Nephroprotektive Wirkungen von Ethanol und Fomepizol in einem mit Methotrexat vorbehandelten Rattenmodell der Methanolintoxikation

Zusammenfassung

Diese Studie vergleicht die nephroprotektiven Wirkungen von Ethanol und Fomepizol in einem mit Methotrexat vorbehandelten Rattenmodell einer Methanolintoxikation, das darauf ausgelegt ist, die folatabhängige Formatausscheidung zu verringern. Die renalen Ergebnisse wurden anhand von Parametern der Nierenfunktion, Biomarkern für Nierenschädigungen, Entzündungsmarkern, redoxbezogenen Biomarkern sowie histopathologischen Befunden bewertet.

Zusammenfassung

Methanolvergiftung verursacht metabolische Azidose, Organschäden und Tod; Nierenschäden sagen ungünstige Verläufe voraus. Ethanol und Fomepizol wurden in einem auf Methotrexat vorbehandelten Rattenmodell der Methanolvergiftung verglichen. Dreißig männliche Wistar-Ratten wurden fünf Gruppen zugewiesen: Kontrolle, Methotrexat (MTX), MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizol und MTX + Methanol + Ethanol (n = 6 pro Gruppe). MTX wurde per orale Gavage in einer Dosis von 0,3 mg/kg/Tag an den Tagen 1–7 verabreicht. Die drei Gruppen mit Methanolexposition erhielten am Tag 8 per orale Gavage 3 g/kg Methanol. Fomepizol wurde 4 Stunden nach Methanolverabreichung intraperitoneal in einer Dosis von 15 mg/kg verabreicht, gefolgt von 10 mg/kg nach 12, 24 und 36 Stunden. Ethanol wurde einmalig per orale Gavage 4 Stunden nach Methanolverabreichung in einer Dosis von 0,5 g/kg verabreicht. Die Probenentnahme erfolgte am Tag 10. Es wurde kein primärer Endpunkt prospektiv festgelegt. Nierenfunktion, Nierengewebshomogenat-Schädigung, entzündliche Biomarker, blutbasierte redoxrelevante Biomarker und histopathologische Befunde wurden untersucht. Die Varianzanalyse (ANOVA) ergab signifikante Gruppenunterschiede bei zystatin C im Nierengewebshomogenat (p = 0,003), Interleukin-6 (IL-6; p = 0,013), Molekül-1 für Nierenschädigung (KIM-1; p = 0,017), Serumharnstoff (p = 0,017) und Serumkreatinin (p < 0,001). Post-hoc-Analysen nach Duncan zeigten niedrigere Werte dieser Parameter in beiden Antidotgruppen im Vergleich zur MTX + Methanol-Gruppe. Zwischen den beiden Antidotgruppen wurden keine signifikanten biochemischen Unterschiede festgestellt. Die histopathologischen Scores waren in den Antidotgruppen niedriger. Obwohl Fomepizol ein günstigeres beschreibendes Muster zeigte, belegen die Ergebnisse nicht seine Überlegenheit gegenüber Ethanol. Heterogenität der Varianz, multiple Testung, ungleiche Antidotregime, das Fehlen von toxikokinetischen und Säure-Basen-Messungen sowie eine kurze Nachbeobachtungszeit erschweren die Interpretation. Zukünftige Studien sollten direkte Messungen von Methanol und Formiat, die Aktivität der renalen zytosolischen Alkoholdehydrogenase, Korrelationen mit renalen biochemischen Endpunkten, längere Nachbeobachtungszeiträume und vergleichbare Antidotregime einschließen.

Einleitung

Methanolvergiftungen stellen weltweit einen wichtigen toxischen Notfall dar, der mit erheblicher Morbidität und Mortalität verbunden ist, insbesondere nach Konsum illegaler oder illegal hergestellter alkoholischer Getränke. Obwohl Methanol an sich eine relativ geringe Toxizität aufweist, wird es hauptsächlich in der Leber durch Alkoholdehydrogenase (ADH) zu Formaldehyd und anschließend zu Ameisensäure metabolisiert; die dadurch verursachte Anreicherung von Formiat kann eine metabolische Azidose mit hoher Anionenlücke, eine optische Neuropathie sowie eine Schädigung mehrerer Organe hervorrufen.^1,2Formaldehyd ist ein kurzlebiges Zwischenprodukt, während die Anreicherung von Formiat als Hauptursache der Toxizität gilt, vermittelt durch Hemmung der mitochondrialen Cytochromoxidase, zelluläre Hypoxie und oxidativen Stress 3. Frühzeitige Diagnose, Korrektur der metabolischen Azidose, antitoxische Therapie und Hämodialyse sind die wichtigsten therapeutischen Ansätze zur Verringerung der Mortalität.².

Bei Methanolintoxikation treten klinische Manifestationen typischerweise nach einer Latenzphase auf. Übelkeit, Erbrechen, Bauchschmerzen und eine leichte Depression des zentralen Nervensystems können einer metabolischen Azidose mit hohem Anionenlücke, Dyspnoe, veränderter Bewusstseinslage und visuellen Symptomen folgen^1,2. Sehverschlechterung, Photophobie, Mydriasis, Ödem der Sehnervpapille und im schweren Fall permanente Erblindung gehören zu den charakteristischsten toxischen Wirkungen, die mit der durch Ameisensäure vermittelten Hemmung der mitochondrialen Cytochrom-Oxidase assoziiert sind^1,2. Zu den aktuellen Behandlungsstrategien zählen die supportive Therapie; Korrektur der metabolischen Azidose mittels Natriumbikarbonat; Supplementierung mit Folin- oder Folsäure; Hemmung der Alkoholdehydrogenase mittels Ethanol oder Fomepizol; sowie in ausgewählten schweren Fällen Hämodialyse zur Beschleunigung der Elimination von Methanol und Formiat^3,4. Fomepizol wird aufgrund seiner vorhersehbareren Pharmakokinetik, einfacheren Dosierung und geringeren Risikos von Nebenwirkungen zunehmend als Antidot der ersten Wahl angesehen; Ethanol bleibt jedoch aufgrund seiner Verfügbarkeit und niedrigeren Kosten eine wichtige Alternative^4,5,6,7.

Obwohl die Schädigung des Sehnervs und des zentralen Nervensystems traditionell als die vorherrschenden Manifestationen der Methanolvergiftung angesehen wurden, wird die Niere zunehmend als klinisch relevantes Zielorgan anerkannt^8,9,10. In methanolspezifischen Kohorten war ein akutes Nierenversagen (AKI) mit einer schwereren metabolischen Azidose, Atemversagen, Multiorganversagen, mechanischer Beatmung, extrakorporaler Behandlung, längeren Krankenhausaufenthalten und einer höheren Letalität im Krankenhaus assoziiert; außerdem wurden Volumenmangel, Sepsis, Rhabdomyolyse und akute Pankreatitis als Faktoren identifiziert, die mit der Entwicklung einer AKI verbunden sind^8,10. In der von Chang et al. berichteten Kohorte blieb die AKI in einer multivariablen Analyse unabhängig mit der Letalität im Krankenhaus assoziiert; aufgrund des retrospektiven Beobachtungsdesigns lässt sich jedoch nicht belegen, dass die AKI selbst die Todesursache war⁸. Demnach sollte die AKI als Marker für eine schwerere Erkrankung und eine ungünstigere Prognose bei Methanolvergiftung interpretiert werden. Im Gegensatz dazu bewertete die systematische Übersichtsarbeit von Wang et al. die Nierenfunktion nach Vergiftungen mit toxischen Alkoholen allgemeiner, vor allem Methanol und Ethylenglykol; daher sind ihre Schlussfolgerungen nicht ausschließlich auf Methanol beschränkt⁹. Diese Übersichtsarbeit identifizierte eine erhebliche kurzfristige Mortalität sowie bedeutende Wissenslücken bezüglich der langfristigen Nierenregeneration, der andauernden Dialysebedürftigkeit und der standardisierten Berichterstattung über renale Endpunkte⁹.

Die Beziehung zwischen Methanolvergiftung und akutem Nierenversagen (AKI) ist wahrscheinlich multifaktoriell. Die Anreicherung toxischer Metaboliten könnte durch mitochondriale Hemmung, zelluläre Hypoxie, schwere metabolische Azidose und Redoxungleichgewicht beitragen, während systemische Faktoren, die in klinischen Kohorten dokumentiert wurden – einschließlich Volumenmangels, hämodynamischer Beeinträchtigung, Rhabdomyolyse, Sepsis, Atemversagens und multipler Organfunktionsstörungen – zusätzliche nephrotoxische Noxen darstellen^1,2,3,8,10. Diese Mechanismen stellen biologisch und klinisch plausible Verbindungen zwischen Methanolvergiftung und Nierenschädigung dar. Nephrotoxische Stoffwechselstörungen könnten durch die Exposition gegenüber zirkulierender Ameisensäure, mitochondriale Hemmung, metabolische Azidose und systemischen hämodynamischen Stress verursacht werden. Der spezifische Beitrag des Alkohol- und Aldehydstoffwechsels im Nierengewebe bleibt jedoch unklar, da Konzentrationen von Methanol, Formaldehyd und Ameisensäure, die renale ADH-Aktivität sowie die mitochondriale Funktion in der vorliegenden Studie nicht direkt untersucht wurden.

Eine wesentliche methodische Herausforderung bei experimentellen Studien zur Methanolvergiftung besteht darin, dass Ratten Ameisensäure schneller abbauen als Menschen. Obwohl die Anreicherung von Ameisensäure eine Hauptursache für die Methanolvergiftung beim Menschen ist, ist ein vergleichbarer Anstieg und die daraus resultierende Organschädigung bei Ratten aufgrund ihres äußerst effizienten, folatabhängigen Formatabbaus schwerer zu erreichen. Daher werden in experimentellen Modellen der Methanolvergiftung häufig Substanzen eingesetzt, die den Folatstoffwechsel hemmen^11,12. Eine Vorbehandlung mit Methotrexat (MTX) wurde angewandt, um den folatabhängigen Formatabbau bei Ratten zu verringern und dadurch die Anfälligkeit für Methanolvergiftung zu erhöhen^11,12. Methotrexat verursacht selbst keine Methanolvergiftung, und das resultierende Modell bildet nicht alle Aspekte einer menschlichen Methanolvergiftung ab. Da Methotrexat unabhängig Einfluss auf renale, oxidative und entzündliche Parameter nehmen kann, wurde eine MTX-allein-Gruppe eingeschlossen, um Veränderungen zu charakterisieren, die mit der Vorbehandlung assoziiert sind. Unter Berücksichtigung dieser Einschränkungen bietet das Modell eine kontrollierte präklinische Plattform, um bei Versuchsgruppen, die dieselbe MTX-Vorbehandlung und dieselbe Methanolexpositionsprotokoll erhalten, die Muster renaler Endpunkte zu vergleichen und diese auf biochemischer, entzündlicher, oxidativer sowie histopathologischer Ebene zu bewerten.

