Methodenartikel

In vitro-Inkubation mit Pansenflüssigkeit und histologische Färbung ausgewählter Zellwandbestandteile in Luzerne (Medicago sativa L.)-Stängeln

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DOI:

10.3791/73286

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18. September 2026

 , 
1Department of Agronomy and Plant Genetics, University of Minnesota - Twin Cities, 2United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll veranschaulicht die Ablagerung von Lignin und Pektin-Zellwandbestandteilen in Querschnitten von Stängeln der Luzerne (Medicago sativa L.). Ziel ist es, spezifische Gewebe des Stängels zu identifizieren, die gezielt verändert werden könnten, um neue Luzernelinien mit wünschenswerten Stängeldurchverdaulichkeitseigenschaften zu entwickeln.

Zusammenfassung

Die Anreicherung von Zellwandbestandteilen während des Pflanzenwachstums begrenzt die Futterwertigkeit für Wiederkäuer. Insbesondere die Ablagerung von Lignin in Pflanzengeweben behindert den Abbau der Zellwandpolysaccharide Cellulose und Hemicellulose und verringert dadurch die aus dem Futter gewinnbare Energiemenge. Der gut verdauliche Zellwandbestandteil Pektin hingegen steht für den Abbau leicht zur Verfügung. Informationen über die Ablagerung von Lignin und Pektin in verschiedenen Stammzellen können Einblicke in die Mechanismen liefern, die der Variabilität der Stängeldurchverdaulichkeit zwischen Alfalfa-Linien zugrunde liegen. Die in vitro-Inkubation von Stängelquerschnitten in Pansenflüssigkeit simuliert die Prozesse, denen Stängelgewebe im Pansen unterliegen. In Kombination mit histologischer Färbung und Mikroskopie ermöglicht diese Methode die Visualisierung von Veränderungen im Gewebeabbau über die Zeit sowie die Lokalisation von Lignin und Pektin im Stängel. Die Wiesner-Färbung reagiert mit Guaiacyl-(G-)Aldehydeinheiten des Lignins und färbt diese fuchsinfarben. Ebenso bindet Rutheniumrot an die Carboxylgruppen von Pektin und färbt Pektin im Stängel in Schattierungen von Rosa bis Orange und Braun. Dieses Protokoll beschreibt den Verdau von Alfalfa-Stängelquerschnitten nach Exposition gegenüber Pansenmikroben, gefolgt von einer Färbung zur Visualisierung der Verteilungsmuster von Lignin und Pektin in den Zellwänden. Die Methode kann verwendet werden, um Stängelgewebe zu identifizieren, in denen Lignin und Pektin vorhanden oder fehlend sind, und erleichtert somit den Vergleich zwischen verschiedenen Alfalfa-Linien.

Einleitung

Eine Zellwand umschließt jede Pflanzenzelle. Cellulose, Hemicellulose, Lignin und Pektin sind Bestandteile der Zellwand und tragen zur pflanzlichen Faser bei, die ein notwendiger Bestandteil der Ernährung von Wiederkäuern ist. Während Pektine hochgradig verdauliche (lösliche) Polysaccharide sind1, ist Lignin ein unverdauliches Polymer, das den Abbau der Faser einschränkt2. Lignin verringert daher die Verdaulichkeit der Pflanze und reduziert letztlich die Energie, die dem Wiederkäuer aus dem Futter zur Verfügung steht. Lignin unterstützt jedoch wichtige physiologische Funktionen der Pflanze, wie beispielsweise den Wassertransport im gesamten Pflanzenkörper durch die Verstärkung der Tracheidelemente3. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Veränderungen an der Stängelfaser, die zu einer Verringerung des Lignins oder einer Erhöhung des Pektins führen, die Verdaulichkeit des Stängels und den ernährungsphysiologischen Wert des Futters verbessern könnten4. Daher konzentriert sich dieses Protokoll auf diese beiden Bestandteile der Zellwand. Die Gesamtkonzentrationen von Lignin und Pektin in der Stängelzellwand liefern unzureichende Informationen, um die Mechanismen der Stängelfaser-Verdaulichkeit zu erklären5. Eine in vitro-Inkubation mit Pansenflüssigkeit und histologische Färbungen können Einblicke auf zellulärer Ebene ermöglichen, indem sie Unterschiede in den Zellwandbestandteilen zwischen Pflanzen mit unterschiedlicher Verdaulichkeit der Stängelfaser sichtbar machen4,6. In dem vorliegenden Protokoll dient Luzerne (Medicago sativa L.), eine verbreitete mehrjährige Futterleguminose, als Modellart, um Muster von Lignin und Pektin in Stängelgeweben darzustellen, die im Vergleich zu Blättern mehr Lignin, aber weniger Pektin enthalten.

