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Methodenartikel

Nephroprotektive Effekte einer Behandlung mit N-Acetylcystein und Montelukast nach Kontrastmittelgabe in einem Rattenmodell für kontrastmittelinduzierte akute Nierenschädigung

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DOI:

10.3791/73087

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3. September 2026

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1Department of Emergency Medicine, Kırşehir Ahi Evran University Faculty of Medicine, 2Department of Histology and Embryology, Kırşehir Ahi Evran University Faculty of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein Rattenmodell einer kontrastmittelinduzierten akuten Nierenschädigung vor und bewertet die Gabe von N-Acetylcystein und Montelukast nach der Kontrastmittelapplikation, einzeln und in Kombination. Die Behandlungsregime waren mit einer weniger schweren Nierenfunktionsstörung, oxidativem Stress, Entzündung und histopathologischer Schädigung assoziiert, obwohl die kombinierte Behandlung die Monotherapie nicht durchgängig übertraf.

Zusammenfassung

Die kontrastmittelinduzierte akute Nierenschädigung (CI-AKI) ist eine wichtige Komplikation nach Exposition gegenüber jodhaltigen Kontrastmitteln, bei der oxidativer Stress und entzündliche Prozesse zur Nierenschädigung beitragen. Diese Studie etablierte ein experimentelles Rattenmodell der CI-AKI und untersuchte die Wirkungen einer Behandlung, die nach der Gabe des Kontrastmittels mit N-Acetylcystein (NAC), Montelukast oder einer Kombination beider Substanzen begonnen wurde. Adulte männliche Wistar-Ratten wurden wasserentzogen und erhielten anschließend eine sequenzielle intravenöse Gabe von Nω-Nitro-L-Arginin-Methylester (L-NAME), Indomethacin und Iohexol. Die Behandlung wurde 1 h nach Abschluss der Iohexol-Gabe, etwa 1,5 h nach der Gabe von L-NAME, begonnen und an drei aufeinanderfolgenden Tagen täglich fortgesetzt. Es wurden Parameter der Nierenfunktion, des oxidativen Stresses, entzündliche Zytokine, Biomarker der Nierenschädigung sowie die Nierenhistopathologie evaluiert. Die unbehandelte CI-AKI-Gruppe zeigte eine ausgeprägte Nierenfunktionsstörung, ein ungünstiges Profil hinsichtlich oxidativen Stresses und Entzündung sowie erhebliche histopathologische Schäden. Im Vergleich zur unbehandelten CI-AKI-Gruppe zeigten Tiere, die NAC, Montelukast oder die Kombinationsbehandlung erhielten, im Allgemeinen verbesserte biochemische und histopathologische Befunde. Die Glutathion (GSH)-Spiegel waren in der Kombinationsgruppe am höchsten, und die mittleren histopathologischen Schädigungswerte waren numerisch am niedrigsten; die kombinierte Behandlung übertraf die Monotherapien jedoch bei den untersuchten Endpunkten nicht durchgängig. Dieses Protokoll bietet einen kontrollierten präklinischen Rahmen zur Bewertung von Interventionen nach Kontrastmittelgabe bei CI-AKI, und die Ergebnisse rechtfertigen weitere experimentelle Untersuchungen zu NAC und Montelukast, ohne klinische Wirksamkeit oder einen Vorteil der Kombinationstherapie zu belegen.

Einleitung

Akute Nierenschädigung (AKI) erschwert häufig den Krankheitsverlauf stationär behandelte Patienten und trägt zu einer erhöhten Morbidität, Mortalität und Inanspruchnahme von Gesundheitsressourcen bei. Da jodierte Kontrastmittel routinemäßig in der diagnostischen Bildgebung und bei interventionellen Verfahren eingesetzt werden, hat sich die Verschlechterung der Nierenfunktion nach Exposition gegenüber Kontrastmitteln zu einem wichtigen klinischen Problem entwickelt. Die aktuelle Nomenklatur unterscheidet zwischen kontrastassoziiierter akuter Nierenschädigung (CA-AKI), die jeden AKI-Fall nach Gabe eines Kontrastmittels umfasst, und kontrastinduzierter akuter Nierenschädigung (CI-AKI), bei der die Nierenschädigung kausal auf das Kontrastmittel zurückgeführt wird. In kontrollierten experimentellen Modellen, bei denen die Exposition gegenüber Kontrastmitteln direkt mit Nierenschäden verknüpft werden kann, wird daher weiterhin weithin der Begriff CI-AKI verwendet1,2.

Patienten mit chronischer Nierenerkrankung, Diabetes mellitus, fortgeschrittenem Alter, Herzinsuffizienz oder anderen kardiovaskulären Komorbiditäten sind besonders anfällig für CI-AKI. Bei vielen betroffenen Patienten erholt sich die Nierenfunktion; jedoch können bei schwereren Fällen eine persistierende Nierenfunktionsstörung, die Notwendigkeit einer Nierenersatztherapie sowie ein erhöhtes Todesrisiko auftreten. CI-AKI ist außerdem mit einer längeren Krankenhausbehandlung und einem stärkeren Einsatz von Gesundheitsressourcen verbunden. Diese negativen Folgen unterstreichen die fortbestehende Notwendigkeit, wirksame präventive und therapeutische Ansätze für kontrastmittelbedingte Nierenschäden zu entwickeln1,3,4,5.

Die Entstehung der CI-AKI umfasst mehrere miteinander verknüpfte Prozesse, darunter veränderte Nierendurchblutung, Sauerstoffmangel im Markbereich, oxidativen Stress, Entzündungen und direkte tubuläre Toxizität. Die Exposition gegenüber Kontrastmitteln verschiebt den intrarenalen Gefäßtonus in Richtung Vasokonstriktion und schwächt gleichzeitig vasodilatatorische Reaktionen, wodurch die Nierendurchblutung abnimmt. Das äußere Mark ist besonders anfällig, da die Sauerstoffverfügbarkeit in diesem Bereich unter physiologischen Bedingungen bereits eingeschränkt ist. Ein weiterer Rückgang der Sauerstoffzufuhr nach der Gabe von Kontrastmittel kann daher eine hypoxische Tubulusschädigung auslösen2,6,7.

Renale Hypoxie nach Kontrastmittelgabe geht mit einer erhöhten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) einher, was wesentlich zur Nierenschädigung beiträgt. Wenn die Produktion von ROS die körpereigene antioxidative Kapazität übersteigt, kann es zu oxidativem Schaden an zellulären Lipiden, Proteinen und der DNA kommen, während gleichzeitig die entzündliche Signalübertragung verstärkt wird. Sowohl in experimentellen als auch in klinischen Untersuchungen wurde die Gabe von Kontrastmitteln mit erhöhten Parametern oxidativen Stresses und einer beeinträchtigten antioxidativen Abwehr in Verbindung gebracht. Zu den molekularen Wegen, die an dieser Reaktion beteiligt sind, zählen die Bildung von Radikalen abhängig von der NADPH-Oxidase und die Aktivierung von nukleärem Faktor kappa-B (NF-κB)1,6,8,9.

Der Beitrag der Entzündung zeigt, dass die CI-AKI nicht allein durch hämodynamische Störungen erklärt werden kann. Neuere Befunde deuten zudem auf eine Beteiligung von Ferroptose, nitrosativem Stress und neutrophilen extrazellulären Fallen bei der Nierenschädigung nach Kontrastmittelanwendung hin. Die Erkenntnis dieser zusätzlichen Mechanismen hat das Spektrum molekularer Zielstrukturen, die für die Prävention und Behandlung der CI-AKI untersucht werden, erweitert1.