Die Hemmung der Alkoholdehydrogenase stellt die Grundlage der Antidottherapie bei Methanolintoxikation dar. Die beiden Wirkstoffe, die in der klinischen Praxis am häufigsten dafür eingesetzt werden, sind Ethanol und Fomepizol (4-Methylpyrazol). Ethanol unterdrückt aufgrund seiner höheren Affinität zur ADH im Vergleich zu Methanol die Bildung toxischer Metaboliten durch kompetitive Hemmung, während Fomepizol, ein potentes und selektives ADH-Hemmittel, die Umwandlung von Methanol in Formaldehyd und Ameisensäure direkt verhindert^5,6. Hinsichtlich der vergleichenden klinischen Wirksamkeit, Sicherheit, Anwendungseinfachheit und organschützenden Effekte dieser beiden Antidote besteht jedoch keine vollständige Übereinstimmung. Fomepizol wird in vielen Zentren als vorteilhaft angesehen, da es ein standardisiertes Dosierungsschema aufweist, keine Überwachung der Serumspiegel erfordert, keine zentralnervöse Depression verursacht und vorhersagbarere pharmakokinetische Eigenschaften besitzt, während die Ethanoltherapie mit potenziellen Nachteilen wie Hypoglykämie, Hepatotoxizität, verändertem Bewusstseinszustand und der Notwendigkeit intensiver Überwachung assoziiert ist^6,7. Umgekehrt haben großangelegte klinische Vergleichsstudien darauf hingewiesen, dass die Effekte der beiden Antidote auf Mortalität und klinische Ergebnisse möglicherweise ähnlich sind. In der Studie von Zakharov et al., die Massenvergiftungsfälle untersuchte, wurde zwischen Fomepizol und Ethanol kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Überlebens beobachtet⁵.

Trotz der prognostischen Bedeutung von akutem Nierenversagen (AKI) bei Methanolvergiftung^8,9,10 hat die Nierenschädigung deutlich weniger Aufmerksamkeit erfahren als die okuläre und neurologische Toxizität, und die vergleichenden renalen Wirkungen von Ethanol und Fomepizol sind weiterhin unzureichend charakterisiert. Daher ist eine nierenfokussierte Untersuchung erforderlich, die konventionelle Nierenfunktionstests, frühe biomarkerbasierte Hinweise auf tubuläre Schädigung, entzündliche Zytokine, redoxrelevante Parameter und die histopathologische Analyse umfasst, um festzustellen, ob die beiden antitoxischen Strategien mit unterschiedlichen renalen Outcome-Mustern assoziiert sind. Darüber hinaus könnte dieses kontrollierte, mit Methotrexat vorbehandelte Rattenmodell die präklinische Bewertung potenzieller antitoxischer, nierengerichteter und unterstützender Maßnahmen unter definierten experimentellen Bedingungen erleichtern. Der Forschungswert dieses Modells liegt in der vergleichenden Beurteilung innerhalb eines akuten experimentellen Settings und nicht in der direkten Nachbildung der klinischen und metabolischen Komplexität der menschlichen Methanolvergiftung.

Unterschiede im Methanolstoffwechsel zwischen Nagetieren und Menschen sowie die Anwendung pharmakologischer Vorbehandlungen zur Verringerung des folatabhängigen Formatabbaus bleiben wichtige methodische Einschränkungen. Zudem spiegelt die unter experimentellen Bedingungen hervorgerufene akute Toxizität möglicherweise nicht vollständig die unterschiedlichen Expositionszeiträume und Begleiterkrankungen wider, wie sie in der klinischen Praxis auftreten. Folglich sollten die Ergebnisse aus diesem Tiermodell als vorläufige präklinische Hinweise betrachtet und nicht direkt zur Begründung therapeutischer Entscheidungen beim Menschen herangezogen werden. Bevor klinische Schlussfolgerungen gezogen werden können, ist eine Bestätigung in angemessen konzipierten klinischen Studien erforderlich. Vor diesem Hintergrund besteht die zentrale Wissenslücke darin, ob Ethanol und Fomepizol mit unterschiedlichen Nierenoutcomemustern in Bezug auf konventionelle Parameter der Nierenfunktion, tubuläre Schädigungsmarker, entzündliche Zytokine, redoxrelevante Parameter und die histopathologische Befunde in einem mit Methotrexat vorbehandelten Rattenmodell assoziiert sind. Die Studienhypothese lautete, dass die Hemmung der Alkoholdehydrogenase durch entweder Ethanol oder Fomepizol mit einer Abschwächung der Nierenschädigung verbunden sein würde, wobei potenzielle Unterschiede zwischen den Behandlungen über die untersuchten Outcomebereiche hinweg bestehen könnten. Nephroprotektion wurde operational definiert als ein günstigeres Muster der Nierenparameter im Vergleich zur MTX + Methanol-Gruppe. Dieses Muster umfasste niedrigere Konzentrationen von Harnstoff und Kreatinin im Serum; niedrigere renale Spiegel von Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1), Cystatin C, Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-1-beta (IL-1β); niedrigere Konzentrationen von Malondialdehyd (MDA) im Serum; höhere Aktivität der Superoxiddismutase (SOD) im Serum, höhere Konzentrationen von reduziertem Glutathion (GSH) im Blut und höhere katalytische Aktivität von Katalase (CAT) im Blut; sowie niedrigere histopathologische Scores für tubuläre Degeneration, tubuläre Nekrose, glomeruläre Schädigung, vaskuläre Stauung, interstitielle Entzündung und Fibrose. Die Nephroprotektion wurde nicht als einzelner zusammengesetzter Score berechnet; stattdessen wurden die einzelnen Ergebnisse über diese komplementären Bereiche hinweg gemeinsam ausgewertet. Demgemäß zielte die Studie darauf ab, die Wirkungen von Ethanol und Fomepizol auf die Nierenfunktion, tubuläre Schädigung, Entzündung, den Redoxstatus und die Nierenhistopathologie in diesem Modell zu vergleichen.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von dem Lokalen Ethikkomitee für Tierversuche der Kırşehir Ahi Evran University genehmigt (Genehmigungsbeschluss Nr. 1, Sitzung Nr. 12, Genehmigungsdatum: 12. Juni 2025) und wurden gemäß den nationalen und internationalen Leitlinien für die Haltung und Verwendung von Labor­tieren durchgeführt. Während der gesamten Studie wurden Maßnahmen ergriffen, um Schmerzen und Belastungen zu minimieren und die geringstmögliche Anzahl an Tieren einzusetzen.

Zubereitung der Chemikalien
Methotrexat wurde als Vorbehandlungsagent verwendet, um die Erstellung des experimentellen Methanolvergiftungsmodells zu erleichtern. Da die folatabhängige Formatoxidation bei Ratten effizienter ist als beim Menschen, diente die Methotrexat-Vorbehandlung dazu, die Formatausscheidung zu verringern und die Anfälligkeit für Methanolvergiftung zu erhöhen; es wurde als modellsensibilisierende Maßnahme und nicht als Ersatz für die Methanolexposition eingesetzt^11,12. Methotrexat wurde als 500 mg/5 mL-Zubereitung bereitgestellt, was einer Stammlösungskonzentration von 100 mg/mL entspricht. Die Zubereitung wurde mit steriler 0,9%iger Natriumchloridlösung verdünnt, um eine endgültige Arbeitskonzentration von 0,06 mg/mL zu erhalten. Die Arbeitslösung wurde per oraler Gavage in einer Dosis von 5 mL/kg verabreicht, was einer MTX-Dosis von 0,3 mg/kg entspricht. Bei Ratten mit einem Körpergewicht von 200–220 g zu Studienbeginn lag das tägliche Verabreichungsvolumen zwischen 1,00 und 1,10 mL pro Tier und wurde individuell anhand des zu Studienbeginn erfassten Körpergewichts berechnet. Das Körpergewicht wurde während der siebentägigen MTX-Vorbehandlungsphase nicht erneut gemessen. Methotrexat wurde einmal täglich an sieben aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht (Studientage 1–7), und Methanol wurde am Studientag 8 nach Abschluss des MTX-Vorbehandlungsprotokolls verabreicht. Dieses Regime entsprach zuvor veröffentlichten Modellen zur oralen Gavage-Vorbehandlung mit MTX¹³.

Methanol (Reinheit ≥99,8 %) wurde am Tag der Verabreichung frisch als 20 %ige (V/V) wässrige Arbeitslösung durch Verdünnung mit steriler destillierter Wasser hergestellt. Die Arbeitslösung wurde durch Mischen von einem Volumen Methanol mit vier Volumina steriler destillierter Wasser hergestellt. Gemäß zuvor beschriebenen Methotrexat-vorbehandelten Rattenmodellen der Methanolvergiftung wurde den Gruppen 3–5 am Studientag 8 eine Einzeldosis Methanol in Höhe von 3 g/kg über eine orale Gavage verabreicht. Vor der Methanolverabreichung wurden keinerlei Einschränkungen bezüglich Futter oder Wasser vorgenommen. Das erforderliche Verabreichungsvolumen wurde individuell anhand des Körpergewichts jedes Tieres berechnet und betrug für die 20 %ige Methanolösung etwa 18,9 mL/kg. Bei einer Ratte mit einem Gewicht von etwa 220 g entsprach diese Dosis 0,66 g Methanol und einem endgültigen Gavagevolumen von ungefähr 4,2 mL. Dieses Expositionsschema mit Methanol wurde gewählt, um die Vergleichbarkeit mit zuvor veröffentlichten Methotrexat-vorbehandelten Rattenmodellen der akuten Methanoltokizität zu gewährleisten^13,14,15.

Die Arbeitslösung von Fomepizol wurde in steriler 0,9%iger Natriumchloridlösung mit einer Endkonzentration von 10 mg/mL hergestellt. Eine intraperitoneale Initialdosis von 15 mg/kg wurde 4 Stunden nach der Gabe von Methanol verabreicht, gefolgt von intraperitonealen Erhaltungsdosen von 10 mg/kg nach 12, 24 und 36 Stunden. Bei der Arbeitskonzentration von 10 mg/mL betrugen die Applikationsvolumina 1,5 mL/kg für die Initialdosis und 1,0 mL/kg für jede Erhaltungsdosis. Für eine Ratte mit einem Körpergewicht von etwa 220 g zu Studienbeginn entsprachen diese Dosen ungefähr 0,33 mL für die Initialdosis und 0,22 mL für jede Erhaltungsdosis. Alle Applikationsvolumina wurden anhand des Körpergewichts berechnet, das zu Studienbeginn erfasst wurde. Die Wahl der Fomepizol-Initial- und Erhaltungsdosen erfolgte unter Bezugnahme auf etablierte Empfehlungen zur Behandlung einer Methanolvergiftung^1,6.

Ethanol wurde als vergleichende Gegenmittelbehandlung verwendet. Absoluter Ethanol (Reinheit ≥99,8 %) wurde durch Mischen von 1 Volumen absolutem Ethanol mit 4 Volumina steriler destillierter Wasser verdünnt, um eine endgültige wässrige Arbeitslösung von 20 % (V/V) zu erhalten. Eine Einzeldosis Ethanol wurde 4 Stunden nach der Methanolverabreichung oral per Magensonde in einer Dosis von 0,5 g/kg verabreicht; es wurden keine Erhaltungsdosen an Ethanol verabreicht. Das Verabreichungsvolumen betrug etwa 3,2 mL/kg. Bei einer Ratte mit einem Körpergewicht von etwa 220 g zu Studienbeginn entsprach dies einem endgültigen Magensondenvolumen von etwa 0,70 mL. Das Verabreichungsvolumen wurde anhand des zum Studienbeginn erfassten Körpergewichts berechnet. Die Konzentration, Dosis, Applikationsweg und der Zeitpunkt der Ethanolverabreichung wurden basierend auf zuvor veröffentlichten Methotrexat-vorbehandelten Rattenmodellen ausgewählt, in denen Ethanol als vergleichendes Gegenmittel verwendet wurde^13,14.

