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Methodenartikel

Netzwerkgestützte Evaluierung von β-Sitosterol in entzündlichen und profibrotischen Mesangialzellmodellen mit Relevanz für die chronische Glomerulonephritis

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DOI:

10.3791/73000

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28. August 2026

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1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie kombiniert Netzwerkpharmakologie, validierte molekulare Docking-Verfahren und in vitro-Experimente, um mögliche Verbindungs-Zielbeziehungen zwischen Inhaltsstoffen von Cordyceps sinensis und Prozessen im Zusammenhang mit chronischer Glomerulonephritis zu bewerten. β-Sitosterol wurde für die Validierung auf Verbindungsebene ausgewählt und erwies sich als wirksam bei der Abschwächung entzündlicher und profibrotischer Aktivierungen in Mesangialzellenmodellen.

Zusammenfassung

Die chronische Glomerulonephritis (CGN) ist gekennzeichnet durch anhaltende entzündliche Schädigungen und fortschreitende fibrotische Umbildung, doch die Wirkstoff-Zielstrukturen-Beziehungen natürlicher Produkte sind bisher unvollständig definiert. Diese Studie kombinierte Netzwerkpharmakologie, validierte molekulare Docking-Verfahren und in vitro-Experimente, um Kandidatensubstanzen aus Cordyceps sinensis (C. sinensis) hinsichtlich ihrer Beteiligung an CGN-assoziierten pathologischen Prozessen zu bewerten. Kandidatensubstanzen von C. sinensis wurden identifiziert, und die aus der Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform abgeleiteten, verbindungsassoziierten Zielstrukturen wurden mit CGN-assoziierten Genen abgeglichen. Mithilfe funktioneller Anreicherungsanalysen und Protein-Protein-Interaktionsanalysen wurden biologische Prozesse und zentrale Zielstrukturen priorisiert. PTGS2 wurde als zentrale überlappende Zielstruktur identifiziert. Molekulares Docking wurde unter Verwendung einer mit Celecoxib gebundenen COX-2-Struktur durchgeführt. Die erneute Einlagerung des ko-kristallisierten Celecoxib-Liganden reproduzierte die kristallographische Pose mit einem RMSD von 0,876 Å und bestätigte damit das Docking-Protokoll. β-Sitosterol und Linoleylacetat zeigten eine vorhergesagte Kompatibilität mit der COX-2-Docking-Region mit Bindungsaffinitäten von −7,2 bzw. −7,5 kcal/mol. β-Sitosterol wurde für die Validierung auf Verbindungsebene in HBZY-1-Ratten-Glomerulamesangialzellen ausgewählt. Bei Konzentrationen von 0,5–10 µM verringerte β-Sitosterol die Zellviabilität nicht signifikant. In mit Lipopolysaccharid (LPS) stimulierten Zellen reduzierte β-Sitosterol die Expression von Tnf, Il6 und Ptgs2, verringerte die Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2) und senkte die Proteinkonzentration von Cyclooxygenase-2 (COX-2). In mit Transforming Growth Factor β1 (TGF-β1) behandelten Zellen verringerte β-Sitosterol die Expression von Col1a1 und Acta2 sowie die Proteinkonzentration von alpha-glatter Muskelaktin (α-SMA). Diese Ergebnisse liefern hypothetische Hinweise darauf, dass β-Sitosterol entzündliche und profibrotische Aktivierungen in Mesangialzellmodellen moduliert, belegen jedoch weder eine direkte enzymatische Hemmung von COX-2 noch eine therapeutische Wirksamkeit bei CGN.

Einleitung

Die chronische Glomerulonephritis (CGN) umfasst eine heterogene Gruppe glomerulärer Erkrankungen, die zu chronischer Nierenerkrankung und terminalem Nierenversagen fortschreiten können1. Sie ist gekennzeichnet durch anhaltende glomeruläre Schädigung, entzündliche Aktivierung und fortschreitende fibrotische Umbildung2,3. Obwohl Kortikosteroide und immunsuppressive Wirkstoffe bei ausgewählten Patienten eingesetzt werden, bleibt eine langfristige Krankheitskontrolle in vielen Fällen schwierig, und therapiebedingte Nebenwirkungen sind häufig1,4,5. Die Progression der CGN beinhaltet miteinander verbundene pathologische Prozesse wie Immunaktivierung, endotheliale Dysfunktion, oxidativen Stress und Akkumulation der extrazellulären Matrix3,6,7. Daher könnte die Identifizierung molekularer Schnittstellen, die entzündliche und profibrotische Reaktionen verbinden, zur Erstellung überprüfbarer Hypothesen für krankheitsrelevante therapeutische Strategien beitragen.