Serumkreatinin und Harnmenge werden gewöhnlich zur Identifizierung von CI-AKI verwendet, aber beide verändern sich erst, nachdem eine Nierenschädigung bereits eingetreten ist. Diese Einschränkung hat die Evaluierung früherer Indikatoren befördert, darunter das Nierenverletzungsmolekül-1 (KIM-1), das tubuläre Schäden widerspiegelt, und Cystatin C, das mit Veränderungen der glomerulären Filtration assoziiert ist. Befunde aus experimentellen und klinischen Studien deuten darauf hin, dass Veränderungen dieser Biomarker bereits in der frühen Phase von CI-AKI nachweisbar werden können und somit eine frühzeitige Beurteilung einer Nierenschädigung unterstützen9,10,11.

Fortschritte im Verständnis der Pathophysiologie der CI-AKI haben die Evaluierung pharmakologischer Interventionen, die auf oxidative und entzündliche Signalwege abzielen, gefördert. Eine ausreichende Flüssigkeitszufuhr bleibt die wichtigste vorbeugende Maßnahme, während die berichteten Vorteile von medikamentösen Ansätzen in verschiedenen Studien unterschiedlich waren. Folglich hat bisher keine pharmakologische Behandlung eine ausreichend konsistente Wirksamkeit gezeigt, um als standardmäßige klinische Intervention bei CI-AKI empfohlen zu werden1,4,12,13.

N-Acetylcystein (NAC) wurde umfassend als pharmakologischer Ansatz zur Begrenzung von CI-AKI untersucht. Die vorgeschlagenen nephroprotektiven Wirkungen stehen im Zusammenhang mit der Neutralisierung reaktiver Spezies und der Wiederherstellung der Glutathionreserven. Frühe klinische Hinweise ergaben sich aus einer wegweisenden Studie an Patienten mit chronischer Nierenerkrankung, bei der NAC das Auftreten kontrastmittelbedingter Nierenfunktionsstörungen verringerte14. Spätere klinische Studien und Evidenzsynthesen lieferten jedoch widersprüchliche Ergebnisse, wobei einige Studien einen Nutzen zeigten, während andere keinen relevanten klinischen Effekt nachweisen konnten. Die Wirksamkeit von NAC bei CI-AKI bleibt daher ungewiss12,15,16,17.

Montelukast blockiert selektiv den zysteinyl-Leukotrien-Rezeptor-1 und wird seit langem zur Behandlung von Asthma und allergischen Erkrankungen eingesetzt. Experimentelle Befunde deuten außerdem darauf hin, dass dieser Wirkstoff entzündungshemmende, antioxidative und antiapoptotische Effekte entfaltet. In verschiedenen Modellen renaler Schädigungen war die Gabe von Montelukast mit einer verminderten Lipidperoxidation, einer Stärkung der endogenen antioxidativen Abwehrmechanismen, weniger schweren histopathologischen Schäden und einer Abschwächung der Nierenschädigung assoziiert18,19,20,21,22.

Befunde zur spezifischen Untersuchung von Montelukast bei CI-AKI sind nach wie vor begrenzt. Verfügbare experimentelle Ergebnisse deuten darauf hin, dass seine renalen Wirkungen eine Modulation oxidativer und entzündlicher Signalwege beinhalten könnten. Eine verminderte Expression von NADPH-Oxidase 4 (NOX4), p22phox und NF-κB wurde als ein Mechanismus vorgeschlagen, durch den Montelukast die kontrastmittelbedingte Nierenschädigung abschwächen könnte9.

NAC und Montelukast beeinflussen teilweise unterschiedliche, aber überlappende Signalwege, die an einer Nierenschädigung beteiligt sind. NAC unterstützt hauptsächlich die antioxidative Abwehr, während Montelukast sowohl entzündungshemmende als auch antioxidative Wirkungen besitzt. Eine gleichzeitige Gabe dieser Wirkstoffe könnte daher mehrere Komponenten der Pathophysiologie der CI-AKI beeinflussen; ob jedoch ihre Wechselwirkung einen additiven oder synergistischen Nutzen bewirkt, wurde in experimentellen Modellen bisher nicht belegt18,19,20,21,22.

Bisherige Untersuchungen haben überwiegend Interventionen bewertet, die vor der Kontrastmittelgabe verabreicht wurden, während die Datenlage zu Behandlungen, die nach der Exposition begonnen werden, spärlich ist. Insbesondere die Gabe von Montelukast in Kombination mit NAC nach der Kontrastmittelgabe wurde im experimentellen CI-AKI bisher wenig untersucht. Die vorliegende Studie evaluierte daher Montelukast und NAC, die nach der Kontrastmittelexposition entweder einzeln oder in Kombination verabreicht wurden, hinsichtlich der Nierenfunktion, Parameter des oxidativen Stresses und der antioxidativen Abwehr, Nierenschädigungs- und inflammatorischer Biomarker sowie histopathologischer Veränderungen in einem Rattenmodell des CI-AKI.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren an Tieren wurden gemäß den international anerkannten Richtlinien für die Haltung und Verwendung von Labor­tieren durchgeführt und entsprachen den Anforderungen von Animal Research: Reporting of In vivo Experimente (ARRIVE)-Richtlinien. Das Versuchsprotokoll wurde von dem Tierexperimentausschuss des Ahi Evran Universität Lokalen Ethikkomitees, Kırşehir, Türkei, genehmigt (Beschluss-Nr. 2, Sitzungs-Nr. 12, Datum: 12. Juni 2025). Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um tierisches Leid zu minimieren und die Anzahl der für die Studie verwendeten Tiere so gering wie möglich zu halten. Die Angaben zu allen verwendeten Reagenzien und Geräten sind aufgeführt in der Tabelle der Materialien.

Zubereitung der Chemikalien

Nω-Nitro-L-arginin-Methylester (L-NAME), Indometacin, Iohexol, Montelukast-Natrium und NAC wurden in dieser Studie verwendet. Eine 10 mg/mL-L-NAME-Lösung wurde in steriler 0,9%iger Kochsalzlösung hergestellt, wobei 1 g L-NAME pro 100 mL verwendet wurde. Die Lösung wurde am Tag der Applikation frisch hergestellt und ohne Lagerung über diesen Tag hinaus verwendet. Zur Induktion des experimentellen CI-AKI-Modells wurde L-NAME intravenös (IV) in einer Dosis von 10 mg/kg appliziert. Bei einer Ratte mit einem Gewicht von etwa 220 g betrug die berechnete Menge etwa 2,2 mg, was einem Applikationsvolumen von etwa 0,22 mL entspricht. Indometacin wurde in einer 5%igen Natriumbikarbonatlösung mit einer Konzentration von 10 mg/mL hergestellt, indem 100 mg in einem Endvolumen von 10 mL gelöst wurden. Die Zubereitung wurde geschüttelt, bis sie visuell homogen war. Der endgültige pH-Wert der hergestellten Indometacin-Lösung wurde während des Experiments nicht gemessen und konnte daher retrospektiv nicht bestimmt werden. Ein spezifisches Sterilitäts- oder Filtrationsverfahren für die hergestellte Indometacin-Lösung war in den experimentellen Aufzeichnungen nicht dokumentiert und konnte deshalb retrospektiv nicht berichtet werden. Es wurde kein formelles Stabilitätsintervall festgelegt oder überprüft; die Lösung wurde frisch hergestellt und am selben Tag verwendet. Zur Induktion des experimentellen CI-AKI-Modells wurde Indometacin intravenös in einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht. Bei einer Ratte mit einem Gewicht von etwa 220 g betrug die berechnete Menge etwa 2,2 mg, was einem Applikationsvolumen von etwa 0,22 mL entspricht.