Alle Lösungen wurden am Tag der Verabreichung frisch hergestellt und auf ein homogenes Aussehen sowie das Fehlen sichtbarer Partikel überprüft. Die orale Verabreichung erfolgte mithilfe einer Kanüle aus rostfreiem Stahl. Während der Gavage wurde die Kanüle vorsichtig von der Mundhöhle in die Speiseröhre vorgeschoben, wobei Erbrechen, oraler Ausfluss, Aspiration und Atemnot vermieden wurden. Intraperitoneale Injektionen wurden unter aseptischen Bedingungen mit sterilen Einwegspritzen und -nadeln durchgeführt. Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Zubereitung und Verabreichung von Chemikalien wurden gemäß den institutionellen Sicherheitsvorschriften für Labore durchgeführt.

Experimentelle Tiere, Haltungsbedingungen und Randomisierung
Insgesamt 30 erwachsene männliche Wistar-Albinoratten im Alter von 8–12 Wochen mit einem Gewicht von 220 ± 20 g wurden aus dem Labor für Versuchstierforschung der Ahi Evran-Universität in Kırşehir, Türkiye, bezogen. Wistar-Ratten wurden gewählt, da sie häufig in experimentellen Toxizitäts- und Nephroprotektionsstudien eingesetzt wurden und einen Vergleich mit bereits veröffentlichten Studien ermöglichen. Die Tiere wurden bei 24 ± 2 °C in einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Wechselzyklus gehalten. Während des gesamten 10-tägigen Versuchszeitraums erhielten sie ad libitum Standard-Pelletfutter und Leitungswasser. Vor den experimentellen Eingriffen durchliefen alle Tiere eine 7-tägige Eingewöhnungsphase.

Dreißig Ratten wurden mithilfe eines computergestützten Zufallsverfahrens fünf experimentellen Gruppen zugewiesen, wobei pro Gruppe sechs Tiere angestrebt wurden. Für jede Ratte wurde eine zufällige ganze Zahl zwischen 1 und 5 generiert, und das Tier wurde der entsprechenden experimentellen Gruppe zugeordnet. Sobald eine Gruppe sechs Tiere enthielt, wurde jede weitere Ziehung, die diese Gruppe bezeichnete, verworfen, und eine neue Zufallszahl wurde erzeugt, bis eine Gruppe mit verfügbarem Platz ausgewählt wurde. Dieses Verfahren wurde fortgesetzt, bis alle 30 Ratten zugewiesen waren, sodass am Ende je sechs Tiere pro Gruppe vorlagen. Derselbe Forscher erstellte die Zufallszuweisungen und führte die Zuweisung durch; es wurde kein separater Zuweisungsoperator verwendet. Gruppe 1 (Kontrolle) erhielt keine experimentelle Arzneimittelbehandlung und unterzog sich derselben terminplanmäßigen Probennahme wie die übrigen Gruppen. Gruppe 2 (MTX) erhielt sieben Tage lang Methotrexat per Schlundsonde in einer Dosis von 0,3 mg/kg. Gruppe 3 (MTX + Methanol) erhielt sieben Tage lang Methotrexat, gefolgt am Studientag 8 von Methanol in einer Dosis von 3 g/kg. Gruppe 4 (MTX + Methanol + Fomepizol) erhielt eine Vorbehandlung mit Methotrexat, gefolgt von Methanol, wobei die Behandlung mit 4-Methylpyrazol vier Stunden später begann. Gruppe 5 (MTX + Methanol + Ethanol) erhielt eine Vorbehandlung mit Methotrexat, gefolgt von Methanol, wobei vier Stunden später Ethanol verabreicht wurde.

Alle drei Gruppen, die Methanol ausgesetzt waren, erhielten dieselbe MTX-Vorbehandlung und Methanolapplikationsprotokoll und unterschieden sich lediglich hinsichtlich der antidotischen Behandlung nach der Exposition. Die experimentelle Gruppeneinteilung, das Applikationsprotokoll, der Zeitpunkt der antidotischen Behandlung sowie der Prozess der Probensammlung sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Eine a-priori-Power-Analyse wurde für eine einfaktorielle ANOVA mit festen Effekten und fünf unabhängigen Gruppen durchgeführt. Unter Annahme einer großen standardisierten Effektgröße (Cohens f = 0,70), eines Signifikanzniveaus von 0,05 und einer statistischen Power von 80 % ergab sich eine minimal erforderliche Gesamtstichprobengröße von 30 Tieren, was sechs Tieren pro Gruppe entspricht. Die berechnete Power bei einer Gesamtstichprobengröße von 30 betrug etwa 80,9 %. Die angenommene Effektgröße (Cohens f = 0,70) wurde vor dem Experiment festgelegt, basierend auf der Erwartung der Forscher, in diesem akuten Toxizitätsmodell einen großen gesamten Gruppeneffekt zu beobachten. Diese Annahme beruhte auf der fachlichen Einschätzung der Forscher und nicht auf einer Schätzung, die auf Pilotdaten oder einer spezifischen früheren Studie basierte. Für diese Studie wurde kein einzelnes primäres Ergebnis im Voraus festgelegt; die Berechnung der Stichprobengröße basierte auf der Annahme eines großen Gesamteffekts in einem Omnibus-Vergleich zwischen den fünf experimentellen Gruppen. Ein primäres Ergebnis kann nicht rückwirkend als im Voraus festgelegter Endpunkt definiert werden. Demzufolge bietet die Berechnung der Stichprobengröße keine ausreichende Power für jedes einzelne Ergebnis oder für paarweise Vergleiche.

Protokoll zur Methanolintoxikation und antitoxischen Behandlung
Nach der Akklimatisierungsphase erhielten die Tiere der Gruppen 2–5 über 7 aufeinanderfolgende Tage hinweg einmal täglich Methotrexat (Studientage 1–7). Am Studientag 8 erhielten die Tiere der Gruppen 3–5 eine Einzeldosis einer 20%igen Methanollösung von 3 g/kg per Schlundsonde. Vor der Gabe von Methanol erfolgte weder eine Nahrungskarenz noch sonstige Einschränkungen bezüglich Futter oder Wasser.

In der Gruppe MTX + Methanol + Fomepizol wurde 4 h nach Gabe von Methanol eine intraperitoneale Initialdosis von 15 mg/kg verabreicht, gefolgt von intraperitonealen Erhaltungsdosen von 10 mg/kg nach 12, 24 und 36 h nach Methanolgabe. In der Gruppe MTX + Methanol + Ethanol wurde 4 h nach Methanolgabe eine Einzeldosis Ethanol mittels oraler Gavage in einer Dosis von 0,5 g/kg verabreicht; es wurden keine Erhaltungsdosen mit Ethanol verabreicht. Die beiden antidotischen Therapieregime wurden so gewählt, dass sie etablierte Dosierungsempfehlungen für Fomepizol sowie zuvor publizierte Vergleichsprotokolle mit Ethanol widerspiegeln^1,6,13,14. Die Regime waren nicht darauf ausgelegt, eine dosis-, applikationsweg- oder expositionsangepasste Behandlung bereitzustellen. Daher stellten das mehrfach intraperitoneal verabreichte Fomepizol-Regime und die orale Einzeldosis Ethanol einen ungleichen pharmakologischen Vergleich dar. Eine erfolgreiche Gavage-Applikation wurde durch das Fehlen von Regurgitation, oraler Leckage oder Atemnot während des Eingriffs bestätigt. Eine erfolgreiche intraperitoneale Applikation wurde durch das Fehlen von Leckage, Blutung oder deutlicher Schwellung an der Injektionsstelle bestätigt.

Nach der Verabreichung wurden die Tiere regelmäßig hinsichtlich ihres allgemeinen Gesundheitszustands, ihrer Beweglichkeit, Nahrungsaufnahme, Körperhaltung, Fellzustands und Anzeichen einer Toxizität überwacht. Der Behandlungszeitplan wurde so gestaltet, dass die Bildung toxischer Metaboliten aus Methanol einsetzen konnte, gleichzeitig aber die Bewertung der schützenden und therapeutischen Wirkungen der Gegenmittel ermöglicht wurde.

Tötung aus tierschutzrechtlichen Gründen, humane Endpunkte und Probennahme
Während des gesamten Experiments wurden alle Tiere täglich hinsichtlich ihres allgemeinen Gesundheitszustands, der Nahrungsaufnahme und Wasseraufnahme, der Beweglichkeit sowie von Verhaltensänderungen beurteilt. Als humane Endpunkt-Kriterien wurden zuvor festgelegt: deutliche Lethargie, Unfähigkeit, Nahrung oder Wasser aufzunehmen, starker Gewichtsverlust, eingeschränkte Beweglichkeit, abnorme Körperhaltung, anhaltende Haarsträubung oder offensichtliche Anzeichen von Belastung. Tiere, die eines dieser Kriterien erfüllten, sollten human getötet werden. Im Verlauf der Studie erreichte jedoch kein Tier die vorab definierten humanen Endpunkt-Kriterien.

Alle Tiere in den fünf experimentellen Gruppen wurden am Studientag 10 euthanasiert. Für die Gruppen MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizol und MTX + Methanol + Ethanol entsprach dieser Endpunkt 48 Stunden nach der einmaligen Verabreichung von Methanol am Studientag 8. Die Kontrollgruppe blieb bis zum Studientag 10 unbehandelt, während die MTX-allein-Gruppe nach Abschluss des siebentägigen MTX-Verabreichungsprotokolls bis zum Studientag 10 überwacht wurde. Somit hatten alle fünf Gruppen eine identische Gesamtstudienzeitdauer und wurden am gleichen Studientag euthanasiert und probenentnommen.

Ketamin und Xylazin wurden zur Einleitung einer tiefen Anästhesie verwendet. Die Tiefe der Anästhesie wurde durch das Fehlen des plantaren Withdrawal-Reflexes bestätigt. Nach Erreichen der tiefen Anästhesie wurden Blutproben mittels intrakardialer Punktion entnommen. Mithilfe einer geeigneten Spritze und Nadel wurden etwa 3–5 mL Blut gewonnen. Das zur Bestimmung der Konzentrationen von Harnstoff und Kreatinin im Serum, der SOD-Aktivität im Serum sowie der MDA-Konzentration im Serum gesammelte Blut wurde in röhrchen ohne Antikoagulans überführt und vollständig gerinnen gelassen. Das für die Bestimmung des GSH-Spiegels und der CAT-Aktivität bestimmte Blut wurde separat in Röhrchen mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gesammelt und ohne Gerinnungsschritt weiterverarbeitet. Nach vollständiger Gerinnung wurden die Serumproben bei 4 °C für 10–15 min mit 3.000 × g zentrifugiert. Das abgetrennte Serum wurde bis zur Analyse bei −80 °C gelagert. Eine erfolgreiche Serumtrennung wurde anhand eines klaren, nicht hämolytischen Aussehens bestätigt. Nach der Blutentnahme wurde die Euthanasie unter tiefer Anästhesie durch Exsanguination abgeschlossen. Anschließend erfolgte eine mediale Laparotomie, und beide Nieren wurden sorgfältig entfernt. Nach Entfernung des umgebenden Fett- und Bindegewebes wurden die Nieren mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gespült. Die Gewebeproben wurden für histopathologische und biochemische Analysen aufgeteilt. Die für die histopathologische Untersuchung vorgesehenen Proben wurden in 10 % neutralpufferter Formaldehydlösung aufbewahrt. Die für biochemische Analysen bestimmten Proben wurden entsprechend beschriftet und bei −80 °C gelagert.