Cordyceps sinensis (C. sinensis) wurde bereits in klinischen und experimentellen nephrologischen Kontexten eingesetzt und berichtetermaßen in mehreren Krankheitsmodellen entzündungshemmende, antiapoptotische und zytoprotektive Wirkungen entfaltet8,9,10. Die molekulare Grundlage, über die seine in Frage kommenden Inhaltsstoffe jedoch mit für Glomerulonephritis relevante Zielstrukturen interagieren könnten, ist bisher jedoch unzureichend geklärt11. Angesichts der Mehrkomponentennatur von C. sinensis und der mechanistischen Heterogenität der CGN bietet die Netzwerkpharmakologie ein nützliches Konzept zur Priorisierung von Verbindungen, Zielstrukturen und Signalwegen12,13.

In dieser Studie wurden Verbindungsscreening, Target-Identifizierung, Analyse der Überlappung zwischen Krankheits- und Genprofil, funktionelle Anreicherung, Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks, molekulares Docking und in vitro-Validierung kombiniert, um potenzielle molekulare Zusammenhänge zwischen den Kandidatbestandteilen von C. sinensis und CGN-relevanten pathologischen Prozessen zu untersuchen. Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase 2 (PTGS2) wurde als zentrales Target aus dem Verbindung-Krankheit-Netzwerk herausgestellt und mittels molekularem Docking unter Verwendung einer mit Celecoxib gebundenen Cyclooxygenase-2 (COX-2)-Struktur sowie einer erneuten Docking-Validierung bewertet. Auf Grundlage der Netzwerkergebnisse, der Docking-Analyse und früherer Hinweise auf entzündungshemmende und antifibrotische Wirkungen wurde β-Sitosterol als repräsentativer Kandidatenwirkstoff für die nachgeschaltete Validierung ausgewählt14,15,16. Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierte Mesangialzellen wurden verwendet, um die entzündliche Aktivierung und die COX-2/Prostaglandin E2 (PGE2)-assoziierte Reaktion zu untersuchen, während ein durch Transformierendes Wachstumsfaktor-β1 (TGF-β1) induziertes Modell zur Bewertung der Expression profibrotischer Marker eingeschlossen wurde.

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Protokoll

Die Netzwerkpharmakologie- und Bioinformatikanalysen basierten auf öffentlich zugänglichen Datenbanken und beinhalteten keine menschlichen Probanden oder Tiere. Die in vitro-Experimente wurden unter Verwendung einer etablierten Zelllinie durchgeführt und erforderten gemäß den institutionellen Vorgaben keine Ethikgenehmigung.

Screening der Kandidatenbestandteile und Zielaufklärung

Kandidatenbestandteile und ihre entsprechenden Zielstrukturen wurden aus der Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) mit dem Suchbegriff „dongchongxiacao“ am 13. Juli 2025 abgerufen. Verbindungen mit einer vorhergesagten oralen Bioverfügbarkeit von mindestens 30 % und einer drug-likeness von mindestens 0,18 wurden beibehalten. Sieben Kandidatenbestandteile erfüllten beide Screening-Kriterien. Molekulargewicht, orale Bioverfügbarkeit, drug-likeness und andere verfügbare pharmakokinetische Deskriptoren wurden aus der TCMSP für einen beschreibenden Vergleich erfasst.

Die den behaltenen Inhaltsstoffen zugeordneten Wirkstoff-Zielstrukturen wurden direkt aus TCMSP heruntergeladen. Doppelte Zielstruktureinträge wurden manuell entfernt, während die ursprünglichen Verbindungen zwischen Inhaltsstoffen und Zielstrukturen für den anschließenden Aufbau des Netzwerks beibehalten wurden. Da TCMSP die Namen der Zielstrukturen in ihrer vollständigen Schreibweise und nicht als standardisierte Gensymbole angab, wurde jede Zielstruktur in der UniProt-Datenbank (Zugriff am 14. Juli 2025) gesucht. Der entsprechende Eintrag für den Menschen wurde ausgewählt und der Name der Zielstruktur in das offizielle Gensymbol umgewandelt. Der standardisierte Datensatz aus Inhaltsstoffen und Zielstrukturen wurde für die Schnittstellenanalyse zwischen Krankheits- und Zielstrukturen sowie für die Analyse des Inhaltsstoff-Zielstruktur-Netzwerks verwendet.