In-vitro-Inkubation mit Pansenflüssigkeit simuliert die Futterverdauung im Pansen des Wiederkäuers und ermöglicht die Beobachtung der Auswirkungen der Futteranatomie auf die Verdaulichkeit. Indem im Reagenzglas Bedingungen geschaffen werden, die denen im Pansen ähneln, können Stängelquerschnitte, die auf Objektträgern befestigt sind, zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen werden, um den Grad des Gewebeabbaus nach Exposition gegenüber Pansenflüssigkeit zu bewerten6. Diese Methode bietet einen vergleichsweise einfachen, schnellen und kostengünstigen Ansatz, um die anatomischen Strukturen von Luzernestängeln7 sichtbar zu machen und zu untersuchen, wie Zelltypen mit unterschiedlichen Zellwandbestandteilen während der Verdauung des Stängels verändert werden.

Die histologische Färbung von Stängelquerschnitten ermöglicht die Visualisierung von Zellwandbestandteilen. Phloroglucinol und Salzsäure (HCl) reagieren miteinander zur Bildung der Wiesner-Färbung, die Gewebe im Stängel mit guaiacylreichen Lignin-Einheiten8 durch Reaktion mit G-C6C3-Aldehyd-Monomeren (Coniferaldehyd)9 anfärbt. Lignin besteht aus mehreren Monomer-Untereinheiten; im vorliegenden Artikel bezieht sich der Begriff „Lignin“ jedoch ausschließlich auf das G-Einheiten-Monomer, da dieses mit der Wiesner-Färbung reagiert10 und daher mittels dieses Protokolls sichtbar gemacht werden kann. Bestimmte Gewebe, wie beispielsweise Xylemgefäße, sind stets verholzt6. Andernfalls beginnt die Ablagerung von Lignin in Alfalfa-Stängelgeweben mit dem Einsetzen des sekundären (kambialen) Wachstums und fällt zeitlich mit der Beendigung der Streckung der Stängelzwischenknollen zusammen6. Rutheniumrot bindet an pektische Substanzen, die Carboxylgruppen enthalten, die teilweise verestert sind und einige Seitenketten gemeinsam haben11. Die Carboxylgruppen der Pektine in der Mittellamelle und den primären Zellwänden wechselwirken mit Rutheniumrot11. Pektin ist an der Zellstreckung beteiligt und daher während des primären Wachstums in den Zellen vorhanden. Im gesamten Manuskript bezieht sich der Begriff „Pektin“ allgemein auf das Spektrum möglicherweise vorhandener Pektine. Die Kombination histologischer Färbung mit einer in vitro-Inkubation im Pansen ermöglicht die Beobachtung der Lokalisation von Zellwandbestandteilen im Stängel und verdeutlicht, wie sich unterschiedliche Zelltypen während der Pansendigestion verändern. Letztendlich kann dieses Protokoll verwendet werden, um Stängelzellen, die Lignin und Pektin enthalten, zu identifizieren und Muster zwischen verschiedenen Alfalfa-Linien und Inkubationszeiten zu charakterisieren.

Protokoll

Diese Forschung wurde gemäß den institutionellen Richtlinien für Tierversuche durchgeführt (IACUC 2301-40689B).

