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Yangjing-Kapseln lindern die spermatogene Dysfunktion bei Mäusen durch Hemmung des QKI-5/p38-MAPK-Signalwegs mittels Hochregulierung der lncRNA NONMMUT031883.2

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DOI:

10.3791/73166

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28. August 2026

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1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht die schützenden Wirkungen von Yangjing-Kapseln bei cyclophosphamidinduzierter Spermatogenesestörung bei Mäusen und prüft die Beteiligung des lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK-Signalwegs.

Zusammenfassung

Die Spermatogenese-Dysfunktion ist eine wichtige Ursache für männliche Unfruchtbarkeit, und Cyclophosphamid (CP) kann die Spermatogenese beeinträchtigen, indem es eine abnormale Apoptose der Spermatogonien induziert. Die Yangjing-Kapsel (YC) wird zur Verbesserung der Fortpflanzungsfunktion eingesetzt, doch ihr zugrundeliegender molekularer Wirkmechanismus ist bisher unklar. Diese Studie untersuchte die schützenden Effekte von YC in einem CP-induzierten Mausmodell der Spermatogenese-Dysfunktion sowie in GC-1-Spermatogonien. Die Spermienanzahl und -motilität, die männliche Fruchtbarkeit, die Konzentration der Sexualhormone im Serum sowie histopathologische Veränderungen in Hoden und Nebenhoden wurden analysiert. In GC-1-Zellen wurden Zellviabilität, Laktatdehydrogenase-Freisetzung, Apoptose und apoptosebezogene Proteine untersucht. Quantitative reversetranskriptive Polymerase-Kettenreaktion, RNA-Pull-down-Assays, Immunfluoreszenz und Western Blotting dienten der Untersuchung der lncRNA NONMMUT031883.2, Quaking-5 (QKI-5) und des p38-MAPK-Signalwegs (p38 mitogen-aktivierte Proteinkinase). YC verbesserte dosisabhängig die Spermienqualität, die Konzentration der Sexualhormone im Serum, die Morphologie der Fortpflanzungsorgane, die Hodenhistopathologie und die Fruchtbarkeit bei CP-behandelten Mäusen. In GC-1-Zellen erhöhte YC die Zellviabilität und verringerte zelluläre Schäden sowie die Apoptose. Die lncRNA NONMMUT031883.2 interagierte physikalisch mit QKI-5, und die Behandlung mit YC führte zu einer erhöhten Expression der lncRNA NONMMUT031883.2, während die Expression von QKI-5 und die Phosphorylierung von p38 abnahmen. Die Behandlung mit YC hemmte die durch Knockdown der lncRNA NONMMUT031883.2 induzierte Apoptose in GC-1-Zellen, während die Überexpression von QKI-5 die antiapoptotischen Effekte von YC abschwächte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YC die CP-induzierte Spermatogenese-Dysfunktion lindert und dass ihre schützenden Wirkungen über die Regulation des Signalwegs lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK vermittelt werden.

Einleitung

Die Spermatogenesestörung bezeichnet eine reproduktive Beeinträchtigung, die durch Abnormalitäten in der Spermienproduktion, -reifung oder -funktion im männlichen Fortpflanzungssystem verursacht wird. Sie zeichnet sich durch eine verminderte Spermienanzahl und -beweglichkeit sowie eine erhöhte Rate an Spermienfehlbildungen aus.1,2Die Pathogenese einer gestörten Spermatogenese ist komplex und mit genetischen Faktoren, Autoimmunerkrankungen, Umweltgiften, durch Chemotherapie verursachten Schäden sowie Läsionen der Fortpflanzungsorgane assoziiert3-5. Chemotherapeutika wie Cyclophosphamid (CP) können direkt die Hoden-Seminiferustubuli schädigen und die Apoptose von Spermatogonien induzieren, wodurch sie zur männlichen Spermatogenesestörung beitragen6,7Hormonersatztherapie, antioxidative Supplementierung und assistierte Fortpflanzungstechnologien werden derzeit als klinische Interventionen eingesetzt. Diese Ansätze weisen jedoch eine uneinheitliche Wirksamkeit sowie erhebliche Nebenwirkungen auf.8,9,10Daher ist die Identifizierung sicherer und wirksamer Interventionen sowie die Aufklärung ihrer molekularen Zielstrukturen klinisch wichtig, um die Fruchtbarkeitsprognose bei Patienten mit einer gestörten Spermatogenese zu verbessern.

Die chinesische Kräutermedizin hat aufgrund ihrer multizielträchtigen Eigenschaften und relativ geringen Toxizität Potenzial beim Schutz der männlichen Fortpflanzungsfunktion und bei der Behandlung von spermatogenen Dysfunktionen gezeigt11,12. Die Yangjing-Kapsel (YC) ist ein traditionelles chinesisches Patentarzneimittel, das aus Rehmannia glutinosa, Epimedium, Plazenta, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis und anderen chinesischen Kräutermedizinen besteht. Es wird verwendet, um die Niere und das Wesen zu stärken, das Blut und das Mark zu nähren und die Fortpflanzungsfunktion zu regulieren13. Frühere Studien haben gezeigt, dass YC die Sexualhormonspiegel bei männlichen Tieren regulieren, die Spermienqualität verbessern, Schäden im Hodengewebe reparieren und vor reproduktiven Schäden durch chemische Substanzen schützen kann14,15. Spermatogoniale Zellen bilden die Grundlage der Spermatogenese, und eine abnormale Apoptose spermatogonialer Zellen ist ein zentraler Vorgang bei der Entstehung spermogener Dysfunktionen16. Berichten zufolge kann YC auch die Vitalität spermatogonialer Zellen verbessern, den Anteil der Zellen in der S-Phase erhöhen und die Apoptose hemmen17. Die schützenden Wirkungen und spezifischen molekularen Mechanismen von YC bei CP-induzierter spermogener Dysfunktion sind jedoch noch nicht vollständig geklärt.

Lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) sind RNA-Moleküle, die länger als 200 Nukleotide sind und keine Proteinkodierungsfähigkeit besitzen18. LncRNAs können die Genexpression durch Mechanismen wie chromosomale Stilllegung, Chromatinmodifikation, genomisches Imprinting und transkriptionelle Aktivierung regulieren19,20. Das RNA-bindende Protein Quaking-5 (QKI-5) ist an physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt, darunter Zellproliferation und Apoptose, indem es die alternative Spleißung nachgeschalteter Gene reguliert21. Der p38-Mitogen-aktivierte Proteinkinase-(MAPK)-Signalweg ist an der Regulation der Apoptose beteiligt und spielt zudem eine wichtige Rolle bei der männlichen Fertilität und der Hodenentwicklung22,23. Eine frühere Studie zeigte, dass die Überexpression von QKI-5 den p38-MAPK-Signalweg in hepatzellulären Karzinomzellen aktiviert24. Außerdem wurde gezeigt, dass das lncRNA NONMMUT074098.2 in Spermatogonien an QKI-5 bindet, während die Absenkung von QKI-5 den p38-MAPK-Signalweg hemmte und die Apoptose von Spermatogonien verringerte25. In dieser Studie wurde ein durch CP induziertes Mausmodell der spermatogenen Dysfunktion verwendet, um zu untersuchen, ob YC die Expression des lncRNA NONMMUT031883.2 sowie die QKI-5/p38-MAPK-Signalachse reguliert und dadurch eine abnormale Apoptose von Spermatogonien reduziert und die durch CP induzierte spermatogene Dysfunktion abschwächt (Abbildung 1). Ziel war es, den molekularen Mechanismus aufzuklären, der den schützenden Wirkungen von YC auf die Spermatogenese zugrunde liegt, und das Verständnis über seine pharmakologische Rolle beim Schutz der männlichen Fortpflanzungsfunktion zu erweitern.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Designs. Das obere Panel fasst die in vitro-Experimente in GC-1-Spermatogonienzellen zusammen. Die Herunterregulierung der lncRNA NONMMUT031883.2 wurde verwendet, um Apoptose und zelluläre Schäden hervorzurufen, gefolgt von der Herunterregulierung von QKI-5, um deren Auswirkungen auf Apoptose und Zellschädigung zu bewerten. Das untere Panel fasst die in vivo-Experimente in Mausmodellen mit durch Cyclophosphamid (CP) induzierter spermatogener Dysfunktion zusammen. Die Mäuse erhielten eine Behandlung mit Yangjing-Kapsel und/oder eine Intervention bezüglich der lncRNA NONMMUT031883.2 oder QKI-5. Anschließend wurden Fruchtbarkeit, Serumhormonspiegel, Hoden- und Nebenhoden-Gewebe, Spermensuspension, Spermienreserven, Spermienqualität und histopathologische Hodenschäden bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien und dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labor­tieren durchgeführt. Alle experimentellen Protokolle wurden vom Tierversuchsausschuss der Südostuniversität überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer 20230216022).