Sammlung glomerulonephritissassoziierter Gene und Zielüberlappung

Krankheitsassoziierte Gene wurden am 14. Juli 2025 aus GeneCards, DisGeNET, PharmGKB und der Therapeutic Target Database mithilfe des Suchbegriffs „glomerulonephritis“ abgerufen. Bei GeneCards wurden Einträge mit Relevanzwerten über dem Medianwert von 10 berücksichtigt. Berechtigte Einträge aus den anderen Datenbanken wurden entsprechend ihren kuratierten Krankheits-Zielstrukturen-Anmerkungen einbezogen. Die Genbezeichnungen wurden auf offizielle humane Gensymbole standardisiert, und doppelte Einträge wurden entfernt. Dieses Vorgehen ergab 1.134 eindeutige, mit Glomerulonephritis assoziierte Gene. Da bei der Suche der umfassendere Begriff „glomerulonephritis“ verwendet wurde, wurde der resultierende Datensatz als relevant für molekulare Prozesse im Zusammenhang mit chronischer Glomerulonephritis angesehen, anstatt auf einen einzelnen histopathologischen Subtyp beschränkt zu sein.

Die aus TCMSP abgeleiteten, mit Verbindungen assoziierten Zielstrukturen wurden mithilfe von R mit dem satz krankheitsassoziierter Gene geschnitten. Es wurden 23 überlappende Zielstrukturen identifiziert. Venn-Diagramme wurden mit dem R-Paket venn erstellt, und das Netzwerk aus Verbindungen und überlappenden Zielstrukturen wurde mit Cytoscape konstruiert und visualisiert. Die Beziehungen zwischen den in Frage kommenden Inhaltsstoffen und den überlappenden Zielstrukturen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Funktionelle Anreicherungs- und Protein-Protein-Interaktionsanalysen

Analysen zur Anreicherung von Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wurden in R mit clusterProfiler und org.Hs.eg.db durchgeführt. Gene Ontology-Terme wurden in den Kategorien biologischer Prozess, zelluläre Komponente und molekulare Funktion analysiert. Die P-Werte wurden mittels der Benjamini-Hochberg-Methode auf Mehrfachvergleiche korrigiert, und Terme oder Signalwege mit korrigierten P-Werten unter 0,05 wurden beibehalten. Angereicherte Terme und Signalwege wurden mithilfe unabhängig erstellter Balken- und Punktdiagramme dargestellt.

Die 23 überlappenden Zielstrukturen wurden in STRING übermittelt, wobei Homo sapiens als Organismus ausgewählt wurde und ein minimaler Interaktionsscore von mehr als 0,4 festgelegt wurde. Das resultierende Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk wurde in Cytoscape importiert. Die Netzwerktopologie wurde mittels CytoNCA basierend auf Grad, Zwischenzentralität, Nähezentralität, Eigenvektorzentralität, lokaler durchschnittlicher Verbindungsdichte und Netzwerkzentralität bewertet. Hub-Zielstrukturen wurden als Knoten definiert, bei denen die Werte für Grad, Zwischenzentralität, Nähezentralität, Eigenvektorzentralität, lokale durchschnittliche Verbindungsdichte und Netzwerkzentralität jeweils über den entsprechenden Medianwerten des Netzwerks lagen. Diese Analyse priorisierte neun Hub-Zielstrukturen für die anschließende Interpretation.

Molekulares Docking und Validierung des Redockings

Das molekulare Docking wurde unter Verwendung der mit Celecoxib gebundenen Cyclooxygenase-2-Struktur mit der PDB-ID 3LN1 durchgeführt. Kette A und ihre assoziierte Häm-Gruppe wurden als Rezeptor beibehalten, während kristallographische Wassermoleküle und der ko-kristallisierte Celecoxib-Ligand während der Rezeptorvorbereitung entfernt wurden. Die native Celecoxib-Konformation wurde separat aus Kette A zur erneuten Docking-Validierung extrahiert. Polare Wasserstoffatome und Gasteiger-Ladungen wurden mit AutoDockTools hinzugefügt, und der Rezeptor wurde im PDBQT-Format gespeichert. Die PDB-ID 3LN1 ist eine 2,40 Å-Struktur der murinen COX-2, die an Celecoxib gebunden ist. Die Strukturen von β-Sitosterol und Linoleylacetat wurden aus PubChem bezogen und mit Open Babel vorbereitet. Wasserstoffatome und Gasteiger-Teilladungen wurden hinzugefügt, rotierbare Bindungen wurden zugewiesen, und jeder Ligand wurde in das PDBQT-Format konvertiert. Celecoxib, β-Sitosterol und Linoleylacetat wurden mit AutoDock Vina unter Verwendung desselben Rezeptors und derselben Suchparameter gedockt.