1. Beschriften der Probenröhrchen

  1. Vorbereitung und Beschriftung von Probenröhrchen für Inkubation, Lagerung und Färbung
    1. Beschriften Sie fünf getrennte Sätze wiederverwerfbarer, schraubverschließbarer konischer Zentrifugenröhrchen mit 50 mL Fassungsvermögen für jede Probe. Tragen Sie den Probenbezeichner und die Inkubationszeit auf jedes Röhrchen für die unten beschriebenen Anwendungen ein.
    2. Beschriften Sie die Röhrchen für die Vorinkubationslagerung und geben Sie 35 mL ultrareines Wasser hinzu.
    3. Beschriften Sie die Inkubationsröhrchen zur Verwendung in den Abschnitten 3 und 4. Ordnen Sie die Röhrchen in separaten Gestellen nach Inkubationszeit (0, 4, 8, 24, 48 oder 96 h).
      HINWEIS: Verwenden Sie einen dauerhaften, industrietauglichen Edding, um zu verhindern, dass die Beschriftung im Wasserbad abgewaschen wird.
    4. Beschriften Sie die Röhrchen für die Lagerung nach der Inkubation und geben Sie 35 mL einer 50:50-Mischung aus 100 % Glycerin und ultrareinem Wasser hinzu. Verwenden Sie diese Röhrchen, um die durchgeschnittenen Querschnitte auf Objektträgern bis zur Färbung aufzubewahren.
    5. Beschriften Sie die Röhrchen vor der Färbung und geben Sie 35 mL einer 50:50-Mischung aus 200-proof Ethanol und ultrareinem Wasser hinzu. Verwenden Sie diese Röhrchen, um Glycerin aus den Querschnitten vor der Färbung zu extrahieren.
    6. Beschriften Sie die Röhrchen zur Rehydratisierung und geben Sie 35 mL ultrareines Wasser hinzu.

2. Querschnittsanfertigung von Stängeln und Montage auf Objektträgern

  1. Entnehmen Sie mit einer Pinzette jeweils ein Stängelstück aus den Probematerialien und schneiden Sie die Mitte des Segmentes heraus.
    ANMERKUNG: Verwenden Sie vier Stängel pro Probe als technische Replikate für jedes biologische Replikat. Wählen Sie die vier Stängel zufällig aus allen verfügbaren Stängeln pro Probe aus. Verwenden Sie zusätzlich einen weiteren Satz standardisierter Stängel als Kontrolle über alle Inkubationsdurchläufe hinweg.
  2. Schneiden Sie zwei Rechtecke aus extrudiertem Polystyrol-Hartschaum, jedes etwa 2,5 cm lang und 0,6 cm dick. Schneiden Sie entlang der Länge jedes Stückes einen kleinen Keil, sodass ein Stängelzwischenknoten eng zwischen den beiden Schaumstoffstücken sitzt.
  3. Befestigen Sie das Stängel-„Sandwich“ auf dem Objekttisch eines Schneidmikrotoms, das in der Lage ist, 100 μm dicke Schnitte herzustellen. Geben Sie mit einem feinen Pinsel einen Tropfen Wasser auf den Stängel und die Mikrotomschneide, um ein sauberes Schneiden zu ermöglichen.
  4. Schneiden Sie Querschnitte des Stängels mit einer Dicke von 100 μm. Überführen Sie jeden Querschnitt mit Hilfe des Pinsels in eine vorbeschriftete Petrischale, die ultrareines Wasser enthält, um ihn dort vorübergehend aufzubewahren, und entfernen Sie jeglichen Schaumstoff aus der Schale.
    ANMERKUNG: Ersetzen Sie die Mikrotomschneide, wenn der Schaumstoff einreißt, da dies auf eine stumpfe Klinge hindeuten kann.
  5. Beschriften Sie von Hand zwei Standard-Glaskäfer (25 mm × 75 mm) für jede Probe zu jedem Inkubationszeitpunkt (2 Färbungen × 6 Zeitpunkte = 12 Objektträger pro Probe für jedes biologische Replikat). Tragen Sie auf jedes Etikett die Probenkennung, den Inkubationszeitpunkt und die verwendete Färbung ein.
  6. Schneiden Sie ein 2,5 cm langes Stück doppelseitiges Klebeband (2 mm breit) ab. Positionieren Sie die kurze Seite des Bandes 0,5 cm vom unteren Ende des Objektträgers entfernt, wobei die klebende Seite nach unten zeigt. Drücken Sie die Wachspapier-Seite des Bandes unter Handschuhgebrauch fest an, um eine sichere Haftung zu gewährleisten.
    ANMERKUNG: Führen Sie diesen Schritt auf einer ebenen Fläche durch, um das Zerbrechen der Glasobjektträger zu vermeiden.
  7. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um alle Querschnitte in dieselbe Richtung auszurichten. Entfernen Sie das Wachspapier vom doppelseitigen Klebeband und übertragen Sie die Querschnitte unter Beibehaltung ihrer Orientierung mit einem angefeuchteten, feinen Pinsel auf das Klebeband des vorbeschrifteten Objektträgers. Halten Sie die Querschnitte leicht feucht.
  8. Legen Sie das Wachspapier über die Querschnitte und rollen Sie vorsichtig mit dem Pinsel darüber, um die Querschnitte sicher auf dem doppelseitigen Klebeband zu befestigen. Entfernen Sie anschließend das Wachspapier und legen Sie den präparierten Objektträger mit den vier Querschnitten in das vorbeschriftete Halteröhrchen, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben, wobei sichergestellt werden muss, dass das ultrareine Wasser die montierten Querschnitte bedeckt.
  9. Platzieren Sie für die Färbung mit Rutheniumrot und Wiesner-Färbung jeweils zwei Objektträger rückenseitig in jedem Halteröhrchen, wobei die Seite mit dem doppelseitigen Klebeband nach außen zeigt.
    ANMERKUNG: Nachdem alle Objektträger montiert und in Röhrchen mit ultrareinem Wasser platziert wurden, können die Objektträger gegebenenfalls über Nacht bei Raumtemperatur gelagert werden.

