität sowohl in der S-Phase als auch in der G2/M-Phase des Zellzyklus zu analysieren. Die Proben wurden mit Antikörpern gegen PHH3 und PCNA gefärbt, um die G2/M- und S-Phasen des Zellzyklus jeweils sichtbar zu machen. Die Embryonen wurden außerdem mit geeigneten sekundären Antikörpern gefärbt. Die Kerne wurden mit DAPI angefärbt. Die Proben wurden mit dem Olympus SpinSR Spinning-Disk-Mikroskop mit einer 10x-Objektivlinse (NA = 0,4) abgebildet. Zeiss Arivis Pro wurde verwendet, um alle Kerne, PHH3-positive Kerne, PCNA-positive Kerne sowie doppelt positive Kerne zu identifizieren (Abbildung 5A). Mithilfe dieser Methode konnten wir die Anteile der Zellen in der G2/M- (PHH3+) und S-Phase (PCNA+) des Zellzyklus vergleichen (Abbildung 5B) sowie die Intensität der PHH3- oder PCNA-Färbung in jedem einzelnen Kern (Abbildung 5C). Wir erkennen, dass der Anteil der PCNA+-Kerne im Herzgebiet leicht höher war als im Kopf- und Gesamtembryobereich (Abbildung 5B). Außerdem wies der Kopf einen höheren Anteil an PHH3+- und doppelt gefärbten Kernen im Vergleich zum Herzen und zum gesamten Embryo auf (Abbildung 5B). Auffällige Unterschiede in der Intensität der PHH3- oder PCNA-Färbung zwischen den Regionen waren nicht erkennbar (Abbildung 5C). Diese Daten stammen von einem einzelnen repräsentativen Embryo (n = 1) und dienen der Demonstration des Analyseworkflows; es wurde keine inferenzstatistische Analyse durchgeführt. Insgesamt ermöglicht uns diese Methode, Muster der Zellzyklusausbreitung in einem für die Herzentwicklung und kraniofaziale Entwicklung entscheidenden Entwicklungsstadium zu bestimmen. Diese Methode wird es uns ermöglichen, festzustellen, ob unsere Behandlung die Ausbreitung des Zellzyklus in verschiedenen Regionen des Embryos beeinflusst.

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Abbildung 2Immunfluoreszenzfärbung von Proteinen in E8,5- und E9,5-Embryonen. (A, A’E8.5-Maus-Embryonen wurden mittels Immunfluoreszenz gegen PHH3 zur Visualisierung von Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus, gegen SOX10 zur Visualisierung wandernder Neuralleistenzellen und mit DAPI zur Visualisierung der Kerne gefärbt. N = 11 Embryonen aus 1 Experiment.BE9.5-Embryonen wurden für ISL1 gefärbt, um Vorläuferzellen des zweiten Herzfelds darzustellen, für SOX10, um wandernde Neuralleistenzellen darzustellen, für EMCN, um kapillare und venöse Blutgefäße darzustellen, sowie für DAPI (zur Darstellung der Kerne). Rote Pfeilspitzen weisen auf unspezifische Färbung des Dottersacks hin, und unspezifische Färbung im Embryo durch sekundäre Antikörper gegen Maus (n = 15 Embryonen aus 1 Experiment). Maßstab = 200 µm. DAPI: 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; PHH3: Phosphohiston H3; EMCN: Endomucin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Anfärbung von Transkripten in E8,5- und E9,5-Embryonen mittels RNAscope. (A) E8,5-Embryonen wurden mittels RNAscope mit Sonden gegen Msx1 zur Visualisierung der Neuralplattenbegrenzung, Sox10 zur Visualisierung wandernder Neuralleiste, Dlx2 zur Visualisierung differenzierender Neuralleiste und Sp5 für Wnt-Signalgebung gefärbt. n = 13 Embryonen aus 1 Experiment. (B) E9,5-Embryonen wurden mittels RNAscope mit Sonden gegen Msx1 zur Visualisierung der Neuralplattenbegrenzung, Sox10 zur Visualisierung wandernder Neuralleiste und Sp5 zur Visualisierung der Wnt-Signalgebung gefärbt. n = 4 Embryonen aus 1 Experiment. Maßstab = 200 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Kombinierte Immunfluoreszenz-Färbung und RNAscope-Analyse an E8,5-Embryonen. (A, B, B’) E8,5-Embryonen wurden mittels RNAscope mit Sonden gegen Msx1 gefärbt, um die Neuralplatten-Grenze sichtbar zu machen, sowie mittels Immunfluoreszenz für PCNA, um Zellen in der S-Phase, und für PHH3-Antikörper, um Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus darzustellen. Orangefarbene