Die kommerzielle Iohexol-Formulierung mit einem Gehalt von 647 mg Iohexol/mL und einer äquivalenten Iod-Konzentration von 300 mg/mL wurde ohne weitere Verdünnung verabreicht. Die genaue Temperatur von Iohexol zum Zeitpunkt der Injektion wurde nicht dokumentiert. Ein formel-spezifischer Osmolalitätswert konnte anhand der vorliegenden experimentellen Aufzeichnungen nicht zuverlässig überprüft werden und wird deshalb nicht angegeben. Zur Induktion des experimentellen CI-AKI-Modells wurde Iohexol intravenös mit 3 g Iod/kg appliziert. Bei einer Ratte mit einem Gewicht von etwa 220 g entspricht diese Dosis ungefähr 0,66 g Iod und einem Injektionsvolumen von etwa 2,2 mL.

Eine Montelukast-Natrium-Suspension wurde in 0,5 %iger Carboxymethylcellulose (CMC) hergestellt. Die Suspension wurde jeden Tag der Verabreichung frisch zubereitet und unmittelbar vor der Applikation kurz vortexiert, um eine gleichmäßige Verteilung der suspendierten Partikel zu gewährleisten. Die für jedes Tier erforderliche Montelukast-Dosis wurde individuell anhand des Körpergewichts bei Studienbeginn mit folgender Formel berechnet: erforderliche Dosis (mg) = Körpergewicht (kg) × 10 mg/kg. Bei einem Tier mit einem Gewicht von etwa 220 g betrug die berechnete Dosis etwa 2,2 mg und wurde mittels oraler Gavage verabreicht. Vor jeder Applikation wurde die Suspension visuell überprüft; falls Sedimentation erkennbar war, wurde sie vor der Verwendung erneut vortexiert.

NAC wurde den Behandlungsgruppen in einer Dosis von 100 mg/kg unverdünnt aus der kommerziellen Formulierung intraperitoneal verabreicht. Für jedes Tier wurde die erforderliche Dosis individuell anhand des beim Studienbeginn erfassten Körpergewichts berechnet. Bei einem Tier mit einem Gewicht von etwa 220 g entspricht dies etwa 22 mg NAC und einem Applikationsvolumen von etwa 0,15 mL. Vor der Verabreichung wurde die Lösung visuell überprüft, und nur Zubereitungen, die klar und frei von sichtbaren Partikeln waren, wurden verwendet.

Jede Zubereitung wurde vor der Verabreichung einer visuellen Inspektion unterzogen. Die Lösungen von L-NAME, Indomethacin, Iohexol und NAC wurden auf Verfärbungen und sichtbare Partikel überprüft. Unmittelbar vor der Verabreichung wurde die Montelukast-Suspension geschüttelt und visuell geprüft, um die Homogenität zu bestätigen. Jede Zubereitung, die diese Akzeptanzkriterien nicht erfüllte, wurde nicht verwendet. Im Labor wurden Schutzkittel, Schutzhandschuhe und Augenschutz während der Zubereitung und Verabreichung aller Chemikalien getragen. Alle Verfahren entsprachen den internen Anforderungen für Laborsicherheit und Biosicherheit.

Auswahl der Tiere, Unterbringung, Versuchsgruppen und Randomisierung

Dreißig erwachsene männliche Wistar-Albino-Ratten (8–12 Wochen alt; Körpergewicht 200–220 g) wurden aus dem Labor für Versuchstiere der Ahi Evran-Universität in Kırşehir, Türkiye, bezogen. Männliche Tiere wurden gewählt, um die methodische Konsistenz mit zuvor veröffentlichten experimentellen CI-AKI-Modellen zu gewährleisten und den Einfluss des Fortpflanzungszyklus als zusätzliche biologische Variable auszuschließen. Das Geschlecht wurde in der vorliegenden Studie nicht als experimentelle Variable untersucht. Die Tierhaltungseinrichtung besaß eine Zucht-/Produktionslizenznummer 184, und die Tiere wurden dort unter standardisierten Laborbedingungen gezüchtet und gehalten. Zum Zeitpunkt der Aufnahme verfügten die Tiere über keinen dokumentierten status specific pathogen-free (SPF) oder eine andere formell definierte mikrobiologische Gesundheitsklassifizierung. Jede Ratte wurde einzeln in einem Polycarbonat-Käfig mit den Maßen 40 cm × 25 cm × 20 cm untergebracht, wobei grob zerkleinerte Kiefernspäne als Einstreu dienten. Die Raumbedingungen wurden mittels einer automatisierten Umwelt- und Lüftungssteuerung bei 24 °C ± 2 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 35 % ± 10 % gehalten. Ein 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Rhythmus wurde angewandt, wobei die Beleuchtung von 07:00 bis 19:00 Uhr erfolgte. Während der 7-tägigen Akklimatisierungsphase sowie der anschließenden experimentellen Phase wurde keine gezielte Umweltanreicherung bereitgestellt. Standardisierte pelletierte Nagerkost und Leitungswasser standen ad libitum zur Verfügung, mit Ausnahme einer definierten 16-stündigen Wasserentzugphase vor der Induktion des CI-AKI. Die Futterzusammensetzung betrug 24 % Rohprotein, 3,94 % Rohzellulose, 5,08 % Rohfett, 8,8 % Rohasche, 1,44 % Lysin, 0,61 % Methionin, 1,14 % Calcium, 0,89 % Phosphor und 0,28 % Natrium. Alle Tiere wurden sieben Tage lang akklimatisiert, bevor die experimentellen Verfahren begannen. Tägliche Beobachtungen wurden sowohl während der Akklimatisierungs- als auch der experimentellen Phase durchgeführt, um den allgemeinen Zustand, den Futter- und Wasserverbrauch, die Beweglichkeit, die Körperhaltung, das Fellbild sowie Anzeichen von Belastung zu beurteilen. Um eine Selektionsverzerrung zu minimieren, wurden die Tiere mittels einer computergenerierten Zufallszuordnung auf fünf experimentelle Gruppen verteilt, wobei je sechs Tiere pro Gruppe zugewiesen wurden. Die Stichprobengröße wurde anhand einer a priori Power-Analyse mit G*Power Version 3.1.9.6 ermittelt.

Die Stichprobengröße wurde anhand einer a priori Power-Analyse für eine einfaktorielle Varianzanalyse mit festen Effekten unter Berücksichtigung von fünf experimentellen Gruppen bestimmt. Unter der Annahme einer Effektgröße (f) von 0,65, einer Fehlerrate 1. Art (α) von 0,05 und einer statistischen Power von 80 % ergab sich eine erforderliche Gesamtstichprobengröße von 30 Tieren, was sechs Tieren pro Gruppe entspricht. Die Effektgröße (f = 0,65) wurde a priori als große gesamte Effektstärke zwischen den Gruppen für den Vergleich der fünf Gruppen angenommen. Die Berechnung diente dazu, die Stichprobengröße zu ermitteln, die notwendig ist, um einen solchen Gesamteffekt nachzuweisen, und war nicht speziell darauf ausgelegt, kleinere paarweise Unterschiede zwischen den aktiven Behandlungsgruppen zu detektieren. Das einzelne Tier galt für alle Analysen als experimentelle Einheit.