3. Vorbereitung der in vitro-Inkubation von Stängelquerschnitten

  1. Verwenden Sie die für die Inkubation vorbereiteten Einweg-Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (50 mL) (siehe 1.1.3). Gruppieren Sie alle Probenröhrchen für jedes Inkubationsintervall auf einem einzigen Kunststoffrack.
  2. Verwenden Sie eine Analysenwaage mit vier Dezimalstellen, um 0,2 g eines auf 1 mm gemahlenen Maisstängelstandards auf Wiegepapier abzuwiegen, und überführen Sie das Material vorsichtig in jedes Inkubationsröhrchen mit Ausnahme der 0-h-Röhrchen, die als nicht inkubierte Kontrolle dienen. Verschließen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie bis zur weiteren Verwendung beiseite.
    HINWEIS: Der Maisstängelstandard liefert Energie zur Aufrechterhaltung der Pansenmikroben während der Inkubation, da die Biomasse der Stängelquerschnitte nicht ausreicht, um die mikrobielle Aktivität aufrechtzuerhalten.
  3. Füllen Sie ein zirkulierendes Wasserbad mit ausreichend Wasser und bringen Sie es auf die gewünschte Temperatur ein. 39 °C bevor die Inkubation beginnt. Stellen Sie die Wassertiefe so ein, dass die 35-mL-Marke auf den 50-mL-Röhrchen bedeckt ist, und verwenden Sie gegebenenfalls einen Belüfter, um eine gleichmäßige Wasserzirkulation und Temperatur aufrechtzuerhalten.
  4. Herstellung des McDougall-Puffers für die Inokulationslösung
    1. Bereiten Sie den McDougall-Puffer nicht mehr als 2 Tage vor Beginn der Inkubationen zu.
      HINWEIS: McDougall-Puffer und Pansenflüssigkeit im Verhältnis 4:1 mischen, um die Inokulationslösung herzustellen. Das Puffervolumen entsprechend der Anzahl der Proben anpassen und ausreichend Inokulationslösung herstellen, um pro Reagenzglas 30 mL bereitzustellen.
    2. Messen Sie 1.600 mL ultrareines Wasser ab. Geben Sie 1 L in einen 3-L-Flachkolben und bewahren Sie 600 mL zum Überführen und Spülen von Reagenzien auf.
    3. Geben Sie einen Magnetrührer in den Erlenmeyerkolben und stellen Sie den Kolben auf ein Rührgerät.
    4. Stellen Sie einen Kunststofftrichter in den Erlenmeyerkolben. Geben Sie 15,7 g Natriumbicarbonat (NaHCO₃) hinzu.₃), 5,9 g Natriumphosphat, zweibasisch, wasserfrei (Na₂HPO₄), 0,91 g Kaliumchlorid (KCl), 0,75 g Natriumchlorid (NaCl), 0,19 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO₄·7H₂O) und 0,06 g Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl₂), wobei jeweils ein Reagenz nach dem anderen hinzugefügt wird und jedes Reagenz vor der Zugabe des nächsten vollständig gelöst werden muss. Nach jeder Zugabe verwenden Sie portionsweise das reservierte Ultrapure-Wasser (600 mL), um das Trichter abzuspülen.
    5. Nach Zugabe von Calciumchlorid-Dihydrat eine CO₂ Diffusor zur Erleichterung der Lösung verwenden und die Lösung spülen. Sobald die Lösung klar wird, weitere 10–15 min spülen.
    6. Verschließen Sie den Kolben fest und sichern Sie den Stopfen mit Kreppband, da das Erwärmen des Puffers den Behälter unter Druck setzen kann.
    7. Bewahren Sie die Lösung bei 20 °C bis zu 2 Tage. Stellen Sie die Lösung in ein 39 °C Wasserbad am Tag vor der Verwendung, oder direkt hineinstellen 39 °C Wasserbad, falls es am folgenden Tag verwendet wird.

