Nephroprotektive Effekte einer Behandlung mit N-Acetylcystein und Montelukast nach Kontrastmittelgabe in einem Rattenmodell für kontrastmittelinduzierte akute Nierenschädigung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein Rattenmodell einer kontrastmittelinduzierten akuten Nierenschädigung vor und bewertet die Gabe von N-Acetylcystein und Montelukast nach der Kontrastmittelapplikation, einzeln und in Kombination. Die Behandlungsregime waren mit einer weniger schweren Nierenfunktionsstörung, oxidativem Stress, Entzündung und histopathologischer Schädigung assoziiert, obwohl die kombinierte Behandlung die Monotherapie nicht durchgängig übertraf.

Zusammenfassung

Die kontrastmittelinduzierte akute Nierenschädigung (CI-AKI) ist eine wichtige Komplikation nach Exposition gegenüber jodhaltigen Kontrastmitteln, bei der oxidativer Stress und entzündliche Prozesse zur Nierenschädigung beitragen. Diese Studie etablierte ein experimentelles Rattenmodell der CI-AKI und untersuchte die Wirkungen einer Behandlung, die nach der Gabe des Kontrastmittels mit N-Acetylcystein (NAC), Montelukast oder einer Kombination beider Substanzen begonnen wurde. Adulte männliche Wistar-Ratten wurden wasserentzogen und erhielten anschließend eine sequenzielle intravenöse Gabe von Nω-Nitro-L-Arginin-Methylester (L-NAME), Indomethacin und Iohexol. Die Behandlung wurde 1 h nach Abschluss der Iohexol-Gabe, etwa 1,5 h nach der Gabe von L-NAME, begonnen und an drei aufeinanderfolgenden Tagen täglich fortgesetzt. Es wurden Parameter der Nierenfunktion, des oxidativen Stresses, entzündliche Zytokine, Biomarker der Nierenschädigung sowie die Nierenhistopathologie evaluiert. Die unbehandelte CI-AKI-Gruppe zeigte eine ausgeprägte Nierenfunktionsstörung, ein ungünstiges Profil hinsichtlich oxidativen Stresses und Entzündung sowie erhebliche histopathologische Schäden. Im Vergleich zur unbehandelten CI-AKI-Gruppe zeigten Tiere, die NAC, Montelukast oder die Kombinationsbehandlung erhielten, im Allgemeinen verbesserte biochemische und histopathologische Befunde. Die Glutathion (GSH)-Spiegel waren in der Kombinationsgruppe am höchsten, und die mittleren histopathologischen Schädigungswerte waren numerisch am niedrigsten; die kombinierte Behandlung übertraf die Monotherapien jedoch bei den untersuchten Endpunkten nicht durchgängig. Dieses Protokoll bietet einen kontrollierten präklinischen Rahmen zur Bewertung von Interventionen nach Kontrastmittelgabe bei CI-AKI, und die Ergebnisse rechtfertigen weitere experimentelle Untersuchungen zu NAC und Montelukast, ohne klinische Wirksamkeit oder einen Vorteil der Kombinationstherapie zu belegen.

Einleitung

Akute Nierenschädigung (AKI) erschwert häufig den Krankheitsverlauf stationär behandelte Patienten und trägt zu einer erhöhten Morbidität, Mortalität und Inanspruchnahme von Gesundheitsressourcen bei. Da jodierte Kontrastmittel routinemäßig in der diagnostischen Bildgebung und bei interventionellen Verfahren eingesetzt werden, hat sich die Verschlechterung der Nierenfunktion nach Exposition gegenüber Kontrastmitteln zu einem wichtigen klinischen Problem entwickelt. Die aktuelle Nomenklatur unterscheidet zwischen kontrastassoziiierter akuter Nierenschädigung (CA-AKI), die jeden AKI-Fall nach Gabe eines Kontrastmittels umfasst, und kontrastinduzierter akuter Nierenschädigung (CI-AKI), bei der die Nierenschädigung kausal auf das Kontrastmittel zurückgeführt wird. In kontrollierten experimentellen Modellen, bei denen die Exposition gegenüber Kontrastmitteln direkt mit Nierenschäden verknüpft werden kann, wird daher weiterhin weithin der Begriff CI-AKI verwendet^1,2.

Patienten mit chronischer Nierenerkrankung, Diabetes mellitus, fortgeschrittenem Alter, Herzinsuffizienz oder anderen kardiovaskulären Komorbiditäten sind besonders anfällig für CI-AKI. Bei vielen betroffenen Patienten erholt sich die Nierenfunktion; jedoch können bei schwereren Fällen eine persistierende Nierenfunktionsstörung, die Notwendigkeit einer Nierenersatztherapie sowie ein erhöhtes Todesrisiko auftreten. CI-AKI ist außerdem mit einer längeren Krankenhausbehandlung und einem stärkeren Einsatz von Gesundheitsressourcen verbunden. Diese negativen Folgen unterstreichen die fortbestehende Notwendigkeit, wirksame präventive und therapeutische Ansätze für kontrastmittelbedingte Nierenschäden zu entwickeln^1,3,4,5.

Die Entstehung der CI-AKI umfasst mehrere miteinander verknüpfte Prozesse, darunter veränderte Nierendurchblutung, Sauerstoffmangel im Markbereich, oxidativen Stress, Entzündungen und direkte tubuläre Toxizität. Die Exposition gegenüber Kontrastmitteln verschiebt den intrarenalen Gefäßtonus in Richtung Vasokonstriktion und schwächt gleichzeitig vasodilatatorische Reaktionen, wodurch die Nierendurchblutung abnimmt. Das äußere Mark ist besonders anfällig, da die Sauerstoffverfügbarkeit in diesem Bereich unter physiologischen Bedingungen bereits eingeschränkt ist. Ein weiterer Rückgang der Sauerstoffzufuhr nach der Gabe von Kontrastmittel kann daher eine hypoxische Tubulusschädigung auslösen^2,6,7.

Renale Hypoxie nach Kontrastmittelgabe geht mit einer erhöhten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) einher, was wesentlich zur Nierenschädigung beiträgt. Wenn die Produktion von ROS die körpereigene antioxidative Kapazität übersteigt, kann es zu oxidativem Schaden an zellulären Lipiden, Proteinen und der DNA kommen, während gleichzeitig die entzündliche Signalübertragung verstärkt wird. Sowohl in experimentellen als auch in klinischen Untersuchungen wurde die Gabe von Kontrastmitteln mit erhöhten Parametern oxidativen Stresses und einer beeinträchtigten antioxidativen Abwehr in Verbindung gebracht. Zu den molekularen Wegen, die an dieser Reaktion beteiligt sind, zählen die Bildung von Radikalen abhängig von der NADPH-Oxidase und die Aktivierung von nukleärem Faktor kappa-B (NF-κB)^1,6,8,9.

Der Beitrag der Entzündung zeigt, dass die CI-AKI nicht allein durch hämodynamische Störungen erklärt werden kann. Neuere Befunde deuten zudem auf eine Beteiligung von Ferroptose, nitrosativem Stress und neutrophilen extrazellulären Fallen bei der Nierenschädigung nach Kontrastmittelanwendung hin. Die Erkenntnis dieser zusätzlichen Mechanismen hat das Spektrum molekularer Zielstrukturen, die für die Prävention und Behandlung der CI-AKI untersucht werden, erweitert¹.

Serumkreatinin und Harnmenge werden gewöhnlich zur Identifizierung von CI-AKI verwendet, aber beide verändern sich erst, nachdem eine Nierenschädigung bereits eingetreten ist. Diese Einschränkung hat die Evaluierung früherer Indikatoren befördert, darunter das Nierenverletzungsmolekül-1 (KIM-1), das tubuläre Schäden widerspiegelt, und Cystatin C, das mit Veränderungen der glomerulären Filtration assoziiert ist. Befunde aus experimentellen und klinischen Studien deuten darauf hin, dass Veränderungen dieser Biomarker bereits in der frühen Phase von CI-AKI nachweisbar werden können und somit eine frühzeitige Beurteilung einer Nierenschädigung unterstützen^9,10,11.

Fortschritte im Verständnis der Pathophysiologie der CI-AKI haben die Evaluierung pharmakologischer Interventionen, die auf oxidative und entzündliche Signalwege abzielen, gefördert. Eine ausreichende Flüssigkeitszufuhr bleibt die wichtigste vorbeugende Maßnahme, während die berichteten Vorteile von medikamentösen Ansätzen in verschiedenen Studien unterschiedlich waren. Folglich hat bisher keine pharmakologische Behandlung eine ausreichend konsistente Wirksamkeit gezeigt, um als standardmäßige klinische Intervention bei CI-AKI empfohlen zu werden^1,4,12,13.

N-Acetylcystein (NAC) wurde umfassend als pharmakologischer Ansatz zur Begrenzung von CI-AKI untersucht. Die vorgeschlagenen nephroprotektiven Wirkungen stehen im Zusammenhang mit der Neutralisierung reaktiver Spezies und der Wiederherstellung der Glutathionreserven. Frühe klinische Hinweise ergaben sich aus einer wegweisenden Studie an Patienten mit chronischer Nierenerkrankung, bei der NAC das Auftreten kontrastmittelbedingter Nierenfunktionsstörungen verringerte¹⁴. Spätere klinische Studien und Evidenzsynthesen lieferten jedoch widersprüchliche Ergebnisse, wobei einige Studien einen Nutzen zeigten, während andere keinen relevanten klinischen Effekt nachweisen konnten. Die Wirksamkeit von NAC bei CI-AKI bleibt daher ungewiss^12,15,16,17.

Montelukast blockiert selektiv den zysteinyl-Leukotrien-Rezeptor-1 und wird seit langem zur Behandlung von Asthma und allergischen Erkrankungen eingesetzt. Experimentelle Befunde deuten außerdem darauf hin, dass dieser Wirkstoff entzündungshemmende, antioxidative und antiapoptotische Effekte entfaltet. In verschiedenen Modellen renaler Schädigungen war die Gabe von Montelukast mit einer verminderten Lipidperoxidation, einer Stärkung der endogenen antioxidativen Abwehrmechanismen, weniger schweren histopathologischen Schäden und einer Abschwächung der Nierenschädigung assoziiert^{18,19,20,21,22}.

Befunde zur spezifischen Untersuchung von Montelukast bei CI-AKI sind nach wie vor begrenzt. Verfügbare experimentelle Ergebnisse deuten darauf hin, dass seine renalen Wirkungen eine Modulation oxidativer und entzündlicher Signalwege beinhalten könnten. Eine verminderte Expression von NADPH-Oxidase 4 (NOX4), p22phox und NF-κB wurde als ein Mechanismus vorgeschlagen, durch den Montelukast die kontrastmittelbedingte Nierenschädigung abschwächen könnte⁹.

NAC und Montelukast beeinflussen teilweise unterschiedliche, aber überlappende Signalwege, die an einer Nierenschädigung beteiligt sind. NAC unterstützt hauptsächlich die antioxidative Abwehr, während Montelukast sowohl entzündungshemmende als auch antioxidative Wirkungen besitzt. Eine gleichzeitige Gabe dieser Wirkstoffe könnte daher mehrere Komponenten der Pathophysiologie der CI-AKI beeinflussen; ob jedoch ihre Wechselwirkung einen additiven oder synergistischen Nutzen bewirkt, wurde in experimentellen Modellen bisher nicht belegt^{18,19,20,21,22}.

Bisherige Untersuchungen haben überwiegend Interventionen bewertet, die vor der Kontrastmittelgabe verabreicht wurden, während die Datenlage zu Behandlungen, die nach der Exposition begonnen werden, spärlich ist. Insbesondere die Gabe von Montelukast in Kombination mit NAC nach der Kontrastmittelgabe wurde im experimentellen CI-AKI bisher wenig untersucht. Die vorliegende Studie evaluierte daher Montelukast und NAC, die nach der Kontrastmittelexposition entweder einzeln oder in Kombination verabreicht wurden, hinsichtlich der Nierenfunktion, Parameter des oxidativen Stresses und der antioxidativen Abwehr, Nierenschädigungs- und inflammatorischer Biomarker sowie histopathologischer Veränderungen in einem Rattenmodell des CI-AKI.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren an Tieren wurden gemäß den international anerkannten Richtlinien für die Haltung und Verwendung von Labor­tieren durchgeführt und entsprachen den Anforderungen von Animal Research: Reporting of In vivo Experimente (ARRIVE)-Richtlinien. Das Versuchsprotokoll wurde von dem Tierexperimentausschuss des Ahi Evran Universität Lokalen Ethikkomitees, Kırşehir, Türkei, genehmigt (Beschluss-Nr. 2, Sitzungs-Nr. 12, Datum: 12. Juni 2025). Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um tierisches Leid zu minimieren und die Anzahl der für die Studie verwendeten Tiere so gering wie möglich zu halten. Die Angaben zu allen verwendeten Reagenzien und Geräten sind aufgeführt in der Tabelle der Materialien.