Die Probensammlung, biochemischen Analysen und Ergebnisbewertungen wurden von Forschern durchgeführt, die bezüglich der experimentellen Gruppen verblindet waren. Es wurden keine Tiere von den Analysen ausgeschlossen.

Biochemische Analysen
Die Harnstoffkonzentration im Serum wurde mithilfe eines enzymatischen Urease–Glutamat-Dehydrogenase-Kinetik-Assays auf einem automatisierten Biochemie-Analysengerät bestimmt. Harnstoff wurde durch Urease zu Ammoniak hydrolysiert, der anschließend in Gegenwart von Glutamat-Dehydrogenase mit 2-Oxoglutarat und reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) reagierte. Der Abfall der Extinktion infolge des NADH-Verbrauchs wurde kinetisch gemessen. Die Kreatinin-Konzentration im Serum wurde farbmetrisch mit demselben automatisierten Biochemie-Analysengerät bestimmt.

Die Aktivität der serumgebundenen Superoxiddismutase (SOD) wurde mithilfe eines farbmetrischen Assays bestimmt, der auf der Erzeugung von Superoxidradikalen durch das Xanthin–Xanthinoxidase-System und deren Reaktion mit 2-(4-Iodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid zur Bildung eines gefärbten Formazan-Produkts basiert. Die Endpunkt-Absorption wurde bei 505 nm gemessen. Die Konzentration von Malondialdehyd (MDA) im Serum wurde mit der Thiobarbitursäure-Reaktion bestimmt. Serumproben wurden mit kalter Trichloressigsäure versetzt, um Proteine auszufällen, und bei 4 °C 5 min bei 7.500 × g zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde mit einem gleichen Volumen Thiobarbitursäure vermischt und 60 min bei 90 °C inkubiert. Die Reaktionsgefäße wurden anschließend 10 min in einem kalten Wasserbad abgekühlt, und die Absorption wurde bei 532 nm gemessen. Die MDA-Konzentrationen wurden anhand der entsprechenden Kalibrierungskurve berechnet. Reduziertes Glutathion (GSH) wurde in EDTA-antikoaguliertem Blut nach einer modifizierten Ellman-Methode bestimmt. Nach der Proteinfällung mit Trichloressigsäure wurden die entproteinierten Proben mit 5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) in 500 mM Tris-Puffer bei pH 8,2 umgesetzt, und die Absorption wurde bei 412 nm gemessen. Die Aktivität der Katalase (CAT) wurde in EDTA-antikoaguliertem Blut mittels eines zweistufigen farbmetrischen Assays bestimmt. Die Proben wurden mit einer bekannten Menge Wasserstoffperoxid inkubiert, und nach Beendigung der enzymatischen Reaktion wurde das verbleibende Wasserstoffperoxid unter Verwendung eines chromogenen Reagenz bei 405 nm gemessen.

Da die SOD-Aktivität und die MDA-Konzentration im Serum gemessen wurden und die GSH-Konzentration sowie die CAT-Aktivität im EDTA-antikoagulierten Blut und nicht in Nierengewebshomogenaten bestimmt wurden, war eine Normalisierung dieser redoxbezogenen Parameter auf die Gesamtproteinkonzentration des Gewebes nicht anwendbar. Zur Interpretation des Profils redoxbezogener Biomarker wurden höhere MDA-Konzentrationen im Serum als Hinweis auf stärkere Lipidperoxidation gewertet, während niedrigere SOD-Aktivität im Serum, niedrigere GSH-Spiegel im Blut und verringerte CAT-Aktivität im Blut auf eine verminderte antioxidative Kapazität hindeuteten; Veränderungen in entgegengesetzter Richtung wurden als günstigeres redoxbezogenes Profil interpretiert.

Für die enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (ELISA)-Messungen an Nierengewebe wurde etwa 50 mg bei −80 °C gelagertes Nierengewebe auf Eis in 500 µL Homogenisierungspuffer, der eine Proteaseinhibitor-Cocktail enthielt, homogenisiert, was einem festen Gewebe-zu-Puffer-Verhältnis von 1:10 (w/v) entspricht. Für jede Ratte wurde ein tiereigenes Nierengewebehomogenat hergestellt. Proben von verschiedenen Tieren wurden unabhängig voneinander verarbeitet und zu keinem Zeitpunkt gepoolt. Die Homogenate wurden bei 4 °C 10 min bei 14.000 × g zentrifugiert, und das von jedem Tier erhaltene Überstand wurde separat gesammelt und für die geplanten Analysen des Nierengewebes in Aliquots aufgeteilt. Die Gesamtproteinkonzentration wurde nicht separat gemessen; daher wurden die ELISA-Ergebnisse am Gewebe nicht darauf normiert. Die aus den jeweiligen assayspezifischen Standardkurven berechneten Endkonzentrationen wurden als ng/L für TNF-α und IL-6 sowie als ng/mL für IL-1β, KIM-1 und Cystatin C angegeben.

Kidney injury molecule-1 (KIM-1) und Cystatin C wurden als Biomarker für Nierenschädigungen bewertet, während Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-1β (IL-1β) als Marker für Nierenentzündungen untersucht wurden. Alle fünf Analyten wurden in Nierengewebehomogenaten mithilfe ratspezifischer ELISA-Kits gemäß den Herstellerprotokollen bestimmt. Für die jeweiligen Assays betrugen die analytischen Empfindlichkeiten und Messbereiche 2,51 ng/L bzw. 5–1.000 ng/L für TNF-α, 0,052 ng/L bzw. 0,1–40 ng/L für IL-6, 0,08 ng/mL bzw. 0,2–60 ng/mL für IL-1β, 0,01 ng/mL bzw. 0,05–10 ng/mL für KIM-1 und 0,25 ng/mL bzw. 0,5–100 ng/mL für Cystatin C. Vor der Analyse wurden alle Reagenzien, Standardlösungen und Nierengewebeüberstände auf Raumtemperatur gebracht. Für jeden Assaylauf wurden separate Standardkurven gemäß den Empfehlungen des Herstellers erstellt. Standards und Nierengewebeüberstände wurden in Antikörper-beschichtete Wells pipettiert, gefolgt von den entsprechenden biotinylierten Detektionsantikörpern und Streptavidin-Horseradish-Peroxidase-Konjugat. Proben und ELISA-Reagenzien wurden 1 h bei 37 °C inkubiert. Nach fünf Waschzyklen mit einem automatisierten Mikroplattenwascher wurden die Substratlösungen A und B hinzugegeben und 10 min bei 37 °C inkubiert. Die Farbreaktion wurde durch eine saure Stopplösung beendet, und die Extinktion wurde bei 450 nm gemessen. Für jeden Analyten wurden die blankokorrigierten Extinktionswerte anhand der jeweils assayspezifischen Standardkurve in Konzentrationen umgerechnet.

Alle biochemischen Analysen wurden unter standardisierten Bedingungen durchgeführt, und alle Proben wurden mit denselben Verfahren verarbeitet. Die ELISA-Messungen an Nierengewebe wurden im Duplikat durchgeführt. Für jeden Analyten wurde der Mittelwert der beiden technischen Wiederholungen ermittelt, um einen einzelnen tierbezogenen Wert zu erhalten. Technische Wiederholungen und separate Aliquots, die aus dem gleichen tiereigenen Homogenat stammten, wurden nicht als unabhängige Beobachtungen betrachtet. Das einzelne Tier galt als experimentelle Einheit, und je Parameter wurde ein tierbezogenes Ergebnis in die statistische Analyse einbezogen.

Histopathologische Aufarbeitung und Bewertung der Nierenschädigung
Gewebeproben wurden mithilfe standardmäßiger histopathologischer Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung aufbereitet. Nierengewebe wurde 72 h lang bei Raumtemperatur in 10 % neutralgepufferter Formaldehydlösung fixiert. Anschließend wurde das Gewebe durch eine abgestufte Reihe von Ethanolkonzentrationen (50 %, 70 %, 80 %, 96 % und 100 %) dehydriert, wobei jede Konzentration 1 h lang eingehalten wurde. Danach wurde das Gewebe in zwei Schritten mit Xylol geklärt und in Paraffinblöcke eingebettet. Schnitte mit einer Dicke von 5 µm wurden aus den Paraffinblöcken mittels eines Rotationsmikrotoms angefertigt.

Für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung wurden die Schnitte deparaffinisiert und rehydriert, 5 min mit Hämatoxylin gefärbt und anschließend 5 min unter fließendem Leitungswasser gewaschen. Die Differenzierung erfolgte mit saurem Alkohol, danach wurden die Schnitte 1 min in Ammoniakwasser gehalten. Anschließend wurden die Schnitte 2 min mit Eosin kontragefärbt. Danach wurden die Schnitte über eine aufsteigende Alkoholreihe dehydriert, in Xylol geklärt und mit einem geeigneten Eindeckmedium eingedeckt.

Für die Masson-Färbung wurden die Schnitte deparaffinisiert und rehydriert, anschließend 60 min bei 56 °C in einer Mordanzlösung inkubiert und 10 min unter fließendem Wasser gewaschen. Danach wurden die Schnitte nacheinander 10 min mit Weigert-Eisenhämatoxylin, 15 min mit Biebrich-Scharlach-Säurefuchsin, 10 min mit Phosphormolybdänsäure und 10 min mit Anilinblau behandelt. Schließlich wurden die Schnitte 5 min in 1 %iger Essigsäure gehalten, dehydriert, in Xylol geklärt und eingedeckt.

Die erfolgreiche Färbung wurde durch eine klare Kernfärbung, erhaltene zytoplasmatische Kontraste, die Bewahrung der Nierenarchitektur sowie eine deutliche Sichtbarmachung der Bindegewebsstrukturen bestätigt. Alle gefärbten Präparate wurden unter standardisierten Bedingungen mit einem Lichtmikroskop, das mit einem digitalen Bildgebungssystem ausgestattet war, bewertet.