4. In-vitro-Inkubation von Stammquerschnitten

  1. Am Tag der Inkubation 47 mL Wasser und 4 mL 1 N NaOH in einem 100-mL-Becherglas im Abzug geben und 0,625 g Cystein-HCl hinzufügen. In einem zweiten 100-mL-Becherglas 0,625 g Natriumsulfid zu 47 mL Wasser geben und die beiden Lösungen getrennt halten, bis die Inokulationslösung hergestellt ist.
  2. Einen isolierten Thermosbehälter mit heißem Wasser füllen, um eine warme Umgebung für den Transport von Pansenmikroorganismen von der Kuh ins Labor bereitzustellen. Einen Fünf-Gallonen-Eimer zum Umfüllen des heißen Wassers aus dem Thermosbehälter mitnehmen.
  3. Zum Stall fahren, um Pansenflüssigkeit von der vom Stallmanagement für das Experiment vorgesehenen kanierten Kuh zu sammeln.
    ANMERKUNG: Um Variationen zu minimieren, die Pansenflüssigkeit während eines Experiments stets etwa zur gleichen Tageszeit und von derselben Kuh sammeln. Mit dem Stallmanagement abstimmen, um rechtzeitig vorab Bescheid zu geben, wann man am Stall zur Probennahme anwesend sein wird.
  4. Die Versuchskuh identifizieren und geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen, einschließlich Laborkittel, Augenschutz, Schuhüberzügen und handschuhartigen Ärmeln bis über die Schultern.
    ANMERKUNG: Die Verfahren in den Schritten 4.4–4.8 sind auf Personal beschränkt, das gemäß dem geltenden IACUC-Protokoll autorisiert ist.
  5. Das warme Wasser aus dem Thermosbehälter in den Fünf-Gallonen-Eimer umfüllen. Zwei Lagen Gaze der Güte 50 (Käsetuch) zum Filtern des Pansenmaterials vorbereiten.
  6. Sammlung der Pansenflüssigkeit von der kanierten Kuh
    1. Die Kanüle vorsichtig öffnen und den Stopfen in den Fünf-Gallonen-Eimer mit warmem Wasser legen, um eine Kontamination des Stopfens zu vermeiden. Mit einer behandschuhten Hand ausreichend Material aus dem Pansen entnehmen, um Zugang zur Fest-Flüssig-Grenzfläche des Pansens zu erhalten.
    2. Sobald die Fest-Flüssig-Grenzfläche erreicht ist, mehrere Handvoll Material sammeln und durch zwei Lagen Gaze der Güte 50, jeweils etwa 45 cm quadratisch, in einen vorgewärmten Schraubverschluss-Thermosbehälter auspressen. Das ausgepresste Material nach dem Auspressen der Pansenflüssigkeit entsorgen.
    3. Schritt 4.6.2 wiederholen, bis 1 L Pansenflüssigkeit im Thermosbehälter für jeden Satz von 60 Inokulationsröhrchen vorhanden ist; das Volumen entsprechend der Anzahl der zu inkubierenden Proben anpassen.
      ANMERKUNG: Bei kanierten Kühen gelten spezifische Grenzwerte, wie viel Pansenflüssigkeit pro Woche entnommen werden darf. Mit dem Stallmanager kommunizieren, um sicherzustellen, dass die entnommene Menge an Pansenflüssigkeit den für die Kuh geltenden Grenzwert nicht überschreitet.
  7. Nach ausreichender Sammlung der Pansenflüssigkeit den Thermosbehälter fest verschließen, um die Temperatur zu halten. Die Kanüle wieder einsetzen und das warme Wasser im Fünf-Gallonen-Eimer zur Reinigung verwenden.