Zubereitung der Chemikalien

Nω-Nitro-L-arginin-Methylester (L-NAME), Indometacin, Iohexol, Montelukast-Natrium und NAC wurden in dieser Studie verwendet. Eine 10 mg/mL-L-NAME-Lösung wurde in steriler 0,9%iger Kochsalzlösung hergestellt, wobei 1 g L-NAME pro 100 mL verwendet wurde. Die Lösung wurde am Tag der Applikation frisch hergestellt und ohne Lagerung über diesen Tag hinaus verwendet. Zur Induktion des experimentellen CI-AKI-Modells wurde L-NAME intravenös (IV) in einer Dosis von 10 mg/kg appliziert. Bei einer Ratte mit einem Gewicht von etwa 220 g betrug die berechnete Menge etwa 2,2 mg, was einem Applikationsvolumen von etwa 0,22 mL entspricht. Indometacin wurde in einer 5%igen Natriumbikarbonatlösung mit einer Konzentration von 10 mg/mL hergestellt, indem 100 mg in einem Endvolumen von 10 mL gelöst wurden. Die Zubereitung wurde geschüttelt, bis sie visuell homogen war. Der endgültige pH-Wert der hergestellten Indometacin-Lösung wurde während des Experiments nicht gemessen und konnte daher retrospektiv nicht bestimmt werden. Ein spezifisches Sterilitäts- oder Filtrationsverfahren für die hergestellte Indometacin-Lösung war in den experimentellen Aufzeichnungen nicht dokumentiert und konnte deshalb retrospektiv nicht berichtet werden. Es wurde kein formelles Stabilitätsintervall festgelegt oder überprüft; die Lösung wurde frisch hergestellt und am selben Tag verwendet. Zur Induktion des experimentellen CI-AKI-Modells wurde Indometacin intravenös in einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht. Bei einer Ratte mit einem Gewicht von etwa 220 g betrug die berechnete Menge etwa 2,2 mg, was einem Applikationsvolumen von etwa 0,22 mL entspricht.

Die kommerzielle Iohexol-Formulierung mit einem Gehalt von 647 mg Iohexol/mL und einer äquivalenten Iod-Konzentration von 300 mg/mL wurde ohne weitere Verdünnung verabreicht. Die genaue Temperatur von Iohexol zum Zeitpunkt der Injektion wurde nicht dokumentiert. Ein formel-spezifischer Osmolalitätswert konnte anhand der vorliegenden experimentellen Aufzeichnungen nicht zuverlässig überprüft werden und wird deshalb nicht angegeben. Zur Induktion des experimentellen CI-AKI-Modells wurde Iohexol intravenös mit 3 g Iod/kg appliziert. Bei einer Ratte mit einem Gewicht von etwa 220 g entspricht diese Dosis ungefähr 0,66 g Iod und einem Injektionsvolumen von etwa 2,2 mL.

Eine Montelukast-Natrium-Suspension wurde in 0,5 %iger Carboxymethylcellulose (CMC) hergestellt. Die Suspension wurde jeden Tag der Verabreichung frisch zubereitet und unmittelbar vor der Applikation kurz vortexiert, um eine gleichmäßige Verteilung der suspendierten Partikel zu gewährleisten. Die für jedes Tier erforderliche Montelukast-Dosis wurde individuell anhand des Körpergewichts bei Studienbeginn mit folgender Formel berechnet: erforderliche Dosis (mg) = Körpergewicht (kg) × 10 mg/kg. Bei einem Tier mit einem Gewicht von etwa 220 g betrug die berechnete Dosis etwa 2,2 mg und wurde mittels oraler Gavage verabreicht. Vor jeder Applikation wurde die Suspension visuell überprüft; falls Sedimentation erkennbar war, wurde sie vor der Verwendung erneut vortexiert.

NAC wurde den Behandlungsgruppen in einer Dosis von 100 mg/kg unverdünnt aus der kommerziellen Formulierung intraperitoneal verabreicht. Für jedes Tier wurde die erforderliche Dosis individuell anhand des beim Studienbeginn erfassten Körpergewichts berechnet. Bei einem Tier mit einem Gewicht von etwa 220 g entspricht dies etwa 22 mg NAC und einem Applikationsvolumen von etwa 0,15 mL. Vor der Verabreichung wurde die Lösung visuell überprüft, und nur Zubereitungen, die klar und frei von sichtbaren Partikeln waren, wurden verwendet.

Jede Zubereitung wurde vor der Verabreichung einer visuellen Inspektion unterzogen. Die Lösungen von L-NAME, Indomethacin, Iohexol und NAC wurden auf Verfärbungen und sichtbare Partikel überprüft. Unmittelbar vor der Verabreichung wurde die Montelukast-Suspension geschüttelt und visuell geprüft, um die Homogenität zu bestätigen. Jede Zubereitung, die diese Akzeptanzkriterien nicht erfüllte, wurde nicht verwendet. Im Labor wurden Schutzkittel, Schutzhandschuhe und Augenschutz während der Zubereitung und Verabreichung aller Chemikalien getragen. Alle Verfahren entsprachen den internen Anforderungen für Laborsicherheit und Biosicherheit.

Auswahl der Tiere, Unterbringung, Versuchsgruppen und Randomisierung

Dreißig erwachsene männliche Wistar-Albino-Ratten (8–12 Wochen alt; Körpergewicht 200–220 g) wurden aus dem Labor für Versuchstiere der Ahi Evran-Universität in Kırşehir, Türkiye, bezogen. Männliche Tiere wurden gewählt, um die methodische Konsistenz mit zuvor veröffentlichten experimentellen CI-AKI-Modellen zu gewährleisten und den Einfluss des Fortpflanzungszyklus als zusätzliche biologische Variable auszuschließen. Das Geschlecht wurde in der vorliegenden Studie nicht als experimentelle Variable untersucht. Die Tierhaltungseinrichtung besaß eine Zucht-/Produktionslizenznummer 184, und die Tiere wurden dort unter standardisierten Laborbedingungen gezüchtet und gehalten. Zum Zeitpunkt der Aufnahme verfügten die Tiere über keinen dokumentierten status specific pathogen-free (SPF) oder eine andere formell definierte mikrobiologische Gesundheitsklassifizierung. Jede Ratte wurde einzeln in einem Polycarbonat-Käfig mit den Maßen 40 cm × 25 cm × 20 cm untergebracht, wobei grob zerkleinerte Kiefernspäne als Einstreu dienten. Die Raumbedingungen wurden mittels einer automatisierten Umwelt- und Lüftungssteuerung bei 24 °C ± 2 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 35 % ± 10 % gehalten. Ein 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Rhythmus wurde angewandt, wobei die Beleuchtung von 07:00 bis 19:00 Uhr erfolgte. Während der 7-tägigen Akklimatisierungsphase sowie der anschließenden experimentellen Phase wurde keine gezielte Umweltanreicherung bereitgestellt. Standardisierte pelletierte Nagerkost und Leitungswasser standen ad libitum zur Verfügung, mit Ausnahme einer definierten 16-stündigen Wasserentzugphase vor der Induktion des CI-AKI. Die Futterzusammensetzung betrug 24 % Rohprotein, 3,94 % Rohzellulose, 5,08 % Rohfett, 8,8 % Rohasche, 1,44 % Lysin, 0,61 % Methionin, 1,14 % Calcium, 0,89 % Phosphor und 0,28 % Natrium. Alle Tiere wurden sieben Tage lang akklimatisiert, bevor die experimentellen Verfahren begannen. Tägliche Beobachtungen wurden sowohl während der Akklimatisierungs- als auch der experimentellen Phase durchgeführt, um den allgemeinen Zustand, den Futter- und Wasserverbrauch, die Beweglichkeit, die Körperhaltung, das Fellbild sowie Anzeichen von Belastung zu beurteilen. Um eine Selektionsverzerrung zu minimieren, wurden die Tiere mittels einer computergenerierten Zufallszuordnung auf fünf experimentelle Gruppen verteilt, wobei je sechs Tiere pro Gruppe zugewiesen wurden. Die Stichprobengröße wurde anhand einer a priori Power-Analyse mit G*Power Version 3.1.9.6 ermittelt.

Die Stichprobengröße wurde anhand einer a priori Power-Analyse für eine einfaktorielle Varianzanalyse mit festen Effekten unter Berücksichtigung von fünf experimentellen Gruppen bestimmt. Unter der Annahme einer Effektgröße (f) von 0,65, einer Fehlerrate 1. Art (α) von 0,05 und einer statistischen Power von 80 % ergab sich eine erforderliche Gesamtstichprobengröße von 30 Tieren, was sechs Tieren pro Gruppe entspricht. Die Effektgröße (f = 0,65) wurde a priori als große gesamte Effektstärke zwischen den Gruppen für den Vergleich der fünf Gruppen angenommen. Die Berechnung diente dazu, die Stichprobengröße zu ermitteln, die notwendig ist, um einen solchen Gesamteffekt nachzuweisen, und war nicht speziell darauf ausgelegt, kleinere paarweise Unterschiede zwischen den aktiven Behandlungsgruppen zu detektieren. Das einzelne Tier galt für alle Analysen als experimentelle Einheit.

Abgesehen von der routinemäßigen Tierhaltung, der täglichen Gesundheitsüberwachung und terminalen Verfahren wurden Tiere der Kontrollgruppe keiner protokollbedingten Handhabung oder Fixierung, Wasserverweigerung, intravenösen oder intraperitonealen Injektionen, oraler Gavage oder Applikation von Trägerlösung unterzogen. Die CI-AKI-Gruppe umfasste Tiere, bei denen am Tag 8 das CI-AKI-Modell etabliert wurde und die keine Behandlung erhielten. Die CI-AKI + Montelukast-Gruppe umfasste Tiere, bei denen das CI-AKI-Modell etabliert wurde und die anschließend mit Montelukast behandelt wurden. Die CI-AKI + NAC-Gruppe umfasste Tiere, bei denen das CI-AKI-Modell etabliert wurde und die anschließend mit NAC behandelt wurden. Die CI-AKI + Montelukast + NAC-Gruppe umfasste Tiere, bei denen das CI-AKI-Modell etabliert wurde und die anschließend mit einer Kombination aus Montelukast und NAC behandelt wurden. Weder die Kontrollgruppe noch die unbehandelte CI-AKI-Gruppe erhielten behandlungsentsprechende Scheinverfahren. Insbesondere wurden in diesen Gruppen keine Schein-Handhabungen, keine Schein-oralen Gavagen, keine Scheinbehandlungs-Injektionen oder behandlungsentsprechenden Applikationen von Trägerlösung durchgeführt. Die zur Herstellung von L-NAME, Indomethacin und Montelukast verwendeten Trägerlösungen waren 0,9 % Kochsalzlösung, 5 %ige Natriumbikarbonatlösung und 0,5 %ige CMC-Lösung, wie unter Vorbereitung der Chemikalien beschrieben. NAC wurde aus der kommerziellen Formulierung ohne weitere Verdünnung verabreicht, und für NAC wurde keine separate Trägerlösung hergestellt. Am Tag 8 wurden alle Tiere außer denen der Kontrollgruppe 16 Stunden lang wasserentzogen und anschließend nacheinander intravenös L-NAME (10 mg/kg), Indomethacin (10 mg/kg) und Iohexol (3 g Jod/kg) appliziert, um eine kontrastmittelinduzierte akute Nierenschädigung hervorzurufen. In den entsprechenden Behandlungsgruppen wurden Montelukast (10 mg/kg, orale Gavage) und/oder NAC (100 mg/kg, intraperitoneale Injektion) erstmals eine Stunde nach Abschluss der Iohexol-Applikation am Tag 8 verabreicht, was etwa 1,5 Stunden nach der L-NAME-Gabe entspricht, und anschließend täglich zur gleichen Zeit an den Tagen 9 und 10 erneut appliziert.

