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Forschungsartikel

Yangjing-Kapseln lindern die spermatogene Dysfunktion bei Mäusen durch Hemmung des QKI-5/p38-MAPK-Signalwegs mittels Hochregulierung der lncRNA NONMMUT031883.2

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DOI:

10.3791/73166

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28. August 2026

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1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht die schützenden Wirkungen von Yangjing-Kapseln bei cyclophosphamidinduzierter Spermatogenesestörung bei Mäusen und prüft die Beteiligung des lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK-Signalwegs.

Zusammenfassung

Die Spermatogenese-Dysfunktion ist eine wichtige Ursache für männliche Unfruchtbarkeit, und Cyclophosphamid (CP) kann die Spermatogenese beeinträchtigen, indem es eine abnormale Apoptose der Spermatogonien induziert. Die Yangjing-Kapsel (YC) wird zur Verbesserung der Fortpflanzungsfunktion eingesetzt, doch ihr zugrundeliegender molekularer Wirkmechanismus ist bisher unklar. Diese Studie untersuchte die schützenden Effekte von YC in einem CP-induzierten Mausmodell der Spermatogenese-Dysfunktion sowie in GC-1-Spermatogonien. Die Spermienanzahl und -motilität, die männliche Fruchtbarkeit, die Konzentration der Sexualhormone im Serum sowie histopathologische Veränderungen in Hoden und Nebenhoden wurden analysiert. In GC-1-Zellen wurden Zellviabilität, Laktatdehydrogenase-Freisetzung, Apoptose und apoptosebezogene Proteine untersucht. Quantitative reversetranskriptive Polymerase-Kettenreaktion, RNA-Pull-down-Assays, Immunfluoreszenz und Western Blotting dienten der Untersuchung der lncRNA NONMMUT031883.2, Quaking-5 (QKI-5) und des p38-MAPK-Signalwegs (p38 mitogen-aktivierte Proteinkinase). YC verbesserte dosisabhängig die Spermienqualität, die Konzentration der Sexualhormone im Serum, die Morphologie der Fortpflanzungsorgane, die Hodenhistopathologie und die Fruchtbarkeit bei CP-behandelten Mäusen. In GC-1-Zellen erhöhte YC die Zellviabilität und verringerte zelluläre Schäden sowie die Apoptose. Die lncRNA NONMMUT031883.2 interagierte physikalisch mit QKI-5, und die Behandlung mit YC führte zu einer erhöhten Expression der lncRNA NONMMUT031883.2, während die Expression von QKI-5 und die Phosphorylierung von p38 abnahmen. Die Behandlung mit YC hemmte die durch Knockdown der lncRNA NONMMUT031883.2 induzierte Apoptose in GC-1-Zellen, während die Überexpression von QKI-5 die antiapoptotischen Effekte von YC abschwächte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YC die CP-induzierte Spermatogenese-Dysfunktion lindert und dass ihre schützenden Wirkungen über die Regulation des Signalwegs lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK vermittelt werden.

Einleitung

Die Spermatogenesestörung bezeichnet eine reproduktive Beeinträchtigung, die durch Abnormalitäten in der Spermienproduktion, -reifung oder -funktion im männlichen Fortpflanzungssystem verursacht wird. Sie zeichnet sich durch eine verminderte Spermienanzahl und -beweglichkeit sowie eine erhöhte Rate an Spermienfehlbildungen aus.1,2Die Pathogenese einer gestörten Spermatogenese ist komplex und mit genetischen Faktoren, Autoimmunerkrankungen, Umweltgiften, durch Chemotherapie verursachten Schäden sowie Läsionen der Fortpflanzungsorgane assoziiert3-5. Chemotherapeutika wie Cyclophosphamid (CP) können direkt die Hoden-Seminiferustubuli schädigen und die Apoptose von Spermatogonien induzieren, wodurch sie zur männlichen Spermatogenesestörung beitragen6,7Hormonersatztherapie, antioxidative Supplementierung und assistierte Fortpflanzungstechnologien werden derzeit als klinische Interventionen eingesetzt. Diese Ansätze weisen jedoch eine uneinheitliche Wirksamkeit sowie erhebliche Nebenwirkungen auf.8,9,10Daher ist die Identifizierung sicherer und wirksamer Interventionen sowie die Aufklärung ihrer molekularen Zielstrukturen klinisch wichtig, um die Fruchtbarkeitsprognose bei Patienten mit einer gestörten Spermatogenese zu verbessern.