Pfeilspitzen zeigen spezifische Msx1-Färbung an, rote Pfeilspitzen weisen auf Farbdurchschlag hin (B) bzw. auf spezifische PHH3-Färbung ohne Durchschlag in den Msx1-Kanal (B'). N = 2 Embryonen aus 1 Experiment. Maßstab = 200 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Analyse des Zellzyklusstadiums in E8,5-Embryonen mithilfe von Arivis Pro. (A) E8,5-Maus-Embryonen wurden mittels Immunfluoreszenz für PCNA gefärbt, um Zellen in der S-Phase des Zellzyklus (grün) sichtbar zu machen, für PHH3, um Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus sichtbar zu machen (magenta), sowie für DAPI, um die Kerne sichtbar zu machen (blau). Erkannte 3D-Objekte (mehrfarbige Kugeln) wurden überlagert und mit dem 4D-Viewer in Zeiss Arivis Pro visualisiert. (B) Der Graph zeigt den Anteil von PCNA+-, PHH3+- und doppelt positiven Kernen im gesamten Körper, Kopf und Herzen eines einzelnen Embryos. (C) Der Graph zeigt die mittlere Intensität der PCNA- und PHH3-Färbung pro Kern im gesamten Körper, Kopf und Herzen eines einzelnen Embryos. Kreise stellen den Mittelwert dar; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung aller Kerne innerhalb einer einzelnen Probe. Die Graphen wurden mit GraphPad Prism erstellt. Maßstabsbalken = 200 µm. Die quantitative Analyse wurde an n = 1 Embryo durchgeführt. Es wurden keine inferenzstatistischen Analysen durchgeführt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung zwischen einzelnen Kernen. 3D: dreidimensional; DAPI: 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Hier beschreiben wir eine optimierte Methode zur räumlichen Analyse der Gen- und Proteinexpression in Ganzpräparaten von E8.5- und E9.5-Embryonen. Diese Methoden weisen im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren der RNA-in situ-Hybridisierung und der Immunfluoreszenz von Schnitten eine verbesserte räumliche Auflösung und Multiplexfähigkeit auf. Dieses Protokoll baut auf kürzlich veröffentlichten Protokollen zur Untersuchung von Entwicklungsprozessen in Mausembryonen auf. Ein kürzlich vorgestelltes Protokoll nutzte RNAscope und Immunfluoreszenz-Färbung, um die Wnt-Signalübertragung in Embryonen zu untersuchen, arbeitete jedoch mit Gewebeschnitten statt mit Ganzpräparaten26. Eine weitere aktuelle Studie führte RNAscope- und Immunfluoreszenz-Färbungen an Ganzpräparaten von Mausembryonen im Stadium E8.5–E10.5 durch27, kombinierte jedoch die beiden Färbeverfahren nicht und verwendete auch keinen vierten RNAscope-Kanal mittels C4-Proben und Opal-780-Fluorophoren. Die kombinierte Immunfluoreszenz und RNAscope wurde bereits früher in Ganzpräparaten von E3.5-Embryonen beschrieben, wobei die RNAscope-Nachweisreaktion nach Abschluss des Immunfluoreszenzprotokolls durchgeführt wurde28. Obwohl wir dieses exakte Protokoll nicht an späteren Embryonen getestet haben, erzielten wir bei E8.5-Embryonen eine schlechte Antikörperfärbung, als wir die RNAscope-Färbung zwischen die Inkubation mit primären und sekundären Antikörpern unseres Immunfluoreszenzprotokolls einfügten. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass bei der Durchführung von RNAscope an größeren Embryonen eine Protease-Inkubation erforderlich ist, die in der Studie mit E3.5-Mausembryonen nicht notwendig war. Die Protease-Inkubation könnte die Stabilität gebundener Antikörper beeinträchtigen, weshalb ein Vertauschen der Reihenfolge von RNAscope und Immunfluoreszenz in diesem System unwahrscheinlich erfolgreich wäre. Eine weitere aktuelle Studie an Myofasern kombinierte beide Protokolle, indem RNAscope vor der Immunfluoreszenz-Färbung durchgeführt wurde29. Ähnlich wie in unserem Protokoll führte auch diese Studie RNAscope vor der Immunfluoreszenz durch; das Verfahren wurde jedoch nicht an Ganzpräparaten von Mausembryonen validiert, und es wurde kein zusätzlicher RNAscope-Kanal mittels C4-Proben und Opal-780-Fluorophor eingesetzt.