Abgesehen von der routinemäßigen Tierhaltung, der täglichen Gesundheitsüberwachung und terminalen Verfahren wurden Tiere der Kontrollgruppe keiner protokollbedingten Handhabung oder Fixierung, Wasserverweigerung, intravenösen oder intraperitonealen Injektionen, oraler Gavage oder Applikation von Trägerlösung unterzogen. Die CI-AKI-Gruppe umfasste Tiere, bei denen am Tag 8 das CI-AKI-Modell etabliert wurde und die keine Behandlung erhielten. Die CI-AKI + Montelukast-Gruppe umfasste Tiere, bei denen das CI-AKI-Modell etabliert wurde und die anschließend mit Montelukast behandelt wurden. Die CI-AKI + NAC-Gruppe umfasste Tiere, bei denen das CI-AKI-Modell etabliert wurde und die anschließend mit NAC behandelt wurden. Die CI-AKI + Montelukast + NAC-Gruppe umfasste Tiere, bei denen das CI-AKI-Modell etabliert wurde und die anschließend mit einer Kombination aus Montelukast und NAC behandelt wurden. Weder die Kontrollgruppe noch die unbehandelte CI-AKI-Gruppe erhielten behandlungsentsprechende Scheinverfahren. Insbesondere wurden in diesen Gruppen keine Schein-Handhabungen, keine Schein-oralen Gavagen, keine Scheinbehandlungs-Injektionen oder behandlungsentsprechenden Applikationen von Trägerlösung durchgeführt. Die zur Herstellung von L-NAME, Indomethacin und Montelukast verwendeten Trägerlösungen waren 0,9 % Kochsalzlösung, 5 %ige Natriumbikarbonatlösung und 0,5 %ige CMC-Lösung, wie unter Vorbereitung der Chemikalien beschrieben. NAC wurde aus der kommerziellen Formulierung ohne weitere Verdünnung verabreicht, und für NAC wurde keine separate Trägerlösung hergestellt. Am Tag 8 wurden alle Tiere außer denen der Kontrollgruppe 16 Stunden lang wasserentzogen und anschließend nacheinander intravenös L-NAME (10 mg/kg), Indomethacin (10 mg/kg) und Iohexol (3 g Jod/kg) appliziert, um eine kontrastmittelinduzierte akute Nierenschädigung hervorzurufen. In den entsprechenden Behandlungsgruppen wurden Montelukast (10 mg/kg, orale Gavage) und/oder NAC (100 mg/kg, intraperitoneale Injektion) erstmals eine Stunde nach Abschluss der Iohexol-Applikation am Tag 8 verabreicht, was etwa 1,5 Stunden nach der L-NAME-Gabe entspricht, und anschließend täglich zur gleichen Zeit an den Tagen 9 und 10 erneut appliziert.

Protokoll zur Arzneimittelverabreichung

CI-AKI wurde gemäß einem veröffentlichten experimentellen Protokoll etabliert, das aus einer 16-stündigen Wasserverweigerung gefolgt von der sequenziellen intravenösen Verabreichung von L-NAME, Indomethacin und Iohexol bestand23,24,25. L-NAME und Indomethacin wurden jeweils in einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht, während Iohexol in einer Dosis von 3 g Jod/kg appliziert wurde. Die Behandlungsdosen betrugen 10 mg/kg für Montelukast-Natrium und 100 mg/kg für NAC. Die Auswahl der Modellinduktions- und Behandlungsdosen erfolgte anhand zuvor veröffentlichter experimenteller Studien22,26,27. Es wurde keine vorläufige Dosisfindungs- oder Dosisoptimierungsstudie durchgeführt. Die Dosen für NAC und Montelukast wurden unabhängig voneinander basierend auf zuvor veröffentlichten experimentellen Studien zu den einzelnen Wirkstoffen ausgewählt und nicht aus einer kombinationsspezifischen Dosisfindungsstudie abgeleitet. Die gewählten Dosen sollten keine pharmakologisch äquivalenten Expositionen darstellen, und es wurde keine Dosis-Wirkungs- oder formale Arzneimittelinteraktionsanalyse durchgeführt. Zur Definition einer erfolgreichen Modellinduktion auf Ebene des einzelnen Tieres wurde keine vorab festgelegte numerische oder laborchemische Schwelle verwendet. Am Studienende wurde der erfolgreiche Nachweis einer Nierenschädigung durch die charakteristischen histopathologischen Veränderungen in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe gestützt. Am Tag 8 wurden alle Tiere außer denen der Kontrollgruppe unmittelbar vor der Induktion einer kontrastmittelinduzierten akuten Nierenschädigung einer einmaligen 16-stündigen Wasserverweigerung unterzogen. Die Wasserverweigerung wurde während des restlichen experimentellen Zeitraums nicht wiederholt. Standardisierte Pellet-Nahrung blieb während der gesamten Phase der Wasserverweigerung ad libitum verfügbar. Unmittelbar nach Abschluss der 16-stündigen Wasserverweigerung wurde in allen wasserverweigerten Versuchsgruppen gleichzeitig und ad libitum wieder Zugang zu Leitungswasser gewährt, bevor die erste modellinduzierende Substanz, L-NAME, verabreicht wurde; dieser Zugang blieb für den Rest des experimentellen Zeitraums bestehen. Die Zeitpunkte und Bedingungen der Wiederherstellung des Wasserverbrauchs waren in allen wasserverweigerten Gruppen identisch. Der Wasserkonsum nach Wiederherstellung war nicht auf ein vordefiniertes Volumen beschränkt und wurde nicht quantitativ erfasst. Paarweise Körpergewichte unmittelbar vor und nach der 16-stündigen Wasserverweigerung wurden nicht erhoben; daher konnte der dehydrationsbedingte prozentuale Körpergewichtsverlust nicht berechnet werden. Die Harnproduktion wurde nicht quantitativ überwacht. Nach Wiederherstellung des Wasserverbrauchs wurde die Induktion von CI-AKI eingeleitet. Alle sequenziellen intravenösen Applikationen von L-NAME, Indomethacin und Iohexol erfolgten über eine seitliche Schwanzvene mittels einer 26-G-Nadel, die an eine sterile 5-mL-Spritze angeschlossen war. Vor der intravenösen Verabreichung wurde der Schwanz mehrere Minuten lang in Wasser erwärmt, um die Visualisierung und Dilatation der seitlichen Schwanzvenen zu erleichtern. Nach jeder intravenösen Applikation wurde die Vene zusätzlich zum berechneten Applikationsvolumen des jeweiligen modellinduzierenden Wirkstoffs mit 0,5 mL steriler 0,9%iger Kochsalzlösung gespült , um die Durchgängigkeit zu gewährleisten. Die Injektionsstelle wurde während der Applikation und Spülung visuell auf Schwellung, Austritt oder Hinweise auf Extravasation überwacht. Zunächst wurde L-NAME (10 mg/kg) verabreicht. Fünfzehn Minuten nach der Gabe von L-NAME wurde Indomethacin (10 mg/kg) intravenös über dieselbe seitliche Schwanzvene appliziert. Fünfzehn Minuten nach der Indomethacingabe wurde Iohexol intravenös über dieselbe seitliche Schwanzvene in einer Dosis von 3 g Jod/kg verabreicht. Für jedes Tier wurde die Iohexol-Dosis und das entsprechende Injektionsvolumen individuell basierend auf dem Körpergewicht zum Studienbeginn und der kommerziellen Jodkonzentration von 300 mg Jod/mL berechnet. Dies entsprach einem Applikationsvolumen von 10 mL/kg und damit etwa 2,0–2,2 mL für Ratten mit einem Gewicht von 200–220 g. Es war kein separater, protokolldefinierter maximaler zulässiger intravenöser Volumenbetrag vorgegeben; die größte Einzelapplikation in dieser Studie war Iohexol mit 10 mL/kg. Iohexol wurde langsam über etwa 1–2 Minuten verabreicht. Der erfolgreiche intravenöse Versuch wurde durch das Fehlen sichtbarer Schwellung, Austritt oder Extravasation an der Injektionsstelle bestätigt. Es wurde keine partielle Extravasation beobachtet, und keine Injektion musste aufgrund vermuteter Extravasation wiederholt oder neu dosiert werden. Eine Stunde nach Abschluss der Iohexolapplikation wurden die vorgesehenen Behandlungen erstmals den Behandlungsgruppen verabreicht. Da die Iohexolapplikation 30 Minuten nach der L-NAME-Gabe begann und innerhalb von etwa 1–2 Minuten abgeschlossen war, erfolgte der Behandlungsbeginn etwa 91–92 Minuten (ca. 1,5 h) nach der L-NAME-Gabe. Montelukast-Natrium (10 mg/kg) wurde per orale Gavage verabreicht, während NAC (100 mg/kg) intraperitoneal appliziert wurde.