Die chinesische Kräutermedizin hat aufgrund ihrer multizielträchtigen Eigenschaften und relativ geringen Toxizität Potenzial beim Schutz der männlichen Fortpflanzungsfunktion und bei der Behandlung von spermatogenen Dysfunktionen gezeigt11,12. Die Yangjing-Kapsel (YC) ist ein traditionelles chinesisches Patentarzneimittel, das aus Rehmannia glutinosa, Epimedium, Plazenta, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis und anderen chinesischen Kräutermedizinen besteht. Es wird verwendet, um die Niere und das Wesen zu stärken, das Blut und das Mark zu nähren und die Fortpflanzungsfunktion zu regulieren13. Frühere Studien haben gezeigt, dass YC die Sexualhormonspiegel bei männlichen Tieren regulieren, die Spermienqualität verbessern, Schäden im Hodengewebe reparieren und vor reproduktiven Schäden durch chemische Substanzen schützen kann14,15. Spermatogoniale Zellen bilden die Grundlage der Spermatogenese, und eine abnormale Apoptose spermatogonialer Zellen ist ein zentraler Vorgang bei der Entstehung spermogener Dysfunktionen16. Berichten zufolge kann YC auch die Vitalität spermatogonialer Zellen verbessern, den Anteil der Zellen in der S-Phase erhöhen und die Apoptose hemmen17. Die schützenden Wirkungen und spezifischen molekularen Mechanismen von YC bei CP-induzierter spermogener Dysfunktion sind jedoch noch nicht vollständig geklärt.

Lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) sind RNA-Moleküle, die länger als 200 Nukleotide sind und keine Proteinkodierungsfähigkeit besitzen18. LncRNAs können die Genexpression durch Mechanismen wie chromosomale Stilllegung, Chromatinmodifikation, genomisches Imprinting und transkriptionelle Aktivierung regulieren19,20. Das RNA-bindende Protein Quaking-5 (QKI-5) ist an physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt, darunter Zellproliferation und Apoptose, indem es die alternative Spleißung nachgeschalteter Gene reguliert21. Der p38-Mitogen-aktivierte Proteinkinase-(MAPK)-Signalweg ist an der Regulation der Apoptose beteiligt und spielt zudem eine wichtige Rolle bei der männlichen Fertilität und der Hodenentwicklung22,23. Eine frühere Studie zeigte, dass die Überexpression von QKI-5 den p38-MAPK-Signalweg in hepatzellulären Karzinomzellen aktiviert24. Außerdem wurde gezeigt, dass das lncRNA NONMMUT074098.2 in Spermatogonien an QKI-5 bindet, während die Absenkung von QKI-5 den p38-MAPK-Signalweg hemmte und die Apoptose von Spermatogonien verringerte25. In dieser Studie wurde ein durch CP induziertes Mausmodell der spermatogenen Dysfunktion verwendet, um zu untersuchen, ob YC die Expression des lncRNA NONMMUT031883.2 sowie die QKI-5/p38-MAPK-Signalachse reguliert und dadurch eine abnormale Apoptose von Spermatogonien reduziert und die durch CP induzierte spermatogene Dysfunktion abschwächt (Abbildung 1). Ziel war es, den molekularen Mechanismus aufzuklären, der den schützenden Wirkungen von YC auf die Spermatogenese zugrunde liegt, und das Verständnis über seine pharmakologische Rolle beim Schutz der männlichen Fortpflanzungsfunktion zu erweitern.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Designs. Das obere Panel fasst die in vitro-Experimente in GC-1-Spermatogonienzellen zusammen. Die Herunterregulierung der lncRNA NONMMUT031883.2 wurde verwendet, um Apoptose und zelluläre Schäden hervorzurufen, gefolgt von der Herunterregulierung von QKI-5, um deren Auswirkungen auf Apoptose und Zellschädigung zu bewerten. Das untere Panel fasst die in vivo-Experimente in Mausmodellen mit durch Cyclophosphamid (CP) induzierter spermatogener Dysfunktion zusammen. Die Mäuse erhielten eine Behandlung mit Yangjing-Kapsel und/oder eine Intervention bezüglich der lncRNA NONMMUT031883.2 oder QKI-5. Anschließend wurden Fruchtbarkeit, Serumhormonspiegel, Hoden- und Nebenhoden-Gewebe, Spermensuspension, Spermienreserven, Spermienqualität und histopathologische Hodenschäden bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien und dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labor­tieren durchgeführt. Alle experimentellen Protokolle wurden vom Tierversuchsausschuss der Südostuniversität überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer 20230216022).

1. Herstellung des Yangjing-Capsules-haltigen Serums
Zwei Yangjing-Capsules (YC; 0,5 g/Kapsel) wurden geöffnet und 0,8 g des Kapselinhalts abgewogen. Normale Kochsalzlösung wurde bis zu einem Endvolumen von 10 mL zugegeben, und das Gemisch wurde gründlich verwirbelt, um eine 80 mg/mL Suspension herzustellen. Spezifisch pathogenfreie männliche BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 22–25 g und einem Alter von 8 Wochen wurden bei 22 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 55–60 % im 12-Stunden-Licht-/Dunkel-Wechsel gehalten, wobei Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung standen. Nach einer Akklimatisierungsphase von einer Woche erhielten die Mäuse YC mittels oraler Gavage in einer Dosis von 800 mg/kg Körpergewicht in einem Volumen von 10 mL/kg einmal täglich über 5 aufeinanderfolgende Tage. Zwei Stunden nach der letzten Gabe wurden die Mäuse mit 1 %igem Natriumpentobarbital intraperitoneal anästhesiert, und Blutproben wurden entnommen, um das YC-haltige Serum herzustellen. Das Serum wurde 30 Minuten bei 56 °C inaktiviert, durch eine 0,22 µm-Membran filtriert und bis zur Verwendung bei −80 °C gelagert.