Die Docking-Box wurde auf dem nativen Bindungsgebiet von Celecoxib mit den folgenden Koordinaten zentriert: center_x = 30,9886 center_y = -22,2836 center_z = -16,5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. Der Exhaustiveness-Wert wurde auf 16, die Anzahl der Ausgabemodi auf 10 und der Energiebereich auf 3 kcal/mol festgelegt. Die am höchsten bewertete Pose, basierend auf der niedrigsten vorhergesagten Bindungsenergie, wurde zur Visualisierung beibehalten. Zur Protokollvalidierung wurde natives Celecoxib unter denselben Bedingungen erneut gedockt, und die Root-Mean-Square-Abweichung der schweren Atome zwischen der kristallographischen und der erneut gedockten Pose wurde mit PyMOL berechnet. Eine Root-Mean-Square-Abweichung unterhalb von 2 Å galt als akzeptable Wiedergabe der Referenzpose. In PyMOL wurden die Reste identifiziert, die sich innerhalb von 4 Å zu jedem gedockten Liganden befanden. Die Docking-Scores und -Posen wurden als Schätzwerte für die strukturelle Verträglichkeit interpretiert und nicht als direkter Nachweis einer Zielbindungs- oder enzymatischen Hemmung.

Zellkultur und Verbindungsvorbereitung

HBZY-1-Ratten-Glomerulamesangialzellen wurden in einem Dulbecco’s modifizierten Eagle-Medium mit hohem Glucosespiegel kultiviert, das mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C unter befeuchteten Bedingungen mit 5 % CO₂ ergänzt wurde. Für alle Experimente wurden Zellen der Passagen 2–7 verwendet, und der mykoplasmafreie Status wurde vor der Verwendung überprüft. β-Sitosterol und Celecoxib dienten als chemisch definierte Verbindungen. β-Sitosterol wurde in absolutem Ethanol gelöst, um eine Stammlösung von 10 mM (ca. 4,15 mg/mL) herzustellen. Gegebenenfalls wurden kurze Beschallung und Erwärmung auf 50–60 °C durchgeführt, um eine optisch klare Lösung zu erhalten. Celecoxib wurde in Dimethylsulfoxid gelöst, um eine Stammlösung von 10 mM (ca. 3,81 mg/mL) herzustellen. Die Stammlösungen wurden portioniert und bei −20 °C gelagert. Vor der Behandlung wurden die Stammlösungen direkt in vorgewärmtes Kulturmedium verdünnt und unmittelbar gemischt.

Die Fahrzeugkonzentrationen wurden innerhalb jedes Experiments angeglichen. Bei dem Zellviabilitätsassay wurde die endgültige Ethanol-Konzentration in allen Gruppen auf 0,2 % (V/V) eingestellt, da die höchste getestete β-Sitosterol-Konzentration 20 µM betrug. Bei dem LPS-induzierten entzündlichen Experiment wurden die endgültigen Konzentrationen von Ethanol und Dimethylsulfoxid in allen Gruppen jeweils auf 0,1 % und 0,01 % (V/V) eingestellt. Bei dem TGF-β1-induzierten profibrotischen Experiment wurde die endgültige Ethanol-Konzentration in allen Gruppen auf 0,1 % (V/V) eingestellt. Den Kontroll-, LPS- und TGF-β1-Gruppen wurden äquivalente Volumina der entsprechenden Fahrzeuge hinzugefügt.

Test zur Zellviabilität

Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 103 Zellen pro Well in 100 µL komplettem Medium ausgesät und 24 h lang zum Anheften freigegeben. Um den Konzentrationsbereich von β-Sitosterol zu bewerten, wurden die Zellen 24 h lang mit 0,5, 1, 5, 10 oder 20 µM β-Sitosterol inkubiert. Für den LPS-bezogenen Zellviabilitätsassay wurden die Zellen vorab 2 h lang mit β-Sitosterol in Konzentrationen von 1, 5 oder 10 µM vorbehandelt und anschließend zusätzlich 24 h lang 1 µg/mL Lipopolysaccharid ausgesetzt.