  8. Beschmutzte Schuhüberzüge, Handschuhe und Gaze nach Verlassen des Stalls in die dafür vorgesehene Entsorgungseinrichtung entsorgen. So schnell wie möglich ins Labor zurückkehren, um Temperatur und anoxische Bedingungen der Pansenflüssigkeit aufrechtzuerhalten.
  9. Im Labor die beiden Reduktionsmittellösungen (siehe 4.1) im Abzug miteinander vermengen und umrühren, um die Reduktionslösung herzustellen.
  10. Einen Glasbecher mit mindestens 2 L Fassungsvermögen, der einen großen Rührstab enthält, auf eine beheizte Rührplatte stellen, die auf <30 °C eingestellt ist, und einen CO₂-Verteiler über der Flüssigkeit positionieren. 1.600 mL McDougall-Puffer hinzufügen und langsam umrühren, wobei der CO₂-Verteiler die Flüssigkeit nicht berühren darf.
    ANMERKUNG: Bei dieser niedrigen Temperatur kann gegebenenfalls ein Polypropylen-Becher verwendet werden. CO₂ verwenden, um O₂ zu verdrängen und anoxische Bedingungen aufrechtzuerhalten.
  11. Einen großen Trichter mit zwei Lagen Gaze der Güte 50 (Käsetuch) auskleiden und über einen 2-L-Messzylinder stellen. 400 mL Pansenflüssigkeit filtrieren und zur McDougall-Pufferlösung (siehe 3.4.7) hinzufügen, um die Inokulationslösung herzustellen.
  12. 80 mL der Reduktionslösung (siehe 4.9) zur Inokulationslösung hinzufügen und langsam vermischen. Vermeiden, dass der CO₂-Verteiler mit der Flüssigkeit in Kontakt kommt.
  13. Im Abzug die Verschlüsse der Inkubationsröhrchen entfernen und die Röhrchen nach Inkubationszeit in separate Gestelle sortieren. Die Vorinkubations-Halte-Röhrchen öffnen, um die Übertragung der Objektträger vorzubereiten (siehe 1.1.2).
  14. Nacheinander jeweils ein Vorinkubations-Halte-Röhrchen zufällig auswählen und mit einer Pinzette die montierten Objektträger in das entsprechende Inkubationsröhrchen überführen (siehe 1.1.3). Jedes Inkubationsröhrchen mit den montierten Objektträgern in ein kleines Probengestell stellen und das Vorinkubations-Halte-Röhrchen beiseitestellen.
    ANMERKUNG: Die Schritte 4.14–4.15 sollten von zwei Personen durchgeführt werden. Wenn möglich, die Abkühlung der Pansenflüssigkeits-Puffer-Mischung minimieren.
  15. 30 mL Inokulationslösung in eine 60-mL-Spritze mit einer stumpfen, großlumigen Nadel aufziehen. Die Lösung langsam an der Innenseite des Inkubationsröhrchens entlang ausbringen, das Röhrchen etwa 20 Sekunden mit CO₂ spülen, verschließen und ins Gestell zurückstellen.
  16. Die Gestelle mit den beimpften Röhrchen in ein 39 °C warmes Wasserbad stellen. Die Röhrchen mindestens einmal täglich vorsichtig schwenken und die Position der Gestelle täglich wechseln, um ungleichmäßige Erwärmung zu minimieren.
    ANMERKUNG: Die Bildung von Gasblasen in den Röhrchen weist auf eine aktive Fermentation hin.
  17. Am Ende jeder Inkubationszeit das entsprechende Gestell aus dem Wasserbad entnehmen. Jeweils ein Röhrchen öffnen, jeden Objektträger entnehmen und vorsichtig mit ultrareinem Wasser von Feststoffen und restlicher Inokulationslösung abspülen.
  18. Die gespülten Objektträger in die Post-Inkubations-Lagerungsgefäße mit der in Schritt 1.1.4 beschriebenen Glycerin-Wasser-Mischung geben.