Die Fähigkeit, Ganzpräparate von Embryonen mittels Multiplexing-Anfärbung zu untersuchen, hat weitreichende Anwendungen in der Entwicklungsbiologie, um wichtige Transkripte und Proteine abzubilden sowie Vorläuferzelltypen oder entwicklungsrelevante Signalwege in Embryonen unterschiedlicher Stadien zu markieren. Mithilfe dieser Techniken konnten wir die Verteilung von Herzzellvorläufern (Abbildung 2B), Neuralleistenzellen in verschiedenen Phasen der Migration und Differenzierung (Abbildung 3), Wnt-Signalgebung (Abbildung 3) sowie den Zellzyklusstatus (Abbildung 2, Abbildung 4, Abbildung 5) kartieren. Durch Anpassung der verwendeten Sonden und Antikörper lassen sich diese Methoden auf beliebige Zelltypen oder Signalstoffe ausweiten, sofern diese in Embryonen zu diesem Entwicklungszeitpunkt vorhanden sind. Obwohl wir uns in diesem Protokoll auf die Stadien E8,5 und E9,5 konzentriert haben, ist es möglich, jüngere oder ältere Embryonen ebenfalls anzufärben, indem die Gewebedurchlässigmachung, Inkubationszeiten und die Gewebeaufhellung angepasst werden.

Allerdings hat diese verbesserte Fähigkeit zur Multiplex-Analyse von Protein- und Transkriptaufklärung in Ganzpräparaten weiterführende Herausforderungen mit sich gebracht. Erstens ist die Analyse von Ganzpräparaten zeitaufwändiger im Vergleich zur Immunfluoreszenz und RNAscope an Schnitten, die in der Regel innerhalb von 1–2 Tagen durchgeführt werden können, anstatt über mehrere Tage hinweg. Zudem erfordert die Verwendung von Ganzpräparaten eine sorgfältige Abwägung mikroskopischer Parameter, um ausreichende Probentiefe und Auflösung sicherzustellen. Es wird ein Mikroskop benötigt, das in der Lage ist, durch bis zu 700 µm dickes Gewebe, und bei größeren Embryonen muss eine Gewebeklärung angewendet werden, da sonst tiefer liegende Strukturen im Probeninneren möglicherweise nicht erfasst werden. Zudem würde die Dicke der Proben bei der Bildgebung mit einem Weitfeldmikroskop dazu führen, dass eine große Menge an Licht außerhalb der Fokusebene mitabgebildet wird; ein konfokales Mikroskop ist daher vorzuziehen, da es Signale aus außerfokalen Ebenen unterdrücken kann und somit eine Bildgebung durch die gesamte Probe ermöglicht, während Signale aus anderen Ebenen ausgeschlossen werden. Außerdem ermöglicht ein Spinning-Disk-Konfokalmikroskop oft schnellere Bildaufnahmegeschwindigkeiten, bietet jedoch im Vergleich zu einem punktscannenden Konfokalmikroskop weniger feine Kontrolle bei der Fluoreszenzerfassung. Auch die Größe der Embryonen kann eine Herausforderung darstellen, da viele Mikroskope kein ausreichend großes Gesichtsfeld besitzen, um den Embryo ohne Kachelscannen abzubilden. Dies kann zu Stitching-Artefakten im Bild führen (z. B. Abbildung 2B). Die Multiplexierung von Proben kann ebenfalls zu Übersprechen zwischen den Kanälen führen (z. B. Abbildung 4B), was durch die Auswahl eines punktscannenden konfokalen Mikroskops gemindert werden kann, bei dem die Detektionsfenster verengt werden können, insbesondere wenn Fluorophore geringfügige Überlappungen in ihren Emissionsspektren aufweisen. Die Verwendung des Fluorophors Opal 780 ermöglicht die Multiplex-Detektion weiterer Zielstrukturen in einer einzelnen Probe; zur Detektion dieses Systems ist ein Mikroskop erforderlich, das in der Lage ist, Nahinfrarotlicht abzubilden. Diese Fähigkeit ist bei den meisten Lichtmikroskopen nicht verfügbar.