Histopathologische Bewertungen wurden von einem einzigen erfahrenen Pathologen durchgeführt, der bezüglich der experimentellen Gruppen verblindet war. Die histopathologische Punktzahl wurde bei einer Vergrößerung von 200× bestimmt. Für jedes Tier und jeden histopathologischen Parameter wurden 10 zufällig ausgewählte mikroskopische Felder untersucht. Das Feld mit der schwersten Veränderung für den jeweils bewerteten Parameter diente zur Zuweisung der einzelnen ganzzahligen Punktzahl des Tieres auf der Skala von 0–4. Die tubuläre Schädigung wurde anhand von tubulärer Dilatation, Ansammlung proteinhaltigen Materials im tubulären Lumen, degenerativen Veränderungen des tubulären Epithels und tubulärer Nekrose beurteilt. Die glomeruläre Schädigung wurde anhand von glomerulärer Degeneration oder Atrophie, Vergrößerung des Bowman-Raums und vaskulärer Kongestion bewertet. Die interstitielle Schädigung wurde basierend auf interstitieller Entzündung und Fibrose beurteilt. Fünf-Mikrometer-dicke, mit Hämatoxylin und Eosin sowie mit Masson-Trichrom gefärbte Nierenschnitte jedes Tieres wurden für die histopathologische Beurteilung verwendet. Repräsentative Photomikrografien wurden bei einer Vergrößerung von 200× angefertigt, wobei die Maßstabsbalken 100 µm entsprechen. Die Anzahl der pro Tier untersuchten separaten histologischen Schnitte konnte nicht aus den Studienunterlagen rekonstruiert werden und kann daher nicht angegeben werden.

Die Masson-Trichrom-Befunde wurden histomorphologisch interpretiert, wobei die Lokalisation und das morphologische Muster der Kollagenablagerung berücksichtigt wurden, nicht allein die Intensität der blauen Färbung. Die semiquantitative interstitielle Fibrosescore basierte auf dieser histomorphologischen Beurteilung, und der Prozentsatz des kollagenpositiven Bereichs wurde nicht quantifiziert. Die histopathologische Bewertung erfolgte semiquantitativ anhand zuvor beschriebener Kriterien zur Beurteilung renaler Schädigungen^16,17. Jedes Tier erhielt für jeden histopathologischen Parameter eine ganzzahlige Bewertung auf einer Skala von 0–4, wobei 0 = nicht vorhanden, 1 = minimal, 2 = gering, 3 = mäßig und 4 = schwer bedeutete. Die Bewertungskategorien repräsentierten die Gesamtbewertung der morphologischen Schwere jedes einzelnen Läsionsbefundes durch den verblindeten Pathologen und nicht eine kontinuierliche morphometrische Messung.

Sicherheitsvorkehrungen und Abfallentsorgung
Bei der Handhabung von Methanol, Formaldehyd, Xylol, biologischen Proben und Tiergeweben wurde geeignete persönliche Schutzausrüstung verwendet. Es wurden Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz getragen. Aufgrund der systemischen Toxizität und Flüchtigkeit von Methanol wurden alle Arbeiten vorsichtig durchgeführt. Verfahren, bei denen Formaldehyd und Xylol verwendet wurden, erfolgten nach Möglichkeit unter einer chemischen Abzugshaube. Scharfe Gegenstände wurden in geeigneten Entsorgungsbehältern für spitze Gegenstände gesammelt. Chemischer Abfall und biologische Materialien wurden gemäß den institutionellen Vorschriften für Bio­sicherheit und die Entsorgung gefährlicher Abfälle entsorgt.

Statistische Analyse
Kontinuierliche biochemische, Nierenschaden-bedingte Biomarker, entzündliche, Nierenfunktions- und redoxbezogene Variablen wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) angegeben. Die Normalverteilung der Daten wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test überprüft, die Varianzhomogenität mit dem Levene-Test bewertet. Gruppenvergleiche für biochemische Ergebnisse wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Annahmeprüfungen ergaben Abweichungen von der Normalverteilung in einer Gruppe bezüglich des Serumkreatinins sowie Varianzheterogenität bei mehreren biochemischen Ergebnissen. Der ursprüngliche ANOVA-Ansatz wurde beibehalten; diese Abweichungen könnten jedoch die Zuverlässigkeit der resultierenden p-Werte beeinträchtigt haben, weshalb die Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert wurden.

Wenn eine statistisch signifikante Differenz mittels ANOVA ermittelt wurde, wurden paarweise Vergleiche zwischen den Gruppen mit Duncans post-hoc-Mehrfachvergleichstest durchgeführt. Werte, die innerhalb einer Zeile denselben hochgestellten Buchstaben aufwiesen, unterschieden sich gemäß Duncans post-hoc-Test nicht signifikant. Es wurde keine zusätzliche Anpassung für Mehrfachprüfungen bei den biochemischen Ergebnissen vorgenommen. Duncans Verfahren gewährleistete keine strenge Kontrolle der familienweisen Typ-I-Fehlerquote, und die Prüfung mehrerer Ergebnisse erhöhte das Risiko für falsch-positive Befunde weiter. Daher wurden einzelne signifikante Vergleiche mit Vorsicht interpretiert.

Die Gesamteffektgrößen für biochemische Ergebnisse wurden mithilfe von Eta-Quadrat (η²) geschätzt, berechnet als (F × df_between)/(F × df_between + df_error), wobei df_between = 4 und df_error = 25 betrug. Zweiseitige 95-%-Konfidenzintervalle wurden durch Invertierung der nichtzentralen F-Verteilung und Transformation der Grenzen der Nichtzentralitätsparameter (λ) unter Verwendung von λ/(λ + N) berechnet, wobei N = 30 war. Diese ergänzenden Berechnungen wurden mit einer wissenschaftlichen Rechenumgebung durchgeführt. Die Schätzungen basierten auf gerundeten F-Statistiken aus der primären statistischen Analyse und waren daher näherungsweise. Die Konfidenzintervalle stützten sich auf die Annahmen der Normalverteilung und der Varianzhomogenität des ANOVA-Modells und wurden nicht für multiple Ergebnisse adjustiert.

Histopathologische Scores waren ordinale, semiquantitative Beobachtungen, die beschreibend als Mittelwert ± SD zusammengefasst wurden, um die durchschnittliche Gruppenlast der Läsionen und die Variabilität zwischen den Tieren darzustellen. Für die histopathologischen Scores wurden keine inferenzstatistischen Hypothesentests oder post-hoc-paarweisen Vergleiche durchgeführt. Daher wurden ANOVA, der post-hoc-Test nach Duncan und die Angabe von p-Werten nur auf biochemische Parameter, Biomarker der Nierenschädigung, entzündliche Parameter, Nierenfunktion sowie ergebnisse im Zusammenhang mit Redox-Reaktionen angewendet. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.

Ergebnisse

All 30 animals were included in the analyses, with six animals in each of the five experimental groups. All animals in the five groups were euthanized and sampled on study day 10. For the three methanol-exposed groups, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Therefore, the total study duration and sample collection time were consistent across all experimental groups. Renal injury and inflammatory biomarkers, renal function and redox-related parameters, and histopathological findings were evaluated as described below.

Biochemical findings: renal injury and inflammatory biomarkers
The findings for renal injury and inflammatory biomarkers measured in kidney tissue homogenates are presented in Table 1. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in cystatin C [F(4,25) = 5.329, p = 0.003], IL-6 [F(4,25) = 3.907, p = 0.013], KIM-1 [F(4,25) = 3.673, p = 0.017], TNF-α [F(4,25) = 7.660, p < 0.001], and IL-1β [F(4,25) = 11.584, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 1. Kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, and KIM-1 were highest in the MTX + Methanol group, whereas no significant differences were observed among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups for these variables. Kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β were also highest in the MTX + Methanol group. The MTX-only group showed higher levels of TNF-α and IL-1β in kidney tissue homogenates than the Control group, whereas the antidote-treated groups showed intermediate values (Table 1).

Renal function and redox-related parameters
Serum renal function indices and blood-derived redox-related parameters were presented in Table 2. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in serum urea [F(4,25) = 3.694, p = 0.017], serum creatinine [F(4,25) = 12.988, p < 0.001], serum SOD activity [F(4,25) = 11.621, p < 0.001], blood GSH level [F(4,25) = 10.164, p < 0.001], blood CAT activity [F(4,25) = 10.631, p < 0.001], and serum MDA concentration [F(4,25) = 8.814, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 2.

Serum urea, serum creatinine, and serum MDA concentrations were highest in the MTX + Methanol group. Serum urea and serum MDA concentrations did not differ significantly among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups, whereas serum creatinine was lowest in the Control group (Table 2).

The MTX + Methanol group also showed the lowest serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity. Compared with the MTX + Methanol group, the fomepizole-treated group showed significantly higher serum SOD and blood CAT activities, whereas the corresponding increases in the ethanol-treated group were not statistically significant. Blood GSH levels did not differ significantly among the MTX-only, MTX + Methanol, and two antidote-treated groups (Table 2).

Compared with the Control group, the MTX-only group showed higher kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β and lower serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity but did not differ significantly in kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, or KIM-1 or in serum urea, serum creatinine, or serum MDA concentration.

Histopathological findings and renal injury scores
The results of the histopathological evaluation of renal tissues were presented in Table 3. Descriptive variation among the groups was observed in tubular dilatation, accumulation of proteinaceous material, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.

In the Control group, renal tissue preserved normal histological architecture, with no evident pathological alterations in the glomerular or tubular structures. In the MTX group, mild tubular degeneration, vascular congestion, and interstitial inflammation were observed.

The MTX + Methanol group showed the highest observed injury scores across the evaluated tubular, glomerular, vascular, and interstitial parameters. Both antidote-treated groups showed descriptively lower observed scores than the MTX + Methanol group. In descriptive comparisons, the fomepizole-treated group showed lower observed scores than the ethanol-treated group for most parameters, particularly tubular dilatation, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, and interstitial fibrosis (Table 3). These comparisons were descriptive, and no inferential statistical tests were performed on the histopathological scores. Representative renal histopathological images obtained using hematoxylin and eosin and Masson’s trichrome staining are shown in Figure 2.

Overall, the MTX + Methanol group showed the highest renal injury and inflammatory biomarker values, the least favorable renal function and redox profiles, and the highest histopathological injury scores. Both antidote-treated groups showed more favorable renal outcome patterns than the MTX + Methanol group, with the fomepizole-treated group showing a more consistently favorable pattern across the evaluated domains. The MTX-only group also showed changes in selected inflammatory and redox-related parameters relative to the Control group.

DATA AVAILABILITY:
The animal-level raw data supporting the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, renal function, and redox-related analyses are provided in Supplementary File 1.