1. Herstellung des Yangjing-Capsules-haltigen Serums
Zwei Yangjing-Capsules (YC; 0,5 g/Kapsel) wurden geöffnet und 0,8 g des Kapselinhalts abgewogen. Normale Kochsalzlösung wurde bis zu einem Endvolumen von 10 mL zugegeben, und das Gemisch wurde gründlich verwirbelt, um eine 80 mg/mL Suspension herzustellen. Spezifisch pathogenfreie männliche BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 22–25 g und einem Alter von 8 Wochen wurden bei 22 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 55–60 % im 12-Stunden-Licht-/Dunkel-Wechsel gehalten, wobei Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung standen. Nach einer Akklimatisierungsphase von einer Woche erhielten die Mäuse YC mittels oraler Gavage in einer Dosis von 800 mg/kg Körpergewicht in einem Volumen von 10 mL/kg einmal täglich über 5 aufeinanderfolgende Tage. Zwei Stunden nach der letzten Gabe wurden die Mäuse mit 1 %igem Natriumpentobarbital intraperitoneal anästhesiert, und Blutproben wurden entnommen, um das YC-haltige Serum herzustellen. Das Serum wurde 30 Minuten bei 56 °C inaktiviert, durch eine 0,22 µm-Membran filtriert und bis zur Verwendung bei −80 °C gelagert.

2. Zellkultur und Transfektion
Maus-GC-1-Spermatogonialzellen wurden in DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin und 10 % fetalem Kälberserum kultiviert. Alle Kulturen wurden bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO₂ (V/V) gehalten.

LncRNA-spezifische kurze Haarnadel-RNA (sh-lncRNA), ein QKI-5-Überexpression-Plasmid (OE-QKI-5), QKI-5-spezifische kleine interferierende RNA (si-QKI-5) sowie deren entsprechende negative Kontrollen (sh-NC, OE-NC und si-NC) wurden synthetisiert und konstruiert. GC-1-Zellen wurden gemäß den Anweisungen des Transfektionsreagenzes mit sh-lncRNA oder sh-NC, si-QKI-5 oder si-NC bzw. OE-QKI-5 oder OE-NC transfiziert. Nach einer Inkubation von 48 h wurde die Transfektionseffizienz durch die Messung der Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 oder von QKI-5 überprüft.

Für die Gruppe sh-lncRNA + si-QKI-5 + Etoposid wurden GC-1-Zellen mit sh-lncRNA und si-QKI-5 transfiziert und anschließend 12 h lang mit 100 µM Etoposid behandelt26. Für nachfolgende Zellviabilitätsassays wurden GC-1-Zellen in Medium kultiviert, das mit 5 %, 10 % oder 20 % YC-haltigem Serum ergänzt war, und als Gruppen mit niedriger Dosis YC (L-YC), mittlerer Dosis YC (M-YC) bzw. hoher Dosis YC (H-YC) bezeichnet. Die Konzentrationen von YC-haltigem Serum (5 %, 10 % und 20 % YC) wurden basierend auf den Ergebnissen vorläufiger Konzentrationsgradientenexperimente festgelegt. Für die Gruppen sh-lncRNA + H-YC + OE-NC und sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5 wurden GC-1-Zellen 48 h lang mit sh-lncRNA plus OE-NC oder sh-lncRNA plus OE-QKI-5 transfiziert und anschließend 24 h lang 20 %igem YC-haltigem Serum ausgesetzt.

3. Cell Counting Kit-8-Assay
GC-1-Zellen wurden in 96-Loch-Platten mit jeweils 5 × 103 Zellen/Loch ausgesät und 24 h kultiviert. Nach der Zellanheftung wurde das ursprüngliche Medium durch 100 µL komplettes Medium ergänzt durch YC-haltiges Serum ersetzt, und die Zellen wurden 6, 12 oder 24 h inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 µL Cell Counting Kit-8-Reagenz zu jedem Loch hinzugefügt, und die Zellen wurden 2 h bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplatten-Reader gemessen.

4. Lactatdehydrogenase-Assay
Nach der Transfektion mit sh-NC oder sh-lncRNA für 48 h wurde das Kulturmedium der GC-1-Zellen gesammelt und das Supernatant durch Zentrifugation gewonnen. Gemäß den Anweisungen des Lactatdehydrogenase-Assay-Kits wurde das Supernatant vorsichtig mit der Detektionsarbeitslösung vermischt und in eine 96-Well-Platte überführt. Die Platte wurde 30 min bei 25 °C im Dunkeln inkubiert. Die Absorption bei 490 nm wurde mithilfe eines Mikroplattenlesegeräts gemessen, und die Freisetzung von Lactatdehydrogenase wurde zur Beurteilung von Zellschäden berechnet.

5. Calcein-AM/Propidiumiodid-Färbung
Nach einer Transfektion mit sh-NC oder sh-lncRNA für 48 h wurde die Überlebensfähigkeit der GC-1-Zellen mittels Calcein-AM/Propidiumiodid (PI)-Färbung bewertet. Die Zellen wurden in 12-Loch-Platten mit jeweils 5 × 104 Zellen pro Loch ausgesät und solange kultiviert, bis sie eine Konfluenz von 60–70 % erreichten. Die Zellen wurden vorsichtig mit phosphatgepufferter Salzlösung gespült und anschließend mit 500 µL Calcein-AM/PI-Färbelösung pro Loch versetzt. Die Probe wurde 30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubiert und danach unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Lebende und tote Zellen wurden mithilfe einer Bildanalyse-Software gezählt, und der Anteil überlebender Zellen wurde berechnet.

6. Durchflusszytometrie
GC-1-Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. Das Zellpellet wurde in 500 µL Bindungspuffer bei einer Dichte von 5 × 105 Zellen/mL resuspendiert. Anschließend wurden jeweils 5 µL Annexin V-APC und PI zugegeben, die Suspension gründlich gemischt und 10 Minuten bei 25 °C im Dunkeln inkubiert. Die Apoptose wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert, wobei die Anregungs-/Emissionswellenlängen 633/660 nm für APC und 488/630 nm für PI verwendet wurden. Die Apoptoserate wurde mit einer Software zur Analyse von Durchflusszytometriedaten bewertet.

7. Caspase-3-Aktivitäts-Assay
Nach den angegebenen Behandlungen wurden etwa 1 × 106 GC-1-Zellen gesammelt, gewaschen und in phosphatgepufferter Salzlösung resuspendiert. Die Zellen wurden mit 100 µL Reagenz II aus dem Caspase-3-Aktivitäts-Assay-Kit gemischt und 15 min auf Eis lysiert. Nach der Zentrifugation wurden 50 µL des Überstandes der Zelllyse gesammelt und mit 40 µL Reagenz I sowie 10 µL Reagenz III vermischt. Die Mischung wurde 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Absorption bei 405 nm wurde mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, und die Caspase-3-Aktivität wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet.

8. RNA-Pull-down-Assay
Die Sinus- und Antisinnusstränge der lncRNA NONMMUT031883.2 wurden entsprechend der zugehörigen Sequenz synthetisiert und mit Biotin markiert. Die Zellen wurden 30 min auf Eis in einem Immunpräzipitations-Puffer zum Aufschluss von Zellen lysiert, und der proteinhaltige Überstand wurde durch Zentrifugation gewonnen. Streptavidin-Magnetkügelchen wurden dreimal mit RNA-Bindungspuffer gewaschen und anschließend 30 min in Bindungspuffer mit 1 % Rinderserumalbumin inkubiert.

Die vorbehandelten Kügelchen wurden mit den biotinmarkierten Sonden kombiniert und bei 25 °C für 30 min inkubiert. Ungebundene Sonden wurden durch magnetische Trennung entfernt. Anschließend wurde der Zelllysat-Überstand hinzugegeben und die Mischung bei 4 °C für 4 h inkubiert, um magnetische Kügelchen-RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die magnetischen Kügelchen wurden dreimal mit Waschpuffer gewaschen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Der Waschpuffer wurde durch magnetische Trennung entfernt und 2× SDS-Probelade-Puffer hinzugefügt. Die Proben wurden bei 95 °C für 10 min erhitzt und der Überstand durch magnetische Trennung für die nachfolgende Western-Blot-Analyse gesammelt.

9. Erstellung eines Mausmodells für eine gestörte Spermatogenese
Nach einer Eingewöhnungsphase von 5 Tagen erhielten spezifisch pathogenfreie männliche BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 22–25 g und einem Alter von 8 Wochen über 7 Tage hinweg einmal täglich Cyclophosphamid (CP) in einer Dosis von 50 mg/kg intraperitoneal, um ein Modell für eine gestörte Spermatogenese zu etablieren14,27. Die erfolgreich modellierten Mäuse wurden mithilfe einer Zufallszahltabelle den folgenden Gruppen zufällig zugewiesen: CP, 200 mg/kg YC, 400 mg/kg YC, 800 mg/kg YC, 800 mg/kg YC + sh-NC und 800 mg/kg YC + sh-lncRNA, jeweils mit sechs Mäusen pro Gruppe.