Die Probenaufbringung für die Bildgebung erfordert ebenfalls sorgfältige Überlegungen. Wenn die Proben frei schweben dürfen, wie beispielsweise bei der Bildgebung in einer Mehrfach-Well-Kammernobjektträger, befinden sie sich nicht immer exakt im gleichen Winkel zur Aufnahme. Dies kann zu Unterschieden in der Färbungsintensität führen, je nachdem, welche Teile des Embryos der Kamera/dem Detektor am nächsten sind, und erschwert anschließende Intensitätsanalysen. Ein weiteres Problem bei der Verwendung von Mehrfach-Well-Kammernobjektträgern besteht darin, dass der Rand der Vertiefung im Bildfeld liegen kann, was zu Bildartefakten führen kann. Das Fixieren des Embryos, beispielsweise in einer Hohlraumobjektträger, kann helfen, die Orientierung beizubehalten, erleichtert jedoch die Beschädigung und/oder Kompression des Embryos, wodurch die Volumenanalyse von Strukturen erschwert wird.

Bei der Durchführung dieses Protokolls sind mehrere Aspekte zu berücksichtigen. Bei der Immunfluoreszenz ist während der Antigen-Retrieval-Methode Vorsicht geboten, um eine Dissoziation des Embryos zu vermeiden, insbesondere bei jüngeren Embryonen. Um dies zu verhindern, könnten alternative Antigen-Retrieval-Methoden in Betracht gezogen werden, beispielsweise die Verwendung eines anderen Puffers wie Tris/EDTA oder eines proteolytischen Retrievialansatzes. Kleinere oder größere Embryonen könnten von einer Optimierung der Inkubationszeiten für die Antikörper profitieren. Die Auswahl der primären Antikörper erfordert besondere Überlegung, da viele Antikörper in Mäusen hergestellt wurden; die Verwendung von Anti-Maus-Antikörpern kann jedoch an das verbliebene Dottersackgewebe binden und stark fluoreszieren. Dies ist sichtbar, wenn Anti-Maus-Sekundärantikörper mit AlexaFluor 488 (Abbildung 2) und AlexaFluor 647 (Abbildung 4) verwendet werden. Andere Fluorophore wurden in unserem Labor nicht getestet, könnten jedoch unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten aufweisen, was eine zusätzliche Optimierung erforderlich machen könnte. Dieser Effekt tritt nicht in Kanälen auf, in denen Anti-Kaninchen- (Abbildung 2, Abbildung 4, Abbildung 5) oder Anti-Ratte-Antikörper (Abbildung 2B) verwendet wurden; daher wird nach Möglichkeit die Verwendung von primären Antikörpern, die in anderen Spezies hergestellt wurden, empfohlen.

Bei der RNAscope-Analyse ist es von entscheidender Bedeutung, die Inkubationsschritte mit Protease zu optimieren, da eine zu kurze Dauer zu unzureichendem Eindringen der Sonden führen kann, während eine zu lange Dauer zur vollständigen Dissoziation der Probe führen kann. Bei der Optimierung der Protease-Inkubationszeiten empfehlen wir, die Dauer schrittweise um jeweils eine Minute anzupassen. Es ist außerdem empfehlenswert, geeignete Kontrollen einzusetzen, um zu überprüfen, ob eine Sonde oder ein Antikörper wirksam war. Als negative Kontrolle dient ein Embryo gleichen Entwicklungsstadiums, der parallel gefärbt wurde, jedoch keine Sonde bzw. keinen primären Antikörper enthält, oder alternativ die Verwendung einer IgG-Isotyp-Kontrolle beziehungsweise einer negativen Kontrollsonde für Immunfluoreszenz bzw. RNAscope, um sicherzustellen, dass die beobachtete Färbung echt ist. Positive Kontrollen aus einem Gewebe vergleichbarer Größe, von dem bekannt ist, dass es das Gen oder Transkript von Interesse exprimiert, können ebenfalls hilfreich sein, um den Erfolg der Färbung zu beurteilen.