Protokoll zur Arzneimittelverabreichung

CI-AKI wurde gemäß einem veröffentlichten experimentellen Protokoll etabliert, das aus einer 16-stündigen Wasserverweigerung gefolgt von der sequenziellen intravenösen Verabreichung von L-NAME, Indomethacin und Iohexol bestand^23,24,25. L-NAME und Indomethacin wurden jeweils in einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht, während Iohexol in einer Dosis von 3 g Jod/kg appliziert wurde. Die Behandlungsdosen betrugen 10 mg/kg für Montelukast-Natrium und 100 mg/kg für NAC. Die Auswahl der Modellinduktions- und Behandlungsdosen erfolgte anhand zuvor veröffentlichter experimenteller Studien^22,26,27. Es wurde keine vorläufige Dosisfindungs- oder Dosisoptimierungsstudie durchgeführt. Die Dosen für NAC und Montelukast wurden unabhängig voneinander basierend auf zuvor veröffentlichten experimentellen Studien zu den einzelnen Wirkstoffen ausgewählt und nicht aus einer kombinationsspezifischen Dosisfindungsstudie abgeleitet. Die gewählten Dosen sollten keine pharmakologisch äquivalenten Expositionen darstellen, und es wurde keine Dosis-Wirkungs- oder formale Arzneimittelinteraktionsanalyse durchgeführt. Zur Definition einer erfolgreichen Modellinduktion auf Ebene des einzelnen Tieres wurde keine vorab festgelegte numerische oder laborchemische Schwelle verwendet. Am Studienende wurde der erfolgreiche Nachweis einer Nierenschädigung durch die charakteristischen histopathologischen Veränderungen in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe gestützt. Am Tag 8 wurden alle Tiere außer denen der Kontrollgruppe unmittelbar vor der Induktion einer kontrastmittelinduzierten akuten Nierenschädigung einer einmaligen 16-stündigen Wasserverweigerung unterzogen. Die Wasserverweigerung wurde während des restlichen experimentellen Zeitraums nicht wiederholt. Standardisierte Pellet-Nahrung blieb während der gesamten Phase der Wasserverweigerung ad libitum verfügbar. Unmittelbar nach Abschluss der 16-stündigen Wasserverweigerung wurde in allen wasserverweigerten Versuchsgruppen gleichzeitig und ad libitum wieder Zugang zu Leitungswasser gewährt, bevor die erste modellinduzierende Substanz, L-NAME, verabreicht wurde; dieser Zugang blieb für den Rest des experimentellen Zeitraums bestehen. Die Zeitpunkte und Bedingungen der Wiederherstellung des Wasserverbrauchs waren in allen wasserverweigerten Gruppen identisch. Der Wasserkonsum nach Wiederherstellung war nicht auf ein vordefiniertes Volumen beschränkt und wurde nicht quantitativ erfasst. Paarweise Körpergewichte unmittelbar vor und nach der 16-stündigen Wasserverweigerung wurden nicht erhoben; daher konnte der dehydrationsbedingte prozentuale Körpergewichtsverlust nicht berechnet werden. Die Harnproduktion wurde nicht quantitativ überwacht. Nach Wiederherstellung des Wasserverbrauchs wurde die Induktion von CI-AKI eingeleitet. Alle sequenziellen intravenösen Applikationen von L-NAME, Indomethacin und Iohexol erfolgten über eine seitliche Schwanzvene mittels einer 26-G-Nadel, die an eine sterile 5-mL-Spritze angeschlossen war. Vor der intravenösen Verabreichung wurde der Schwanz mehrere Minuten lang in Wasser erwärmt, um die Visualisierung und Dilatation der seitlichen Schwanzvenen zu erleichtern. Nach jeder intravenösen Applikation wurde die Vene zusätzlich zum berechneten Applikationsvolumen des jeweiligen modellinduzierenden Wirkstoffs mit 0,5 mL steriler 0,9%iger Kochsalzlösung gespült , um die Durchgängigkeit zu gewährleisten. Die Injektionsstelle wurde während der Applikation und Spülung visuell auf Schwellung, Austritt oder Hinweise auf Extravasation überwacht. Zunächst wurde L-NAME (10 mg/kg) verabreicht. Fünfzehn Minuten nach der Gabe von L-NAME wurde Indomethacin (10 mg/kg) intravenös über dieselbe seitliche Schwanzvene appliziert. Fünfzehn Minuten nach der Indomethacingabe wurde Iohexol intravenös über dieselbe seitliche Schwanzvene in einer Dosis von 3 g Jod/kg verabreicht. Für jedes Tier wurde die Iohexol-Dosis und das entsprechende Injektionsvolumen individuell basierend auf dem Körpergewicht zum Studienbeginn und der kommerziellen Jodkonzentration von 300 mg Jod/mL berechnet. Dies entsprach einem Applikationsvolumen von 10 mL/kg und damit etwa 2,0–2,2 mL für Ratten mit einem Gewicht von 200–220 g. Es war kein separater, protokolldefinierter maximaler zulässiger intravenöser Volumenbetrag vorgegeben; die größte Einzelapplikation in dieser Studie war Iohexol mit 10 mL/kg. Iohexol wurde langsam über etwa 1–2 Minuten verabreicht. Der erfolgreiche intravenöse Versuch wurde durch das Fehlen sichtbarer Schwellung, Austritt oder Extravasation an der Injektionsstelle bestätigt. Es wurde keine partielle Extravasation beobachtet, und keine Injektion musste aufgrund vermuteter Extravasation wiederholt oder neu dosiert werden. Eine Stunde nach Abschluss der Iohexolapplikation wurden die vorgesehenen Behandlungen erstmals den Behandlungsgruppen verabreicht. Da die Iohexolapplikation 30 Minuten nach der L-NAME-Gabe begann und innerhalb von etwa 1–2 Minuten abgeschlossen war, erfolgte der Behandlungsbeginn etwa 91–92 Minuten (ca. 1,5 h) nach der L-NAME-Gabe. Montelukast-Natrium (10 mg/kg) wurde per orale Gavage verabreicht, während NAC (100 mg/kg) intraperitoneal appliziert wurde.

Die orale Gavage wurde unter Verwendung einer 22-G-Lochstahl-Fütterungskanüle durchgeführt. Jedes Tier wurde in aufrechter Position gehalten, und die Fütterungskanüle wurde vorsichtig durch die Speiseröhre in den Magen vorgeschoben. Bei starkem Widerstand wurde die Kanüle zurückgezogen und erneut positioniert, bevor die Applikation erfolgte. Das Tier wurde während und unmittelbar nach der Gavage auf Regurgitation überwacht. Bei keinem Tier wurde Regurgitation oder ein anderer Hinweis auf unvollständige orale Applikation während oder unmittelbar nach der Gavage beobachtet, und kein Tier wurde aufgrund vermuteter erfolgloser oraler Verabreichung ausgeschlossen. Intraperitoneale Injektionen wurden in das rechte untere Quadrant des Abdomens verabreicht. Die Nadel wurde in einem Winkel von etwa 30°–45° eingeführt, und vor der Applikation wurde eine Aspiration durchgeführt, um einen versehentlichen vaskulären Einstich auszuschließen. Der Injektionsort wurde während und unmittelbar nach der Applikation visuell auf Austreten, Blutung oder andere sichtbare Komplikationen überwacht. Die vorgesehenen Behandlungen wurden einmal täglich zur gleichen Zeit an den Tagen 8, 9 und 10 verabreicht. Entsprechend erhielten die Tiere in der Gruppe CI-AKI + Montelukast einmal täglich Montelukast über drei aufeinanderfolgende Tage, die Tiere in der Gruppe CI-AKI + NAC erhielten einmal täglich NAC über drei aufeinanderfolgende Tage, und die Tiere in der Gruppe CI-AKI + Montelukast + NAC erhielten einmal täglich sowohl Montelukast als auch NAC gemäß dem gleichen dreitägigen Behandlungsplan. Alle Applikationen zur Modellinduktion und Behandlung wurden von derselben Untersucherin durchgeführt. Das Körpergewicht wurde für jedes Tier einmalig zu Studienbeginn gemessen und während des experimentellen Zeitraums nicht erneut bestimmt. Für jedes Tier wurden Dosis und entsprechendes Applikationsvolumen aller modellinduzierenden Substanzen und Studienbehandlungen individuell anhand des zu Studienbeginn erfassten Körpergewichts berechnet. Alle intravenösen, intraperitonealen und oralen Gavage-Verfahren wurden mit derselben standardisierten Technik durchgeführt, um applikationsbedingte Variabilität zu minimieren.

Tötungsverfahren, humane Endpunkte und Probennahme

Die Tiere wurden während des gesamten Experiments einmal täglich auf Veränderungen ihres Allgemeinzustands, ihres Futter- und Wasserverbrauchs, ihrer Beweglichkeit, Körperhaltung, Fellzustands sowie auf Anzeichen von Belastung beobachtet. Zu den vorausschauend festgelegten humanen Endpunkten gehörten deutliche Lethargie, Unfähigkeit, verfügbares Futter oder Wasser zu erreichen oder aufzunehmen, abnormale Körperhaltung, verminderte Beweglichkeit, anhaltende Sträubung des Fells sowie jegliche andere offensichtliche Manifestation von Belastung. Tiere, die auch nur einen dieser Kriterien erfüllten, sollten unverzüglich euthanasiert werden; im Verlauf der Studie erfüllte jedoch kein Tier die Kriterien für humane Endpunkte. Am Tag 11, 24 Stunden nach der letzten Behandlung, wurde durch intraperitoneale Gabe von Ketamin (80 mg/kg) zusammen mit Xylazin (10 mg/kg) eine tiefe Narkose induziert. Das Fehlen der pflanzlichen Rückzugsreaktion diente zur Überprüfung einer ausreichenden Narkosetiefe. Nach Bestätigung einer ausreichenden Narkosetiefe wurden von jedem Tier etwa 3–5 mL Blut durch intrakardiale Punktion entnommen. Die Euthanasie wurde anschließend durch Ausbluten vollzogen, während das Tier weiterhin unter tiefer Narkose stand. Das Fehlen sowohl der Herzaktivität als auch der spontanen Atmung wurde zur Bestätigung des Todes verwendet.

Das für biochemische Serumuntersuchungen gesammelte Blut wurde in rohrförmige Behältnisse ohne Antikoagulans gegeben und stehengelassen, bis die Blutgerinnung vollständig war. Die Röhrchen wurden anschließend bei 4 °C 10–15 Minuten lang mit 3.000 × g zentrifugiert, wonach die Serumfraktion abgetrennt und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert wurde. Proben, die für die Glutathionbestimmung vorgesehen waren, wurden separat in Röhrchen mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gesammelt. Da diese Proben antikoaguliert waren, erfolgte ihre Verarbeitung ohne vorherige Gerinnungsphase gemäß dem entsprechenden Verfahren für den Glutathion-Test. Die Abtrennung des Serums galt als akzeptabel, wenn das gewonnene Serum klar war und keine sichtbaren Anzeichen einer Hämolyse aufwies.

Nach Bestätigung des Todes wurde eine mediale Laparotomie durchgeführt und beide Nieren vorsichtig von jedem Tier entfernt. Umgebendes Fett- und Bindegewebe wurde von den Proben abgetrennt. Die rechte Niere wurde ausschließlich für die histopathologische Untersuchung zurückbehalten, während die linke Niere für die biochemische Analyse verwendet wurde. Das gemischte Gewebe der linken Niere wurde analysiert, ohne dass die Nierenrinde und das Nierenmark separat präpariert wurden. Die beiden Nieren wurden unabhängig voneinander behandelt, und Proben verschiedener Tiere blieben während der gesamten Aufarbeitung getrennt, ohne Zusammenführung. Die gesamte rechte Niere wurde in 10 % neutral gepuffertem Formaldehyd fixiert und für die histopathologische Beurteilung aufgearbeitet. Schnitte, die die Nierenrinde und das äußere Mark umfassten, wurden hergestellt und gemäß den in der histopathologischen Aufarbeitung und Bewertung beschriebenen Verfahren untersucht. Jede linke Niere wurde einzeln gekennzeichnet und bis zur Homogenisierung und biochemischen Analyse bei -80 °C gelagert. Nach der Entnahme wurde die makroskopische Gewebestruktur überprüft, und eine ausreichende Menge an Gewebe wurde für die geplanten histopathologischen und biochemischen Untersuchungen beibehalten.

Der für die Modellinduktion und die Verabreichung der Behandlung zuständige Untersucher konnte nicht verblindet werden, da die experimentellen Gruppen unterschiedliche Verfahren durchliefen. Die Gruppenzugehörigkeiten wurden jedoch den Untersuchern, die die biochemischen und statistischen Analysen durchführten, sowie dem Pathologen, der die histopathologischen Beurteilungen vornahm, nicht bekanntgegeben. Alle eingeschlossenen Tiere blieben in der Studie und wurden in die nachfolgenden Analysen einbezogen. Biologische Proben, Tiergewebe, fixierende Mittel auf Basis von Formaldehyd und andere chemische Abfälle wurden unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung behandelt. Die Entsorgung aller biologischen und chemischen Abfälle erfolgte gemäß den Anforderungen der institutionellen Biosicherheit und der Gefahrgutentsorgung.