5. Querschnittsfärbung für Lignin

  1. Wenn die Objektträger in einer 50:50-Glycerin-Wasser-Mischung aufbewahrt wurden, überführen Sie beide Objektträger mit den montierten Querschnitten in Vorwaschröhrchen, die die Ethanol-Ultrapure-Wasser-Lösung enthalten (siehe 1.1.5). Lagern Sie die Röhrchen über Nacht im Kühlschrank, um das Glycerin vor der Färbung zu entfernen.
  2. Stellen Sie eine 3 %ige Phloroglucinol-Lösung (PG) her, indem Sie 0,3 g PG in 10 mL absolutem Ethanol in einem 25 mL-Erlenmeyerkolben auflösen, der mit Aluminiumfolie umwickelt ist, um das lichtempfindliche Reagenz vor Lichteinfluss zu schützen. Verschließen und beschriften Sie den Kolben mit dem Namen der Lösung, dem Herstellungsdatum und dem Namen des Herstellers und lagern Sie ihn bei 20 °C.
  3. Nehmen Sie die Objektträger aus den gekühlten Röhrchen und überführen Sie sie vorübergehend in die in Schritt 1.1.6 beschriebenen Befeuchtungsröhrchen, die 100 % Ultrapure-Wasser enthalten.
    ANMERKUNG: Halten Sie die Querschnitte während der Handhabung feucht, um eine Oxidation zu minimieren, die die Schnitte beschädigen und die anschließende Bildgebung beeinträchtigen kann.
  4. Stellen Sie die Wiesner-Färbung im Abzug unter Verwendung eines Pipettiergeräts her, indem Sie 50 μL der 3 %igen PG-Lösung in Ethanol (siehe 5.2) mit 25 μL Salzsäure (HCl) in einem 50 mL-Becherglas mischen.
    ANMERKUNG: Passen Sie die Mengen an die Anzahl der Objektträger an, wobei das Verhältnis von PG zu HCl stets 2:1 betragen muss.
    ACHTUNG: Handhaben Sie Salzsäure im Abzug, da sie metallkorrosiv ist, schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen kann und Atemwegsreizungen hervorrufen kann. Vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen oder Aerosolen, tragen Sie geeignete Schutzhandschuhe, Schutzkleidung, Augen- und Gesichtsschutz und waschen Sie die Haut nach der Handhabung gründlich.
  5. Nehmen Sie einen Objektträger aus dem Röhrchen und tupfen Sie vorsichtig das Glas um das doppelseitige Klebeband mit einem fuselfreien Tuch ab, um zu verhindern, dass die Färbung vom Band abläuft. Legen Sie den Objektträger auf ein kleines Plastiktablett und geben Sie mithilfe einer Pipette mehrere Tropfen Wiesner-Färbung über die Querschnitte. 
  6. Stellen Sie einen Timer auf 12 Minuten und decken Sie die Objektträger mit Aluminiumfolie ab, um sie vor Licht zu schützen. Überprüfen Sie die Querschnitte während der Färbung und tragen Sie die Färbung bei Bedarf erneut auf, um Austrocknung zu verhindern.
    ANMERKUNG: Verhindern Sie das Austrocknen der Querschnitte, da eine Oxidation das Gewebe beschädigen und die anschließende Bildgebung beeinträchtigen kann.
  7. Nach 12 Minuten entfernen Sie vorsichtig überschüssige Wiesner-Färbung mit einem fuselfreien Tuch. Spülen Sie das Gewebe vor der Montage ab, um die Belastung der Mikroskop-Objektivlinse mit korrosiven HCl-Dämpfen zu minimieren.
  8. Geben Sie 1–2 Tropfen einer 50 %igen Glycerin-Ultrapure-Wasser-Lösung auf jeden Querschnitt und decken Sie ihn mit einem Deckglas (24 mm × 30 mm, Dicke Nr. 1,5) ab. Führen Sie anschließend unverzüglich die mikroskopische Analyse und Bildaufnahme durch.
    ANMERKUNG: Erstellen Sie die Aufnahmen innerhalb von 6–8 Stunden, da die Wiesner-Färbung zeitabhängig ist und sich im Laufe der Zeit gelb färben und von der Schnittfläche diffundieren kann.