Mäusen in den mit YC behandelten Gruppen wurde einmal täglich über einen Zeitraum von 30 Tagen die entsprechende Dosis YC mittels oraler Gavage verabreicht13. Bei den Gruppen 800 mg/kg YC + sh-NC und 800 mg/kg YC + sh-lncRNA wurden nach erfolgreicher Modellerstellung die Tiere durch Inhalation von 2 % Isofluran narkotisiert. Nachdem sichergestellt war, dass kein Zehefortzugsreflex mehr auftrat und die Atemfrequenz stabil war, wurde die Operationsstelle rasiert und mit Povidon-Iodid desinfiziert. Unter aseptischen Bedingungen erfolgte ein medianer ventraler Haut- und Bauchwandanschnitt vor der Genitalregion. Der Hoden wurde durch vorsichtiges Zurückziehen des Nebenhodenfettgewebes freigelegt, wobei darauf geachtet wurde, keine Gefäße zu verletzen. Mithilfe eines Mikromanipulators wurden die Samenkanälchen sichtbar gemacht, und 1 µL der Adenovirus-Suspension (1 × 1010 TU/mL) wurden langsam mittels einer Mikroinjektionsnadel injiziert28. Die Nadel blieb nach der Injektion 5 Minuten lang an Ort und Stelle, bevor sie langsam zurückgezogen wurde; die Blutstillung erfolgte mit einem sterilen Wattestäbchen. Der gleiche Vorgang wurde anschließend am kontralateralen Hoden durchgeführt. Der Schnitt wurde anschließend vernäht, und die Tiere durften postoperativ auf einer Wärmematte aus der Narkose aufwachen. Kontrolltiere erhielten täglich eine isovolumetrische Menge an Kochsalzlösung per Gavage sowie Injektion.

10. Beurteilung der Fruchtbarkeit
Nach Abschluss der Medikamentengabe wurden männliche Mäuse jeder Gruppe für 7 Tage im Verhältnis 1:2 mit weiblichen BALB/c-Mäusen frei verpaart. Die Bildung von Vaginalpfropfen bei den weiblichen Mäusen wurde täglich überwacht und dokumentiert. Nach Bestätigung einer erfolgreichen Paarung wurden die männlichen Mäuse entfernt, und die weiblichen Mäuse wurden einzeln bis zur natürlichen Geburt gehalten. Pro Gruppe wurden neun trächtige weibliche Mäuse erhalten und in die Analyse eingeschlossen. Die durchschnittliche Wurfgröße wurde erfasst, um die Fruchtbarkeit der männlichen Mäuse in jeder Gruppe zu bewerten.

Am Ende der Versuchszeit wurden die Mäuse durch intraperitoneale Verabreichung von Pentobarbital-Natrium (100 mg/kg) euthanasiert. Diese Methode der Euthanasie wurde vom Tierversuchsausschuss der Southeast University genehmigt (Genehmigungsnummer 20230216022). Die Hoden und Nebenhoden wurden sorgfältig präpariert, fotografiert und gewogen. Die Hoden- und Nebenhoden-Indizes wurden als Organmasse/Körpermasse berechnet. Von jedem Tier wurde ein Nebenhoden entnommen, in Stücke geschnitten, in 1 mL vorgewärmtes phosphatgepuffertes Kochsalzlösung (37 °C) gegeben und 20 Minuten lang inkubiert, um das Ausschwimmen der Spermien zu ermöglichen29. Die Spermien-Suspension wurde vorsichtig gemischt, und 10 µL der Suspension wurden auf eine vorgewärmte Blutkörperchen-Zählkammer gegeben. Die Spermienzahl wurde manuell unter dem Lichtmikroskop bei 200×-Vergrößerung bestimmt, und die Ergebnisse wurden als 106/L angegeben. Außerdem wurde der Anteil der progressiv beweglichen Spermatozoen im Verhältnis zur Gesamtanzahl der Spermatozoen als Spermienmotilität berechnet13.

11. Bestimmung der Sexualhormonspiegel
Blut wurde aus der Orbitavene von Mäusen jeder Gruppe entnommen und bei 25 °C 30 min lang stehen gelassen. Das Serum wurde durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 10 min gewonnen30. Die Konzentrationen von Testosteron, luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem Hormon (FSH) im Serum wurden mithilfe der entsprechenden ELISA-Testsätze bestimmt.

12. RNA-Stabilitäts-Assay
GC-1-Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten ausgesät, mit si-QKI-5 oder si-NC transfiziert und 48 h kultiviert. Anschließend wurde Actinomycin D in einer Konzentration von 5 µg/mL zugegeben, und die Zellen wurden nach 0, 3, 6 und 9 h gesammelt. Gesamt-RNA wurde isoliert, und die relative Expression von lncRNA NONMMUT031883.2 wurde mittels quantitativer reverser Transkription-Polymerase-Kettenreaktion nach reverser Transkription bestimmt. Die relative RNA-Menge zu jedem Zeitpunkt wurde unter Verwendung des Expressionsspiegels zum Zeitpunkt 0 h als 100 % berechnet.

13. Quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion
GC-1-Zellen und murine Hodengewebe wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und zur Isolierung der Gesamt-RNA lysiert. Die komplementäre DNA wurde mittels reverser Transkription unter Verwendung von AMV-Reverser Transkriptase synthetisiert. Die Polymerase-Kettenreaktion wurde unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Systems und eines quantitativen PCR-Kits durchgeführt, wobei die komplementäre DNA als Amplifikationsvorlage diente. U6 wurde als interne Referenz für die lncRNA NONMMUT031883.2 verwendet, und GAPDH wurde als interner Referenzwert für QKI-5. Die relative Expression der Zielgene wurde unter Verwendung des 2−ΔΔCt Methode25RNA wurde außerdem separat aus den zytoplasmatischen und nukleären Fraktionen isoliert, um die subzelluläre Lokalisation der lncRNA NONMMUT031883.2 zu bestimmen. Die Primersequenzen sind angegeben in Tabelle 1.

GenForward-Primer (5' zu 3')Reverse-Primer (5' zu 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

Tabelle 1: Primersequenzen für die quantitative reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion. Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen sind in 5′–3′-Richtung für die lncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5, U6 und GAPDH aufgeführt.

14. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
Mäusetesticular- und Nebenhoden-Gewebe wurden in 4% Paraformaldehyd eingetaucht und bei 4 °C 24 h lang fixiert. Nach dem Spülen mit phosphatgepufferter Salzlösung wurden die Gewebe durch eine abgestufte Ethanolreihe dehydriert, in Paraffin eingebettet und in 5 µm dicken Schnitten geschnitten. Die Schnitte wurden 60 min bei 60 °C erhitzt und 30 min in Xylol entwachst.

Nach der Hydratation durch eine abgestufte Ethanolreihe wurden die Schnitte 5 min mit Hämatoxylin angefärbt, 10 s lang mit einer Salzsäure-Ethanol-Differenzierungslösung behandelt, mit Leitungswasser zum Bläuen gewaschen und anschließend 2 min mit 1 % Eosin gefärbt. Danach wurden die Schnitte in 95 %igem Ethanol und absolutem Ethanol dehydriert und 30 min in Xylol geklärt. Nach dem Lufttrocknen wurden die Schnitte mit neutraler Gummi eingedeckt. Morphologische Veränderungen in Hoden und Nebenhoden wurden unter dem Mikroskop untersucht.

15. Immunfluoreszenz
Paraffinschnitte von Maustestes wurden deparaffiniert und über eine abgestufte Ethanolreihe rehydriert, gefolgt von einer antigenen Retrieval-Behandlung im Zitratpuffer bei pH 6,0 mittels Mikrowelle. Nach dem natürlichen Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Schnitte 10 Minuten lang mit 0,3 % Triton X-100 behandelt. Die Schnitte wurden mit 5 % bovinem Serumalbumin bei 25 °C für 60 Minuten blockiert, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült und anschließend über Nacht bei 4 °C mit einem primären Antikörper gegen Ki67 inkubiert. Am folgenden Tag wurde ein fluorochrom-markierter sekundärer Immunglobulin-G-Antikörper aufgetragen, und die Schnitte wurden 60 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Nach dem Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden die Schnitte 10 Minuten lang mit DAPI kontrastgefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Fluoreszenzintensität wurde mithilfe einer Bildanalyse-Software ausgewertet.

Für die Immunfluoreszenzfärbung von GC-1-Zellen wurden die Zellen in 12-Loch-Platten mit 1 × 105 Zellen/Loch ausgesät und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden 30 min mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, 10 min mit 0,3 % Triton X-100 permeabilisiert, mit 5 % Rinderserumalbumin blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit einem primären Antikörper gegen QKI-5 inkubiert. Der weitere Verfahrensschritt wurde wie für die Hodengewebeschnitte beschrieben durchgeführt.

16. TUNEL-Färbung
Paraffinschnitte von Maustestes wurden entparaffiniert, durch eine abgestufte Ethanolreihe rehydriert und zur Erhöhung der Zellmembranpermeabilität 5 min mit 0,1 %iger Triton X-100-Lösung inkubiert. Anschließend wurde die Arbeitslösung von Proteinase K (20 µg/mL) ohne DNase gleichmäßig auf die Schnitte aufgetragen und 15 min bei 37 °C inkubiert. Die TUNEL-Nachweislösung wurde hinzugefügt, und die Schnitte wurden 90 min bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation mit DAPI wurde ein Antifade-Montierungsmittel aufgetragen, und das Hodengewebe wurde im Fluoreszenzmikroskop untersucht.