Biochemische Analysen

Biochemische Messungen wurden unter Verwendung von Serum, EDTA-antikoaguliertem Blut und Homogenaten aus linkem Nierengewebe durchgeführt, die von jedem Tier gesammelt wurden. Die Verfahren werden unten entsprechend der biologischen Matrix dargestellt, die für jeden Parameter verwendet wurde. Im Serum wurden Harnstoff, Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN), Kreatinin, Superoxiddismutase (SOD) und Malondialdehyd (MDA) analysiert. Harnstoff, BUN und Kreatinin dienten als Parameter der Nierenfunktion, während die SOD-Aktivität und die MDA-Konzentration als Indikatoren für oxidativen Stress bewertet wurden. Die Harnstoff- und BUN-Werte im Serum wurden mittels desselben enzymatischen Urease–Glutamat-Dehydrogenase-Assays ermittelt. Bei dieser Methode wurde Harnstoff durch Urease zu Ammoniak hydrolysiert, das anschließend mit 2-Oxoglutarat und reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) in Gegenwart von Glutamat-Dehydrogenase reagierte. Die verwendete analytische Methode war ein kinetisches enzymatisches Urease–Glutamat-Dehydrogenase-Assay. Der Rückgang der Extinktion infolge des NADH-Verbrauchs wurde kinetisch mittels eines Spektralphotometers gemessen. Die Kreatinin-Konzentration im Serum wurde farbenmetrisch unter Verwendung eines automatisierten biochemischen Analysegeräts bestimmt. Die SOD-Aktivität im Serum wurde farbenmetrisch mit einem kommerziell erhältlichen Assay-Kit auf demselben automatisierten biochemischen Analysegerät gemessen. Der SOD-Assay basierte auf der Erzeugung von Superoxid-Radikalen durch das Xanthin–Xanthin-Oxidase-System und deren Reaktion mit 2-(4-Iodphenyl)-3-(4-Nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid zur Bildung eines gefärbten Formazan-Produkts. Die Endpunkt-Extinktion wurde bei 505 nm gemessen und die SOD-Aktivität in U/mL angegeben. Die MDA-Konzentration im Serum wurde farbenmetrisch mittels der Thiobarbitursäure-Reaktion bestimmt. Serumproben wurden mit kalter Trichloressigsäure versetzt, um Proteine auszufällen, und der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Dieser Zentrifugationsschritt wurde bei 7.500 × g für 5 min bei 4 °C durchgeführt. Der Überstand wurde mit Thiobarbitursäure bei 90 °C für 60 min umgesetzt, abgekühlt und bei 532 nm gemessen. Die MDA-Konzentrationen wurden aus der entsprechenden Kalibrierkurve berechnet und in nmol/mL angegeben. Die Glutathion (GSH)-Analyse wurde mit EDTA-antikoaguliertem Blut durchgeführt. Proteine wurden mit Trichloressigsäure ausgefällt, und die resultierenden enteiweißten Proben wurden farbenmetrisch nach einer modifizierten Ellman-Methode analysiert. Die Proben wurden mit 5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) in 500 mM Tris-Puffer bei pH 8,2 versetzt. Die Reaktion der Thiolgruppen von GSH mit DTNB erzeugte ein gefärbtes Produkt, und die Extinktion wurde bei 412 nm erfasst. Die Katalase (CAT)-Aktivität wurde mittels eines zweistufigen farbenmetrischen Verfahrens bestimmt. Die Proben wurden zunächst mit einer definierten Menge Wasserstoffperoxid inkubiert, das von Katalase in Wasser und molekularen Sauerstoff umgewandelt wurde. Nach Beendigung der enzymatischen Reaktion wurde das verbleibende Wasserstoffperoxid mittels eines chromogenen Reagenzials gemessen. Die Extinktion wurde bei 405 nm erfasst und die CAT-Aktivität in U/mL angegeben. Für die Nierengewebemessungen wurde die linke Niere jedes Tieres als gemischtes Gewebe verwendet, ohne dass Kortex und Mark getrennt wurden. Wie im Verfahren angegeben, wurde die rechte Niere ausschließlich für die histopathologische Beurteilung aufbewahrt. Proben einzelner Tiere wurden unabhängig verarbeitet und zu keinem Zeitpunkt gepoolt. Jedes linke Nierengewebe wurde auf Eis in 50 mM Phosphatpuffer bei pH 7,4 homogenisiert, wobei ein Gewebe-zu-Puffer-Verhältnis von 1:10 (w/v) verwendet wurde. Für jede Ratte wurde ein tiereigenes Nierengewebe-Homogenat hergestellt. Separate Aliquote dieses Homogenats wurden für die verschiedenen Nierengewebemessungen verwendet, um sicherzustellen, dass alle Parameter aus demselben individuellen Tier stammten. Die resultierenden Nierengewebe-Homogenate wurden bei 14.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand von jedem Tier separat gesammelt und in Aliquote für die geplanten Nierengewebeanalysen aufgeteilt. Die Konzentrationen von Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α), Interleukin-1-beta (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6), Cystatin C und KIM-1 in den Nierengewebe-Überständen wurden mittels ratten-spezifischer ELISA-Kits (enzyme-linked immunosorbent assay) gemessen. Die Assays wurden gemäß den Herstellerprotokollen durchgeführt. Die Inkubationsbedingungen waren für die TNF-α-, IL-1β-, IL-6-, Cystatin C- und KIM-1-ELISAs identisch. Bei jedem Assay wurden die Proben und ELISA-Reagenzien 1 h bei 37 °C inkubiert; nach fünf Waschzyklen wurden die Substratlösungen A und B hinzugefügt und 10 min bei 37 °C inkubiert. Kurz gesagt, wurden Standardproben und Nierengewebe-Überstände in die mit Antikörper beschichteten Vertiefungen gegeben, gefolgt von dem entsprechenden biotinylierten Detektionsantikörper und dem Streptavidin–Peroxidase-Konjugat. Nach den vorgegebenen Inkubationsschritten wurden ungebundene Komponenten mittels eines automatisierten Mikroplatten-Washers entfernt. Anschließend wurde die Substratlösung zugegeben, und die Farbreaktion wurde mit der sauren Stopplösung beendet. Die Extinktion wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, und die Analytkonzentrationen wurden aus den entsprechenden Standardkurven berechnet. Die ELISA-Messungen im Nierengewebe wurden im Duplikat durchgeführt. Für jeden Analyten wurde der Mittelwert der beiden technischen Wiederholungen berechnet, um einen einzelnen, tierniveau-basierten Wert zu erhalten. Technische Wiederholungen und separate Aliquote aus demselben tiereigenen Homogenat wurden nicht als unabhängige Beobachtungen betrachtet. Alle biochemischen Messungen wurden unter standardisierten, assayspezifischen Bedingungen durchgeführt. Serum-, EDTA-antikoagulierte Blut- und Nierengewebeproben wurden entsprechend den Anforderungen der jeweiligen analytischen Methoden separat verarbeitet. Die Untersucher, die die biochemischen Analysen durchführten, waren bezüglich der Gruppenzuordnung verblindet. Als experimentelle Einheit galt das einzelne Tier und nicht jede Serumprobe, Blutprobe, Nierenprobe, Homogenat-Aliquot oder technische Wiederholung. Entsprechend wurden für jede experimentelle Gruppe sechs unabhängige, tierniveau-basierte Beobachtungen in die statistische Analyse eingeschlossen.

Histopathologische Aufarbeitung und Bewertung

Rechtsnierenproben wurden zur mikroskopischen Untersuchung mittels routinemäßiger histologischer Aufarbeitung vorbereitet. Die gesamte rechte Niere jedes Tieres wurde 72 h bei Raumtemperatur in 10 % neutralgepufferter Formaldehydlösung fixiert. Anschließend erfolgte die Dehydrierung des Gewebes nacheinander in 50 %, 70 %, 80 %, 96 % und 100 % Ethanol, wobei jede Konzentration 1 h lang angewendet wurde. Danach wurden die Proben jeweils 30 min lang zwei Xylolbädern ausgesetzt, bevor eine Paraffineinbettung vorgenommen wurde. Mithilfe eines Rotationsmikrotoms wurden 5 µm dicke Schnitte, die sowohl die Nierenrinde als auch das äußere Mark enthielten, aus den Paraffinblöcken gewonnen.

Für die Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung wurden die Schnitte deparaffinisiert und rehydriert, anschließend 5 min lang Hämatoxylin ausgesetzt und danach 5 min lang unter fließendem Leitungswasser gewaschen. Zur Differenzierung wurde saurer Alkohol verwendet, danach wurden die Schnitte 1 min lang in ammoniakalkalisiertem Wasser blau gemacht und anschließend 2 min lang mit Eosin kontragefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden danach in aufsteigenden Alkoholkonzentrationen dehydriert, mit Xylol geklärt und dauerhaft unter Deckgläsern eingebettet.

Für die Masson-Färbung vorgesehenen Schnitte wurden ebenso entparaffiniert und rehydriert. Die Mordanzbehandlung erfolgte 60 min bei 56 °C, gefolgt von einer Spülung unter fließendem Leitungswasser für 10 min. Anschließend wurden die Schnitte nacheinander 10 min mit Weigert-Eisenhämakalin, 15 min mit Biebrich-Scarlet–Säurefuchsin-Lösung, 10 min mit Phosphorwolframsäure-Lösung und 10 min mit Anilinblau-Lösung behandelt. Nach einer Behandlung in 1 %iger Essigsäure für 5 min wurden die Schnitte dehydriert, in Xylol geklärt und mit Deckgläsern eingebettet.

Vor der mikroskopischen Beurteilung wurde die Angemessenheit der Färbung für jede Methode separat überprüft. HE-gefärbte Schnitte galten als geeignet, wenn die Kerndetails und der zytoplasmatische Kontrast deutlich erkennbar waren, während Massons-trichrom-gefärbte Schnitte akzeptiert wurden, wenn die Bindegewebsstrukturen klar visualisiert werden konnten. Für jedes Tier wurden drei HE-gefärbte und drei Massons-trichrom-gefärbte Schnitte untersucht. In jedem Schnitt wurden fünf zufällig ausgewählte mikroskopische Felder mit einem 40×-Objektiv bewertet. Demnach wurden pro Tier 15 mikroskopische Felder pro Färbemethode untersucht. Alle mikroskopischen Untersuchungen wurden mit demselben Objektiv und unter standardisierten Bewertungsbedingungen für alle Tiere und experimentellen Gruppen durchgeführt. Massons-trichrom-gefärbte Schnitte wurden qualitativ hinsichtlich der Verteilung und Ablagerung von interstitiellem Kollagen, der Akkumulation der extrazellulären Matrix sowie der tubulointerstitiellen Architektur beurteilt. Diese Schnitte dienten nicht zur Erstellung der semiquantitativen histopathologischen Schädigungsscores von 0–3. Repräsentative HE- und Massons-trichrom-gefärbte Photomikrogramme wurden mit einem 40×-Objektiv aufgenommen, wobei in jedes repräsentative Bild ein Maßstabsbalken von 100 µm eingefügt wurde. Diese Photomikrogramme dienten lediglich illustrativen Zwecken und wurden nicht als unabhängige Beobachtungen in die histopathologische Bewertung oder statistische Analysen einbezogen. Alle histopathologischen Beurteilungen wurden von einem erfahrenen Pathologen durchgeführt, der über die Zugehörigkeit zu den experimentellen Gruppen im Unklaren blieb. Die Verwendung eines einzelnen, verblindeten Untersuchers diente der Minimierung von Bewertungsfehlern und der Reduzierung von Variabilität aufgrund von Unterschieden zwischen Beobachtern. Tubuläre Nekrose, tubuläre Dilatation, zelluläre Degeneration und vaskuläre Kongestion wurden semiquantitativ an HE-gefärbten Nierenschnitten anhand eines Systems bewertet, das auf zuvor publizierten Nierenschädigungsmodellen basiert^28,29. Für jeden Parameter reichten die Scores von 0 bis 3 und entsprachen jeweils keiner, leichter, mittelschwerer und schwerer histopathologischer Schädigung. Für jedes Tier wurden die Befunde aus den fünf mikroskopischen Feldern jedes der drei HE-gefärbten Schnitte – insgesamt 15 Felder – zusammenfassend zur Vergabe eines einzelnen 0–3-Scores für jeden histopathologischen Parameter herangezogen. Somit trug jedes Tier einen Score für tubuläre Nekrose, tubuläre Dilatation, zelluläre Degeneration und vaskuläre Kongestion bei. Histologische Schnitte und mikroskopische Felder wurden als innerhalb eines Tieres liegende Teilproben betrachtet und nicht als unabhängige Beobachtungen gewertet. In jedem Schnitt wurden die mikroskopischen Felder zufällig aus vergleichbaren Bereichen der Nierenrinde und des äußeren Markbereichs ausgewählt, um die anatomische Stichprobenziehung zwischen den Tieren und experimentellen Gruppen zu standardisieren. Als experimentelle Einheit galt das einzelne Tier, nicht die einzelne Niere, der histologische Schnitt oder das mikroskopische Feld. Entsprechend wurden sechs unabhängige tierbezogene Beobachtungen in die statistische Analyse für jede experimentelle Gruppe einbezogen. Die in Tabelle 3 dargestellten Werte repräsentieren die Gruppenmittelwerte, die aus den tierbezogenen Scores der sechs Tiere jeder experimentellen Gruppe berechnet wurden.