Die Behandlungsgruppen waren Kontrolle, β-Sitosterol bei 0,5 µM, β-Sitosterol bei 1 µM, β-Sitosterol bei 5 µM, β-Sitosterol bei 10 µM, β-Sitosterol bei 20 µM, LPS, LPS plus β-Sitosterol bei 1 µM, LPS plus β-Sitosterol bei 5 µM und LPS plus β-Sitosterol bei 10 µM. Pro Mulde wurde 10 µL Cell Counting Kit-8-Reagenz zugegeben, und die Platten wurden 2 h inkubiert. Die Absorption wurde anschließend bei 450 nm gemessen. Die Zellviabilität wurde nach Subtraktion des zellfreien Leerwerts bestimmt und relativ zur Kontrollgruppe angegeben. Jede Bedingung umfasste sechs technische Mulden in jeweils sechs unabhängigen biologischen Experimenten. Die Werte der technischen Mulden jedes Experiments wurden gemittelt, um einen biologischen Replikatwert für die statistische Analyse zu erzeugen.

LPS-induzierte entzündliche Aktivierung

Für Experimente zur entzündlichen Aktivierung wurden HBZY-1-Zellen in 6-Loch-Platten mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Loch ausgesät und nach Erreichen einer Konfluenz von etwa 70–80 % behandelt. Die Zellen wurden 12 Stunden vor der Behandlung in Medium mit 1 % fetalem Rinderserum kultiviert. β-Sitosterol oder Celecoxib wurden 2 Stunden vor der LPS-Stimulation verabreicht. Anschließend wurden die Zellen 24 Stunden lang 1 µg/mL LPS ausgesetzt.

Die experimentellen Gruppen waren Kontrolle, β-Sitosterol bei 10 µM, LPS, LPS plus β-Sitosterol bei 1 µM, LPS plus β-Sitosterol bei 5 µM, LPS plus β-Sitosterol bei 10 µM sowie LPS plus Celecoxib bei 1 µM. Celecoxib wurde als funktionelle positive Kontrolle zur Hemmung der COX-2-abhängigen Prostaglandinproduktion hinzugefügt. Am Ende der Behandlung wurden die Kulturüberstände zur Messung von PGE2 gesammelt. Die Zellen wurden separat gesammelt, um eine quantitative Echtzeit-PCR-Analyse von Tnf, Il6 und Ptgs2 sowie eine Western-Blot-Analyse von COX-2 durchzuführen.

Profibrotische Aktivierung durch TGF-β1

Ein separates, durch TGF-β1 induziertes Modell wurde verwendet, um die profibrotische Aktivierung zu bewerten. HBZY-1-Zellen wurden in 6-Loch-Platten mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Loch ausgesät und 12 h vor der Behandlung in Medium mit 1 % fetalem Rinderserum kultiviert. Die Zellen wurden 2 h mit β-Sitosterol vorbehandelt und anschließend 48 h mit 10 ng/mL rekombinantem TGF-β1 stimuliert.

Die Behandlungsgruppen umfassten Kontrolle, β-Sitosterol (10 µM), TGF-β1, TGF-β1 + β-Sitosterol (5 µM) und TGF-β1 + β-Sitosterol (10 µM). Am Ende der Behandlungszeit wurden die Zellen zur quantitativen Echtzeit-PCR-Analyse von Col1a1 und Acta2 sowie zur Western-Blot-Analyse von Alpha-Smooth-Muscle-Aktin (α-SMA) gewonnen.