Die orale Gavage wurde unter Verwendung einer 22-G-Lochstahl-Fütterungskanüle durchgeführt. Jedes Tier wurde in aufrechter Position gehalten, und die Fütterungskanüle wurde vorsichtig durch die Speiseröhre in den Magen vorgeschoben. Bei starkem Widerstand wurde die Kanüle zurückgezogen und erneut positioniert, bevor die Applikation erfolgte. Das Tier wurde während und unmittelbar nach der Gavage auf Regurgitation überwacht. Bei keinem Tier wurde Regurgitation oder ein anderer Hinweis auf unvollständige orale Applikation während oder unmittelbar nach der Gavage beobachtet, und kein Tier wurde aufgrund vermuteter erfolgloser oraler Verabreichung ausgeschlossen. Intraperitoneale Injektionen wurden in das rechte untere Quadrant des Abdomens verabreicht. Die Nadel wurde in einem Winkel von etwa 30°–45° eingeführt, und vor der Applikation wurde eine Aspiration durchgeführt, um einen versehentlichen vaskulären Einstich auszuschließen. Der Injektionsort wurde während und unmittelbar nach der Applikation visuell auf Austreten, Blutung oder andere sichtbare Komplikationen überwacht. Die vorgesehenen Behandlungen wurden einmal täglich zur gleichen Zeit an den Tagen 8, 9 und 10 verabreicht. Entsprechend erhielten die Tiere in der Gruppe CI-AKI + Montelukast einmal täglich Montelukast über drei aufeinanderfolgende Tage, die Tiere in der Gruppe CI-AKI + NAC erhielten einmal täglich NAC über drei aufeinanderfolgende Tage, und die Tiere in der Gruppe CI-AKI + Montelukast + NAC erhielten einmal täglich sowohl Montelukast als auch NAC gemäß dem gleichen dreitägigen Behandlungsplan. Alle Applikationen zur Modellinduktion und Behandlung wurden von derselben Untersucherin durchgeführt. Das Körpergewicht wurde für jedes Tier einmalig zu Studienbeginn gemessen und während des experimentellen Zeitraums nicht erneut bestimmt. Für jedes Tier wurden Dosis und entsprechendes Applikationsvolumen aller modellinduzierenden Substanzen und Studienbehandlungen individuell anhand des zu Studienbeginn erfassten Körpergewichts berechnet. Alle intravenösen, intraperitonealen und oralen Gavage-Verfahren wurden mit derselben standardisierten Technik durchgeführt, um applikationsbedingte Variabilität zu minimieren.

Tötungsverfahren, humane Endpunkte und Probennahme

Die Tiere wurden während des gesamten Experiments einmal täglich auf Veränderungen ihres Allgemeinzustands, ihres Futter- und Wasserverbrauchs, ihrer Beweglichkeit, Körperhaltung, Fellzustands sowie auf Anzeichen von Belastung beobachtet. Zu den vorausschauend festgelegten humanen Endpunkten gehörten deutliche Lethargie, Unfähigkeit, verfügbares Futter oder Wasser zu erreichen oder aufzunehmen, abnormale Körperhaltung, verminderte Beweglichkeit, anhaltende Sträubung des Fells sowie jegliche andere offensichtliche Manifestation von Belastung. Tiere, die auch nur einen dieser Kriterien erfüllten, sollten unverzüglich euthanasiert werden; im Verlauf der Studie erfüllte jedoch kein Tier die Kriterien für humane Endpunkte. Am Tag 11, 24 Stunden nach der letzten Behandlung, wurde durch intraperitoneale Gabe von Ketamin (80 mg/kg) zusammen mit Xylazin (10 mg/kg) eine tiefe Narkose induziert. Das Fehlen der pflanzlichen Rückzugsreaktion diente zur Überprüfung einer ausreichenden Narkosetiefe. Nach Bestätigung einer ausreichenden Narkosetiefe wurden von jedem Tier etwa 3–5 mL Blut durch intrakardiale Punktion entnommen. Die Euthanasie wurde anschließend durch Ausbluten vollzogen, während das Tier weiterhin unter tiefer Narkose stand. Das Fehlen sowohl der Herzaktivität als auch der spontanen Atmung wurde zur Bestätigung des Todes verwendet.

Das für biochemische Serumuntersuchungen gesammelte Blut wurde in rohrförmige Behältnisse ohne Antikoagulans gegeben und stehengelassen, bis die Blutgerinnung vollständig war. Die Röhrchen wurden anschließend bei 4 °C 10–15 Minuten lang mit 3.000 × g zentrifugiert, wonach die Serumfraktion abgetrennt und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert wurde. Proben, die für die Glutathionbestimmung vorgesehen waren, wurden separat in Röhrchen mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gesammelt. Da diese Proben antikoaguliert waren, erfolgte ihre Verarbeitung ohne vorherige Gerinnungsphase gemäß dem entsprechenden Verfahren für den Glutathion-Test. Die Abtrennung des Serums galt als akzeptabel, wenn das gewonnene Serum klar war und keine sichtbaren Anzeichen einer Hämolyse aufwies.

Nach Bestätigung des Todes wurde eine mediale Laparotomie durchgeführt und beide Nieren vorsichtig von jedem Tier entfernt. Umgebendes Fett- und Bindegewebe wurde von den Proben abgetrennt. Die rechte Niere wurde ausschließlich für die histopathologische Untersuchung zurückbehalten, während die linke Niere für die biochemische Analyse verwendet wurde. Das gemischte Gewebe der linken Niere wurde analysiert, ohne dass die Nierenrinde und das Nierenmark separat präpariert wurden. Die beiden Nieren wurden unabhängig voneinander behandelt, und Proben verschiedener Tiere blieben während der gesamten Aufarbeitung getrennt, ohne Zusammenführung. Die gesamte rechte Niere wurde in 10 % neutral gepuffertem Formaldehyd fixiert und für die histopathologische Beurteilung aufgearbeitet. Schnitte, die die Nierenrinde und das äußere Mark umfassten, wurden hergestellt und gemäß den in der histopathologischen Aufarbeitung und Bewertung beschriebenen Verfahren untersucht. Jede linke Niere wurde einzeln gekennzeichnet und bis zur Homogenisierung und biochemischen Analyse bei -80 °C gelagert. Nach der Entnahme wurde die makroskopische Gewebestruktur überprüft, und eine ausreichende Menge an Gewebe wurde für die geplanten histopathologischen und biochemischen Untersuchungen beibehalten.