Statistische Analyse

Die statistischen Analysen wurden mit statistischer Analyse-Software durchgeführt. Das einzelne Tier galt als experimentelle Einheit für alle statistischen Analysen. Jede experimentelle Gruppe umfasste sechs unabhängige Tiere (n = 6 pro Gruppe). Technische Replikate, Assay-Vertiefungen, Gewebeschnitte und mikroskopische Aufsuchfelder wurden nicht als unabhängige Beobachtungen betrachtet und nicht zur Erhöhung des statistischen Stichprobenumfangs herangezogen. Stetige Variablen werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die Normalverteilung wurde innerhalb jeder experimentellen Gruppe separat mittels des Shapiro-Wilk-Tests überprüft, die Varianzhomogenität wurde mit dem Levene-Test bewertet. Aufgrund des vollständig balancierten Versuchsdesigns mit gleichen Stichprobengrößen in allen Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) zur Gruppenvergleichung verwendet. Paarweise Vergleiche erfolgten mittels des post-hoc-Duncan-Mehrfachvergleichstests. Mögliche Ausreißer wurden durch grafische Überprüfung von Boxplots und Untersuchung einzelner Beobachtungen identifiziert. Keine Beobachtung wurde als Messfehler oder ungültiges Versuchsergebnis angesehen, und kein Datenpunkt wurde aus statistischen Gründen ausgeschlossen. Ein p-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Serummarker für die Nierenfunktion (Harnstoff, Blutharnstoffstickstoff und Kreatinin)

Das experimentelle Design, die Tiergruppierung, der Behandlungszeitplan und der Zeitrahmen für die Probensammlung der vorliegenden Studie sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Unter den Gruppen wurden statistisch signifikante Unterschiede bei den Konzentrationen von Harnstoff, BUN und Kreatinin im Serum beobachtet (p = 0,003, p = 0,003 bzw. p = 0,002). Der mittlere Harnstoffspiegel im Serum betrug 67,43 mg/dL ± 53,11 mg/dL in der Kontrollgruppe und stieg auf 606,71 mg/dL ± 429,42 mg/dL in der CI-AKI-Gruppe an. Ebenso erhöhte sich der mittlere BUN-Spiegel von 31,51 mg/dL ± 24,82 mg/dL in der Kontrollgruppe auf 268,63 mg/dL ± 190,84 mg/dL in der CI-AKI-Gruppe. Auch die Kreatininkonzentrationen im Serum stiegen deutlich an, und zwar von 0,60 mg/dL ± 0,05 mg/dL in der Kontrollgruppe auf 3,27 mg/dL ± 2,14 mg/dL in der CI-AKI-Gruppe. Post-hoc-Vergleiche nach Duncan zeigten, dass die Harnstoff-, BUN- und Kreatininkonzentrationen im Serum in jeder Behandlungsgruppe – der CI-AKI + Montelukast-, der CI-AKI + NAC- und der CI-AKI + Montelukast + NAC-Gruppe – signifikant niedriger waren als in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe (alle p < 0,05). Die Daten zu den serumbasierten Nierenfunktionsmarkern sind in Tabelle 1 dargestellt.

Parameter des oxidativen Stresses und Aktivitäten antioxidativer Enzyme

Unter den Gruppen wurden statistisch signifikante Unterschiede hinsichtlich der Gehalte an SOD, GSH, CAT und MDA beobachtet (p = 0,044, p = 0,001, p = 0,003 bzw. p = 0,001; Tabelle 1). Die post-hoc-Analyse nach Duncan zeigte, dass die GSH-Spiegel in den Gruppen mit Montelukast, NAC und Kombinationsbehandlung signifikant höher waren als in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe (alle p < 0,05). Die Kombinationsgruppe wies ebenfalls einen signifikant höheren GSH-Spiegel auf als die Kontrollgruppe (p < 0,05). Es wurden jedoch keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Kombinationsgruppe und den einzelnen Monotherapiegruppen oder zwischen den beiden Monotherapiegruppen festgestellt (alle p > 0,05). Der niedrigste SOD-Spiegel wurde in der CI-AKI-Gruppe gemessen (92,23 U/mL ± 16,37 U/mL), während die Kontrollgruppe 147,81 U/mL ± 33,27 U/mL zeigte. Die GSH-Spiegel waren in der CI-AKI-Gruppe am niedrigsten (66,05 mmol/L ± 24,72 mmol/L) und in der Gruppe CI-AKI + Montelukast + NAC am höchsten (172,44 mmol/L ± 60,48 mmol/L). Die CAT-Aktivität war in der Kontrollgruppe am höchsten (93,35 U/mL ± 18,75 U/mL) und in der CI-AKI-Gruppe am niedrigsten (33,22 U/mL ± 17,07 U/mL). Bezüglich der MDA-Spiegel wurde der höchste Wert in der CI-AKI-Gruppe festgestellt (54,13 nmol/mL ± 19,37 nmol/mL), während der niedrigste Wert in der CI-AKI + NAC-Gruppe gemessen wurde (21,53 nmol/mL ± 5,07 nmol/mL). Die Daten zu den Parametern des oxidativen Stresses und der Aktivitäten der antioxidativen Enzyme sind in Tabelle 1 dargestellt.

Nierenverletzung und entzündliche Biomarker (KIM-1, Cystatin C, TNF-α, IL-1β und IL-6)

Unter den Gruppen wurden hinsichtlich der Niveaus von Nieren-Cystatin C, IL-6, KIM-1, TNF-α und IL-1β statistisch signifikante Unterschiede beobachtet (p < 0,001, p = 0,008, p = 0,027, p = 0,006 bzw. p < 0,001; Tabelle 2). Post-hoc-Vergleiche nach Duncan zeigten, dass die Konzentrationen von Cystatin C, IL-6, KIM-1, TNF-α und IL-1β in jeder Behandlungsgruppe – der CI-AKI + Montelukast-, CI-AKI + NAC- und CI-AKI + Montelukast + NAC-Gruppe – signifikant niedriger waren als in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe (alle p < 0,05). Bei IL-1β wurde außerdem ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der CI-AKI + Montelukast- und der CI-AKI + NAC-Gruppe festgestellt (p < 0,05). Die Konzentrationen von Nieren-Cystatin C waren in der CI-AKI-Gruppe am höchsten (18,43 ng/mL ± 1,06 ng/mL), während die Kontrollgruppe einen Wert von 10,30 ng/mL ± 0,78 ng/mL aufwies. Ebenso lagen die IL-6-Spiegel in der CI-AKI-Gruppe am höchsten (13,41 ng/L ± 2,14 ng/L) und in der Kontrollgruppe am niedrigsten (9,29 ng/L ± 2,70 ng/L). Die KIM-1-Konzentrationen waren in der CI-AKI-Gruppe am höchsten (3,07 ng/mL ± 0,36 ng/mL) im Vergleich zu 2,25 ng/mL ± 0,54 ng/mL in der Kontrollgruppe. Ähnlich waren die TNF-α-Spiegel in der CI-AKI-Gruppe am höchsten (161,69 ng/L ± 26,14 ng/L), während die niedrigsten Werte in der Kontrollgruppe beobachtet wurden (95,49 ng/L ± 16,98 ng/L). Die IL-1β-Konzentrationen waren in der CI-AKI-Gruppe am höchsten (9,28 ng/mL ± 0,68 ng/mL), während der niedrigste Wert in der CI-AKI + Montelukast-Gruppe gemessen wurde (7,34 ng/mL ± 0,57 ng/mL). Die Daten zu Nierenschädigungs- und entzündlichen Biomarkern sind in Tabelle 2 dargestellt. Wichtig ist, dass trotz numerisch höherer Werte einiger biochemischer Marker in der CI-AKI + Montelukast + NAC-Gruppe im Vergleich zur CI-AKI + Montelukast-Gruppe die post-hoc-Vergleiche nach Duncan keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen diesen beiden Behandlungsgruppen für irgendeine der untersuchten biochemischen Variablen zeigten, einschließlich Parameter des oxidativen Stresses, Nierenschädigungsbiomarkern und entzündlichen Biomarkern (p > 0,05).

Die histopathologische Beurteilung

histopathologische Befunde

Nierenschnitte, die mit HE gefärbt wurden, zeigten bei der Kontrollgruppe eine erhaltene Nierenarchitektur mit normaler Glomerulus- und tubulärer Morphologie. Im Gegensatz dazu wiesen die unbehandelten CI-AKI-Tiere deutliche histopathologische Veränderungen auf, darunter tubuläre epitheliale Schädigungen, weitverbreitete zelluläre Degeneration, tubuläre Dilatation, zelluläres Detritus in den Tubuluslumen sowie vaskuläre Stauung. Nekrotische Veränderungen zeigten sich insbesondere in den proximalen Tubulusabschnitten. Bei der CI-AKI + Montelukast-Gruppe war das Ausmaß der tubulären Schädigung im Vergleich zur unbehandelten CI-AKI-Gruppe reduziert, wenngleich fokale degenerative Veränderungen weiterhin erkennbar blieben. Ebenso zeigte die CI-AKI + NAC-Gruppe eine bessere Erhaltung der tubulären epithelialen Integrität und weniger nekrotische Bereiche. Bei der qualitativen histopathologischen Untersuchung erschien die Nierenarchitektur in der CI-AKI + Montelukast + NAC-Gruppe erhalten, mit weitgehend intakten kortikalen und medullären Strukturen sowie relativ gering ausgeprägter tubulärer Nekrose, tubulärer Dilatation, zellulärer Degeneration und vaskulärer Stauung. Mit der Azan-Färbung gefärbte Schnitte zeigten bei der Kontrollgruppe eine normale Verteilung des interstitiellen Kollagens. Bei der unbehandelten CI-AKI-Gruppe wurden eine vermehrte Ablagerung von interstitiellem Kollagen, eine tubulointerstitielle Architekturstörung sowie eine Akkumulation der extrazellulären Matrix beobachtet. Diese Veränderungen waren in den Behandlungsgruppen, einschließlich der kombinierten Behandlungsgruppe, im Vergleich zur unbehandelten CI-AKI-Gruppe weniger ausgeprägt. Repräsentative HE- und Azan-gefärbte Nierenschnitte, die diese Befunde veranschaulichen, sind in Abbildung 2 dargestellt.

Semiquantitative histopathologische Bewertung

Die semiquantitative histopathologische Beurteilung zeigte, dass die Werte für tubuläre Nekrose, tubuläre Dilatation, zelluläre Degeneration und vaskuläre Kongestion in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe am höchsten waren. Die mittleren Werte in dieser Gruppe betrugen 2,67, 2,83, 2,67 bzw. 2,50. Die relativ hohen mittleren Werte, die nahe an der Obergrenze der 0–3-Skala lagen, entsprachen den bei der qualitativen histopathologischen Untersuchung in derselben Gruppe beobachteten weitverbreiteten und schweren tubulären und vaskulären Veränderungen. Im Gegensatz dazu waren alle Parameter in der Kontrollgruppe nicht nachweisbar. In allen Behandlungsgruppen wurden im Vergleich zur unbehandelten CI-AKI-Gruppe niedrigere Schädigungswerte beobachtet. Die CI-AKI + Montelukast-Gruppe wies mittlere Werte von 1,33 für tubuläre Nekrose, 1,50 für tubuläre Dilatation, 1,17 für zelluläre Degeneration und 1,00 für vaskuläre Kongestion auf. Die entsprechenden Werte in der CI-AKI + NAC-Gruppe betrugen 1,17, 1,17, 0,83 und 0,83. Zahlenmäßig lagen die niedrigsten mittleren histopathologischen Schädigungswerte in der CI-AKI + Montelukast + NAC-Gruppe vor, mit mittleren Werten von 0,50, 0,67, 0,50 und 0,17 für tubuläre Nekrose, tubuläre Dilatation, zelluläre Degeneration bzw. vaskuläre Kongestion. Detaillierte histopathologische Bewertungsdaten sind in Tabelle 3 dargestellt.

Die Rohdaten für alle biochemischen und histopathologischen Analysen sowie die ursprünglichen, nicht zugeschnittenen HE- und Masson’s-Trichrom-Histologiebilder werden als Zusätzliche Datei 1 bereitgestellt.

Abbildung 1: Experimenteller Aufbau und Studienzeitplan. Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs. Dreißig erwachsene männliche Wistar-Ratten wurden nach einer 7-tägigen Eingewöhnungsphase zufällig auf fünf Gruppen (n = 6 pro Gruppe) verteilt. Die Kontrollgruppe erhielt weder eine Wasserkarenz, noch eine CI-AKI-Induktion oder eine Behandlung. Die verbleibenden Gruppen erhielten eine einmalige 16-stündige Wasserkarenz, gefolgt von einer sequenziellen intravenösen Gabe von L-NAME (10 mg/kg), Indomethacin (10 mg/kg) und Iohexol (3 g Jod/kg) zur Induktion einer CI-AKI. Eine Stunde nach der Gabe von Iohexol erhielten die entsprechenden Behandlungsgruppen Montelukast (10 mg/kg, orale Gavage), NAC (100 mg/kg, intraperitoneale Injektion) oder beides einmal täglich an den Tagen 8–10, während die unbehandelte CI-AKI-Gruppe keine therapeutische Behandlung erhielt. Alle Gruppen wurden am Tag 11 euthanasiert, und es erfolgte die Probennahme. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Repräsentative HE- und Massonscher Dreifachfarbung gefärbte Nierenschnitte aus den experimentellen Gruppen. Repräsentative HE- und Massonscher Dreifachfarbung gefärbte Nierenschnitte aus den Gruppen (A) Kontrolle, (B) CI-AKI, (C) CI-AKI + Montelukast, (D) CI-AKI + NAC und (E) CI-AKI + Montelukast + NAC. Die HE-gefärbten Schnitte (obere Reihe) zeigen eine erhaltene Nierenarchitektur in der Kontrollgruppe, während die CI-AKI-Gruppe ausgeprägte tubuläre Nekrose (*), tubuläre Dilatation (+), zelluläre Degeneration (×) und vaskuläre Kongestion (↑) aufweist. Diese histopathologischen Veränderungen waren in den repräsentativen Schnitten der Behandlungsgruppen im Vergleich zur unbehandelten CI-AKI-Gruppe gemindert. Die mit Massonscher Dreifachfarbung gefärbten Schnitte (untere Reihe) zeigen eine erhöhte interstitielle Kollagenablagerung und tubulointerstitielle Desorganisation in der CI-AKI-Gruppe, wobei diese Veränderungen in den repräsentativen Schnitten der Behandlungsgruppen weniger ausgeprägt erschienen. Maßstabsbalken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Variable	Kontrolle	CI-AKI	CI-AKI+M	CI-AKI+NAC	CI-AKI+NAC+M	p
UREA (mg/dL)	67,43±53,11a	606,71±429,42b	105,89±28,63a	243,14±135,99a	293,61±212,05a	0,003
BUN (mg/dL)	31,51±24,82a	268,63±190,84b	51,53±14,69a	129,54±73,54a	108,38±87,36a	0,003
Kreatinin (mg/dL)	0,60±0,05a	3,27±2,14b	0,61±0,12a	1,53±1,17a	1,28±0,55a	0,002
SOD (U/mL)	147,81±33,27a	92,23±16,37b	130,96±42,19a	137,87±31,95a	141,71±30,27a	0,044
GSH (mmol/L)	124,29±21,24b	66,05±24,72a	133,87±26,95bc	139,31±30,10bc	172,44±60,48c	0,001
CAT (U/mL)	93,35±18,75c	33,22±17,07a	58,67±32,95ab	52,64±19,97ab	75,46±26,85bc	0,003
MDA (nmol/mL)	23,42±13,48a	54,13±19,37b	22,40±14,81a	21,53±5,07a	37,01±9,29a	0,001
In jeder Zeile waren Gruppen, die mindestens einen hochgestellten Buchstaben gemeinsam haben, nicht signifikant verschieden, während Gruppen ohne gemeinsamen hochgestellten Buchstaben gemäß dem Duncan’schen post-hoc-Test signifikant verschieden waren (p < 0,05).