Insgesamt handelt es sich bei diesem Protokoll um eine robuste, optimierte Methode zur Visualisierung der Expression von Proteinen und Transkripten in Ganzpräparaten von Maus-Embryonen zu den Zeitpunkten E8.5 und E9.5, die ein großes Potenzial für die Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen in der normalen embryonalen Entwicklung und bei Erkrankungen bietet.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein konkurrierendes finanzielles Interesse besteht.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Team der Cellular Imaging Core-Einrichtung am Centre for Human Genetics der University of Oxford für die technische Unterstützung bei der Mikroskopie und Bildanalyse, die in dieser Arbeit enthalten sind. Die Autoren danken dem Personal der Biomedical Services der University of Oxford für die Unterstützung bei der Tierpflege sowie bei zeitlich gesteuerten Paarungen zur Erzeugung von Embryonen.

Diese Forschung wurde durch ein Senior-Stipendium der British Heart Foundation FS/SBSRF/22/31022 (DBS), den Additional Ventures Single Ventricle Fund (DBS), den John Fell Fund der Universität Oxford 0016065 (VSR) und den Medical Sciences Internal Fund der Universität Oxford 0016707 (VSR) finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Plastik- und Glaswaren
3-ml-Pasteurpipetten aus Polyethylen niedriger Dichte (LDPE), skaliertWheaton711116
Eppendorf-Safe-Lock-Röhrchen, 1,5-ml-MikroröhrchenEppendorf0030 120.086
Ibidi µ-Slide 18-Well Ibidi81817#1.5H-Glasdeckgläschen, unbehandelt
Menzel X1000 Deckgläschen 22x50 mm #1.5 (0,16–0,19 mm)Thermo Scientific17284904
Mikroskopobjektträger mit VertiefungenMarienfeld Superior1320000
Safe-Seal-Mikroröhrchen, 2 mlSarstedt72.695.5002-ml-„Eppendorf“-Röhrchen, rundbodig
Lösungen/Puffer
1x Antikörperverdünnungs-/BlockierungspufferAkoya BiosciencesARD1001EA
Ambion™ RnaseZap™ RNase-DeskontaminationslösungAmbion9780.9782
Citrat-EntmaskierungspufferVector Labs H-3300Als Antigen-Entmaskierungslösung gekennzeichnet,
zitronensäurebasiert
Dimethylsulfoxid (DMSO)Merck (Sigma-Aldrich)D8418
Hanks‘ Balanced Salt Solution 10xMerck (Sigma-Aldrich)H4641
WasserstoffperoxidlösungMerck (Sigma-Aldrich)H100930 % (w/w) in H2O
MethanolMerck (Sigma-Aldrich)32213-2.5L-M
Normales Eselserum AbcamAb7475100 % Stammlösung,
endgültige Konzentration 10 %
Paraformaldehyd (PFA)-PulverMerck (Sigma-Aldrich)158127-500gMit Wasser auf 4 % verdünnen. In der Abzugshaube ansetzen. Auf einem beheizten Block unter Zusatz einer geringen Menge NaOH unter Rühren auflösen. pH 7,2–7,6
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Merck (Sigma-Aldrich)P44171 Tablette pro 200 ml destilliertem Wasser
RNAscope 4-Plex-Zusatzkit für Multiplex-Fluoreszenz-Reagenzien-Kit v2ACD (Bio-Techne)323120Enthält HRP-C4 und HRP-Blocker
RNAscope™ Multiplex-Fluoreszenznachweis-Kit v2 ACD (Bio-Techne)323110Enthält Protease Plus, Protease III,
Protease IV, Wasserstoffperoxid, TSA-Puffer,
Amp1/2/3, Hrp-C1/2/3, HRP-Blocker und DAPI
Saline-Sodium-Citrate-(SSC)-Puffer 20x-LösungFisher BioreagentsBP-1325-1Mit destilliertem Wasser auf 0,2x verdünnen
Gewebeklärungsreagenz Cubic-R+(M) [für Tiere]Tokyo Chemical IndustryT3741
Triton™ X 100Merck (Sigma-Aldrich)X100
Tween® 20Merck (Sigma-Aldrich)P7949
Ultrapure™ 0,5 M EDTA, pH 8Invitrogen15575020
Primärantikörper
Endomucin-Antikörper (V.7C7) Santa CruzSC-654951:50 Verdünnung verwenden. 