Quantitative Echtzeit-PCR

Gesamt-RNA wurde aus behandelten Zellen unter Verwendung eines auf Phenol-Guanidinium basierenden RNA-Extraktionsreagenz gemäß der Herstellerprotokoll isoliert. Die RNA-Konzentration und -reinheit wurden mittels eines Spektrophotometers bestimmt. Nur Proben mit einem A260/A280-Verhältnis von 1,8–2,0 wurden für die Reverse Transkription verwendet. Für jede Probe wurden 1 µg Gesamt-RNA in einer endgültigen Reaktionsvolumen von 20 µL in komplementäre DNA umgeschrieben. Die erhaltene komplementäre DNA wurde vor der quantitativen PCR fünfmal mit nukleasefreiem Wasser verdünnt. Die quantitative PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 20 µL durchgeführt, das 10 µL 2× SYBR Green Mastermix, jeweils 0,4 µL 10 µM vorwärts- und rückwärtsgerichteter Primer, 2 µL verdünnter komplementärer DNA und 7,2 µL nukleasefreies Wasser enthielt. Die Amplifikationsbedingungen bestanden aus einer initialen Denaturierungsstufe bei 95 °C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 5 s und Annealing-Extension bei 60 °C für 30 s. Anschließend wurde eine Schmelzkurvenanalyse von 65 °C bis 95 °C durchgeführt, um die Spezifität der Amplifikation zu überprüfen.

Die gemessenen Gene waren Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2 und Gapdh. Gapdh diente als internes Referenzgen. Die relative Genexpression wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode bestimmt, wobei die Kontrollgruppe als Kalibrator verwendet wurde. Die Primersequenzen sind in Supplementary Table 1 angegeben. Jede Probe wurde technisch im Dreifachansatz analysiert, und es wurden sechs unabhängige biologische Experimente durchgeführt. Die Werte der technischen Replikate wurden vor der statistischen Analyse gemittelt.

Bestimmung von PGE2 mittels enzymgekoppelter Immunadsorption

Kulturüberstände wurden 24 h nach LPS-Stimulation gesammelt und bei 4 °C 10 min bei 1.000 ×g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die PGE2-Konzentrationen wurden mithilfe eines kommerziell erhältlichen ELISA-Tests gemäß den Herstelleranweisungen bestimmt.

Standards und Proben wurden verdoppelt auf die Testplatte aufgetragen. Nach Abschluss der Antikörperbindungs- und Farbentwicklungs-Schritte wurde die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader aufgezeichnet. Die PGE2-Konzentrationen wurden anhand einer vierparametrigen logistischen Standardkurve bestimmt und als pg/mL angegeben. Überstände aus sechs unabhängigen Zellversuchen wurden analysiert. Die Duplikat-Messungen jeder biologischen Probe wurden vor der statistischen Analyse gemittelt.

Immunoblot

Behandelte Zellen wurden in Radioimmunpräzipitationspuffer, ergänzt mit einer Proteaseinhibitormischung, lysiert. Die Lysate wurden 30 min auf Eis inkubiert und bei 4 °C 15 min bei 12.000 × g zentrifugiert. Die Protein-konzentrationen in den Überständen wurden mithilfe eines Bicinchoninsäure-Proteinassays bestimmt. Gleiche Proteinmengen (30 µg pro Lane) wurden mit Lade-puffer gemischt und 5 min bei 95 °C denaturiert. Proteine aus den LPS-Experimenten wurden auf 10 %igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen aufgetrennt, während jene aus den TGF-β1-Experimenten auf 12 %igen Gelelektrophoresegelen aufgetrennt wurden. Die getrennten Proteine wurden anschließend auf Polyvinylidenfluoridmembranen übertragen.

Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch in Tris-gepufferter Salzlösung mit 0,1 % Tween 20 für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) und GAPDH (1:5000) inkubiert. COX-2 wurde in Proben aus dem LPS-Experiment analysiert, während α-SMA in Proben aus dem TGF-β1-Experiment analysiert wurde. Nach dem Waschen wurden die Membranen für 1 h bei Raumtemperatur mit mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern (1:5000) inkubiert. Proteinbande wurden mithilfe eines verbesserten chemilumineszenten Substrats sichtbar gemacht und mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem aufgezeichnet. Die Belichtungszeiten betrugen etwa 10 s für COX-2, 10 s für α-SMA und 2 s für GAPDH.

Die Bandenintensitäten wurden mit ImageJ quantifiziert. Die Signale von COX-2 und α-SMA wurden auf das entsprechende GAPDH-Signal normalisiert. Die Western-Blot-Analyse wurde mit Proteinen durchgeführt, die aus sechs unabhängigen Zellkultur- und Behandlungsversuchen gewonnen wurden.

Statistische Analyse

Die statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Für jede quantitative Analyse wurden sechs unabhängige Zellkultur- und Behandlungsversuche durchgeführt, wobei jeder unabhängige Versuch eine biologische Wiederholung darstellt. Technische Wiederholungsmessungen, die aus demselben biologischen Versuch stammten, wurden vor der statistischen Analyse gemittelt und nicht als unabhängige Beobachtungen betrachtet.