GC-1-Zellen wurden in 12-Loch-Platten ausgesät und 30 min mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach Permeabilisierung mit 0,1 % Triton X-100 für 5 min wurde die TUNEL-Nachweislösung auf die Zellen aufgetragen und anschließend 60 min im Dunkeln inkubiert. Danach wurden die Zellen 10 min mit DAPI angefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

17. Western-Blot
Mäusetesticumgewebe und GC-1-Zellen wurden 30 min auf Eis in einem Zelllysepuffer für die Immunpräzipitation lysiert und durch Ultraschall zerkleinert. Nach Zentrifugation wurde der proteinhaltige Überstand gesammelt, und die Protein-Konzentration wurde mit einem Bicinchoninsäure-Assay-Kit bestimmt. Der Protein-Überstand wurde mit SDS-Lade-Puffer versetzt und 10 min im siedenden Wasser erhitzt. Nach Trennung mittels Gelelektrophorese wurden die Proteine auf Polyvinylidenfluorid-Membranen übertragen und 2 h mit 5 % Rinderserumalbumin blockiert31.

Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen gespaltene Caspase-3 (1:500), Bcl-2 (1:1000), Caspase-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), phosphoryliertes p38 (1:1000) oder p38 (1:500) inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Membranen mit Tris-gepufferter Salzlösung mit Tween 20 gespült und anschließend 2 h bei 25 °C mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG in einer Verdünnung von 1:10000 inkubiert. Die Arbeitslösung für die verbesserte Chemilumineszenz wurde auf die Membranoberfläche aufgetragen, und die Proteinbänder wurden mit einem Gel-Imaging-System aufgenommen. Die Bandenintensität wurde mithilfe einer Bildanalyse-Software ausgewertet, und die relative Proteinausprägung wurde auf GAPDH (1:3000) normalisiert.

Cycloheximid in einer Konzentration von 50 µg/mL wurde verwendet, um die Proteinsynthese zu hemmen. Um die Halbwertszeit von QKI-5 zu bestimmen, wurden Zellen nach 0, 3, 6 und 9 h gesammelt, und die Proteinspiegel von QKI-5 wurden anschließend mittels Western-Blotting bestimmt25.

18. Statistische Analyse
Alle Daten wurden statistisch analysiert und mithilfe von Statistik-, Grafik- und Bildanalyse-Software dargestellt. Zur Beurteilung der Daten-Normalverteilung wurde der Shapiro-Wilk-Test verwendet. Die experimentellen Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Zur Bewertung der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Bei homogener Varianz kamen für die post-hoc paarweisen Vergleiche der LSD-t-Test zum Einsatz, bei heterogener Varianz hingegen der Dunnett’s-T3-Test. Ein p-Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Die Herunterregulierung des lncRNA NONMMUT031883.2 induziert die Apoptose von Spermatogonien
GC-1-Zellen wurden mit sh-lncRNA transfiziert, um die Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 herunterzuregulieren. Im Vergleich zu mit sh-NC transfizierten Zellen war das transkriptionelle Niveau der lncRNA NONMMUT031883.2 nach Transfektion mit sh-lncRNA deutlich verringert, was eine erfolgreiche Herunterregulierung bestätigt (Abbildung 2A). Nach der Herunterregulierung der lncRNA NONMMUT031883.2 war die Vitalität der GC-1-Zellen signifikant reduziert (Abbildung 2B), während die Freisetzung von LDH signifikant anstieg, was auf eine stärkere Zellschädigung hinweist (Abbildung 2C). Die Färbung mit Calcein-AM/PI zeigte eine erhöhte Anzahl PI-positiver GC-1-Zellen und einen verminderten Anteil überlebender Zellen in der sh-lncRNA-Gruppe (Abbildung 2D, E). Die Apoptoserate der GC-1-Zellen stieg nach der Herunterregulierung der lncRNA NONMMUT031883.2 deutlich an (Abbildung 2F, G). Die TUNEL-positiven Zellen waren in der sh-lncRNA-Gruppe ebenfalls signifikant erhöht, was auf eine verstärkte Apoptose hindeutet (Abbildung 2H, I). Zusätzlich führte die Herunterregulierung der lncRNA NONMMUT031883.2 zu einer signifikanten Erhöhung der Caspase-3-Aktivität in GC-1-Zellen (Abbildung 2J). In der sh-lncRNA-Gruppe war die Expression von Bax deutlich erhöht, die Expression von Bcl-2 verringert und das Verhältnis von gespaltener Caspase-3 zu Gesamt-Caspase-3 signifikant erhöht (Abbildung 2K, L). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Herunterregulierung der lncRNA NONMMUT031883.2 die Apoptose in GC-1-Zellen induziert. Alle quantifizierten Daten wurden mit n = 6 ermittelt.

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Abbildung 2: Die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 induziert die Apoptose von Spermatogonien. (A) Quantitative reversetranskriptive Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) zur Analyse der Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 in GC-1-Zellen. (B) Cell-Counting-Kit-8 (CCK-8)-Test zur Bestimmung der Vitalität von GC-1-Zellen nach Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2. (C) Ausschüttung von Lactatdehydrogenase (LDH) aus GC-1-Zellen nach Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2. (D, E) Calcein-AM/Propidiumiodid (PI)-Färbung zur Beurteilung des Überlebens von GC-1-Zellen (20×; Maßstabsbalken: 100 µm). (F, G) Durchflusszytometrische Analyse der Apoptose nach Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2. (H, I) Terminal-deoxynucleotidyl-transferase-dUTP-Nick-End-Labeling (TUNEL)-Analyse von GC-1-Zellen (40×; Maßstabsbalken: 50 µm). (J) Caspase-3-Aktivität nach Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2. (K, L) Western-Blot-Analyse der Expression von Bcl-2, Bax, Caspase-3 und gespaltener Caspase-3 nach Transfektion mit sh-lncRNA. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; n = 6. ***p < 0,001 im Vergleich zu sh-NC. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung einzusehen.

LncRNA NONMMUT031883.2 interagiert mit QKI-5
Die Interaktion zwischen der lncRNA NONMMUT031883.2 und QKI-5 wurde untersucht, um den molekularen Mechanismus der Spermatogonialapoptose aufzuklären. Nach der Trennung der nukleären und zytoplasmatischen Fraktionen zeigte die qRT-PCR-Analyse, dass die lncRNA NONMMUT031883.2 hauptsächlich in den Kernen der GC-1-Zellen lokalisiert war (Abbildung 3A). Die Immunfluoreszenz-Analyse zeigte, dass QKI-5 ebenfalls im Zellkern angereichert war, was eine räumliche Grundlage für die Interaktion zwischen lncRNA NONMMUT031883.2 und QKI-5 bildet (Abbildung 3B). Die Halbwertszeit der lncRNA NONMMUT031883.2 wurde nach Behandlung mit Actinomycin D gemessen, um zu prüfen, ob QKI-5 die Stabilität der lncRNA reguliert. Der Knockdown von QKI-5 hatte keinen nennenswerten Einfluss auf die Halbwertszeit des lncRNA-Transkripts (Abbildung 3C). Nach Hemmung der Proteinsynthese durch Cycloheximid veränderte der Knockdown der lncRNA NONMMUT031883.2 die Proteinausprägung von QKI-5 nicht (Abbildung 3D, E). Die Erfassungseffizienz der biotinmarkierten Antisense-Sonde, die auf die lncRNA NONMMUT031883.2 abzielt, wurde anschließend mittels qRT-PCR bewertet. Die Antisense-Sonde reicherte die Ziel-lncRNA effizient an und wurde daher für den nachfolgenden RNA-Pull-down-Assay verwendet (Abbildung 3F). Der RNA-Pull-down gefolgt von einer Western-Blot-Analyse zeigte eine spezifische physikalische Interaktion zwischen der lncRNA NONMMUT031883.2 und QKI-5 (Abbildung 3G, H). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass lncRNA NONMMUT031883.2 und QKI-5 im Kern der GC-1-Zellen kolokalisieren und spezifisch miteinander interagieren. Die quantitativen Daten von Abbildung 3C und Abbildung 3D, F wurden mit n = 3 erhalten, und die restlichen quantitativen Daten wurden mit n = 6 erhalten.