2. Zellkultur und Transfektion
Maus-GC-1-Spermatogonialzellen wurden in DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin und 10 % fetalem Kälberserum kultiviert. Alle Kulturen wurden bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO₂ (V/V) gehalten.

LncRNA-spezifische kurze Haarnadel-RNA (sh-lncRNA), ein QKI-5-Überexpression-Plasmid (OE-QKI-5), QKI-5-spezifische kleine interferierende RNA (si-QKI-5) sowie deren entsprechende negative Kontrollen (sh-NC, OE-NC und si-NC) wurden synthetisiert und konstruiert. GC-1-Zellen wurden gemäß den Anweisungen des Transfektionsreagenzes mit sh-lncRNA oder sh-NC, si-QKI-5 oder si-NC bzw. OE-QKI-5 oder OE-NC transfiziert. Nach einer Inkubation von 48 h wurde die Transfektionseffizienz durch die Messung der Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 oder von QKI-5 überprüft.

Für die Gruppe sh-lncRNA + si-QKI-5 + Etoposid wurden GC-1-Zellen mit sh-lncRNA und si-QKI-5 transfiziert und anschließend 12 h lang mit 100 µM Etoposid behandelt26. Für nachfolgende Zellviabilitätsassays wurden GC-1-Zellen in Medium kultiviert, das mit 5 %, 10 % oder 20 % YC-haltigem Serum ergänzt war, und als Gruppen mit niedriger Dosis YC (L-YC), mittlerer Dosis YC (M-YC) bzw. hoher Dosis YC (H-YC) bezeichnet. Die Konzentrationen von YC-haltigem Serum (5 %, 10 % und 20 % YC) wurden basierend auf den Ergebnissen vorläufiger Konzentrationsgradientenexperimente festgelegt. Für die Gruppen sh-lncRNA + H-YC + OE-NC und sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5 wurden GC-1-Zellen 48 h lang mit sh-lncRNA plus OE-NC oder sh-lncRNA plus OE-QKI-5 transfiziert und anschließend 24 h lang 20 %igem YC-haltigem Serum ausgesetzt.

3. Cell Counting Kit-8-Assay
GC-1-Zellen wurden in 96-Loch-Platten mit jeweils 5 × 103 Zellen/Loch ausgesät und 24 h kultiviert. Nach der Zellanheftung wurde das ursprüngliche Medium durch 100 µL komplettes Medium ergänzt durch YC-haltiges Serum ersetzt, und die Zellen wurden 6, 12 oder 24 h inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 µL Cell Counting Kit-8-Reagenz zu jedem Loch hinzugefügt, und die Zellen wurden 2 h bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplatten-Reader gemessen.

4. Lactatdehydrogenase-Assay
Nach der Transfektion mit sh-NC oder sh-lncRNA für 48 h wurde das Kulturmedium der GC-1-Zellen gesammelt und das Supernatant durch Zentrifugation gewonnen. Gemäß den Anweisungen des Lactatdehydrogenase-Assay-Kits wurde das Supernatant vorsichtig mit der Detektionsarbeitslösung vermischt und in eine 96-Well-Platte überführt. Die Platte wurde 30 min bei 25 °C im Dunkeln inkubiert. Die Absorption bei 490 nm wurde mithilfe eines Mikroplattenlesegeräts gemessen, und die Freisetzung von Lactatdehydrogenase wurde zur Beurteilung von Zellschäden berechnet.

5. Calcein-AM/Propidiumiodid-Färbung
Nach einer Transfektion mit sh-NC oder sh-lncRNA für 48 h wurde die Überlebensfähigkeit der GC-1-Zellen mittels Calcein-AM/Propidiumiodid (PI)-Färbung bewertet. Die Zellen wurden in 12-Loch-Platten mit jeweils 5 × 104 Zellen pro Loch ausgesät und solange kultiviert, bis sie eine Konfluenz von 60–70 % erreichten. Die Zellen wurden vorsichtig mit phosphatgepufferter Salzlösung gespült und anschließend mit 500 µL Calcein-AM/PI-Färbelösung pro Loch versetzt. Die Probe wurde 30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubiert und danach unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Lebende und tote Zellen wurden mithilfe einer Bildanalyse-Software gezählt, und der Anteil überlebender Zellen wurde berechnet.