Islet-1- und Islet-2-AntikörperDevelopmental Studies Hybridoma Bank34.4DS-5Mit Glycerin 1:1 verdünnen. 1:50 Verdünnung verwenden.
PCNA (PC10) Maus-Monoklonaler AntikörperCell Signaling Technology2586S1:500 Verdünnung verwenden
P-Histon H3 (Ser10) (6G3) Maus-Monoklonaler AntikörperCell Signaling Technology9706S1:500 Verdünnung verwenden
P-Histon H3 (Ser10) (D7N8E) XP® Kaninchen-Monoklonaler AntikörperCell Signaling Technology53348S1:500 Verdünnung verwenden
Sox10 (E6B6I) XP® Kaninchen-Monoklonaler Antikörper Cell Signaling Technology69661S1:500 Verdünnung verwenden
Sekundärantikörper/Kernfärbungen
AlexaFluor® 488-konjugiertes Affinipure® Esel-Anti-Maus-IgG (H+L)Jackson Immunoresearch715-545-1511:500 Verdünnung verwenden
AlexaFluor® 647-konjugiertes Affinipure®  Esel-Anti-Ratte-IgG (H+L)Jackson Immunoresearch712-605-1531:500 Verdünnung verwenden
AlexaFluor® 647-konjugiertes Affinipure® F(ab')2-Fragment Esel-Anti-Maus-IgG (H+L)Jackson Immunoresearch715-606-1501:500 Verdünnung verwenden
Cy™3 Affinipure® Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-165-1521:500 Verdünnung verwenden
DAPIMerck (Sigma-Aldrich)D9542Verwendet bei 1 µg/ml
RNAscope-Sonden
RNAscope®-Sonde - Mm Sp5-C4ACD (Bio-Techne)405681-C4C4-Sonde
RNAscope®-Sonde - Mm-Dlx2-C3ACD (Bio-Techne)555951-C3C3-Sonde
RNAscope®-Sonde - Mm-Msx1ACD (Bio-Techne)421841C1-Sonde
RNAscope®-Sonde - Mm-Sox10-C2ACD (Bio-Techne)435931-C2C2-Sonde
RNAscope-Fluorophore
Opal 780 ReagenzpackungAkoya BiosciencesFP1501001KT Enthält Opal-780-Reagenz, Opal-TSA-DIG,
DMSO
TSA-vivid™ Fluorophor 520ACD (Bio-Techne)323271jetzt ClariTSA™ Fluorophor 520
TSA-vivid™ Fluorophor 570ACD (Bio-Techne)323272jetzt ClariTSA™ Fluorophor 570
TSA-vivid™ Fluorophor 650ACD (Bio-Techne)323273jetzt ClariTSA™ Fluorophor 650
Geräte/Software
Fluoview FV4000 Laser-Scanning  MikroskopEvidentfv4000Anregungslaser: 405/488/561/640/730 nm.
Detektierte Wellenlängen (Abb. 3): 430–470, 500–540, 570–620,
650–710, 750–850 nm. Detektierte Wellenlängen (Abb. 4): 430–470,
500–531, 570–620 nm.
GraphPad Prism 10GraphPadv10.6.1
HeizblockGrantQBT1
Hybrigene-HybridisierungsöfenTechne (Bibby Scientific)FHB4DD
Ixplore IX83 SpinSR Super-Resolution-MikroskopsystemOlympusixplore-ix83-spinsrAnregungslaser: 405/488/561/640 nm.
Emissionsfilter: 447/60, 525/50, 617/73, 685/40. 
Zeiss Arivis Pro Carl Zeiss Microscopy GmbHv. 4.5 (früher Arivis Vision 4D)
Zeiss Arivis SIS-KonverterCarl Zeiss Microscopy GmbHv. 4.3.0

Referenzen

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