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Abbildung 3: LncRNA NONMMUT031883.2 interagiert mit QKI-5. (A) qRT-PCR-Analyse der nukleären und zytoplasmatischen Verteilung der lncRNA NONMMUT031883.2 in GC-1-Zellen. (B) Immunfluoreszenzanalyse der subzellulären Lokalisation von QKI-5 in GC-1-Zellen (40×; Maßstabsbalken, 50 µm). (C) qRT-PCR-Analyse der Halbwertszeit der lncRNA NONMMUT031883.2 nach Behandlung mit Actinomycin D und Knockdown von QKI-5 (n = 3). (D, E) Western-Blot-Analyse der QKI-5-Proteinexpression nach Behandlung mit Cycloheximid und Knockdown der lncRNA NONMMUT031883.2 (n = 3). (F) qRT-PCR-Validierung der Anreicherungseffizienz der biotinmarkierten Antisense-Sonde, die gegen die lncRNA NONMMUT031883.2 gerichtet ist. (G, H) RNA-Pull-down- und Western-Blot-Analyse der Interaktion zwischen der lncRNA NONMMUT031883.2 und QKI-5. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; n = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Die Herunterregulation von QKI-5 hemmt die Apoptose von Spermatogonien durch Suppression des p38-MAPK-Signalwegs
Die Rolle von QKI-5 und des nachgeschalteten p38-MAPK-Signalwegs bei der Apoptose von Spermatogonien wurde untersucht. Nach der Transfektion mit si-QKI-5 waren die QKI-5-Proteinspiegel in GC-1-Zellen signifikant reduziert, was eine erfolgreiche Herunterregulation bestätigte (Abbildung 4A, B). Die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 erhöhte signifikant das Verhältnis von p-p38/p38, während gleichzeitige Herunterregulation von QKI-5 dieses Verhältnis verringerte, was auf eine Hemmung der Aktivierung des p38-MAPK-Signalwegs hindeutet (Abbildung 4C, D). Die Herunterregulation von QKI-5 milderte die durch die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 verursachten Schäden an GC-1-Zellen ab, während die Behandlung mit dem Apoptoseinduktor Etoposid die Zellviabilität signifikant verringerte (Abbildung 4E). Die Herunterregulation von QKI-5 reduzierte die Apoptoserate von GC-1-Zellen signifikant, während die Behandlung mit Etoposid die Apoptose stark erhöhte (Abbildung 4F, G). Die Transfektion mit si-QKI-5 verringerte ebenfalls signifikant die Aktivität von Caspase-3, während die Behandlung mit Etoposid die Caspase-3-Aktivität erhöhte (Abbildung 4H). Die Herunterregulation von QKI-5 senkte die Expression von Bax, erhöhte die Expression von Bcl-2 und verringerte signifikant das Verhältnis von gespaltener Caspase-3 zu Gesamt-Caspase-3, während die Behandlung mit Etoposid diese Expressionsmuster umkehrte (Abbildung 4I, J). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Herunterregulation von QKI-5 die Apoptose in GC-1-Spermatogonien durch Hemmung des p38-MAPK-Signalwegs unterdrückt. Alle quantifizierten Daten wurden mit n = 6 ermittelt.

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Abbildung 4: Die Herunterregulation von QKI-5 hemmt die Apoptose von Spermatogonien durch Unterdrückung des p38-MAPK-Signalwegs. (A, B) Western-Blot-Analyse der QKI-5-Expression in GC-1-Zellen nach Transfektion mit si-NC oder si-QKI-5. (C, D) Western-Blot-Analyse der phosphorylierten p38 (p-p38) und der gesamten p38-Expression. (E) CCK-8-Analyse der Vitalität von GC-1-Zellen in den verschiedenen Behandlungsgruppen. (F, G) Durchflusszytometrische Analyse der Apoptose nach Behandlung mit Etoposid. (H) Caspase-3-Aktivität in den verschiedenen Behandlungsgruppen. (I, J) Western-Blot-Analyse der Expression von Bax, Bcl-2, Caspase-3 und gespaltener Caspase-3 in GC-1-Zellen. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; n = 6. ***p < 0,001 im Vergleich zu si-NC oder sh-NC; ###p < 0,001 im Vergleich zu sh-lncRNA; &&&p < 0,001 im Vergleich zu sh-lncRNA + si-QKI-5. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

YC hemmt die Apoptose von Spermatogonien über der lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38-MAPK-Signalweg
Nach der Behandlung von GC-1-Zellen mit YC-haltigem Serum für 6, 12 und 24 h stieg die Zellviabilität schrittweise mit zunehmenden YC-Konzentrationen und längeren Expositionszeiten an. Daher wurden diese Konzentrationen für nachfolgende Experimente ausgewählt, wobei eine Behandlungsdauer von 24 h verwendet wurde (Abbildung 5A). Die YC-Behandlung für 24 h erhöhte signifikant das transkriptionelle Niveau des lncRNA NONMMUT031883.2 in GC-1-Zellen (Abbildung 5B) und erhöhte seine Bindungskapazität an QKI-5 (Abbildung 5C, D). Nach der YC-Behandlung waren die QKI-5-Expression und das Verhältnis p-p38/p38 in GC-1-Zellen deutlich verringert, was auf eine Hemmung des p38-MAPK-Signalwegs hindeutet (Abbildung 5E, F). Die YC-Behandlung verringerte die Apoptoserate ebenfalls deutlich (Abbildung 5G, H), verminderte Caspase-3-Aktivität (Abbildung 5I), erhöhte Bcl-2-Expression sowie verringerte Bax-Expression und Verhältnis von gespaltenem Caspase-3 zu Caspase-3 (Abbildung 5J, K).

Um die Wegspezifität weiter zu bewerten, wurden GC-1-Zellen mit OE-NC oder OE-QKI-5 transfiziert. Die QKI-5-Proteinexpression war in OE-QKI-5-transfizierten Zellen signifikant erhöht, was eine erfolgreiche Überexpression bestätigt (Abbildung 5L, M). Die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 verringerte die Zellviabilität signifikant, während die YC-Behandlung diesen Effekt umkehrte. Die Überexpression von QKI-5 milderte die zytoprotektive Wirkung von YC (Abbildung 5N). Die YC-Behandlung verringerte außerdem die durch die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 induzierte Apoptose (Abbildung 5O, P), senkte die Caspase-3-Aktivität (Abbildung 5Q), reduzierte die Bax-Expression, erhöhte die Bcl-2-Expression und verringerte das Verhältnis von gespaltener Caspase-3 zu Gesamt-Caspase-3 (Abbildung 5R, S). Im Gegensatz dazu milderte die Überexpression von QKI-5 die anti-apoptotischen Effekte von YC. Diese Ergebnisse zeigen, dass YC die lncRNA NONMMUT031883.2 hochreguliert und deren Bindung an QKI-5 fördert, wodurch der p38-MAPK-Signalweg gehemmt und die Apoptose in GC-1-Zellen unterdrückt wird. Alle quantifizierten Daten wurden mit n = 6 ermittelt.

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Abbildung 5: YC hemmt die Apoptose von Spermatogonien über der lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38-MAPK-Signalweg. (A) CCK-8-Analyse der GC-1-Zellviabilität nach Exposition gegenüber Yangjing Capsule (YC)-haltigem Serum für 6, 12 und 24 h. (B) qRT-PCR-Analyse der lncRNA NONMMUT031883.2-Expression in GC-1-Zellen nach 24 h YC-Behandlung (C, D) RNA-Pull-down-Analyse der Bindung der lncRNA NONMMUT031883.2 an QKI-5 nach YC-Behandlung. (E, F) Western-Blot-Analyse der Expression von QKI-5, p-p38 und p38 nach YC-Behandlung. (G, H) Durchflusszytometrische Analyse der Apoptose in GC-1-Zellen nach YC-Behandlung. (I) Caspase-3-Aktivität nach YC-Behandlung. (J, K) Western-Blot-Analyse der Expression von Bcl-2, Bax, Caspase-3 und gespaltener Caspase-3 nach YC-Behandlung. (L, M) Western-Blot-Analyse der QKI-5-Expression nach Transfektion mit OE-NC oder OE-QKI-5. (N) CCK-8-Analyse der Vitalität von GC-1-Zellen (O, P) Durchflusszytometrische Analyse der Apoptose in GC-1-Zellen nach Überexpression von QKI-5 (Q) Caspase-3-Aktivität nach Überexpression von QKI-5 (R, S) Western-Blot-Analyse der Expression von Bax, Bcl-2, Caspase-3 und gespaltener Caspase-3 nach Überexpression von QKI-5. Die Daten sind als Mittelwert dargestellt ± Standardabweichung; n = 6. ***p < 0,001 im Vergleich zur Kontrolle; ###p < 0,001 im Vergleich zu sh-lncRNA; &&&p < 0,001 im Vergleich zu sh-lncRNA + H-YC + OE-NC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

YC verbessert die CP-induzierte spermatogene Dysfunktion bei Mäusen
Die schützenden Wirkungen von YC wurden bei Mäusen mit spermatogener Dysfunktion untersucht. Die Hoden und Nebenhoden der Mäuse in der CP-Gruppe wiesen eine deutliche Atrophie, vermindertes Volumen und ein blasses Aussehen auf. Nach Behandlung mit verschiedenen Dosen von YC verbesserten sich Morphologie, Fülle und Farbe der Fortpflanzungsorgane schrittweise (Abbildung 6A). Die relativen Gewichte der Hoden und Nebenhoden nahmen signifikant zu, wobei der stärkste Effekt in der YC-Gruppe mit 800 mg/kg beobachtet wurde (Abbildung 6B, C).