6. Durchflusszytometrie
GC-1-Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. Das Zellpellet wurde in 500 µL Bindungspuffer bei einer Dichte von 5 × 105 Zellen/mL resuspendiert. Anschließend wurden jeweils 5 µL Annexin V-APC und PI zugegeben, die Suspension gründlich gemischt und 10 Minuten bei 25 °C im Dunkeln inkubiert. Die Apoptose wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert, wobei die Anregungs-/Emissionswellenlängen 633/660 nm für APC und 488/630 nm für PI verwendet wurden. Die Apoptoserate wurde mit einer Software zur Analyse von Durchflusszytometriedaten bewertet.

7. Caspase-3-Aktivitäts-Assay
Nach den angegebenen Behandlungen wurden etwa 1 × 106 GC-1-Zellen gesammelt, gewaschen und in phosphatgepufferter Salzlösung resuspendiert. Die Zellen wurden mit 100 µL Reagenz II aus dem Caspase-3-Aktivitäts-Assay-Kit gemischt und 15 min auf Eis lysiert. Nach der Zentrifugation wurden 50 µL des Überstandes der Zelllyse gesammelt und mit 40 µL Reagenz I sowie 10 µL Reagenz III vermischt. Die Mischung wurde 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Absorption bei 405 nm wurde mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, und die Caspase-3-Aktivität wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet.

8. RNA-Pull-down-Assay
Die Sinus- und Antisinnusstränge der lncRNA NONMMUT031883.2 wurden entsprechend der zugehörigen Sequenz synthetisiert und mit Biotin markiert. Die Zellen wurden 30 min auf Eis in einem Immunpräzipitations-Puffer zum Aufschluss von Zellen lysiert, und der proteinhaltige Überstand wurde durch Zentrifugation gewonnen. Streptavidin-Magnetkügelchen wurden dreimal mit RNA-Bindungspuffer gewaschen und anschließend 30 min in Bindungspuffer mit 1 % Rinderserumalbumin inkubiert.

Die vorbehandelten Kügelchen wurden mit den biotinmarkierten Sonden kombiniert und bei 25 °C für 30 min inkubiert. Ungebundene Sonden wurden durch magnetische Trennung entfernt. Anschließend wurde der Zelllysat-Überstand hinzugegeben und die Mischung bei 4 °C für 4 h inkubiert, um magnetische Kügelchen-RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die magnetischen Kügelchen wurden dreimal mit Waschpuffer gewaschen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Der Waschpuffer wurde durch magnetische Trennung entfernt und 2× SDS-Probelade-Puffer hinzugefügt. Die Proben wurden bei 95 °C für 10 min erhitzt und der Überstand durch magnetische Trennung für die nachfolgende Western-Blot-Analyse gesammelt.

9. Erstellung eines Mausmodells für eine gestörte Spermatogenese
Nach einer Eingewöhnungsphase von 5 Tagen erhielten spezifisch pathogenfreie männliche BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 22–25 g und einem Alter von 8 Wochen über 7 Tage hinweg einmal täglich Cyclophosphamid (CP) in einer Dosis von 50 mg/kg intraperitoneal, um ein Modell für eine gestörte Spermatogenese zu etablieren14,27. Die erfolgreich modellierten Mäuse wurden mithilfe einer Zufallszahltabelle den folgenden Gruppen zufällig zugewiesen: CP, 200 mg/kg YC, 400 mg/kg YC, 800 mg/kg YC, 800 mg/kg YC + sh-NC und 800 mg/kg YC + sh-lncRNA, jeweils mit sechs Mäusen pro Gruppe.

Mäusen in den mit YC behandelten Gruppen wurde einmal täglich über einen Zeitraum von 30 Tagen die entsprechende Dosis YC mittels oraler Gavage verabreicht13. Bei den Gruppen 800 mg/kg YC + sh-NC und 800 mg/kg YC + sh-lncRNA wurden nach erfolgreicher Modellerstellung die Tiere durch Inhalation von 2 % Isofluran narkotisiert. Nachdem sichergestellt war, dass kein Zehefortzugsreflex mehr auftrat und die Atemfrequenz stabil war, wurde die Operationsstelle rasiert und mit Povidon-Iodid desinfiziert. Unter aseptischen Bedingungen erfolgte ein medianer ventraler Haut- und Bauchwandanschnitt vor der Genitalregion. Der Hoden wurde durch vorsichtiges Zurückziehen des Nebenhodenfettgewebes freigelegt, wobei darauf geachtet wurde, keine Gefäße zu verletzen. Mithilfe eines Mikromanipulators wurden die Samenkanälchen sichtbar gemacht, und 1 µL der Adenovirus-Suspension (1 × 1010 TU/mL) wurden langsam mittels einer Mikroinjektionsnadel injiziert28. Die Nadel blieb nach der Injektion 5 Minuten lang an Ort und Stelle, bevor sie langsam zurückgezogen wurde; die Blutstillung erfolgte mit einem sterilen Wattestäbchen. Der gleiche Vorgang wurde anschließend am kontralateralen Hoden durchgeführt. Der Schnitt wurde anschließend vernäht, und die Tiere durften postoperativ auf einer Wärmematte aus der Narkose aufwachen. Kontrolltiere erhielten täglich eine isovolumetrische Menge an Kochsalzlösung per Gavage sowie Injektion.