Der für die Modellinduktion und die Verabreichung der Behandlung zuständige Untersucher konnte nicht verblindet werden, da die experimentellen Gruppen unterschiedliche Verfahren durchliefen. Die Gruppenzugehörigkeiten wurden jedoch den Untersuchern, die die biochemischen und statistischen Analysen durchführten, sowie dem Pathologen, der die histopathologischen Beurteilungen vornahm, nicht bekanntgegeben. Alle eingeschlossenen Tiere blieben in der Studie und wurden in die nachfolgenden Analysen einbezogen. Biologische Proben, Tiergewebe, fixierende Mittel auf Basis von Formaldehyd und andere chemische Abfälle wurden unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung behandelt. Die Entsorgung aller biologischen und chemischen Abfälle erfolgte gemäß den Anforderungen der institutionellen Biosicherheit und der Gefahrgutentsorgung.

Biochemische Analysen

Biochemische Messungen wurden unter Verwendung von Serum, EDTA-antikoaguliertem Blut und Homogenaten aus linkem Nierengewebe durchgeführt, die von jedem Tier gesammelt wurden. Die Verfahren werden unten entsprechend der biologischen Matrix dargestellt, die für jeden Parameter verwendet wurde. Im Serum wurden Harnstoff, Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN), Kreatinin, Superoxiddismutase (SOD) und Malondialdehyd (MDA) analysiert. Harnstoff, BUN und Kreatinin dienten als Parameter der Nierenfunktion, während die SOD-Aktivität und die MDA-Konzentration als Indikatoren für oxidativen Stress bewertet wurden. Die Harnstoff- und BUN-Werte im Serum wurden mittels desselben enzymatischen Urease–Glutamat-Dehydrogenase-Assays ermittelt. Bei dieser Methode wurde Harnstoff durch Urease zu Ammoniak hydrolysiert, das anschließend mit 2-Oxoglutarat und reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) in Gegenwart von Glutamat-Dehydrogenase reagierte. Die verwendete analytische Methode war ein kinetisches enzymatisches Urease–Glutamat-Dehydrogenase-Assay. Der Rückgang der Extinktion infolge des NADH-Verbrauchs wurde kinetisch mittels eines Spektralphotometers gemessen. Die Kreatinin-Konzentration im Serum wurde farbenmetrisch unter Verwendung eines automatisierten biochemischen Analysegeräts bestimmt. Die SOD-Aktivität im Serum wurde farbenmetrisch mit einem kommerziell erhältlichen Assay-Kit auf demselben automatisierten biochemischen Analysegerät gemessen. Der SOD-Assay basierte auf der Erzeugung von Superoxid-Radikalen durch das Xanthin–Xanthin-Oxidase-System und deren Reaktion mit 2-(4-Iodphenyl)-3-(4-Nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid zur Bildung eines gefärbten Formazan-Produkts. Die Endpunkt-Extinktion wurde bei 505 nm gemessen und die SOD-Aktivität in U/mL angegeben. Die MDA-Konzentration im Serum wurde farbenmetrisch mittels der Thiobarbitursäure-Reaktion bestimmt. Serumproben wurden mit kalter Trichloressigsäure versetzt, um Proteine auszufällen, und der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Dieser Zentrifugationsschritt wurde bei 7.500 × g für 5 min bei 4 °C durchgeführt. Der Überstand wurde mit Thiobarbitursäure bei 90 °C für 60 min umgesetzt, abgekühlt und bei 532 nm gemessen. Die MDA-Konzentrationen wurden aus der entsprechenden Kalibrierkurve berechnet und in nmol/mL angegeben. Die Glutathion (GSH)-Analyse wurde mit EDTA-antikoaguliertem Blut durchgeführt. Proteine wurden mit Trichloressigsäure ausgefällt, und die resultierenden enteiweißten Proben wurden farbenmetrisch nach einer modifizierten Ellman-Methode analysiert. Die Proben wurden mit 5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) in 500 mM Tris-Puffer bei pH 8,2 versetzt. Die Reaktion der Thiolgruppen von GSH mit DTNB erzeugte ein gefärbtes Produkt, und die Extinktion wurde bei 412 nm erfasst. Die Katalase (CAT)-Aktivität wurde mittels eines zweistufigen farbenmetrischen Verfahrens bestimmt. Die Proben wurden zunächst mit einer definierten Menge Wasserstoffperoxid inkubiert, das von Katalase in Wasser und molekularen Sauerstoff umgewandelt wurde. Nach Beendigung der enzymatischen Reaktion wurde das verbleibende Wasserstoffperoxid mittels eines chromogenen Reagenzials gemessen. Die Extinktion wurde bei 405 nm erfasst und die CAT-Aktivität in U/mL angegeben. Für die Nierengewebemessungen wurde die linke Niere jedes Tieres als gemischtes Gewebe verwendet, ohne dass Kortex und Mark getrennt wurden. Wie im Verfahren angegeben, wurde die rechte Niere ausschließlich für die histopathologische Beurteilung aufbewahrt. Proben einzelner Tiere wurden unabhängig verarbeitet und zu keinem Zeitpunkt gepoolt. Jedes linke Nierengewebe wurde auf Eis in 50 mM Phosphatpuffer bei pH 7,4 homogenisiert, wobei ein Gewebe-zu-Puffer-Verhältnis von 1:10 (w/v) verwendet wurde. Für jede Ratte wurde ein tiereigenes Nierengewebe-Homogenat hergestellt. Separate Aliquote dieses Homogenats wurden für die verschiedenen Nierengewebemessungen verwendet, um sicherzustellen, dass alle Parameter aus demselben individuellen Tier stammten. Die resultierenden Nierengewebe-Homogenate wurden bei 14.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand von jedem Tier separat gesammelt und in Aliquote für die geplanten Nierengewebeanalysen aufgeteilt. Die Konzentrationen von Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α), Interleukin-1-beta (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6), Cystatin C und KIM-1 in den Nierengewebe-Überständen wurden mittels ratten-spezifischer ELISA-Kits (enzyme-linked immunosorbent assay) gemessen. Die Assays wurden gemäß den Herstellerprotokollen durchgeführt. Die Inkubationsbedingungen waren für die TNF-α-, IL-1β-, IL-6-, Cystatin C- und KIM-1-ELISAs identisch. Bei jedem Assay wurden die Proben und ELISA-Reagenzien 1 h bei 37 °C inkubiert; nach fünf Waschzyklen wurden die Substratlösungen A und B hinzugefügt und 10 min bei 37 °C inkubiert. Kurz gesagt, wurden Standardproben und Nierengewebe-Überstände in die mit Antikörper beschichteten Vertiefungen gegeben, gefolgt von dem entsprechenden biotinylierten Detektionsantikörper und dem Streptavidin–Peroxidase-Konjugat. Nach den vorgegebenen Inkubationsschritten wurden ungebundene Komponenten mittels eines automatisierten Mikroplatten-Washers entfernt. Anschließend wurde die Substratlösung zugegeben, und die Farbreaktion wurde mit der sauren Stopplösung beendet. Die Extinktion wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, und die Analytkonzentrationen wurden aus den entsprechenden Standardkurven berechnet. Die ELISA-Messungen im Nierengewebe wurden im Duplikat durchgeführt. Für jeden Analyten wurde der Mittelwert der beiden technischen Wiederholungen berechnet, um einen einzelnen, tierniveau-basierten Wert zu erhalten. Technische Wiederholungen und separate Aliquote aus demselben tiereigenen Homogenat wurden nicht als unabhängige Beobachtungen betrachtet. Alle biochemischen Messungen wurden unter standardisierten, assayspezifischen Bedingungen durchgeführt. Serum-, EDTA-antikoagulierte Blut- und Nierengewebeproben wurden entsprechend den Anforderungen der jeweiligen analytischen Methoden separat verarbeitet. Die Untersucher, die die biochemischen Analysen durchführten, waren bezüglich der Gruppenzuordnung verblindet. Als experimentelle Einheit galt das einzelne Tier und nicht jede Serumprobe, Blutprobe, Nierenprobe, Homogenat-Aliquot oder technische Wiederholung. Entsprechend wurden für jede experimentelle Gruppe sechs unabhängige, tierniveau-basierte Beobachtungen in die statistische Analyse eingeschlossen.