Die Spermienfehlbildungsrate war in der CP-Gruppe signifikant erhöht, wobei häufige Anomalien Verformungen des Kopfes, Krümmungen des Geißels und strukturelle Schäden umfassten. Die Spermienanzahl und -beweglichkeit waren ebenfalls deutlich verringert. Nach der YC-Behandlung verbesserte sich die Spermienmorphologie (Abbildung 6D), die Spermienanzahl stieg an (Abbildung 6E) und die Spermienmotilität wurde signifikant gesteigert (Abbildung 6F). Paarungsversuche zeigten, dass Fruchtbarkeit und Wurfgröße in der CP-Gruppe deutlich reduziert waren, während die YC-Behandlung die Fruchtbarkeit verbesserte (Abbildung 6G). Die Konzentrationen von Serum-Testosteron, follikelstimulierendem Hormon und luteinisierendem Hormon waren in der CP-Gruppe ebenfalls deutlich vermindert und stiegen nach der YC-Behandlung an (Abbildung 6H–J). Diese Ergebnisse zeigen, dass YC die Atrophie der Fortpflanzungsorgane, die Spermienqualität, die Fruchtbarkeit und die Sekretion von Sexualhormonen bei Mäusen mit einer Spermatogenesestörung verbessert. Die quantitativen Daten von Abbildung 6G wurden mit n = 9 ermittelt, die übrigen quantitativen Daten mit n = 6.

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Abbildung 6: YC verbessert die durch CP verursachte spermatogene Dysfunktion bei Mäusen. (A–C) Morphologie der Fortpflanzungsorgane in der Kontroll-, Cyclophosphamid- (CP-) und YC-Behandlungsgruppe (A), Testisindex (B) und Nebenhodenindex (C). (D–F) Spermienmorphologie (D) (40×; Maßstabsleiste: 50 µm), Spermienkonzentration (E) und Spermienmotilität (F). (G) Männliche Fertilität, bewertet mittels Verpaarungsexperimenten (n = 9). (H–J) Spiegel an follikelstimulierendem Hormon (FSH), Testosteron und luteinisierendem Hormon (LH) im Serum, gemessen mit Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay-Kits. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben; n = 6. ***p < 0,001 im Vergleich zur Kontrolle; #p < 0,05, ##p < 0,01 und ###p < 0,001 im Vergleich zu CP. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

YC verbessert histopathologische Schädigungen des Hodengewebes bei Mäusen mit gestörter Spermatogenese
Die reparative Wirkung von YC auf Hodengewebeschädigungen wurde mittels histologischer Färbung bewertet. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigte im Kontrollkollektiv eine intakte Gewebestruktur, deutlich abgegrenzte Zellschichten und eine ausreichende Anzahl von Zellen. Im Gegensatz dazu wiesen Tiere der CP-Gruppe eine ausgeprägte Atrophie der Keimdrüsenkanälchen sowie eine strukturelle Desorganisation, eine verminderte Zellzahl und einen Kollaps des Nebenhodenlumens auf. Nach Behandlung mit YC ließen sich die Schädigungen von Hoden und Nebenhoden reduzieren, die Struktur der Keimdrüsenkanälchen allmählich wiederherstellen, und die Zellen ordneten sich regelmäßiger an und nahmen in ihrer Zahl zu (Abbildung 7A, B).

Der Anteil der TUNEL-positiven Zellen im Hodengewebe war in der CP-Gruppe signifikant erhöht und nach YC-Behandlung signifikant vermindert (Abbildung 7C, D). Die Expression von Bax sowie das Verhältnis von gespaltenem Caspase-3 zu Caspase-3 waren in der CP-Gruppe deutlich erhöht, während die Expression von Bcl-2 vermindert war. Die YC-Behandlung kehrte diese Expressionsmuster um (Abbildung 7E, F). Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass die Ki67-Fluoreszenzintensität in der CP-Gruppe deutlich vermindert und nach YC-Behandlung signifikant erhöht war, was auf eine Wiederherstellung der Proliferation der Keimzellen hindeutet (Abbildung 7G, H). Diese Ergebnisse legen nahe, dass YC die durch CP induzierten histopathologischen Schäden in Hoden und Nebenhoden vermindert, eine übermäßige Apoptose hemmt und die Proliferation der Keimzellen fördert. Alle quantifizierten Daten wurden mit n = 6 ermittelt.

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Abbildung 7: YC verbessert die CP-induzierten histopathologischen Schäden im Hodengewebe von Mäusen. (A, B) Hämisierung und Eosinfärbung (HE) der Hoden (A) und Nebenhoden (B) nach YC-Behandlung (20×; Maßstabsbalken: 100 µm). (C, D) TUNEL-Analyse der Apoptose im Hodengewebe von Mäusen (40×; Maßstabsbalken: 50 µm). (E, F) Western-Blot-Analyse der Expression von Bax, Bcl-2, Caspase-3 und gespaltener Caspase-3 im Hodengewebe nach YC-Behandlung. (G, H) Immunfluoreszenzanalyse der Ki67-Expression im Hodengewebe von Mäusen (40×; Maßstabsbalken: 50 µm). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben; n = 6. ***p < 0,001 im Vergleich zur Kontrolle; p < 0,001 im Vergleich zu CP. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

YC verbessert die spermatogene Dysfunktion und testikuläre pathologische Schädigungen bei Mäusen über der lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38-MAPK-Signalweg
Die Beteiligung des lncRNA-NONMMUT031883.2/QKI-5/p38-MAPK-Signalwegs an den Wirkungen von YC wurde weiter untersucht. Die Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 war in Hodengewebe von Mäusen der CP-Gruppe signifikant vermindert, während die Expression von QKI-5 sowie das Verhältnis von p-p38/p38 deutlich erhöht waren (Abbildung 8A-DNach der YC-Behandlung stieg die Expression des lncRNA NONMMUT031883.2, während die Expression von QKI-5 sowie das Verhältnis von p-p38 zu p38 abnahmen.

Um die Wegspezifität weiter zu bewerten, wurde die lncRNA NONMMUT031883.2 in Mäusen mittels sh-lncRNA herunterreguliert. Die Expressionsmenge der lncRNA NONMMUT031883.2 war signifikant reduziert, was eine erfolgreiche Herunterregulation bestätigt (Abbildung 8E). Nach der Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 änderte sich der QKI-5-Spiegel im Hodengewebe nicht signifikant, während der p-p38/p38-Spiegel signifikant anstieg (Abbildung 8F, G). Die Behandlung mit sh-lncRNA milderte die Effekte von 800 mg/kg YC ab und führte zu einer verringerten Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 im Hodengewebe (Abbildung 8H) sowie erhöhten p-p38/p38-Spiegeln (Abbildung 8I, J). Die YC-Behandlung erhöhte nach CP-Induktion signifikant die Spermienanzahl und -motilität, wohingegen die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 diese Effekte abschwächte (Abbildung 8K, L). Die YC-Behandlung erhöhte außerdem die Spiegel von Testosteron, follikelstimulierendem Hormon und luteinisierendem Hormon in der CP-Gruppe, während die lncRNA-Herunterregulation diese Effekte abschwächte (Abbildung 8M-O).

Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung zeigte, dass YC die durch CP verursachten Schädigungen des Hodengewebes verbesserte, einschließlich der Atrophie der Keimdrüsenkanälchen und einer ungeordneten Anordnung der spermatogenen Zellen. Die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 schwächte diese schützenden Effekte ab (Abbildung 8P). Nach Behandlung mit YC sank die Expression von Bax sowie das Verhältnis von gespaltenem Caspase-3 zu Caspase-3, während die Expression von Bcl-2 anstieg. Die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 kehrte diese Effekte auf apoptoserelevante Proteine um (Abbildung 8Q, R). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YC die Spermienqualität verbessert und die Schädigung des Hodengewebes nach CP-Behandlung reduziert, indem es die lncRNA NONMMUT031883.2 hochreguliert, QKI-5 herunterreguliert und den p38-MAPK-Signalweg hemmt. Alle quantifizierten Daten wurden mit n = 6 ermittelt.

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Abbildung 8: YC verbessert die Spermatogenese und verringert testikuläre histopathologische Schäden über der lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38-MAPK-Signalweg. (A) qRT-PCR-Analyse der lncRNA NONMMUT031883.2-Expression in murinem Hodengewebe (B-D) Western-Blot-Analyse der Expression von QKI-5, p-p38 und p38 im Hodengewebe von Mäusen nach YC-Behandlung. (E) qRT-PCR-Validierung der Knockdown-Wirkung der lncRNA NONMMUT031883.2 in murinem Hodengewebe nach Verabreichung von sh-lncRNA (F, G) Western-Blot-Analyse der QKI-5- und p-p38/p38-Spiegel im Hodengewebe von Mäusen nach Knockdown der lncRNA NONMMUT031883.2. (H) qRT-PCR-Analyse der lncRNA NONMMUT031883.2-Expression in murinem Hodengewebe nach YC-Behandlung und sh-lncRNA-Applikation. (I, J) Western-Blot-Analyse der Expression von p-p38 und p38 in murinem Hodengewebe (K, L) Spermienanzahl (K) und Spermienmotilität (L) in den verschiedenen Behandlungsgruppen. (M-O) Die Konzentrationen von FSH, Testosteron und LH im Serum wurden mittels enzyme-linked immunosorbent assay-Kits bestimmt. (P) HE-Färbung von Hodengewebe bei mit CP behandelten Mäusen (20×; Maßstabsleiste, 100 µm). (Q, R) Western-Blot-Analyse der Expression von Bcl-2, Bax, gespaltenem Caspase-3 und Caspase-3 in murinem Hodengewebe. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± Standardabweichung; n = 6. ***p < 0,001 im Vergleich zur Kontrolle; p < 0,001 im Vergleich zu CP; p < 0,001 versus 800 mg/kg YC + sh-NC Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Datenverfügbarkeit:
Die Rohdaten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind als Zusatzdatei 1 verfügbar.