Tabelle 1: Biochemische und oxidative Stressparameter in den experimentellen Gruppen. Signifikante paarweise Unterschiede: Harnstoff, BUN, Kreatinin (CREA), SOD und MDA, CI-AKI im Vergleich zu Kontrolle, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC und CI-AKI+M+NAC; GSH, CI-AKI im Vergleich zu allen anderen Gruppen und Kontrolle im Vergleich zu CI-AKI+M+NAC; CAT, Kontrolle im Vergleich zu CI-AKI, CI-AKI+M und CI-AKI+NAC sowie CI-AKI im Vergleich zu CI-AKI+M+NAC. Die Daten sind als Mittelwert ± SD (n = 6) angegeben und wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließendem Duncan-Post-hoc-Test analysiert. Werte ohne gemeinsamen hochgestellten Buchstaben weisen signifikante Unterschiede auf (p < 0,05).

Variable	Kontrolle	CI-AKI	CI-AKI+M	CI-AKI+NAC	CI-AKI+NAC+M	p
Cystatin C (ng/mL)	10,30±0,78a	18,43±1,06b	10,90±1,13a	11,00±0,59a	11,13±0,84a	<0,001
IL-6 (ng/L)	9,29±2,70a	13,41±2,14b	10,24±0,86a	10,66±0,83a	10,85±1,63a	0,008
KIM-1 (ng/mL)	2,25±0,54a	3,07±0,36b	2,39±0,60a	2,45±0,33a	2,45±0,17a	0,027
TNF-α (ng/L)	95,49±16,98a	161,69±26,14b	110,26±38,12a	119,42±35,35a	127,76±15,13a	0,006
IL-1β (ng/mL)	7,65±0,53ab	9,28±0,68c	7,34±0,57a	8,24±0,73b	8,11±0,72ab	<0,001
In jeder Zeile waren Gruppen, die mindestens einen hochgestellten Buchstaben gemeinsam haben, nicht signifikant verschieden, während Gruppen ohne gemeinsamen hochgestellten Buchstaben gemäß dem post-hoc-Test nach Duncan signifikant verschieden waren (p < 0,05).

Tabelle 2: Nierenschaden- und entzündliche Biomarkerwerte in den experimentellen Gruppen. Signifikante paarweise Unterschiede: Cystatin C, IL-6, KIM-1 und TNF-α, CI-AKI im Vergleich zu Kontrolle, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC und CI-AKI+M+NAC; IL-1β, CI-AKI im Vergleich zu allen anderen Gruppen sowie CI-AKI+M im Vergleich zu CI-AKI+NAC. Die Daten sind als Mittelwert ± SD (n = 6) angegeben und wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließendem Duncan-Post-hoc-Test analysiert. Werte ohne gemeinsamen hochgestellten Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p < 0,05).

Gruppen	tubuläre Nekrose	tubuläre Dilatation	zelluläre Degeneration	gefässige Stauung
Kontrolle	0	0	0	0
CI-AKI	2,67	2,83	2,67	2,5
CI-AKI+M	1,33	1,5	1,17	1
CI-AKI+NAC	1,17	1,17	0,83	0,83
CI-AKI+NAC+M	0,5	0,67	0,5	0,17

Tabelle 3: Vergleich der histopathologischen Schadensparameter im Nierengewebe in den experimentellen Gruppen. Semi-quantitative, auf HE basierende histopathologische Verletzungsscores werden als Gruppenmittelwerte (n = 6 Tiere/Gruppe) angegeben. Die Scores wurden wie folgt eingestuft: 0 (kein Schaden), 1 (leicht), 2 (mäßig) und 3 (schwerer Schaden), wobei höhere Werte auf eine stärkere histopathologische Schädigung hinweisen.

Zusatzdatei 1: Daten zur Unterstützung der Ergebnisse dieser Studie.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese experimentelle Studie zu CI-AKI untersuchte die Wirkung einer postkontrastmittelauslösenden Behandlung mit Montelukast, NAC oder deren Kombination hinsichtlich der Nierenfunktion, Parameter des oxidativen Stresses, entzündlichen Reaktionen, Biomarker der Nierenschädigung sowie histopathologischer Ergebnisse. Die Kontrastmittelgabe führte zu erheblichen Anstiegen von Harnstoff, BUN und Kreatinin im Serum und ging mit nachteiligen Veränderungen der Parameter des oxidativen Stresses sowie entzündlicher Biomarker einher. Erhöhte Werte von KIM-1 und Cystatin C lieferten zusätzliche Hinweise auf eine Nierenschädigung.

Die Behandlung nach Kontrastmittelgabe mit Montelukast, NAC oder der Kombination beider zeigte günstige Veränderungen bei mehreren untersuchten Parametern. Die Kombination war jedoch bei den biochemischen Ergebnissen nicht durchgängig wirksamer als die Monotherapie mit Montelukast. Insgesamt sind diese Beobachtungen vereinbar mit der Beteiligung von oxidativem Stress und Entzündung bei der CI-AKI und deuten darauf hin, dass therapeutische Eingriffe, die auf diese Prozesse wirken, die Nierenschädigung abschwächen könnten, obwohl die zugrundeliegenden Signalwege in der vorliegenden Studie nicht direkt untersucht wurden^1,30.

Die deutlichen Anstiege von Harnstoff, BUN und Kreatinin im Serum nach der Gabe von Kontrastmittel unterstützen die erfolgreiche Induktion einer Nierenfunktionsstörung in diesem experimentellen CI-AKI-Modell. Die Exposition gegenüber Kontrastmitteln kann die Nierenfunktion durch wechselwirkende Prozesse beeinträchtigen, zu denen intrarenale Vasokonstriktion, medulläre Hypoxie, oxidativer Schaden und tubuläre Zellschädigung gehören. Die daraus resultierende Verminderung der Nierendurchblutung und der glomerulären Filtration kann die Ausscheidung stickstoffhaltiger Abbauprodukte einschränken und dadurch deren zirkulierende Konzentration erhöhen. Die beobachteten Veränderungen der Nierenfunktion in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe stimmen mit den Ergebnissen früherer experimenteller Studien überein^1,30,31,32.

Bei Harnstoff und BUN im Serum wurde in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe eine erhebliche Variabilität innerhalb der Gruppe beobachtet, was sich in den relativ großen Standardabweichungen widerspiegelt. Diese Streuung könnte interindividuelle biologische Unterschiede in der Anfälligkeit für das sensibilisierte CI-AKI-Induktionsprotokoll widerspiegeln, einschließlich der Variabilität der renalen Reaktion auf Wasserverweigerung, Hemmung der Stickoxid- und Prostaglandinwege sowie Kontrastmittelexposition. Geringfügige Unterschiede in der renalen funktionellen Reserve und den physiologischen Reaktionen zwischen den Tieren könnten ebenfalls zu der heterogenen Schwere der Nierenschädigung beigetragen haben. Die großen Standardabweichungen sollten daher als Hinweis auf eine erhebliche biologische Variabilität innerhalb dieses experimentellen Modells und nicht als Messfehler interpretiert werden. Dennoch sollten die Verteilungseigenschaften und das Ausmaß behandlungsbedingter Unterschiede angesichts der geringen Anzahl von Tieren in jeder Gruppe vorsichtig interpretiert werden.

In der vorliegenden Studie waren Serumharnstoff, BUN und Kreatinin in der mit NAC behandelten Gruppe numerisch niedriger als in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe, ein Muster, das mit einer möglichen Abschwächung der Nierenfunktionsstörung übereinstimmt. NAC wurde bei CI-AKI umfassend untersucht, doch seine berichteten Wirkungen auf die Nierenfunktion variierten zwischen den Studien^14,15,16,17. Vorgeschlagene Wirkmechanismen umfassen das Abfangen reaktiver Spezies, die Unterstützung der Glutathion-Synthese sowie die Begrenzung oxidativer Schäden im Nierengewebe¹. Daher könnte das nach der NAC-Behandlung beobachtete Profil der Nierenfunktion mit seinen antioxidativen Eigenschaften zusammenhängen, obwohl dieser Mechanismus in der vorliegenden Studie nicht direkt untersucht wurde.

In der vorliegenden Studie waren Serumharnstoff, BUN und Kreatinin in der mit Montelukast behandelten Gruppe numerisch niedriger als in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe, was auf eine mögliche Abschwächung der Nierenfunktionsstörung hindeutet. Frühere experimentelle Studien, einschließlich Untersuchungen zur CI-AKI, berichteten ebenfalls über niedrigere Werte von Serumkreatinin und Harnstoff nach Gabe von Montelukast^9,18,19. Auch die Kombinationsgruppe wies numerisch niedrigere Marker der Nierenfunktion auf als die unbehandelte CI-AKI-Gruppe. Harnstoff, BUN und Kreatinin waren jedoch bei der Monotherapie mit Montelukast numerisch niedriger als bei der kombinierten Behandlung, und die post-hoc-Vergleiche nach Duncan zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen diesen beiden Gruppen (p > 0,05). Somit zeigte die Kombinationstherapie bezüglich dieser Marker der Nierenfunktion keine Überlegenheit gegenüber der Monotherapie mit Montelukast.

Oxidativer Schaden gilt als wichtiger Faktor bei der Pathophysiologie der CI-AKI. Eine durch Kontrastmittelverabreichung hervorgerufene Hypoxie im Markbereich fördert die übermäßige Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die zelluläre Lipide und Mitochondrien schädigen, tubuläre Epithelzellen verletzen und entzündliche Signalwege verstärken können^1,12,30.

Die unbehandelte CI-AKI-Gruppe wies die höchste MDA-Konzentration sowie die niedrigsten SOD- und CAT-Aktivitäten und den niedrigsten GSH-Spiegel auf, was auf ein Ungleichgewicht zwischen oxidativer Belastung und antioxidativen Abwehrmechanismen nach Kontrastmittelgabe hinweist. Vergleichbare Profile, gekennzeichnet durch erhöhtes MDA und verminderte antioxidative Kapazität, wurden bereits in anderen experimentellen Modellen der CI-AKI berichtet^18,19. Diese Befunde sprechen dafür, dass oxidativer Stress zur Entstehung und Progression der Nierenschädigung beiträgt und nicht ausschließlich sekundär auftritt^1,30.

Im Vergleich zur unbehandelten CI-AKI-Gruppe zeigten die mit NAC und Montelukast behandelten Gruppen im Allgemeinen niedrigere MDA-Werte in Kombination mit höheren SOD-, GSH- und CAT-Werten, ein Muster, das mit einer Abschwächung der oxidativen Schädigung vereinbar ist. Zu den vorgeschlagenen antioxidativen Wirkungen von NAC gehören die Neutralisierung reaktiver Spezies und die Aufrechterhaltung der intrazellulären Glutathionverfügbarkeit^1,14. Montelukast könnte die renale oxidative Schädigung ebenfalls über Mechanismen begrenzen, die über eine Blockade der zysteinyl-Leukotrien-Rezeptoren hinausgehen, einschließlich der Unterdrückung oxidativer Reaktionen im Nierengewebe^18,33. Frühere Studien zu Nierenschädigungen, einschließlich CI-AKI-Modelle, berichteten ähnlich über verminderte Lipidperoxidation und verbesserte antioxidative Abwehrmechanismen nach Montelukast-Behandlung^9,19,27. Obwohl günstige Parameter bezüglich oxidativen Stresses ebenfalls in der Kombinationsgruppe beobachtet wurden, übertraf die kombinierte Behandlung nicht durchgängig eine der beiden Monotherapien. Entsprechend belegen diese Ergebnisse keinen additiven oder synergistischen antioxidativen Effekt von gemeinsam verabreichtem NAC und Montelukast.