Für den Zellviabilitätsassay umfasste jedes biologische Experiment sechs technische Ansätze pro Bedingung. Die quantitativen PCR-Reaktionen wurden für jede biologische Probe im technischen Triplikat durchgeführt, und die PGE2-Messungen wurden im Duplikat durchgeführt. Die Quantifizierung per Western Blot basierte auf sechs unabhängig hergestellten Proteinproben. Daher enthält jeder quantitative Balken sechs individuelle biologische Wiederholungswerte.

Unterschiede zwischen mehreren Gruppen wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse, gefolgt von Tukeys Test für multiple Vergleiche, analysiert. Ein zweiseitiger P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Werte einzelner biologischer Replikate wurden zusammen mit dem Mittelwert und der Standardabweichung dargestellt.

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Ergebnisse

Screening der Kandidatenbestandteile, Abruf der Zielstrukturen und Schnittmenge der Zielstrukturen

Der Arbeitsablauf zur Identifizierung von potenziellen Überlappungszielen zwischen Verbindungen und Krankheiten ist in Abbildung 1A zusammengefasst. Sieben potenzielle Verbindungen von C. sinensis erfüllten die vorab festgelegten Screening-Kriterien von OB ≥30 % und DL ≥0,18, darunter Arachidonsäure, Linoleylacetat, β-Sitosterol, Peroxyergos...