Zusatzdatei 1: Ursprüngliche Daten. Diese Excel-Datei enthält die rohen Zahlenwerte, die den quantitativen Analysen zugrunde liegen, die in den Abbildungen 2–8 dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die chemotherapieinduzierte erworbene Spermatogenesestörung ist eine wichtige Ursache für männliche Unfruchtbarkeit32,33,34. Die spezifischen molekularen Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Yangjing-Kapsel (YC) dosisabhängig die durch Cyclophosphamid (CP) verursachten Störungen der Sexualhormone, die histopathologischen Schädigungen des Hodens sowie die eingeschränkte Fruchtbarkeit bei männlichen Mäusen verbessert. Diese Verbesserungen waren mit einer Hochregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 und einer Hemmung des QKI-5/p38-MAPK-Signalwegs assoziiert, was darauf hindeutet, dass YC möglicherweise über diese Achse die abnormale Apoptose von Spermatogonien reduziert.

Die reproduktionstoxische Wirkung von CP ist umfassend dokumentiert. Sein Metabolit Acrolein kann sich im Hodengewebe anreichern und durch oxidative Stressreaktionen, DNA-Schäden und andere Signalwege die Apoptose von Keimzellen auslösen. Spermatogonien, als Ausgangszellen der Spermatogenese, sind besonders empfindlich gegenüber den zytotoxischen Effekten von CP35,36. Cao et al. fanden heraus, dass in Hodengewebe von Patienten mit Azoospermie nach CP-Chemotherapie die Signalübertragung über DNA-Schadens-Checkpoints signifikant angereichert war, während Gene, die mit der Spermienentwicklung assoziiert sind, signifikant herunterreguliert wurden und die strukturelle Integrität der Samenkanälchen gestört war37. Bcl-2 ist ein anti-apoptotisches Protein, das seine Funktion durch die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Membranintegrität entfaltet38. Bax ist ein pro-apoptotisches Protein, dessen Hochregulierung die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Cytoplasma fördern, die Caspase-Kaskade aktivieren und somit die Apoptose einleiten kann39,40. Saleh et al. zeigten, dass die Exposition gegenüber CP bei Mäusen eine Atrophie der Samenkanälchen und interstitielle Ödeme verursacht, begleitet von einer Herunterregulierung von Bcl-2 und einer Hochregulierung von Bax, was letztendlich zu einer verminderten Spermienzahl und -beweglichkeit führt41. Daher könnte die Hemmung einer übermäßigen, durch CP induzierten Apoptose von Spermatogonien ein wichtiges Ziel zur Schonung der reproduktiven Funktion nach einer Chemotherapie darstellen. In der vorliegenden Studie reduzierte die Gabe von YC dosisabhängig Störungen der Ausschüttung von Sexualhormonen im Serum, reparierte Schäden an den Samenkanälchen und verbesserte die Spermienbeweglichkeit sowie die männliche Fertilität. YC erhöhte außerdem die Expression von Bcl-2 und verringerte die Expression von Bax, das Verhältnis von gespaltenem Caspase-3 zu Caspase-3 sowie die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen im Hodengewebe. In vitro verringerte ein YC-haltiges Serum signifikant die Apoptose von GC-1-Zellen und erhöhte die Zellviabilität, was die hemmende Wirkung auf die Spermatogonien-Apoptose weiter untermauert.

Lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) spielen wichtige regulatorische Rollen in physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich der Spermatogenese und der Apoptose von Keimzellen42,43. Eine abnormale Expression von lncRNAs kann die spermatogene Funktion des Hodens durch Regulation von oxidativem Stress und apoptotischen Wegen beeinträchtigen, was einen wichtigen molekularen Mechanismus der männlichen Unfruchtbarkeit darstellt44. Wang et al. fanden heraus, dass die lncRNA DNM3OS die miR-214-5p/E2F2-Achse reguliert, was zu einer verminderten Aktivität von Spermatogonien sowie einer erhöhten Apoptose und Zellalterung führt und letztlich zur nicht-obstruktiven Azoospermie beiträgt45. Frühere Untersuchungen zeigten ebenfalls, dass die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT074098.2 in Spermatogonien die Apoptose induziert25. Diese Studien zeigen, dass lncRNAs wichtige Regulatoren der Apoptose von Spermatogonien und der Spermatogenese sind. In der vorliegenden Studie induzierte die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 die Apoptose von Spermatogonien. Ihre Expression war in der Hodengewebe von Mäusen nach CP-Behandlung signifikant verringert, während eine YC-Intervention die Expression teilweise wiederherstellte. Außerdem milderte die YC-Intervention die durch die Herunterregulation der lncRNA NONMMUT031883.2 hervorgerufene abnormale Apoptose von Spermatogonien ab, was darauf hindeutet, dass die schützende Wirkung von YC möglicherweise mit der Regulation dieser lncRNA zusammenhängt.

QKI-5 ist ein RNA-bindendes Protein der STAR-Familie, das an mehreren physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt ist, indem es die Spleißung, Stabilität und translationale Effizienz von Ziel-mRNAs reguliert46,47. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass QKI-5 ein wichtiger Regulator im Fortpflanzungssystem ist und dass seine abnorme Expression die Apoptose von Keimzellen fördern und die Spermienfunktion durch Aktivierung des downstreamliegenden p38-MAPK-Signalwegs beeinträchtigen kann25. Li et al. fanden heraus, dass die Hemmung der p38-MAPK-Aktivierung die durch CP verursachten Schädigungen des Hodengewebes verringerte und die Blut-Hoden-Schranke-Funktion bei Ratten wiederherstellte48. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die QKI-5/p38-MAPK-Achse ein wichtiger Signalweg bei der Regulation der Apoptose von Spermatogonien sein könnte und ein potenzielles Ziel für die Behandlung von spermatogenen Funktionsstörungen darstellt. In der vorliegenden Studie waren die Expression von QKI-5 und die Phosphorylierung von p38 im Hodengewebe von Mäusen nach CP-Induktion signifikant erhöht, während die Intervention mit YC die Expression von QKI-5 und die Aktivierung des p38-MAPK-Signalwegs verringerte. Die lncRNA NONMMUT031883.2 band direkt an QKI-5, wohingegen die Expression von QKI-5 die Stabilität der lncRNA nicht beeinflusste, was darauf hindeutet, dass die lncRNA NONMMUT031883.2 die Funktion von QKI-5 möglicherweise durch direkte Interaktion reguliert. Der Knockdown von QKI-5 milderte die durch den Knockdown der lncRNA NONMMUT031883.2 verursachten Schäden an GC-1-Zellen ab, während die Überexpression von QKI-5 die schützenden Wirkungen von YC auf GC-1-Zellen reduzierte. Li et al. berichteten, dass die lncRNA NONMMUT074098.2 die Apoptose von Keimzellen reguliert, indem sie an QKI-5 bindet25. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass auch die lncRNA NONMMUT031883.2 an QKI-5 bindet und an der Regulation der Apoptose von Spermatogonien beteiligt ist. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass YC möglicherweise die Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 hochreguliert, den QKI-5/p38-MAPK-Signalweg hemmt, eine abnormale Apoptose von Spermatogonien reduziert und die durch CP verursachte spermatogene Dysfunktion lindert. Es ist jedoch zu beachten, dass YC eine mehrkomponentige pflanzliche Formulierung ist, die wahrscheinlich auf mehrere Zielstrukturen wirkt. Andere Mechanismen, wie beispielsweise direkte antioxidative Effekte der YC-Bestandteile, die Modulation weiterer Signalwege oder epigenetische Regulation unabhängig von der lncRNA-QKI-5-Achse, können nicht ausgeschlossen werden und könnten zu den beobachteten schützenden Effekten beitragen.

Mehrere Einschränkungen sollten anerkannt werden. Die Studie wurde nur an einem Mausmodell und der GC-1-Zelllinie durchgeführt und verzichtete auf eine Validierung mittels klinischer Proben von Patienten mit Unfruchtbarkeit. Die Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, und der vollständige spermatogene Zyklus von Mäusen dauert etwa 35 Tage49,50. Die in dieser Studie verwendete 30-tägige YC-Behandlung umfasste keinen kompletten spermatogenen Zyklus. Daher sind zukünftige Studien, die Interventionsprotokolle von ≥35 Tagen einsetzen, erforderlich, um die therapeutischen Wirkungen von YC über einen gesamten spermatogenen Zyklus systematisch zu bewerten. Außerdem müssen die genauen molekularen Vorgänge nach der Bindung der lncRNA NONMMUT031883.2 an QKI-5 – wie Veränderungen in der Spleißaktivität von QKI-5 und seiner subzellulären Lokalisation sowie die Erkennung und Regulation nachgeschalteter Spleißziele – noch erforscht werden. Zudem sind, obwohl die YC-Behandlung die Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 hochregulierte, die upstream liegenden Transkriptionsfaktoren und epigenetischen Mechanismen noch nicht geklärt. Zukünftige Studien, die eine Promotoranalyse und Chromatin-Immunpräzipitationsassays einschließen, sind erforderlich, um die molekulare Grundlage der YC-induzierten Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 aufzuklären. Darüber hinaus sollten zukünftige Untersuchungen die Wirkungen von YC bei Patienten mit chemotherapieassoziiierter männlicher Unfruchtbarkeit bewerten und die Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 im Hodengewebe oder im Samen analysieren, um ihren potenziellen klinischen Nutzen als diagnostischer oder therapeutischer Marker zu bestimmen.