Histopathologische Aufarbeitung und Bewertung

Rechtsnierenproben wurden zur mikroskopischen Untersuchung mittels routinemäßiger histologischer Aufarbeitung vorbereitet. Die gesamte rechte Niere jedes Tieres wurde 72 h bei Raumtemperatur in 10 % neutralgepufferter Formaldehydlösung fixiert. Anschließend erfolgte die Dehydrierung des Gewebes nacheinander in 50 %, 70 %, 80 %, 96 % und 100 % Ethanol, wobei jede Konzentration 1 h lang angewendet wurde. Danach wurden die Proben jeweils 30 min lang zwei Xylolbädern ausgesetzt, bevor eine Paraffineinbettung vorgenommen wurde. Mithilfe eines Rotationsmikrotoms wurden 5 µm dicke Schnitte, die sowohl die Nierenrinde als auch das äußere Mark enthielten, aus den Paraffinblöcken gewonnen.

Für die Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung wurden die Schnitte deparaffinisiert und rehydriert, anschließend 5 min lang Hämatoxylin ausgesetzt und danach 5 min lang unter fließendem Leitungswasser gewaschen. Zur Differenzierung wurde saurer Alkohol verwendet, danach wurden die Schnitte 1 min lang in ammoniakalkalisiertem Wasser blau gemacht und anschließend 2 min lang mit Eosin kontragefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden danach in aufsteigenden Alkoholkonzentrationen dehydriert, mit Xylol geklärt und dauerhaft unter Deckgläsern eingebettet.

Für die Masson-Färbung vorgesehenen Schnitte wurden ebenso entparaffiniert und rehydriert. Die Mordanzbehandlung erfolgte 60 min bei 56 °C, gefolgt von einer Spülung unter fließendem Leitungswasser für 10 min. Anschließend wurden die Schnitte nacheinander 10 min mit Weigert-Eisenhämakalin, 15 min mit Biebrich-Scarlet–Säurefuchsin-Lösung, 10 min mit Phosphorwolframsäure-Lösung und 10 min mit Anilinblau-Lösung behandelt. Nach einer Behandlung in 1 %iger Essigsäure für 5 min wurden die Schnitte dehydriert, in Xylol geklärt und mit Deckgläsern eingebettet.

Vor der mikroskopischen Beurteilung wurde die Angemessenheit der Färbung für jede Methode separat überprüft. HE-gefärbte Schnitte galten als geeignet, wenn die Kerndetails und der zytoplasmatische Kontrast deutlich erkennbar waren, während Massons-trichrom-gefärbte Schnitte akzeptiert wurden, wenn die Bindegewebsstrukturen klar visualisiert werden konnten. Für jedes Tier wurden drei HE-gefärbte und drei Massons-trichrom-gefärbte Schnitte untersucht. In jedem Schnitt wurden fünf zufällig ausgewählte mikroskopische Felder mit einem 40×-Objektiv bewertet. Demnach wurden pro Tier 15 mikroskopische Felder pro Färbemethode untersucht. Alle mikroskopischen Untersuchungen wurden mit demselben Objektiv und unter standardisierten Bewertungsbedingungen für alle Tiere und experimentellen Gruppen durchgeführt. Massons-trichrom-gefärbte Schnitte wurden qualitativ hinsichtlich der Verteilung und Ablagerung von interstitiellem Kollagen, der Akkumulation der extrazellulären Matrix sowie der tubulointerstitiellen Architektur beurteilt. Diese Schnitte dienten nicht zur Erstellung der semiquantitativen histopathologischen Schädigungsscores von 0–3. Repräsentative HE- und Massons-trichrom-gefärbte Photomikrogramme wurden mit einem 40×-Objektiv aufgenommen, wobei in jedes repräsentative Bild ein Maßstabsbalken von 100 µm eingefügt wurde. Diese Photomikrogramme dienten lediglich illustrativen Zwecken und wurden nicht als unabhängige Beobachtungen in die histopathologische Bewertung oder statistische Analysen einbezogen. Alle histopathologischen Beurteilungen wurden von einem erfahrenen Pathologen durchgeführt, der über die Zugehörigkeit zu den experimentellen Gruppen im Unklaren blieb. Die Verwendung eines einzelnen, verblindeten Untersuchers diente der Minimierung von Bewertungsfehlern und der Reduzierung von Variabilität aufgrund von Unterschieden zwischen Beobachtern. Tubuläre Nekrose, tubuläre Dilatation, zelluläre Degeneration und vaskuläre Kongestion wurden semiquantitativ an HE-gefärbten Nierenschnitten anhand eines Systems bewertet, das auf zuvor publizierten Nierenschädigungsmodellen basiert28,29. Für jeden Parameter reichten die Scores von 0 bis 3 und entsprachen jeweils keiner, leichter, mittelschwerer und schwerer histopathologischer Schädigung. Für jedes Tier wurden die Befunde aus den fünf mikroskopischen Feldern jedes der drei HE-gefärbten Schnitte – insgesamt 15 Felder – zusammenfassend zur Vergabe eines einzelnen 0–3-Scores für jeden histopathologischen Parameter herangezogen. Somit trug jedes Tier einen Score für tubuläre Nekrose, tubuläre Dilatation, zelluläre Degeneration und vaskuläre Kongestion bei. Histologische Schnitte und mikroskopische Felder wurden als innerhalb eines Tieres liegende Teilproben betrachtet und nicht als unabhängige Beobachtungen gewertet. In jedem Schnitt wurden die mikroskopischen Felder zufällig aus vergleichbaren Bereichen der Nierenrinde und des äußeren Markbereichs ausgewählt, um die anatomische Stichprobenziehung zwischen den Tieren und experimentellen Gruppen zu standardisieren. Als experimentelle Einheit galt das einzelne Tier, nicht die einzelne Niere, der histologische Schnitt oder das mikroskopische Feld. Entsprechend wurden sechs unabhängige tierbezogene Beobachtungen in die statistische Analyse für jede experimentelle Gruppe einbezogen. Die in Tabelle 3 dargestellten Werte repräsentieren die Gruppenmittelwerte, die aus den tierbezogenen Scores der sechs Tiere jeder experimentellen Gruppe berechnet wurden.