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Diskussion

Diese Studie kombinierte Netzwerkpharmakologie, durch Referenzliganden validiertes molekulares Docking und experimentelle Untersuchungen auf Verbindungsebene, um eine PTGS2-assoziierte Hypothese zu überprüfen, die sich aus Kandidatensubstanzen von C. sinensis ergibt. Sieben Inhaltsstoffe erfüllten die vorab festgelegten TCMSP-Ausschlusskriterien, und 23 Zielstrukturen überlappten sich mit dem genetischen Profil der Glomerulonephritis. Die Analyse proteinbasierter Interaktionen identifizierte neun zentra...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben. KI-basierte Werkzeuge (ChatGPT, OpenAI) wurden zur Unterstützung bei der sprachlichen Überarbeitung und der vorläufigen Gestaltung schematischer Abbildungen verwendet. Generative Künstliche Intelligenz kam bei der Erstellung vorläufiger grafischer Entwürfe der Abbildungen 1A und 7 zum Einsatz, die anschließend von den Autoren überprüft und überarbeitet wurden, um die Übereinstimmung mit den beschriebenen Methoden und Ergebnissen sicherzustellen. Alle von der KI unterstützten Ergebnisse wurden kritisch bewertet und von den Autoren genehmigt. Die Autoren haben den endgültigen Inhalt der Abbildungen verifiziert und übernehmen volle Verantwortung für die Integrität und Genauigkeit der Manuskripterstellung.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt durch die integrierte charakteristische Fachabteilung für nephropathische Erkrankungen der Traditionellen Chinesischen und Westlichen Medizin (ZYTSZK2-3) und die Studie zur Strategie der TCM-Intervention bei chronischer Nierenerkrankung aus der Perspektive des Managements chronischer Erkrankungen (202240169).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Absolute EthanolSigma-Aldrich/MerckE7023Molekularbiologisch reines, nicht denaturiertes Ethanol mit 200 Proof; Lösungsmittel für den β-Sitosterol-Standard.
AutoDock VinaScripps ResearchVersion 1.1.2Molekulare Docking-Simulation
BiosicherheitswerkbankThermo Fisher Scientific1300 Series A2Sterile Zellkultur-Arbeiten
CelecoxibMedChemExpressHY-14398Selektiver COX-2-Hemmer, verwendet als positiver Kontrollstoff; 10 mM-Lösung in DMSO. 
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04WST-8-Färbung zur Bestimmung der Zellviabilität; Absorption bei 450 nm gemessen.
Chemilumineszenz-BildgebungssystemBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPAufnahme von Western Blot-Bildern
clusterProfiler R-PaketBioconductorVersion 4.10.0GO- und KEGG-Enrichment-Analyse
CO2-Zellkultur-InkubatorThermo Fisher ScientificForma Series II 3111Inkubation von Zellkulturen bei 37 °C und 5 % CO2
COX-2 (D5H5) Kaninchen monoklonaler AntikörperCell Signaling Technology12282Für Western Blot validiert gegen menschliches, murines und ratten COX-2; verwendet im Verdünnungsverhältnis 1:1.000.
CytoNCA-PluginCytoscape App StoreVersion 2.1.6Topologische Analyse zentraler Zielstrukturen
Cytoscape-SoftwareCytoscape ConsortiumVersion 3.8.0Visualisierung und Analyse von Netzwerken
DimethylsulfoxidSigma-Aldrich/MerckD2650Sterilfiltriertes BioReagent, ≥99,7 %; Lösungsmittel für Celecoxib-Standard.
DisGeNET-DatenbankIntegrative Biomedical Informatics GroupNicht zutreffendGen-Erkrankungs-Abfrage für Glomerulonephritis
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTGrundmedium für die Kultur von HBZY-1-Zellen
Verbessertes Chemilumineszenz-SubstratBeyotime BiotechnologyP0018SSichtbarmachung von Banden im Western Blot
Fötales KälberserumGibco/Thermo Fisher Scientific10099-141CSerumzusatz für die Zellkultur
GAPDH (D16H11) Kaninchen monoklonaler AntikörperCell Signaling Technology5174Ladungskontrolle im Western Blot; reagiert mit menschlichem, murinem und ratten GAPDH; verwendet im Verdünnungsverhältnis 1:5.000 nach interner Optimierung.
GeneCards-DatenbankWeizmann Institute of ScienceNAIdentifizierung von mit Glomerulonephritis assoziierten Genen
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0.0.121Statistische Analyse von in-vitro-Experimentaldaten
HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgGProteintech GroupSA00001-2Sekundärantikörper für kaninchenstammige Primärantikörper
ImageJ-SoftwareNational Institutes of HealthVersion 1.54Dichtometrische Analyse von Western Blots
Invertiertes PhasenkontrastmikroskopOlympusCKX53Beobachtung der Zellmorphologie
org.Hs.eg.db R-PaketBioconductorVersion 3.18.0Menschliche Genanreicherung für Enrichment-Analysen
Penicillin-Streptomycin-LösungGibco/Thermo Fisher Scientific15140122Antibiotischer Zusatz für die Zellkultur
PGE2-Parameter-Assay-KitR&D Systems, eine Marke von Bio-TechneKGE004BMehrspezies-kompetitives ELISA für Zellkulturüberstände; Messbereich 39–2.500 pg/mL; farbmessende Detektion bei 450 nm.
PharmGKB-DatenbankPharmacogenomics KnowledgebaseNAIdentifizierung krankheitsrelevanter Zielstrukturen
PubChem-DatenbankNational Center for Biotechnology InformationNAAbfrage von Ligandenstrukturen
PVDF-MembranMillipore/MerckIPVH00010Proteintrennmembran für Western Blot
PyMOL-MolekülgrafiksystemSchrödinger, LLCVersion 2.6.2Visualisierung von Docking-Positionen
R-SoftwareR Foundation for Statistical ComputingVersion 4.3.2Identifizierung gemeinsamer Zielstrukturen und Enrichment-Analyse
Ratten-Glomerulus-Mesangialzelllinie (HBZY-1)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0117In-vitro-Validierungsmodell für Mesangialzellen
RCSB Protein Data BankResearch Collaboratory for Structural BioinformaticsPDB ID: 3LN1Abfrage der Kristallstruktur von PTGS2/COX2
Rekombinantes humanes TGF-β1-ProteinPeproTech, eine Marke von Thermo Fisher Scientific100-21-10UGHEK293-abgeleitetes rekombinantes humanes TGF-β1; profibrotische Stimulation mit 10 ng/mL. 
SDS-PAGE-Elektrophorese-SystemBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN TetraProteintrennung mittels SDS-PAGE
STRING-DatenbankELIXIR/STRING ConsortiumVersion 12.0Aufbau von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken
TCMSP-DatenbankTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatabaseNAAuswahl von Wirkstoffkandidaten aus Cordyceps sinensis
Therapeutic Target DatabaseInnovative Drug Research and Bioinformatics GroupNAIdentifizierung therapeutischer Zielstrukturen
α-SMA-PrimärantikörperProteintech Group14395-1-APNachweis der α-SMA-Proteinexpression
β-Sitosterol (Reinheit >98 %)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5; definierter Wirkstoff zur Zellbehandlung; 10 mM-Lösung in absolutem Ethanol. 

Referenzen

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