Zusammenfassend führt YC zu einer Hochregulation des lncRNA NONMMUT031883.2 und hemmt die Aktivierung des QKI-5/p38-MAPK-Signalwegs, wodurch die Apoptose von Spermatogonien und testikuläre Schädigungen verringert sowie die gestörte Spermatogenese bei Mäusen gemildert werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen den molekularen Mechanismus, der den schützenden Wirkungen von YC gegen eine gestörte Spermatogenese zugrunde liegt, und erweitern das derzeitige Verständnis der Rolle von lncRNA NONMMUT031883.2 sowie des QKI-5/p38-MAPK-Signalwegs bei der Regulation der Spermatogenese. Die lncRNA NONMMUT031883.2 und QKI-5 könnten potenzielle therapeutische Zielstrukturen für die männliche Spermatogenesestörung darstellen.

Offenlegungen

Die Autoren geben keine finanziellen oder nichtfinanziellen Interessenkonflikte an.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Nationale Natürliche Wissenschaftsstiftung Chinas (Förderkennzeichen Nr. 82374257), das Vierte Programm zur Förderung des Spitzenakademischen Nachwuchses des Provinzialklinikums für Chinesische Medizin in Jiangsu (Förderkennzeichen Nr. k2026yrc74) und die Forschungsprojekte zur Traditionellen Chinesischen Medizin sowie zur Integrierten Chinesisch-Westlichen Medizin der Provinz Jiangsu (Förderkennzeichen Nr. CYTF2026019) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Actinomycin DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559Transkriptionsinhibitor zur Bestimmung der RNA-Stabilität
AMV-ReversetranskriptaseTakara, Tokyo, Japan2621Enzym zur komplementären DNA-Synthese
Annexin V-APC/PI-DetektionskitBioLab Technology, Beijing, ChinaKFS191Kit zur Durchflusszytometrie-Analyse der Apoptose
Antifade-EinbettmediumMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042Einbettmedium zum Erhalt der Fluoreszenz
Primärantikörper gegen BaxAffinity Biosciences, OH, USAAF0120Primärantikörper zum Nachweis von Bax
BCA-KitMacklin, Shanghai, ChinaB917925Kit zur Bestimmung der Proteinkonzentration
Primärantikörper gegen Bcl-2Affinity Biosciences, OH, USAAF0769Primärantikörper zum Nachweis von Bcl-2
RinderserumalbuminBioLab Technology, Beijing, ChinaBTN131070Blockierendes Reagenz
Calcein/PI-DetektionskitBeyotime, Shanghai, ChinaC2015MKit zur Färbung von lebenden und toten Zellen
Caspase-3-Aktivitäts-Assay-KitBioLab Technology, Beijing, ChinaQN2866Kit zur Messung der Caspase-3-Aktivität
Primärantikörper gegen Caspase-3Abcam, MA, USAab184787Primärantikörper zum Nachweis von Caspase-3
CCK-8-ReagenzMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301Reagenz zur Beurteilung der Zellviabilität
Primärantikörper gegen gespaltene Caspase-3Abcam, MA, USAab32042Primärantikörper zum Nachweis von gespaltener Caspase-3
CycloheximidMacklin, Shanghai, ChinaH823111Inhibitor der Proteinsynthese zur Bestimmung der Protein-Stabilität
CyclophosphamidMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420Wird zur Induktion einer Spermatogenese-Störung verwendet
DAPI-ReagenzBeyotime, Shanghai, ChinaC1006Kerngegenfärbung
DMEM-MediumWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNLM-302Zellkulturmedium für GC-1-Zellen
ECL-ArbeitslösungSolarbio, Beijing, ChinaSW2030Chemilumineszenter Substrat zur Detektion von Proteinbändern
EtoposidMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629Apoptose-induzierendes Agens
DurchflusszytometerBD Biosciences, CA, USABD FACSCaliburGerät zur Analyse der Apoptose
FlowJo-SoftwareBD Biosciences, CA, USAv10.8Software zur Analyse von Durchflusszytometriedaten
FluoreszenzmikroskopLeica, Heidelberg, DeutschlandDM3000Gerät zur Fluoreszenzbildgebung
Fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB22303Sekundärantikörper für die Immunfluoreszenzdetektion
ELISA-Kit für follikelstimulierendes HormonHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E06871mKit zur Bestimmung des serumseitigen follikelstimulierenden Hormons
Primärantikörper gegen GAPDHAffinity Biosciences, OH, USAT0004Ladekontroll-Antikörper für das Western Blotting
GC-1-ZellenWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNL-302Maus-Spermatogonialzelllinie
GelbildgebungssystemJinpeng Analysis Instrument, Shanghai, ChinaJP-2880Bildgebungssystem zur Visualisierung von Gelelektrophorese und Blots
GelbildgebungssystemInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500Chemilumineszenz-Bildgebungssystem für Western Blots
Ziegen-Anti-Kanin-IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB23303Sekundärantikörper für das Western Blotting
HämatoxylinlösungBioLab Technology, Beijing, ChinaYT165Kernfärbung für die histologische Analyse
Chlorsäurehaltige Ethanol-DifferenzierungslösungBeyotime, Shanghai, ChinaC0163SDifferenzierungsreagenz für die Hämatoxylinfärbung
ImageJ-SoftwareNational Institutes of Health, USA1.54hSoftware zur Bildquantifizierung
IP-ZelllysepufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013Lösepuffer für die Immunpräzipitation und Proteinextraktion
Primärantikörper gegen Ki67Affinity Biosciences, OH, USAAF0198Primärantikörper zum Nachweis von Ki67
LDH-Zytotoxizitäts-Assay-KitBeyotime, Shanghai, ChinaC0016Kit zur Messung der Freisetzung von Laktatdehydrogenase und zellulärer Schädigung
LichtmikroskopOlympus, Tokyo, JapanCKX53Wird zur Spermienzählung und morphologischen Beobachtung verwendet
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001Transfektionsreagenz
MikroplattenreaderMolecular Devices, CA, USASpectraMax MiniGerät zur Messung der Absorption
ELISA-Kit für Maus-LHHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E12770mKit zur Bestimmung des serumseitigen luteinisierenden Hormons bei der Maus
ELISA-Kit für Maus-TestosteronHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E05101mKit zur Bestimmung des serumseitigen Testosterons bei der Maus
Neutraler GummibalsamBioLab Technology, Beijing, ChinaQN1253Einbettmedium für histologische Schnitte
Primärantikörper gegen p38Affinity Biosciences, OH, USAAF6456Primärantikörper zum Nachweis von gesamtem p38
ParaformaldehydMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333Konservierungsmittel für Zellen und Gewebe
PARIS-KitInvitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921Kit zur Fraktionierung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA
PCR-SystemABI, CA, USAABI PRISM 7300Realtime-PCR-Gerät
Primärantikörper gegen p-p38Affinity Biosciences, OH, USAAF3455Primärantikörper zum Nachweis von phosphoryliertem p38
Proteinase-K-LösungBeyotime, Shanghai, ChinaST532Reagenz zur Gewebedurchlässigmachung vor der TUNEL-Färbung
PVDF-MembranenMillipore, MA, USAISEQ00010Membranen für den Proteinauftrag beim Western Blotting
Primärantikörper gegen QKI-5Abcam, MA, USAab126742Primärantikörper zum Nachweis von QKI-5
RNA-BindepufferInvitrogen, Carlsbad, CA, USA65040DPuffer für RNA-Protein-Bindungsreaktionen
SDS-LadepufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0286Ladepuffer für SDS-PAGE
Streptavidin-MagnetbeadsMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208Magnetische Beads zur Anreicherung biotinmarkierter RNA-Sonden
TB Green FAST qPCR-KitTakara, Tokyo, JapanCN830SReagenzkit für quantitative PCR
Triton X-100Macklin, Shanghai, ChinaT824275Permeabilisierungsreagenz
TRIzol-ReagenzInvitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CNReagenz zur Gesamt-RNA-Extraktion
TUNEL-DetektionslösungBeyotime, Shanghai, ChinaC1086Reagenz zum Nachweis von DNA-Fragmentierung
XylolMacklin, Shanghai, ChinaX821391Reagenz zur Entfernung von Paraffin und Gewebedurchsichtigung

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Schlagwörter

BiologyYangjing Capsulesspermatogenic dysfunctionlncRNA NONMMUT031883 2Quaking I 5p38 MAPK pathway

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