10. Beurteilung der Fruchtbarkeit
Nach Abschluss der Medikamentengabe wurden männliche Mäuse jeder Gruppe für 7 Tage im Verhältnis 1:2 mit weiblichen BALB/c-Mäusen frei verpaart. Die Bildung von Vaginalpfropfen bei den weiblichen Mäusen wurde täglich überwacht und dokumentiert. Nach Bestätigung einer erfolgreichen Paarung wurden die männlichen Mäuse entfernt, und die weiblichen Mäuse wurden einzeln bis zur natürlichen Geburt gehalten. Pro Gruppe wurden neun trächtige weibliche Mäuse erhalten und in die Analyse eingeschlossen. Die durchschnittliche Wurfgröße wurde erfasst, um die Fruchtbarkeit der männlichen Mäuse in jeder Gruppe zu bewerten.

Am Ende der Versuchszeit wurden die Mäuse durch intraperitoneale Verabreichung von Pentobarbital-Natrium (100 mg/kg) euthanasiert. Diese Methode der Euthanasie wurde vom Tierversuchsausschuss der Southeast University genehmigt (Genehmigungsnummer 20230216022). Die Hoden und Nebenhoden wurden sorgfältig präpariert, fotografiert und gewogen. Die Hoden- und Nebenhoden-Indizes wurden als Organmasse/Körpermasse berechnet. Von jedem Tier wurde ein Nebenhoden entnommen, in Stücke geschnitten, in 1 mL vorgewärmtes phosphatgepuffertes Kochsalzlösung (37 °C) gegeben und 20 Minuten lang inkubiert, um das Ausschwimmen der Spermien zu ermöglichen29. Die Spermien-Suspension wurde vorsichtig gemischt, und 10 µL der Suspension wurden auf eine vorgewärmte Blutkörperchen-Zählkammer gegeben. Die Spermienzahl wurde manuell unter dem Lichtmikroskop bei 200×-Vergrößerung bestimmt, und die Ergebnisse wurden als 106/L angegeben. Außerdem wurde der Anteil der progressiv beweglichen Spermatozoen im Verhältnis zur Gesamtanzahl der Spermatozoen als Spermienmotilität berechnet13.

11. Bestimmung der Sexualhormonspiegel
Blut wurde aus der Orbitavene von Mäusen jeder Gruppe entnommen und bei 25 °C 30 min lang stehen gelassen. Das Serum wurde durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 10 min gewonnen30. Die Konzentrationen von Testosteron, luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem Hormon (FSH) im Serum wurden mithilfe der entsprechenden ELISA-Testsätze bestimmt.

12. RNA-Stabilitäts-Assay
GC-1-Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten ausgesät, mit si-QKI-5 oder si-NC transfiziert und 48 h kultiviert. Anschließend wurde Actinomycin D in einer Konzentration von 5 µg/mL zugegeben, und die Zellen wurden nach 0, 3, 6 und 9 h gesammelt. Gesamt-RNA wurde isoliert, und die relative Expression von lncRNA NONMMUT031883.2 wurde mittels quantitativer reverser Transkription-Polymerase-Kettenreaktion nach reverser Transkription bestimmt. Die relative RNA-Menge zu jedem Zeitpunkt wurde unter Verwendung des Expressionsspiegels zum Zeitpunkt 0 h als 100 % berechnet.

13. Quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion
GC-1-Zellen und murine Hodengewebe wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und zur Isolierung der Gesamt-RNA lysiert. Die komplementäre DNA wurde mittels reverser Transkription unter Verwendung von AMV-Reverser Transkriptase synthetisiert. Die Polymerase-Kettenreaktion wurde unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Systems und eines quantitativen PCR-Kits durchgeführt, wobei die komplementäre DNA als Amplifikationsvorlage diente. U6 wurde als interne Referenz für die lncRNA NONMMUT031883.2 verwendet, und GAPDH wurde als interner Referenzwert für QKI-5. Die relative Expression der Zielgene wurde unter Verwendung des 2−ΔΔCt Methode25RNA wurde außerdem separat aus den zytoplasmatischen und nukleären Fraktionen isoliert, um die subzelluläre Lokalisation der lncRNA NONMMUT031883.2 zu bestimmen. Die Primersequenzen sind angegeben in Tabelle 1.

GenForward-Primer (5' zu 3')Reverse-Primer (5' zu 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

Tabelle 1: Primersequenzen für die quantitative reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion. Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen sind in 5′–3′-Richtung für die lncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5, U6 und GAPDH aufgeführt.

14. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
Mäusetesticular- und Nebenhoden-Gewebe wurden in 4% Paraformaldehyd eingetaucht und bei 4 °C 24 h lang fixiert. Nach dem Spülen mit phosphatgepufferter Salzlösung wurden die Gewebe durch eine abgestufte Ethanolreihe dehydriert, in Paraffin eingebettet und in 5 µm dicken Schnitten geschnitten. Die Schnitte wurden 60 min bei 60 °C erhitzt und 30 min in Xylol entwachst.

Nach der Hydratation durch eine abgestufte Ethanolreihe wurden die Schnitte 5 min mit Hämatoxylin angefärbt, 10 s lang mit einer Salzsäure-Ethanol-Differenzierungslösung behandelt, mit Leitungswasser zum Bläuen gewaschen und anschließend 2 min mit 1 % Eosin gefärbt. Danach wurden die Schnitte in 95 %igem Ethanol und absolutem Ethanol dehydriert und 30 min in Xylol geklärt. Nach dem Lufttrocknen wurden die Schnitte mit neutraler Gummi eingedeckt. Morphologische Veränderungen in Hoden und Nebenhoden wurden unter dem Mikroskop untersucht.

15. Immunfluoreszenz
Paraffinschnitte von Maustestes wurden deparaffiniert und über eine abgestufte Ethanolreihe rehydriert, gefolgt von einer antigenen Retrieval-Behandlung im Zitratpuffer bei pH 6,0 mittels Mikrowelle. Nach dem natürlichen Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Schnitte 10 Minuten lang mit 0,3 % Triton X-100 behandelt. Die Schnitte wurden mit 5 % bovinem Serumalbumin bei 25 °C für 60 Minuten blockiert, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült und anschließend über Nacht bei 4 °C mit einem primären Antikörper gegen Ki67 inkubiert. Am folgenden Tag wurde ein fluorochrom-markierter sekundärer Immunglobulin-G-Antikörper aufgetragen, und die Schnitte wurden 60 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Nach dem Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden die Schnitte 10 Minuten lang mit DAPI kontrastgefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Fluoreszenzintensität wurde mithilfe einer Bildanalyse-Software ausgewertet.

Für die Immunfluoreszenzfärbung von GC-1-Zellen wurden die Zellen in 12-Loch-Platten mit 1 × 105 Zellen/Loch ausgesät und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden 30 min mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, 10 min mit 0,3 % Triton X-100 permeabilisiert, mit 5 % Rinderserumalbumin blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit einem primären Antikörper gegen QKI-5 inkubiert. Der weitere Verfahrensschritt wurde wie für die Hodengewebeschnitte beschrieben durchgeführt.

16. TUNEL-Färbung
Paraffinschnitte von Maustestes wurden entparaffiniert, durch eine abgestufte Ethanolreihe rehydriert und zur Erhöhung der Zellmembranpermeabilität 5 min mit 0,1 %iger Triton X-100-Lösung inkubiert. Anschließend wurde die Arbeitslösung von Proteinase K (20 µg/mL) ohne DNase gleichmäßig auf die Schnitte aufgetragen und 15 min bei 37 °C inkubiert. Die TUNEL-Nachweislösung wurde hinzugefügt, und die Schnitte wurden 90 min bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation mit DAPI wurde ein Antifade-Montierungsmittel aufgetragen, und das Hodengewebe wurde im Fluoreszenzmikroskop untersucht.

GC-1-Zellen wurden in 12-Loch-Platten ausgesät und 30 min mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach Permeabilisierung mit 0,1 % Triton X-100 für 5 min wurde die TUNEL-Nachweislösung auf die Zellen aufgetragen und anschließend 60 min im Dunkeln inkubiert. Danach wurden die Zellen 10 min mit DAPI angefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

17. Western-Blot
Mäusetesticumgewebe und GC-1-Zellen wurden 30 min auf Eis in einem Zelllysepuffer für die Immunpräzipitation lysiert und durch Ultraschall zerkleinert. Nach Zentrifugation wurde der proteinhaltige Überstand gesammelt, und die Protein-Konzentration wurde mit einem Bicinchoninsäure-Assay-Kit bestimmt. Der Protein-Überstand wurde mit SDS-Lade-Puffer versetzt und 10 min im siedenden Wasser erhitzt. Nach Trennung mittels Gelelektrophorese wurden die Proteine auf Polyvinylidenfluorid-Membranen übertragen und 2 h mit 5 % Rinderserumalbumin blockiert31.

Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen gespaltene Caspase-3 (1:500), Bcl-2 (1:1000), Caspase-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), phosphoryliertes p38 (1:1000) oder p38 (1:500) inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Membranen mit Tris-gepufferter Salzlösung mit Tween 20 gespült und anschließend 2 h bei 25 °C mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG in einer Verdünnung von 1:10000 inkubiert. Die Arbeitslösung für die verbesserte Chemilumineszenz wurde auf die Membranoberfläche aufgetragen, und die Proteinbänder wurden mit einem Gel-Imaging-System aufgenommen. Die Bandenintensität wurde mithilfe einer Bildanalyse-Software ausgewertet, und die relative Proteinausprägung wurde auf GAPDH (1:3000) normalisiert.

Cycloheximid in einer Konzentration von 50 µg/mL wurde verwendet, um die Proteinsynthese zu hemmen. Um die Halbwertszeit von QKI-5 zu bestimmen, wurden Zellen nach 0, 3, 6 und 9 h gesammelt, und die Proteinspiegel von QKI-5 wurden anschließend mittels Western-Blotting bestimmt25.

18. Statistische Analyse
Alle Daten wurden statistisch analysiert und mithilfe von Statistik-, Grafik- und Bildanalyse-Software dargestellt. Zur Beurteilung der Daten-Normalverteilung wurde der Shapiro-Wilk-Test verwendet. Die experimentellen Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Zur Bewertung der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Bei homogener Varianz kamen für die post-hoc paarweisen Vergleiche der LSD-t-Test zum Einsatz, bei heterogener Varianz hingegen der Dunnett’s-T3-Test. Ein p-Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

Die Herunterregulierung des lncRNA NONMMUT031883.2 induziert die Apoptose von Spermatogonien
GC-1-Zellen wurden mit sh-lncRNA transfiziert, um die Expression der lncRNA NONMMUT031883.2 herunterzuregulieren. Im Vergleich zu mit sh-NC transfizierten Zellen war das transkriptionelle Niveau der lncRNA NONMMUT031883.2 nach Transfektion mit sh-lncRNA deutlich verringert, was eine erfolgreiche Herunterregulierung bestätigt (Abbildung 2A). Nach der Herunterregulierung der lncR...

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Diskussion

Die chemotherapieinduzierte erworbene Spermatogenesestörung ist eine wichtige Ursache für männliche Unfruchtbarkeit32,33,34. Die spezifischen molekularen Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Yangjing-Kapsel (YC) dosisabhängig die durch Cyclophosphamid (CP) verursachten Störungen der Sexualhormone, die histopathologischen Schädigungen des Hodens sowie die eingesc...