Figure 1: Experimental design and treatment timeline. Schematic representation of the experimental rat model of methanol intoxication. Adult male Wistar albino rats were assigned to five groups: Control, methotrexate (MTX) only, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol (n = 6/group). Standard pellet chow and tap water were available ad libitum throughout the 10-day study, and no fasting or other food or water restrictions were imposed before or after methanol administration. The Control group received no experimental treatment. Animals in Groups 2–5 received MTX by oral gavage at 0.3 mg/kg once daily for seven consecutive days (study days 1–7). Animals in Groups 3–5 received a single dose of methanol at 3 g/kg by oral gavage on study day 8. In the MTX + Methanol + Fomepizole group, an intraperitoneal loading dose of fomepizole at 15 mg/kg was administered 4 h after methanol administration, followed by maintenance doses of 10 mg/kg at 12, 24, and 36 h. In the MTX + Methanol + Ethanol group, ethanol was administered as a single dose of 0.5 g/kg by oral gavage 4 h after methanol administration. All animals were euthanized on study day 10. For Groups 3–5, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Blood and kidney samples were collected for analyses of renal function, renal injury biomarkers, inflammatory cytokines, redox-related biomarkers, and renal histopathology. Abbreviations: MTX = methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2: Representative histopathological findings in renal tissue from experimental groups. Representative kidney sections from the Control, MTX, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups are shown. The upper row presents hematoxylin and eosin (H&E) staining, whereas the lower row presents Masson’s trichrome staining. The Control group exhibited preserved renal architecture with normal glomerular and tubular morphology. The blue-stained collagen observed in the glomerular and tubular basement membranes, vascular walls, and interstitial connective tissue of the Control group was considered physiological collagen rather than evidence of pathological fibrosis. The MTX group showed mild tubular degeneration, vascular congestion, and inflammatory changes. The MTX + Methanol group exhibited more pronounced renal injury, characterized by tubular degeneration (*), vascular congestion (+), widening of Bowman’s space (x), tubular necrosis (↑), interstitial inflammation (↕), and periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change (‡), as observed in the Masson’s trichrome-stained section. The Fomepizole-treated group showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group, with relatively preserved tubular and glomerular structures and less extensive necrosis, inflammation, vascular congestion, and collagen-associated changes. The Ethanol-treated group also showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group; however, residual tubular, glomerular, and vascular alterations were more apparent than in the Fomepizole-treated group. Photomicrographs were obtained at 200× magnification, and scale bars represent 100 µm. Masson’s trichrome staining was evaluated as supportive histomorphological evidence; differences in the intensity of blue staining among the panels were not used as a quantitative measure for intergroup comparison of fibrosis. Symbols: * tubular degeneration; + vascular congestion; x widening of Bowman’s space; ↑ tubular necrosis; ↕ interstitial inflammation; ‡ periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change. MTX, methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.

Variable	Control (n = 6)	MTX (n = 6)	MTX + Methanol (n = 6)	MTX + Methanol + Fomepizole (n = 6)	MTX + Methanol + Ethanol (n = 6)	p	η² (95% CI)
Cystatin C (ng/mL)	26.07 ± 12.05a	32.01 ± 1.86a	45.23 ± 10.51b	32.49 ± 1.60a	31.27 ± 4.60a	0.003	0.460 (0.084 – 0.597)
IL-6 (ng/L)	7.66 ± 1.38a	8.72 ± 2.45a	11.02 ± 0.83b	7.96 ± 1.54a	8.12 ± 1.77a	0.013	0.385 (0.023 – 0.535)
KIM-1 (ng/mL)	2.21 ± 1.00a	2.47 ± 0.24a	3.45 ± 0.81b	2.28 ± 0.58a	2.32 ± 0.37a	0.017	0.370 (0.013 – 0.522)
TNF-α (ng/L)	118.66 ± 22.95a	190.51 ± 5.84b	238.29 ± 34.68c	147.10 ± 24.31ab	168.41 ± 75.41ab	<0.001	0.551 (0.181 – 0.668)
IL-1β (ng/mL)	8.43 ± 0.59a	12.53 ± 1.05c	15.26 ± 1.46d	10.05 ± 2.86ab	11.17 ± 2.37bc	<0.001	0.650 (0.316 – 0.743)

Table 1: Renal injury and inflammatory biomarkers in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. All biomarkers were measured in kidney tissue homogenates. Cystatin C, KIM-1, and IL-1β concentrations are expressed in ng/mL; IL-6 and TNF-α concentrations are expressed in ng/L. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified among some biomarkers; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted with caution. Abbreviations: MTX = methotrexate; KIM-1 = kidney injury molecule-1; IL-6 = interleukin-6; TNF-α = tumor necrosis factor-alpha; IL-1β = interleukin-1 beta; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval. η² represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated.

Variable	Control	MTX	MTX + Methanol	MTX + Methanol + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol	p	η² (95% CI)
Serum urea (mg/dL)	39.64 ± 13.69a	46.88 ± 9.49a	98.75 ± 59.24b	48.03 ± 19.64a	60.44 ± 18.53a	0.017	0.371 (0.014–0.523)
Serum creatinine (mg/dL)	0.50 ± 0.10a	0.54 ± 0.05ab	0.72 ± 0.03c	0.54 ± 0.03ab	0.60 ± 0.05b	<0.001	0.675 (0.356–0.762)
Serum SOD activity (U/mL)	470.40 ± 40.49d	371.16 ± 17.64c	219.29 ± 85.06a	319.38 ± 107.20bc	256.22 ± 67.89ab	<0.001	0.650 (0.317–0.743)
Blood GSH (mmol/L)	58.74 ± 31.90b	26.36 ± 5.92a	11.10 ± 3.73a	19.56 ± 1.66a	13.66 ± 5.32a	<0.001	0.619 (0.272–0.720)
Blood CAT activity (U/mL)	220.82 ± 74.08c	160.88 ± 55.18b	68.90 ± 13.41a	129.45 ± 7.49b	110.14 ± 20.18ab	<0.001	0.630 (0.287–0.728)
Serum MDA (nmol/mL)	13.17 ± 2.03a	17.29 ± 6.36a	31.83 ± 9.94b	17.93 ± 2.04a	19.34 ± 4.65a	<0.001	0.585 (0.225–0.694)

Table 2: Renal function and redox-related parameters in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Serum urea, serum creatinine, superoxide dismutase (SOD) activity, and malondialdehyde (MDA) concentration were measured in serum, whereas reduced glutathione (GSH) level and catalase (CAT) activity were measured in blood anticoagulated with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Serum urea and creatinine concentrations are expressed in mg/dL, SOD and CAT activities in U/mL, GSH levels in mmol/L, and MDA concentrations in nmol/mL. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified for some outcomes; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted cautiously. The redox-related biomarkers are indirect indicators and do not constitute direct measurements of mitochondrial function or molecular mechanisms of injury. η² represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated. Abbreviations: MTX = methotrexate; SOD = superoxide dismutase; GSH = reduced glutathione; CAT = catalase; MDA = malondialdehyde; EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval.

Variable	Control	MTX	MTX + Methanol	MTX + Methanol  + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol
Tubular dilatation	0.16 ± 0.40	1.50 ± 0.54	3.50 ± 0.54	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Proteinaceous material accumulation	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.33 ± 0.51
Tubular epithelial degeneration	0.16 ± 0.40	1.83 ± 0.40	3.83 ± 0.40	1.00 ± 0.00	2.00 ± 0.00
Tubular necrosis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.33 ± 0.51	0.83 ± 0.40	1.33 ± 0.51
Glomerular degeneration	0.16 ± 0.40	1.33 ± 0.51	3.33 ± 0.51	1.00 ± 0.00	1.66 ± 0.51
Bowman's space enlargement	0.00 ± 0.00	1.16 ± 0.40	3.00 ± 0.00	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Vascular congestion	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Interstitial inflammation	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.00 ± 0.63	0.83 ± 0.40	1.16 ± 0.40
Interstitial fibrosis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	2.83 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.16 ± 0.40

Table 3: Descriptive histopathological scores in experimental groups. Data are presented descriptively as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Histopathological scores were obtained from kidney sections stained with hematoxylin and eosin (H&E) and Masson’s trichrome; the scores are dimensionless. Each animal was assigned one integer score for each histopathological parameter on a scale of 0–4, where 0 = absent, 1 = minimal, 2 = mild, 3 = moderate, and 4 = severe. The decimal values presented in the table represent the arithmetic means of the individual integer scores obtained from the six animals in each experimental group and do not represent scores assigned to individual animals or a continuous scoring system. The standard deviations represent between-animal variability within each group. No inferential statistical testing or post hoc pairwise comparisons were performed on the histopathological scores; therefore, the observed between-group patterns should be interpreted descriptively rather than as statistically significant differences. Histopathological evaluation included tubular dilatation, proteinaceous material accumulation, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.

Supplementary File 1: Raw data supporting the biochemical analyses. This spreadsheet contains the animal-level raw values used for the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, and redox-related analyses reported in the manuscript. Please click here to download this file.

Diskussion

Das Hauptergebnis dieser Studie war, dass die Gruppe MTX + Methanol das ungünstigste Nierenschädigungsmuster hinsichtlich funktioneller, entzündlicher, redoxbezogener und histopathologischer Parameter aufwies. Diese Gruppe wies die höchsten Werte an Harnstoff im Serum, Kreatinin im Serum, renalem Cystatin C, KIM-1, TNF-α, IL-6, IL-1β und MDA sowie die niedrigste SOD-Aktivität, GSH-Spiegel und CAT-Aktivität auf, zusammen mit den höchsten beobachteten histopathologischen Schädigungsscores. Beide mit Gegenmitteln behandelte Gruppen zeigten günstigere Nierenbefunde als die Gruppe MTX + Methanol, wobei die mit Fomepizol behandelte Gruppe über alle untersuchten Bereiche hinweg ein konsistent günstigeres Muster zeigte. Diese Ergebnisse wurden jedoch in einem akuten, mit MTX vorbehandelten Rattenmodell unter Verwendung ungleicher Gegenmittel-Regime erzielt: wiederholte intraperitoneale Gabe von Fomepizol im Vergleich zu einer einzigen oralen Dosis Ethanol. Unterschiede in Verabreichungsweg und Dosierungshäufigkeit schränken einen direkten Vergleich der nephroprotektiven Wirksamkeit ein, und die beobachteten Ergebnismuster belegen nicht die Überlegenheit von Fomepizol gegenüber Ethanol. Die Gruppe MTX-allein wies höhere TNF-α- und IL-1β-Spiegel sowie niedrigere SOD-Aktivität, GSH-Spiegel und CAT-Aktivität auf als die Kontrollgruppe, während renales Cystatin C, IL-6, KIM-1, Harnstoff im Serum, Kreatinin im Serum und MDA-Spiegel zwischen den Gruppen statistisch vergleichbar blieben. Dieses Muster deutete darauf hin, dass die Vorbehandlung mit MTX zum zugrundeliegenden entzündlichen und redoxbezogenen Profil beitrug. Demnach traten die zusätzlichen Veränderungen in der Gruppe MTX + Methanol auf einem MTX-vorbehandelten Hintergrund auf und konnten nicht allein auf Methanol zurückgeführt werden. Da keine reine Methanol-Gruppe eingeschlossen wurde, konnte der unabhängige Beitrag von Methanol sowie mögliche Wechselwirkungen zwischen MTX und Methanol nicht vollständig getrennt werden.