Statistische Analyse

Die statistischen Analysen wurden mit statistischer Analyse-Software durchgeführt. Das einzelne Tier galt als experimentelle Einheit für alle statistischen Analysen. Jede experimentelle Gruppe umfasste sechs unabhängige Tiere (n = 6 pro Gruppe). Technische Replikate, Assay-Vertiefungen, Gewebeschnitte und mikroskopische Aufsuchfelder wurden nicht als unabhängige Beobachtungen betrachtet und nicht zur Erhöhung des statistischen Stichprobenumfangs herangezogen. Stetige Variablen werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die Normalverteilung wurde innerhalb jeder experimentellen Gruppe separat mittels des Shapiro-Wilk-Tests überprüft, die Varianzhomogenität wurde mit dem Levene-Test bewertet. Aufgrund des vollständig balancierten Versuchsdesigns mit gleichen Stichprobengrößen in allen Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) zur Gruppenvergleichung verwendet. Paarweise Vergleiche erfolgten mittels des post-hoc-Duncan-Mehrfachvergleichstests. Mögliche Ausreißer wurden durch grafische Überprüfung von Boxplots und Untersuchung einzelner Beobachtungen identifiziert. Keine Beobachtung wurde als Messfehler oder ungültiges Versuchsergebnis angesehen, und kein Datenpunkt wurde aus statistischen Gründen ausgeschlossen. Ein p-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Serummarker für die Nierenfunktion (Harnstoff, Blutharnstoffstickstoff und Kreatinin)

Das experimentelle Design, die Tiergruppierung, der Behandlungszeitplan und der Zeitrahmen für die Probensammlung der vorliegenden Studie sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Unter den Gruppen wurden statistisch signifikante Unterschiede bei den Konzentrationen von Harnstoff, BUN und Kreatinin im Serum beobachtet (p = 0,003, p

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Diskussion

Diese experimentelle Studie zu CI-AKI untersuchte die Wirkung einer postkontrastmittelauslösenden Behandlung mit Montelukast, NAC oder deren Kombination hinsichtlich der Nierenfunktion, Parameter des oxidativen Stresses, entzündlichen Reaktionen, Biomarker der Nierenschädigung sowie histopathologischer Ergebnisse. Die Kontrastmittelgabe führte zu erheblichen Anstiegen von Harnstoff, BUN und Kreatinin im Serum und ging mit nachteiligen Veränderungen der Parameter des oxidativen Stresses sowie entzündlicher Biomarker einhe...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben. Während der Erstellung dieses Manuskripts wurden KI-gestützte Werkzeuge ausschließlich zur Sprachbearbeitung und Grammatikkorrektur verwendet. Für die Erzeugung, Analyse oder Interpretation von Daten sowie für die Erstellung von Abbildungen, Tabellen oder grafischen Elementen kamen keine Künstliche-Intelligenz-Werkzeuge zum Einsatz. Die Autoren übernehmen die volle Verantwortung für den Inhalt des Manuskripts.

BEITRAG DER AUTOREN:

YS, CS und OK trugen zur Konzeption und Durchführung der Studie bei. YS führte die experimentellen Arbeiten und die Datensammlung durch. OK führte die histopathologischen Untersuchungen durch. YS und CS führten die statistischen Analysen durch und interpretierten die Daten. YS verfasste den Manuskriptentwurf. Alle Autoren überarbeiteten den Manuskriptentwurf kritisch und genehmigten die endgültige Version.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der Koordinierungseinheit für wissenschaftliche Forschungsprojekte der Universität Kırşehir Ahi Evran unterstützt (Projekt-Nr.: TIP.A3.26.006).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
 Automatischer Streifen-WascherBio-Tek Instruments, USAELx50Automatisierte ELISA-Plattenwäsche.
 MikroplattenreaderBio-Tek Instruments, USAELx800ELISA-Absorptionsmessungen.
RRID:SCR_028651
10 % neutral gepuffertes FormalinMerckNicht erfasstGewebefixierung für die histopathologische Untersuchung.
Benchtop-ZentrifugeNüveNF048Probenvorbereitung und Zentrifugation.
Carboxymethylcellulose (CMC)Sigma-Aldrich, USAC5678Fahrzeug zur Suspension von Montelukast.
CAT-Kit UniversalOtto ScientificOtto3051Farbmessung der CAT-Aktivität im Serum mittels eines Mindray-BS-400-Chemieanalysators.
Digitaler HomogenisatorDaihan ScientificHG-15DGewebshomogenisierung.
Eosin Y (gelblich)Merck1.15935.0025HE-Färbung.
Harris-HämatoxylinslösungBSLABBS-002HE-Färbung.
IndomethacinSigma-Aldrich, USAI7378Zur Induktion von CI-AKI verwendet.
Iohexol (Omnipaque 300)GE HealthCareNicht erfasstKontrastmittel zur Induktion von CI-AKI.
Ketaminhydrochlorid (Ketalar)Pfizer, USANicht erfasstAllgemeine Anästhesie vor der Probenentnahme.
Lichtmikroskop (Nikon Eclipse)NikonNi-UHistopathologische Untersuchung und Bildgebung.
RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginin-Methylester)Sigma-Aldrich, USAN5751Zur Induktion von CI-AKI verwendet.
Massons-Trichrom-FärbekitMOSLAB, TürkeiBKMTO001Masson-Trichrom-Färbung.
Mindray-ChemieanalysatorMindrayBS-400Biochemische Analysen.
Montelukast-NatriumSigma-Aldrich, USASML0101Oral per Gavage als Behandlung verabreicht.
N-Acetylcystein (ASIST 300 mg/2 mL)MAC figure-materials-1laç, TürkeiNicht erfasstIntraperitoneal als Behandlung verabreicht.
Ratten-Cystatin-C-ELISA-KitBT Lab, ChinaE0145RaELISA-Messung von Cystatin C in Nierengewebesupernatanten.
Ratten-IL-1β-ELISA-KitBT Lab, ChinaE0119RaELISA-Messung von IL-1β in Nierengewebesupernatanten.
Ratten-IL-6-ELISA-KitBT Lab, ChinaE0135RaELISA-Messung von IL-6 in Nierengewebesupernatanten.
Ratten-KIM-1-ELISA-KitBT Lab, ChinaE0549RaELISA-Messung von KIM-1 in Nierengewebesupernatanten.
Ratten-TNF-α-ELISA-KitBT Lab, ChinaE0764RaELISA-Messung von TNF-α in Nierengewebesupernatanten.
Edelstahlfütterungsnadel (22 G orale Gavage-Kanüle)Instech Laboratories, USANicht erfasstVerabreichung per oraler Gavage.
Standardisierte pelletierte Nagetierkost (Optima)Optima, TürkeiNicht erfasstChargennummer 58931. Nährstoffzusammensetzung: 24 % Rohprotein, 3,94 % Rohcellulose, 5,08 % Rohfett, 8,8 % Rohasche, 1,44 % Lysin, 0,61 % Methionin, 1,14 % Calcium, 0,89 % Phosphor und 0,28 % Natrium.
Universal-Creatinin-KitOtto ScientificOttoBC139Farbmessung von Kreatinin im Serum.
Universal-GSH-KitOtto ScientificOtto3053Farbmessung von GSH in EDTA-antikoaguliertem Blut mittels einer modifizierten Ellman-Methode.
Universal-MDA-KitOtto ScientificOtto1001Farbmessung von MDA im Serum mittels eines ELx800-Mikroplattenreaders.
Universal-SOD-KitOtto ScientificOtto3047Farbmessung der SOD-Aktivität im Serum mittels eines Mindray-BS-400-Chemieanalysators.
Universal-Harnstoff-KitOtto ScientificOttoBC157Farbmessung von Harnstoff und BUN im Serum.
Xylazinhydrochlorid (Rompun)Bayer, DeutschlandNicht erfasstAllgemeine Anästhesie vor der Probenentnahme.

Referenzen

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