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Offenlegungen

Die Autoren geben keine finanziellen oder nichtfinanziellen Interessenkonflikte an.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Nationale Natürliche Wissenschaftsstiftung Chinas (Förderkennzeichen Nr. 82374257), das Vierte Programm zur Förderung des Spitzenakademischen Nachwuchses des Provinzialklinikums für Chinesische Medizin in Jiangsu (Förderkennzeichen Nr. k2026yrc74) und die Forschungsprojekte zur Traditionellen Chinesischen Medizin sowie zur Integrierten Chinesisch-Westlichen Medizin der Provinz Jiangsu (Förderkennzeichen Nr. CYTF2026019) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Actinomycin DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559Transkriptionsinhibitor zur Bestimmung der RNA-Stabilität
AMV-ReversetranskriptaseTakara, Tokyo, Japan2621Enzym zur komplementären DNA-Synthese
Annexin V-APC/PI-DetektionskitBioLab Technology, Beijing, ChinaKFS191Kit zur Durchflusszytometrie-Analyse der Apoptose
Antifade-EinbettmediumMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042Einbettmedium zum Erhalt der Fluoreszenz
Primärantikörper gegen BaxAffinity Biosciences, OH, USAAF0120Primärantikörper zum Nachweis von Bax
BCA-KitMacklin, Shanghai, ChinaB917925Kit zur Bestimmung der Proteinkonzentration
Primärantikörper gegen Bcl-2Affinity Biosciences, OH, USAAF0769Primärantikörper zum Nachweis von Bcl-2
RinderserumalbuminBioLab Technology, Beijing, ChinaBTN131070Blockierendes Reagenz
Calcein/PI-DetektionskitBeyotime, Shanghai, ChinaC2015MKit zur Färbung von lebenden und toten Zellen
Caspase-3-Aktivitäts-Assay-KitBioLab Technology, Beijing, ChinaQN2866Kit zur Messung der Caspase-3-Aktivität
Primärantikörper gegen Caspase-3Abcam, MA, USAab184787Primärantikörper zum Nachweis von Caspase-3
CCK-8-ReagenzMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301Reagenz zur Beurteilung der Zellviabilität
Primärantikörper gegen gespaltene Caspase-3Abcam, MA, USAab32042Primärantikörper zum Nachweis von gespaltener Caspase-3
CycloheximidMacklin, Shanghai, ChinaH823111Inhibitor der Proteinsynthese zur Bestimmung der Protein-Stabilität
CyclophosphamidMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420Wird zur Induktion einer Spermatogenese-Störung verwendet
DAPI-ReagenzBeyotime, Shanghai, ChinaC1006Kerngegenfärbung
DMEM-MediumWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNLM-302Zellkulturmedium für GC-1-Zellen
ECL-ArbeitslösungSolarbio, Beijing, ChinaSW2030Chemilumineszenter Substrat zur Detektion von Proteinbändern
EtoposidMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629Apoptose-induzierendes Agens
DurchflusszytometerBD Biosciences, CA, USABD FACSCaliburGerät zur Analyse der Apoptose
FlowJo-SoftwareBD Biosciences, CA, USAv10.8Software zur Analyse von Durchflusszytometriedaten
FluoreszenzmikroskopLeica, Heidelberg, DeutschlandDM3000Gerät zur Fluoreszenzbildgebung
Fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB22303Sekundärantikörper für die Immunfluoreszenzdetektion
ELISA-Kit für follikelstimulierendes HormonHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E06871mKit zur Bestimmung des serumseitigen follikelstimulierenden Hormons
Primärantikörper gegen GAPDHAffinity Biosciences, OH, USAT0004Ladekontroll-Antikörper für das Western Blotting
GC-1-ZellenWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNL-302Maus-Spermatogonialzelllinie
GelbildgebungssystemJinpeng Analysis Instrument, Shanghai, ChinaJP-2880Bildgebungssystem zur Visualisierung von Gelelektrophorese und Blots
GelbildgebungssystemInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500Chemilumineszenz-Bildgebungssystem für Western Blots
Ziegen-Anti-Kanin-IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB23303Sekundärantikörper für das Western Blotting
HämatoxylinlösungBioLab Technology, Beijing, ChinaYT165Kernfärbung für die histologische Analyse
Chlorsäurehaltige Ethanol-DifferenzierungslösungBeyotime, Shanghai, ChinaC0163SDifferenzierungsreagenz für die Hämatoxylinfärbung
ImageJ-SoftwareNational Institutes of Health, USA1.54hSoftware zur Bildquantifizierung
IP-ZelllysepufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013Lösepuffer für die Immunpräzipitation und Proteinextraktion
Primärantikörper gegen Ki67Affinity Biosciences, OH, USAAF0198Primärantikörper zum Nachweis von Ki67
LDH-Zytotoxizitäts-Assay-KitBeyotime, Shanghai, ChinaC0016Kit zur Messung der Freisetzung von Laktatdehydrogenase und zellulärer Schädigung
LichtmikroskopOlympus, Tokyo, JapanCKX53Wird zur Spermienzählung und morphologischen Beobachtung verwendet
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001Transfektionsreagenz
MikroplattenreaderMolecular Devices, CA, USASpectraMax MiniGerät zur Messung der Absorption
ELISA-Kit für Maus-LHHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E12770mKit zur Bestimmung des serumseitigen luteinisierenden Hormons bei der Maus
ELISA-Kit für Maus-TestosteronHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E05101mKit zur Bestimmung des serumseitigen Testosterons bei der Maus
Neutraler GummibalsamBioLab Technology, Beijing, ChinaQN1253Einbettmedium für histologische Schnitte
Primärantikörper gegen p38Affinity Biosciences, OH, USAAF6456Primärantikörper zum Nachweis von gesamtem p38
ParaformaldehydMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333Konservierungsmittel für Zellen und Gewebe
PARIS-KitInvitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921Kit zur Fraktionierung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA
PCR-SystemABI, CA, USAABI PRISM 7300Realtime-PCR-Gerät
Primärantikörper gegen p-p38Affinity Biosciences, OH, USAAF3455Primärantikörper zum Nachweis von phosphoryliertem p38
Proteinase-K-LösungBeyotime, Shanghai, ChinaST532Reagenz zur Gewebedurchlässigmachung vor der TUNEL-Färbung
PVDF-MembranenMillipore, MA, USAISEQ00010Membranen für den Proteinauftrag beim Western Blotting
Primärantikörper gegen QKI-5Abcam, MA, USAab126742Primärantikörper zum Nachweis von QKI-5
RNA-BindepufferInvitrogen, Carlsbad, CA, USA65040DPuffer für RNA-Protein-Bindungsreaktionen
SDS-LadepufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0286Ladepuffer für SDS-PAGE
Streptavidin-MagnetbeadsMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208Magnetische Beads zur Anreicherung biotinmarkierter RNA-Sonden
TB Green FAST qPCR-KitTakara, Tokyo, JapanCN830SReagenzkit für quantitative PCR
Triton X-100Macklin, Shanghai, ChinaT824275Permeabilisierungsreagenz
TRIzol-ReagenzInvitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CNReagenz zur Gesamt-RNA-Extraktion
TUNEL-DetektionslösungBeyotime, Shanghai, ChinaC1086Reagenz zum Nachweis von DNA-Fragmentierung
XylolMacklin, Shanghai, ChinaX821391Reagenz zur Entfernung von Paraffin und Gewebedurchsichtigung

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