Basierend auf der etablierten Toxikologie von Methanol stellte die Anreicherung toxischer Metaboliten einen plausiblen Faktor für die Nierenschädigung dar. Methanol wird vorwiegend in der Leber durch ADH zu Formaldehyd und anschließend zu Ameisensäure metabolisiert^1,3,18,19,20. Die Niere könnte daher primär durch zirkulierendes Formiat und die daraus resultierenden systemischen Stoffwechselstörungen geschädigt worden sein, anstatt durch umfangreiche lokale Methanol-Metabolisierung. Ein Beitrag des Alkohol- oder Aldehyd-Stoffwechsels im Nierengewebe konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden, da die Konzentrationen von Methanol, Formaldehyd und Formiat sowie die renale ADH-Aktivität nicht gemessen wurden. Ameisensäure hemmt die mitochondriale Cytochrom-c-Oxidase, wodurch die oxidative Phosphorylierung beeinträchtigt, die ATP-Produktion vermindert und eine histotoxische Hypoxie induziert wird; dieser Prozess kann in einer Laktatazidose, einer erhöhten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und einer Schädigung der Membranen gipfeln^1,2,3,19,20. Im Vergleich zur Leber, dem primären Ort des Methanolabbaus, könnten die Nieren besonders anfällig für die downstream wirkenden Effekte von Formiat und systemischen Stoffwechselstörungen sein. Proximale tubuläre Epithelzellen weisen einen hohen Energiebedarf auf und sind besonders empfindlich gegenüber mitochondrialer Dysfunktion, oxidativem Stress und einer Beeinträchtigung der Mikrozirkulation. Folglich könnten formiatvermittelte Hypoxie, metabolische Azidose und Entzündungsprozesse zur Nierenschädigung beitragen^{2,8,9,21,22,23}. Klinische Studien, die Assoziationen zwischen akuter Nierenschädigung und metabolischer Azidose, Atemversagen, Rhabdomyolyse, Sepsis und multipler Organfunktionsstörung zeigten, legten nahe, dass die Nierenschädigung die systemische toxische Belastung widerspiegeln könnte^8,9,10,21. Die schnellere, folatabhängige Oxidation von Formiat bei Ratten im Vergleich zu Menschen stellte eine wichtige Einschränkung experimenteller Modelle dar^1,11,12. Daher wurde eine Vorbehandlung mit Methotrexat eingesetzt, um die Formiat-Clearance zu verringern und die Empfänglichkeit gegenüber Methanolvergiftung zu erhöhen, anstatt die vollständigen klinischen und metabolischen Merkmale einer menschlichen Methanolvergiftung zu reproduzieren.

Eine Nierenfunktionsstörung wurde durch die kombinierte Bewertung konventioneller biochemischer Parameter und von Nierenverletzungs-Biomarkern nachgewiesen. Erhöhte Konzentrationen von Harnstoff und Kreatinin im Serum in der MTX + Methanol-Gruppe deuteten auf eine beeinträchtigte Nierenfiltration und Ausscheidungskapazität hin. Erhöhte Werte von cystatin C und KIM-1 in der Niere ließen vermuten, dass eine tubuläre Verletzung mit einer funktionellen Beeinträchtigung einherging. Angesichts der Assoziation von KIM-1 mit einer Verletzung der proximalen Tubuli war dieser Anstieg vereinbar mit einer degenerativen Veränderung des tubulären Epithels, Dilatation und Nekrose^24,25. Auch erhöhte cystatin C-Spiegel stützten die Existenz einer beeinträchtigten Nierenfunktion^26,27. Die niedrigeren Werte dieser Biomarker in den mit Fomepizol und Ethanol behandelten Gruppen deuteten auf eine Abschwächung der Nierenverletzung hin, wobei ein konsistenterer Effekt in der mit Fomepizol behandelten Gruppe beobachtet wurde. Das Muster der redoxbezogenen Biomarker war vereinbar mit oxidativem Stress als möglicher Beteiligter an der Nierenverletzung, jedoch nicht als Nachweis eines gesicherten Mechanismus. MDA wird häufig als Indikator für Lipidperoxidation verwendet, während GSH zur Aufrechterhaltung der zellulären Redox-Homöostase beiträgt^28,29. In experimentellen Modellen der Methanolvergiftung und der methanolassoziierten optischen Neuropathie wurden oxidativer Stress, Lipidperoxidation und verminderte antioxidative Kapazität ebenfalls mit Gewebeverletzungen in Verbindung gebracht^10,15,20. Niedrigere Serumaktivität von SOD, höhere Serumkonzentrationen von MDA sowie niedrigere Blutwerte von GSH und CAT-Aktivität in der MTX + Methanol-Gruppe entsprachen einer verminderten antioxidativen Kapazität und erhöhter Lipidperoxidation; diese Messungen konnten jedoch keinen zugrundeliegenden mitochondrialen oder molekularen Mechanismus belegen. Niedrigere serumtoxische MDA-Konzentrationen und eine teilweise Wiederherstellung der serumtoxischen SOD- und der blutigen CAT-Aktivitäten in den antidotbehandelten Gruppen waren vereinbar mit einem günstigeren Profil redoxbezogener Biomarker, wobei ein konsistenter günstigeres Muster in der mit Fomepizol behandelten Gruppe beobachtet wurde.

Höhere Werte von TNF-α, IL-6 und IL-1β in der MTX + Methanol-Gruppe entsprachen einem proinflammatorischen Nierenprofil. Da diese Zytokine nicht pfadspezifisch waren und MTX selbst mit Veränderungen ausgewählter entzündlicher Marker assoziiert war, unterstützen die Befunde eine Entzündung als möglichen, jedoch nicht bestätigten Mechanismus der Nierenschädigung. Die durch Ameisensäure vermittelte mitochondriale Dysfunktion, zelluläre Hypoxie und oxidativer Stress könnten eine Grundlage für die Aktivierung entzündlicher Signalwege darstellen; daher könnten oxidativer Stress und Entzündung bei Methanoltoxizität als sich gegenseitig verstärkende Prozesse fortschreiten^1,2,3,15. Experimentelle Modelle der Methanolvergiftung berichteten über Assoziationen der Methanolexposition mit inflammatorischer Zellinfiltration, histopathologischen Schäden und erhöhten Spiegeln proinflammatorischer Marker wie IL-1β und TNF-α^13,15. Diese Befunde stimmten mit den erhöhten Spiegeln proinflammatorischer Zytokine sowie den erhöhten Werten für interstitielle Entzündung, tubuläre Degeneration und tubuläre Nekrose in der MTX + Methanol-Gruppe überein. Insgesamt waren die Befunde vereinbar mit einem multifaktoriellen Prozess, der toxische Metaboliteffekte, oxidativen Stress, Entzündung, eine Beeinträchtigung der Mikrozirkulation und eine systemische toxische Belastung umfasst; diese Signalwege wurden jedoch nicht direkt untersucht. Niedrigere TNF-α-, IL-6- und IL-1β-Spiegel in den mit Gegenmittel behandelten Gruppen legten nahe, dass die Hemmung der Bildung toxischer Metabolite auch die entzündliche Reaktion begrenzt haben könnte. Die histopathologischen Befunde lieferten gewebsbasierte Korrelate der Nierenschädigung, wobei die MTX + Methanol-Gruppe die höchsten beobachteten Schadenswerte bezüglich tubulärer, glomerulärer, vaskulärer und interstitieller Parameter aufwies. Beide mit Gegenmitteln behandelte Gruppen zeigten beschreibend niedrigere histopathologische Schadenswerte, und die Fomepizol-behandelte Gruppe wies bei den meisten Parametern beschreibend niedrigere Werte auf als die Ethanol-behandelte Gruppe. Da jedoch keine inferenzstatistischen Tests an den histopathologischen Werten durchgeführt wurden, konnten diese Beobachtungen keinen statistisch signifikanten histopathologischen Schutz oder die Überlegenheit eines der beiden Gegenmittel belegen^16,17.

Die entgiftenden Wirkungen von Ethanol und Fomepizol bei Methanolvergiftung beruhen auf der Hemmung des von Alkoholdehydrogenase vermittelten Stoffwechsels, wodurch die Bildung von Formaldehyd und Ameisensäure verringert wird. Ethanol wirkt als kompetitiver Substrat, während Fomepizol als direkter und potenter Inhibitor der Alkoholdehydrogenase fungiert^{1,3,4,6,7,30,31,32}. Die günstigeren renalen Outcome-Muster, die in beiden mit Antidot behandelten Gruppen beobachtet wurden, entsprachen den erwarteten Effekten einer Hemmung der Alkoholdehydrogenase. Dennoch zeigt die aktuelle Literatur keine eindeutige klinische Überlegenheit von Fomepizol gegenüber Ethanol. Obwohl Fomepizol aufgrund einfacherer Dosierung, vorhersagbarer Pharmakokinetik und eines geringeren Nebenwirkungsprofils oft bevorzugt wird, bleibt Ethanol eine wirksame Alternative^{1,3,4,6,7,30,32}. In den von Zakharov et al. berichteten Daten zu massiver Methanolvergiftung wurde kein klarer Unterschied zwischen den beiden Antidoten hinsichtlich Mortalität, Dauer der Intensivbehandlung oder Dialysebedarf festgestellt; daher sind Interpretationen bezüglich klinischer Überlegenheit mit Vorsicht zu genießen⁵. Bei biochemischen Endpunkten zeigte der Duncan’sche Post-hoc-Test keine statistisch signifikanten direkten Unterschiede zwischen den mit Fomepizol und Ethanol behandelten Gruppen. Zudem wurde Fomepizol in wiederholten Dosen verabreicht, während Ethanol als Einzeldosis gegeben wurde. Die Behandlungsregime waren hinsichtlich Applikationsweg, Dosierungshäufigkeit oder systemischer Exposition nicht vergleichbar. Folglich könnte das deskriptiv günstigere Muster, das mit Fomepizol assoziiert war, Unterschiede im Dosierungsschema, im Applikationsweg oder in der Arzneimittelaussetzung widerspiegeln – zusätzlich zu Unterschieden zwischen den Antidotsubstanzen selbst – und belegt weder eine höhere biochemische Wirksamkeit, klinische Überlegenheit noch eine klinische Therapiepräferenz^5,6,30,32. Eine wesentliche Stärke der Studie bestand in der integrierten Bewertung von Serumharnstoff und -kreatinin, Cystatin C, KIM-1, proinflammatorischen Zytokinen, redoxbezogenen Biomarkern sowie histopathologischen Scores über komplementäre funktionelle, tubuläre, entzündliche, redoxbezogene und strukturelle Bereiche hinweg. Dieses auf Nierenschädigung fokussierte Modell könnte einen nützlichen präklinischen Rahmen zur Beurteilung von Antidotregimen, adjuvanten nephroprotektiven Maßnahmen und Biomarkern für Nierenschädigungen unter Bedingungen einer verminderten folatabhängigen Formatausscheidung bieten^8,9,10,21.