Die Befunde zu KIM-1 und Cystatin C lieferten komplementäre Hinweise auf eine Nierenschädigung nach Kontrastmittelgabe. KIM-1 ist vorwiegend mit tubulärepithelialen Schäden assoziiert, während Cystatin C als Indikator für Veränderungen der Nierenfiltration und -schädigung verwendet wird; beide wurden bereits als frühe Biomarker in experimentellen Modellen der kontrastmittelinduzierten akuten Nierenschädigung (CI-AKI) untersucht^1,10. In der unbehandelten CI-AKI-Gruppe gingen die höchsten Konzentrationen beider Biomarker mit einer deutlichen Verschlechterung der konventionellen Parameter der Nierenfunktion einher. Dieses Muster stimmt mit früheren experimentellen Studien überein, die einen Anstieg von KIM-1 und Cystatin C nach kontrastmittelinduzierter Nierenschädigung berichteten^1,10.

Im Vergleich zur unbehandelten CI-AKI-Gruppe wiesen die Behandlungsgruppen niedrigere Werte für KIM-1 und Cystatin C auf, ein Muster, das mit einer Abschwächung der Nierenschädigung vereinbar ist. Dieses Biomarker-Profil stand im Einklang mit den numerisch niedrigeren Konzentrationen von Harnstoff und Kreatinin im Serum, die nach der Behandlung beobachtet wurden. Frühere experimentelle Studien haben die Gabe von Montelukast mit einer verringerten KIM-1-Expression, einer weniger schweren tubulären Schädigung und einer Erhaltung der Nierenfunktion bei CI-AKI sowie anderen Nierenschädigungsmodellen assoziiert^9,18,19. Ebenso wurde NAC mit günstigeren Biomarker-Profilen bei akutem Nierenversagen in Verbindung gebracht, möglicherweise durch die Begrenzung oxidativer zellulärer Schäden^14,15,16,17. Zwischen der Kombinationsbehandlungs- und der Montelukast-Monotherapie-Gruppe wurden jedoch keine statistisch signifikanten Unterschiede bei KIM-1 oder Cystatin C festgestellt (p > 0,05). Demnach zeigen die vorliegenden Ergebnisse keinen zusätzlichen biomarkerbezogenen Vorteil der kombinierten Behandlung.

Oxidative und entzündliche Reaktionen können sich während der CI-AKI gegenseitig verstärken. Ein Überschuss an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) kann proinflammatorische Signalwege aktivieren, wobei anschließende Anstiege von TNF-α, IL-1β und IL-6 die Nierengewebeschädigung möglicherweise verstärken^1,12,13,30.

Die unbehandelte CI-AKI-Gruppe wies die höchsten Konzentrationen an TNF-α, IL-1β und IL-6 auf, was die Ausbildung einer Entzündungsreaktion nach Kontrastmittelgabe unterstützt. In experimentellen CI-AKI-Modellen wurden Anstiege dieser Zytokine mit tubulären Verletzungen, inflammatorischem Zellinfiltrat und eingeschränkter Nierenfunktion assoziiert^10,12,13. Das in der vorliegenden Studie beobachtete inflammatorische Zytokinprofil stimmt mit früheren experimentellen Befunden überein, die nach Gabe von Kontrastmitteln beschrieben wurden¹.

Die Gruppen, die mit NAC und Montelukast behandelt wurden, wiesen niedrigere Werte für TNF-α, IL-1β und IL-6 auf als die unbehandelte CI-AKI-Gruppe, ein Muster, das mit einer Abschwächung der entzündlichen Reaktion vereinbar ist. Die für NAC vorgeschlagene antiinflammatorische Aktivität könnte teilweise auf einer verminderten oxidativen Belastung und der daraus resultierenden Einschränkung der Produktion proinflammatorischer Zytokine beruhen^{1,14,15,16,17}. Montelukast könnte die Zytokinexpression durch Blockade des zysteinyl-Leukotrien-Rezeptors sowie durch Modulation weiterer entzündlicher Signalprozesse beeinflussen^18,33. Experimentelle Studien zu Nierenschädigungen haben Montelukast-Behandlung ebenfalls mit einer verminderten NF-κB-vermittelten Signalübertragung und proinflammatorischer Aktivität assoziiert^9,19,27. Entsprechend ist das in dieser Studie beobachtete Zytokinprofil vereinbar mit einer Modulation entzündlicher Prozesse, an denen Signalwege wie NF-κB und das NOD-ähnliche Rezeptor-Familien-Pyrin-Domänen-enthaltende 3 (NLRP3)-Inflammasom beteiligt sind. Allerdings wurden NF-κB, NLRP3 und NOX4 nicht direkt gemessen; daher liefern die Biomarker-Befunde lediglich indirekte Hinweise und können keine spezifische Aktivierung oder Hemmung einzelner Signalwege belegen.

Die Werte entzündungsfördernder Zytokine waren in der Kombinationsbehandlungsgruppe niedriger als in der unbehandelten CI-AKI-Gruppe, doch führte die kombinierte Behandlung nicht durchgängig zu niedrigeren Werten als Montelukast allein. Zwischen den Gruppen CI-AKI + Montelukast und CI-AKI + Montelukast + NAC wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede bezüglich TNF-α, IL-1β oder IL-6 festgestellt (p > 0,05). Somit liefern die vorliegenden Ergebnisse keinen Hinweis darauf, dass die Zugabe von NAC zu Montelukast einen zusätzlichen entzündungshemmenden Nutzen bietet.

Histopathologische Untersuchungen zeigten darüber hinaus, dass die Gabe von Kontrastmitteln zu erheblichen strukturellen Nierenschäden führte. Die im CI-AKI-Kollektiv beobachteten Befunde wie tubuläre Nekrose, tubuläre Dilatation, zelluläre Degeneration und vaskuläre Stauung repräsentieren charakteristische histopathologische Merkmale des CI-AKI und wurden mit einer beeinträchtigten Nierendurchblutung, oxidativem Stress sowie tubulärer Zellschädigung assoziiert^1,12,18,19. Gemeinsam mit den biochemischen Befunden bestätigen diese histopathologischen Veränderungen, dass die Applikation von Kontrastmitteln zu signifikanten Schäden im Nierengewebe führte. Der geringere Schweregrad histopathologischer Läsionen in den Gruppen, die mit Montelukast oder NAC behandelt wurden, legt nahe, dass diese Substanzen schützende Effekte auf das Nierengewebe ausüben können. Bemerkenswert ist, dass die Kombinationstherapiegruppe unter allen Behandlungsgruppen die numerisch niedrigsten histopathologischen Schadenswerte aufwies. Darüber hinaus zeigte die qualitative Beurteilung von mit der Masson-Trichrom-Färbung präparierten Schnitten eine weniger ausgeprägte interstitielle Kollagenablagerung und eine bessere Erhaltung der tubulointerstitiellen Architektur in den Behandlungsgruppen im Vergleich zur unbehandelten CI-AKI-Gruppe. Angesichts der kurzen Beobachtungsdauer und des qualitativen Charakters der Masson-Trichrom-Bewertung sollten diese Ergebnisse als Hinweis auf eine bessere strukturelle Erhaltung zum untersuchten Zeitpunkt verstanden werden, nicht jedoch als Beleg für veränderte langfristige Remodellierung der extrazellulären Matrix.

Die semiquantitative histopathologische Beurteilung war mit den qualitativen Beobachtungen vereinbar und zeigte bei allen Behandlungsgruppen im Vergleich zur unbehandelten CI-AKI-Gruppe niedrigere Schadenswerte. Obwohl die Kombinationsgruppe numerisch die niedrigsten histopathologischen Schadenswerte aufwies, ging dieser Befund nicht mit einer durchgängig überlegenen Wirkung in den biochemischen Ergebnissen einher. Daher sollten die günstigen histopathologischen Befunde bei kombinierter Behandlung im vorliegenden Studiendesign nicht als Hinweis auf einen additiven oder synergistischen Effekt interpretiert werden. Ebenso haben frühere Studien an experimentellen Modellen der CI-AKI und anderen Formen akuter Nierenschädigungen berichtet, dass die Hemmung von oxidativem Stress und Entzündungen histopathologische Schäden verringert und zur Erhaltung der tubulären Integrität beiträgt^9,18,19,27.

Ein offensichtlicher Widerspruch zeigte sich zwischen den biochemischen und den histopathologischen Befunden. Obwohl mehrere biochemische Parameter numerisch günstiger in der Montelukast-Monotherapiegruppe im Vergleich zur Kombinationsgruppe waren, waren diese Unterschiede statistisch nicht signifikant. Im Gegensatz dazu wiesen die Kombinationsgruppe die numerisch niedrigsten histopathologischen Schädigungswerte auf. Diese teilweise Diskrepanz könnte Unterschiede in den biologischen Prozessen und zeitlichen Verläufen widerspiegeln, die von den beiden Bewertungsmethoden erfasst werden. Die histopathologische Untersuchung bewertet direkt die lokalen zellulären und strukturellen Schäden im Nierengewebe und kann daher eine Gewebeerhaltung zum untersuchten Zeitpunkt aufzeigen, selbst wenn sich die serumbasierten Nierenfunktionsmarker und andere biochemische Parameter nicht in gleichem Maße verbessern. Im Gegensatz dazu liefern biochemische Parameter indirekte funktionelle oder molekulare Aussagen und können durch die renale funktionelle Reserve, kompensatorische Mechanismen, biologische Variabilität zwischen den Tieren sowie den Zeitpunkt der Probennahme beeinflusst sein. Da alle Endpunkte zu einem einzigen, terminalen Zeitpunkt erhoben wurden, könnten strukturelle Erhaltung und biochemische Erholung nicht synchron verlaufen sein. Demzufolge sollte das günstigere histopathologische Erscheinungsbild in der Kombinationsgruppe als Unterschied zwischen den Bewertungsmethoden verstanden werden und nicht als Hinweis auf eine überlegene Gesamtwirksamkeit. Dennoch wurden die histopathologischen Bewertungen zwar unter verblindeten Bedingungen durchgeführt, um Beobachterbias zu minimieren, alle Gewebeschnitte wurden jedoch von einem einzigen Pathologen beurteilt, sodass eine Beurteilung der Inter-Observer-Variabilität nicht möglich war. Zukünftige Studien mit mehreren unabhängigen Auswertern könnten die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der histopathologischen Befunde weiter erhöhen.

Die reproduzierbare Anwendung dieses Modells hängt von der konsistenten Durchführung mehrerer Verfahrensschritte ab. Die Dauer der Wasserverweigerung, die festgelegten Zeitintervalle zwischen der Verabreichung von L-NAME, Indomethacin und Iohexol sowie die langsame intravenöse Gabe von Iohexol sollten bei allen Tieren standardisiert werden. Eine Extravasation in die Schwanzvene kann die effektive Kontrastmittelmenge verringern und die Variabilität des Schweregrads der Nierenschädigung erhöhen; daher sollte die Injektionsstelle während der gesamten Verabreichung sorgfältig überwacht werden. Tritt während der Injektion eine Leckage, Extravasation oder ein erheblicher Injektionswiderstand auf, sollte bei der Interpretation der entsprechenden Befunde die Möglichkeit einer unvollständigen Kontrastmittelgabe berücksichtigt werden. Die Konsistenz der Dosis kann auch durch Regurgitation während der oralen Gavage oder eine unzureichende Re-Suspension der Montelukast-Zubereitung beeinträchtigt werden. Die Anwendung derselben standardisierten Verfahren bei allen Tieren sowie die Zuweisung der Applikationen an dieselbe Versuchsperson, soweit möglich, kann vermeidbare Verfahrensvariabilitäten reduzieren.

Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung eines CI-AKI innerhalb eines relativ kurzen experimentellen Zeitraums, wobei biochemische und histopathologische Ergebnisse im selben Tiermodell untersucht werden können^1,2,9.

Eine Stärke der vorliegenden Studie besteht darin, dass die Nierenschädigung unter Verwendung komplementärer funktioneller, biochemischer, entzündlicher und histopathologischer Endpunkte charakterisiert wurde. Die gleichzeitige Bewertung von Nierenfunktionsparametern zusammen mit Parametern des oxidativen Stresses, entzündlichen Zytokinen, KIM-1, Cystatin C und der Nierengewebsmorphologie ermöglichte es, mehrere Komponenten der CI-AKI innerhalb desselben Experiments zu untersuchen. Die Einbeziehung von KIM-1 und Cystatin C erweiterte die Beurteilung zudem über konventionelle Kreatininmessungen im Serum hinaus. Die getrennte und kombinierte Anwendung von Montelukast und NAC ermöglichte einen direkten Vergleich der Behandlungsstrategien; allerdings zeigten die Ergebnisse keine durchgängige Überlegenheit der Kombinationsbehandlung gegenüber der Monotherapie in Bezug auf die untersuchten Endpunkte. Darüber hinaus integriert das vorliegende Modell im Gegensatz zu Induktionsansätzen, die allein auf der Kontrastmittelgabe basieren, eine renale Vasokonstriktion und medulläre Hypoxie und schafft somit ein ausgeprägtes Szenario einer Nierenschädigung, in dem behandlungsbedingte biologische Veränderungen evaluiert werden können.

Das 1 h lange Intervall zwischen Kontrastmittelgabe und Behandlungsbeginn stellt lediglich den in diesem experimentellen Protokoll untersuchten Zeitpunkt dar und sollte nicht als klinisch validiertes therapeutisches Zeitfenster interpretiert werden. Obwohl eine Behandlung kurz nach bekannter Kontrastmittelgabe für zukünftige translationsmedizinische Forschung relevant sein könnte, kann die vorliegende Tierversuchsstudie deren Durchführbarkeit oder Wirksamkeit im klinischen Umfeld nicht beurteilen. Insbesondere der optimale Zeitpunkt des Therapiebeginns, die Dosis, die Verabreichungsroute, die Behandlungsdauer sowie die geeignete Patientenpopulation sind unbekannt. Diese Faktoren müssen in speziellen translationsmedizinischen und klinischen Studien untersucht werden, bevor eine Gabe von N-Acetylcystein oder Montelukast nach Kontrastmittelanwendung für den klinischen Einsatz in Betracht gezogen werden kann.

Mehrere Einschränkungen der vorliegenden Studie sollten anerkannt werden. Die Ergebnisse wurden an einem präklinischen Tiermodell gewonnen und können daher nicht direkt auf die klinische Praxis übertragen werden. Da das Protokoll eine Wasserverweigerung mit einer Hemmung der Stickoxid- und Prostaglandinwege kombinierte, könnte der resultierende Nierenschaden schwerer ausgeprägt gewesen sein als die Verletzung, die typischerweise nach Kontrastmittelgabe bei Patienten auftritt. Die Ergebnisse sollten folglich im Kontext dieser sensibilisierten experimentellen Versuchsanordnung interpretiert werden. Obwohl das Modell eine kontrollierte Evaluierung biologischer Reaktionen auf potenziell nephroprotektive Therapien ermöglicht, bildet es weder die gesamte Heterogenität noch das volle Schweregradspektrum einer klinischen CI-AKI ab. Die in dieser Studie beobachteten behandlungsassoziierten Veränderungen könnten daher bei Patienten mit geringerem oder variablerem Risikoprofil anders ausfallen. Eine Reproduktion an weniger intensiven Modellen, die gängigen klinischen Bedingungen näherkommen, gefolgt von angemessen konzipierten klinischen Studien, ist erforderlich, bevor die Größe oder klinische Relevanz dieser Effekte bestimmt werden kann. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass ausschließlich männliche Ratten in die Studie eingeschlossen wurden. Daher wurden mögliche geschlechtsspezifische Unterschiede in der Anfälligkeit für CI-AKI sowie in den Reaktionen auf NAC und Montelukast nicht untersucht, und die vorliegenden Ergebnisse sollten nicht als auf weibliche Tiere übertragbar angenommen werden. Zukünftige Studien, die beide Geschlechter einbeziehen, sind erforderlich, um zu klären, ob das Geschlecht den Schweregrad der Nierenschädigung oder die Therapieantwort beeinflusst.

Eine weitere Einschränkung ist das Fehlen einer prozeduralen Scheingruppe, die den experimentellen Gruppen hinsichtlich protokollbedingter Handhabung, Fixierung, Wasserverweigerung, Injektionen, oraler Gavage und Applikation des Fahrzeugs angepasst ist. Da die Kontrollgruppe diesen Prozeduren nicht unterzogen wurde, können ungleiche prozedurale Belastungen und unspezifische Effekte im Zusammenhang mit Fixierung, wiederholter Handhabung, Injektionen, oraler Gavage und Exposition gegenüber dem Fahrzeug nicht vollständig als mögliche Beiträge zu einigen der beobachteten Unterschiede zwischen der Kontroll- und den experimentellen Gruppen ausgeschlossen werden. Die Einbeziehung angemessen angepasster prozeduraler Schein- und Fahrzeug-Kontrollgruppen in zukünftige Studien würde helfen, diese unspezifischen, prozedurbezogenen Effekte von jenen zu unterscheiden, die spezifisch auf die Induktion und Behandlung von CI-AKI zurückzuführen sind.

Obwohl die vorgegebene Stichprobengröße so berechnet wurde, dass eine Power von 80 % zur Detektion eines angenommenen großen Gesamteffekts über die fünf experimentellen Gruppen hinweg erreicht wird, war die Studie nicht speziell darauf ausgelegt, kleinere paarweise Unterschiede zwischen den Monotherapie- und Kombinationstherapiegruppen nachzuweisen. Daher konnte die Studie eine begrenzte Power besitzen, solche Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen zu erkennen, und nichtsignifikante numerische Trends sollten nicht als Hinweis auf Äquivalenz interpretiert werden. Studien mit größeren Stichprobengrößen werden erforderlich sein, um zu bestimmen, ob diese Trends reproduzierbare Unterschiede in der Behandlung widerspiegeln.

Da jeweils nur eine einzige Dosis jedes Wirkstoffs untersucht wurde, kann die vorliegende Studie keine optimale NAC–Montelukast-Dosiskombination ermitteln, dosisabhängige synergistische oder antagonistische Wechselwirkungen charakterisieren oder den relativen Beitrag jedes einzelnen Wirkstoffs zu den bei der Kombinationsbehandlung beobachteten Effekten quantifizieren. Daher mag ein Wirkstoff stärker zu bestimmten Ergebnissen beigetragen haben, dies lässt sich jedoch aufgrund des aktuellen Studiendesigns nicht belegen. Zukünftige Studien, die mehrere Dosisstufen und formale Arzneimittel-Wechselwirkungsanalysen einbeziehen, sind erforderlich, um Dosis-Wirkungs-Beziehungen zu charakterisieren und ein optimales Kombinationsregime zu identifizieren.

Die Studie bewertete biochemische Indikatoren für oxidativen Stress und Entzündungen, untersuchte jedoch nicht direkt die damit verbundenen intrazellulären Signalwege. Daher können die beobachteten Biomarkerprofile nicht belegen, ob durch die Behandlung NF-κB-, NLRP3- oder NOX4-vermittelte Signalwege aktiviert oder gehemmt wurden. Zukünftige Untersuchungen mittels molekularer Methoden, einschließlich Western Blot und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), sind erforderlich, um aufzuklären, wie diese Signalwege zu den renalen Wirkungen von Montelukast und NAC beitragen.

Da die Bewertungen auf die akute Phase beschränkt waren, liefert die vorliegende Studie keine Informationen über eine spätere Nierenregeneration oder langfristige Gewebeumbildung. Die im Behandlungszeitpunkt beobachtete relativ begrenzte Kollagenablagerung in den Behandlungsgruppen sollte daher als früher struktureller Befund betrachtet werden, nicht als Nachweis dafür, dass eine chronische Nierenfibrose verhindert wurde. Dieser Befund könnte stattdessen eine Abschwächung des initialen Nierenbefalls widerspiegeln. Längsschnittstudien mit späteren Untersuchungszeitpunkten sind erforderlich, um zu klären, ob diese frühen Veränderungen anhalten und ob sie die langfristige Nierenfunktion oder die Gewebeumbildung beeinflussen.

Insgesamt war die Gabe von Montelukast und NAC nach Kontrastmittelverabreichung, einzeln oder in Kombination, mit einer Abschwächung der Nierenfunktionsstörung, oxidativen Belastung, entzündlichen Reaktionen und histopathologischen Schäden in diesem experimentellen CI-AKI-Modell verbunden. Die Kombinationsbehandlung zeigte jedoch bei den untersuchten Endpunkten keine einheitlich überlegene Wirkung im Vergleich zur Monotherapie. Diese Ergebnisse beschränken sich auf das vorliegende präklinische Modell und unterstützen weitere experimentelle Untersuchungen, anstelle einer direkten Übertragung auf die klinische Praxis.

Zusammenfassend war eine postkontrastmittelgebene Behandlung mit Montelukast, NAC oder deren Kombination mit günstigeren biochemischen und histopathologischen Befunden in diesem experimentellen CI-AKI-Modell assoziiert. Allerdings zeigte die kombinierte Therapie bei den untersuchten Endpunkten nicht durchgängig eine Überlegenheit gegenüber der Monotherapie. Da diese Beobachtungen in einer präklinischen Tiervorstudie gewonnen wurden, sollten sie als Grundlage für weitere experimentelle Validierungen betrachtet werden, nicht jedoch als Beleg für klinische Wirksamkeit oder Anwendbarkeit. Weitere Forschung ist erforderlich, um die potenzielle Relevanz dieser postkontrastmittelgebene Therapieansätze für das klinische CI-AKI zu klären.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Automatischer Streifen-Wascher	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	Automatisierte ELISA-Plattenwäsche.
Mikroplattenreader	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	ELISA-Absorptionsmessungen. RRID:SCR_028651
10 % neutral gepuffertes Formalin	Merck	Nicht erfasst	Gewebefixierung für die histopathologische Untersuchung.
Benchtop-Zentrifuge	Nüve	NF048	Probenvorbereitung und Zentrifugation.
Carboxymethylcellulose (CMC)	Sigma-Aldrich, USA	C5678	Fahrzeug zur Suspension von Montelukast.
CAT-Kit Universal	Otto Scientific	Otto3051	Farbmessung der CAT-Aktivität im Serum mittels eines Mindray-BS-400-Chemieanalysators.
Digitaler Homogenisator	Daihan Scientific	HG-15D	Gewebshomogenisierung.
Eosin Y (gelblich)	Merck	1.15935.0025	HE-Färbung.
Harris-Hämatoxylinslösung	BSLAB	BS-002	HE-Färbung.
Indomethacin	Sigma-Aldrich, USA	I7378	Zur Induktion von CI-AKI verwendet.
Iohexol (Omnipaque 300)	GE HealthCare	Nicht erfasst	Kontrastmittel zur Induktion von CI-AKI.
Ketaminhydrochlorid (Ketalar)	Pfizer, USA	Nicht erfasst	Allgemeine Anästhesie vor der Probenentnahme.
Lichtmikroskop (Nikon Eclipse)	Nikon	Ni-U	Histopathologische Untersuchung und Bildgebung. RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginin-Methylester)	Sigma-Aldrich, USA	N5751	Zur Induktion von CI-AKI verwendet.
Massons-Trichrom-Färbekit	MOSLAB, Türkei	BKMTO001	Masson-Trichrom-Färbung.
Mindray-Chemieanalysator	Mindray	BS-400	Biochemische Analysen.
Montelukast-Natrium	Sigma-Aldrich, USA	SML0101	Oral per Gavage als Behandlung verabreicht.
N-Acetylcystein (ASIST 300 mg/2 mL)	MAC laç, Türkei	Nicht erfasst	Intraperitoneal als Behandlung verabreicht.
Ratten-Cystatin-C-ELISA-Kit	BT Lab, China	E0145Ra	ELISA-Messung von Cystatin C in Nierengewebesupernatanten.
Ratten-IL-1β-ELISA-Kit	BT Lab, China	E0119Ra	ELISA-Messung von IL-1β in Nierengewebesupernatanten.
Ratten-IL-6-ELISA-Kit	BT Lab, China	E0135Ra	ELISA-Messung von IL-6 in Nierengewebesupernatanten.
Ratten-KIM-1-ELISA-Kit	BT Lab, China	E0549Ra	ELISA-Messung von KIM-1 in Nierengewebesupernatanten.
Ratten-TNF-α-ELISA-Kit	BT Lab, China	E0764Ra	ELISA-Messung von TNF-α in Nierengewebesupernatanten.
Edelstahlfütterungsnadel (22 G orale Gavage-Kanüle)	Instech Laboratories, USA	Nicht erfasst	Verabreichung per oraler Gavage.
Standardisierte pelletierte Nagetierkost (Optima)	Optima, Türkei	Nicht erfasst	Chargennummer 58931. Nährstoffzusammensetzung: 24 % Rohprotein, 3,94 % Rohcellulose, 5,08 % Rohfett, 8,8 % Rohasche, 1,44 % Lysin, 0,61 % Methionin, 1,14 % Calcium, 0,89 % Phosphor und 0,28 % Natrium.
Universal-Creatinin-Kit	Otto Scientific	OttoBC139	Farbmessung von Kreatinin im Serum.
Universal-GSH-Kit	Otto Scientific	Otto3053	Farbmessung von GSH in EDTA-antikoaguliertem Blut mittels einer modifizierten Ellman-Methode.
Universal-MDA-Kit	Otto Scientific	Otto1001	Farbmessung von MDA im Serum mittels eines ELx800-Mikroplattenreaders.
Universal-SOD-Kit	Otto Scientific	Otto3047	Farbmessung der SOD-Aktivität im Serum mittels eines Mindray-BS-400-Chemieanalysators.
Universal-Harnstoff-Kit	Otto Scientific	OttoBC157	Farbmessung von Harnstoff und BUN im Serum.
Xylazinhydrochlorid (Rompun)	Bayer, Deutschland	Nicht erfasst	Allgemeine Anästhesie vor der Probenentnahme.