Mehrere Einschränkungen beeinflussten die Interpretation. Die direkte Übertragbarkeit auf klinische Methanolintoxikation war durch das experimentelle Tiermodell und interspezifische Stoffwechselunterschiede begrenzt. Methotrexat könnte unabhängig Nieren-, Entzündungs- und oxidative Parameter beeinflussen³³, und das Fehlen einer reinen Methanol-Gruppe verhinderte eine vollständige Trennung der Methanoleffekte von potenziellen MTX–Methanol-Wechselwirkungen. Die Konzentrationen von Methanol, Formaldehyd, Ameisensäure, Ethanol und Fomepizol im Serum oder in Geweben wurden nicht gemessen, und die ADH-Aktivität im rohen renalen zytoplasmatischen Fraktion wurde nicht bestimmt; daher konnten eine metabolische Sensibilisierung, die Bildung toxischer Metaboliten, die Exposition gegenüber dem Gegenmittel sowie die Hemmung des Methanolabbaus nicht direkt verifiziert werden, und Korrelationsanalysen mit renalen biochemischen Ergebnissen konnten nicht durchgeführt werden. Säure-Basen-Variablen, einschließlich pH, Bicarbonat, Basenüberschuss und Anionenlücke, wurden nicht erfasst. Die 48-stündige Nachbeobachtungsphase erlaubte lediglich die Beurteilung akuter Nierenveränderungen und ließ keine Aussage über die Erholung, Persistenz oder Reversibilität der Nierenschädigung oder über chronische strukturelle Veränderungen zu. Die Masson-Trichrom-Färbung wurde histomorphologisch bewertet, ohne eine quantitative Messung des kollagenpositiven Areals vorzunehmen, und molekulare oder biochemische Fibrosemarker wie die Expression von α-Smooth-Muskel-Aktin, Kollagengehalt und 4-Hydroxyprolin-Konzentration wurden nicht untersucht. Die histopathologische Beurteilung durch einen einzigen verblindeten Pathologen schloss eine Bewertung der Übereinstimmung zwischen Beobachtern aus, und die semiquantitative Läsionsbewertung blieb potenziell anfällig für beobachterabhängige Klassifizierung. Die Gegenmittelregime waren pharmakologisch ungleich; die ELISA-Konzentrationen im Nierengewebe wurden nicht auf die Gesamtproteinkonzentration normiert; molekulare Analysen der mitochondrialen Funktion und der Zelltodwege wurden nicht durchgeführt; die Stichprobengröße war begrenzt; und es wurden ausschließlich männliche Ratten eingeschlossen. Zukünftige Studien sollten eine reine Methanol- und eine reine MTX-Gruppe, vergleichbare Gegenmittelregime, serielle Messungen der Konzentrationen von Methanol, Ameisensäure und Gegenmitteln, die renale ADH-Aktivität, Säure-Basen-Parameter, eine quantitative Beurteilung der Fibrose, eine längere Nachbeobachtungszeit und eine angemessen gestaltete klinische Validierung einbeziehen. Zusammenfassend war die Methanolexposition in diesem mit Methotrexat vorbehandelten Rattenmodell mit einer eingeschränkten Nierenfunktion, erhöhten Nierenschädigungs- und Entzündungsmarkern, einem ungünstigen redoxbezogenen Profil und histopathologischen Schädigungen assoziiert. Beide mit Gegenmitteln behandelten Gruppen zeigten günstigere Nierenbefunde im Vergleich zur MTX + Methanol-Gruppe. Fomepizol zeigte über die untersuchten Parameter hinweg ein konsistent günstigeres beschreibendes Muster; jedoch verhinderten das Fehlen signifikanter direkter biochemischer Unterschiede zwischen den Gegenmittelgruppen, der beschreibende Charakter der histopathologischen Vergleiche, die ungleichen Gegenmittelregime und das Fehlen toxikokinetischer Messungen eine Schlussfolgerung hinsichtlich einer Überlegenheit gegenüber Ethanol. Diese Ergebnisse gelten ausschließlich für das mit Methotrexat vorbehandelte Rattenmodell und belegen nicht die renalen Wirkungen eines der beiden Gegenmittel nach Methanolexposition ohne vorherige Methotrexat-Behandlung oder bei menschlicher Methanolvergiftung. Weitere Studien, die direkte toxikokinetische Messungen, mechanistische Bewertungen, vergleichbare Gegenmitteldosierungsregime und eine längere Nachbeobachtung einbeziehen, sind erforderlich, um die Reproduzierbarkeit und breitere Anwendbarkeit dieser Befunde zu beurteilen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10% Neutral gepuffertes Formalin	Merck	Nicht erfasst	Gewebefixierung für die histopathologische Aufarbeitung.
Absoluter Ethanol (≥99,8 %)	Sigma-Aldrich, USA	Nicht erfasst	Mit steriler, destillierter Wasser verdünnt, um eine endgültige 20 %ige (V/V) Lösung zu erhalten; als einzelne orale Gavage-Dosis von 0,5 g/kg 4 h nach Methanolverabreichung verabreicht.
Benchtop-Zentrifuge	Nüve	NF048	Probenpräparation und Zentrifugation.
Biotin-konjugiertes Antikörper	BT Lab ELISA-Kit-Bestandteile	Im Kit enthalten	Nachweistantikörper
CAT (Katalase)-Kit	Otto Scientific	Otto3051	Farbmessung der Katalase-(CAT-)Aktivität in EDTA-antikoaguliertem Blut.
cOmplete Mini EDTA-freie Protease-Inhibitor-Cocktail	Roche / Sigma-Aldrich	11836170001	Zur Homogenisierungspuffer hinzugefügt während der Herstellung von Nierengewebshomogenaten für ELISA-Analysen.
Kreatinin-Kit	Otto Scientific	OttoBC139	Bestimmung der Serumkreatininkonzentration.
Digitaler Homogenisator	Daihan Scientific	HG-15D	Gewebshomogenisierung
ELx50 Auto Strip Washer	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	ELISA-Waschung
ELx800 Mikroplattenreader	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	Extinktionsmessung für ELISA- und farbige Assays; ELISA-Extinktion wurde bei 450 nm gemessen.
Eosin Y (gelblich)	Merck	1.15935.0025	histopathologische Färbung
Fomepizol (4-Methylpyrazol)	Hüsnü Arsan A.., Ankara, Türkei	Nicht erfasst	In steriler 0,9 %iger Natriumchloridlösung auf eine Endkonzentration von 10 mg/mL hergestellt; intraperitoneal als 15 mg/kg-Ladedosis 4 h nach Methanolverabreichung verabreicht, gefolgt von 10 mg/kg-Erhaltungsdosen nach 12, 24 und 36 h nach Methanolverabreichung.
GSH (Glutathion)-Kit	Otto Scientific	Otto3053	Farbmessung der reduzierten Glutathion-(GSH-)Konzentrationen in EDTA-antikoaguliertem Blut.
Harris-Hämatoxylin-Lösung	BSLAB	BS-002	histopathologische Färbung
Salzsäure (HCl)	Merck	7647-01-0	pH-Einstellung
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	IBM SPSS Statistics Version 29.0	Statistische Analyse; RRID:SCR_016479.
Ketaminhydrochlorid (Ketalar)	Pfizer, USA	Nicht erfasst	Allgemeinanästhesie vor Blut- und Nierengewebesammlung.
Leuchtmikroskop	Nikon Eclipse	Ni-U	histopathologische Untersuchung
Massons Dreifachfärbung-Kit	MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. ti., Türkei)	BKMTO001	histopathologische Färbung
MDA (Malondialdehyd)-Kit	Otto Scientific	Otto1001	Farbmessung der Malondialdehyd-(MDA-)Konzentrationen im Serum als Indikator für Lipidperoxidation.
Methanol (≥99,8 %)	Sigma-Aldrich, USA	322415	Oral (3 g/kg) verabreicht, um eine experimentelle Methanolintoxikation hervorzurufen.
Methotrexat (Emthexate 500 mg/5 mL)	Teva Pharma Belgium	Nicht erfasst	Kommerzielle 100 mg/mL-Formulierung mit steriler 0,9 %iger Natriumchloridlösung verdünnt, um eine endgültige Arbeitskonzentration von 0,06 mg/mL zu erhalten; mittels oraler Gavage bei 5 mL/kg, entsprechend 0,3 mg/kg, einmal täglich für 7 aufeinanderfolgende Tage verabreicht.
Mindray Chemistry Analyzer	Mindray	BS-400	Messung von Serumharnstoff und -kreatinin.
Paraffinwachs, histologische Qualität	Nicht erfasst	Nicht erfasst	Geweeinbettung.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Merck	P4417	Gewässerung/Spülen
Ratten-Cystatin-C-ELISA-Kit	BT Lab, China	E0145Ra	Quantifizierung der Cystatin-C-Konzentrationen in Nierengewebshomogenaten; analytische Empfindlichkeit: 0,25 ng/mL; Nachweisbereich: 0,5–100 ng/mL.
Ratten-IL-1β-ELISA-Kit	BT Lab, China	E0119Ra	Quantifizierung der IL-1β-Konzentrationen in Nierengewebshomogenaten; analytische Empfindlichkeit: 0,08 ng/mL; Nachweisbereich: 0,2–60 ng/mL.
Ratten-IL-6-ELISA-Kit	BT Lab, China	E0135Ra	Quantifizierung der IL-6-Konzentrationen in Nierengewebshomogenaten; analytische Empfindlichkeit: 0,052 ng/L; Nachweisbereich: 0,1–40 ng/L.
Ratten-KIM-1-ELISA-Kit	BT Lab, China	E0549Ra	Quantifizierung der KIM-1-Konzentrationen in Nierengewebshomogenaten; analytische Empfindlichkeit: 0,01 ng/mL; Nachweisbereich: 0,05–10 ng/mL.
Ratten-TNF-α-ELISA-Kit	BT Lab, China	E0764Ra	Quantifizierung der TNF-α-Konzentrationen in Nierengewebshomogenaten; analytische Empfindlichkeit: 2,51 ng/L; Nachweisbereich: 5–1.000 ng/L.
RIPA-Lysispuffer und Extraktionspuffer	Thermo Scientific	89900	Nierengewebshomogenisierung und -lyse für ELISA-Analysen.
SOD (Superoxiddismutase)-Kit	Otto Scientific	Otto3047	Farbmessung der Superoxiddismutase-(SOD-)Aktivität im Serum.
Natriumcitrat	Merck	03-04-6132	Pufferherstellung
Natriumhydroxid (NaOH)	Merck	1310-73-2	pH-Einstellung
Edelstahl-Fütterungssonde (22 G orale Gavage-Kanüle)	Instech Laboratories, USA	Nicht erfasst	Wiederverwendbare Edelstahlkanüle zur oralen Gavage-Verabreichung bei Ratten.
Stop-Lösung	BT Lab ELISA-Kit-Bestandteile	Im Kit enthalten	ELISA-Reaktionsbeendigung
Streptavidin-Peroxidase	Thermo Scientific	SHRP248-B	ELISA-Nachweissystem
TMB-Substratlösung	BT Lab ELISA-Kit-Bestandteile	Im Kit enthalten	chromogenes Substrat
Tris-HCl	Thermo Scientific	1185-53-1	Pufferherstellung
Harnstoff-Kit	Otto Scientific	OttoBC157	Messung der Serumharnstoffkonzentration.
Waschpuffer-Konzentrat	BT Lab ELISA-Kit-Bestandteile	Im Kit enthalten	Plattenwäsche
Wistar-Albino-Ratten	Experimentelles Tierversuchslabor der Ahi Evran-Universität, , Türkei	Zucht-/Produktionslizenz Nr. 184	Männlich; 8–12 Wochen alt; Körpergewicht: 220 ± 20 g
Xylazinhydrochlorid (Rompun)	Bayer, Deutschland	Nicht erfasst	Allgemeinanästhesie vor Blut- und Nierengewebesammlung.
Xylol, histologische Qualität	Nicht erfasst	Nicht erfasst	histologische Gewebeaufarbeitung und -klärung.