6. Querschnittsfärbung für Pektin

  1. Folgen Sie Schritt 5.1, um die Glycerin-Ultrapure-Wasser-Mischung von den gelagerten Objektträgern vor der Färbung zu entfernen.
  2. Stellen Sie eine 0,02 %ige Rutheniumrot-Lösung her, indem Sie 0,02 g Rutheniumrot in 100 mL Ultrapure-Wasser in einem 125 mL Erlenmeyerkolben auflösen, der mit Aluminiumfolie umwickelt ist, um das lichtempfindliche Reagenz vor Lichteinfluss zu schützen. Verschließen und beschriften Sie den Kolben mit dem Namen der Lösung, dem Herstellungsdatum und dem Namen des Herstellers, und lagern Sie ihn bei 20 °C.
  3. Nehmen Sie die Objektträger aus den gekühlten Ethanol-Ultrapure-Wasser-Röhrchen und überführen Sie die korrekt beschrifteten Objektträger mit den montierten Schnitten in Röhrchen mit 100 % Ultrapure-Wasser (siehe 1.1.6) zur vorübergehenden Aufbewahrung.
    ANMERKUNG: Beachten Sie die Hydratationsvorkehrungen gemäß Schritt 5.3.
  4. Entnehmen Sie einen Objektträger mit einer Pinzette aus dem Ultrapure-Wasser und tupfen Sie das Wasser um das Klebeband mit einem fusselfreien Tuch ab, um ein Überschwemmen der Färbung auf das Glas zu verhindern. Legen Sie den Objektträger auf ein kleines Plastiktablett.
  5. Geben Sie mehrere Tropfen der Rutheniumrot-Lösung (siehe 6.2) auf, um die Querschnitte gleichmäßig zu bedecken. Bedecken Sie die Objektträger mit Aluminiumfolie für 10 min, um sie vor Lichteinfluss zu schützen, und spülen Sie die Färbung anschließend vorsichtig 2 min lang mit Ultrapure-Wasser ab.
  6. Tupfen Sie überschüssiges Wasser vom Objektträger ab und geben Sie 1–2 Tropfen 50 %iges Glycerin-Ultrapure-Wasser über jeden Querschnitt. Bedecken Sie die Querschnitte mit einem 24 mm × 30 mm Deckglas (Dicke Nr. 1,5) und führen Sie anschließend die mikroskopische Analyse und Bildaufnahme durch.
    ANMERKUNG: Führen Sie die mikroskopische Analyse am selben Tag durch, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

7. Hellfeldmikroskopie

  1. Untersuchen Sie die Querschnitte unter Hellfeldbeleuchtung mit einem Mikroskop bei 10×, 20× und 40× Vergrößerung. Siehe Tabelle 1 für Parameter und Einstellungen zur Bildaufnahme.

Ergebnisse

Die Verwendung von Zentrifugenröhrchen zur Simulation von Pansenbedingungen ermöglichte eine relativ schnelle und kostengünstige Durchführung in vitro Verdauung von Medicago sativa Stängelquerschnitte. Unter Verwendung eines Schiebeschnittmikrotoms 100 μm– dicke Querschnitte von M. sativa Stämme wurden hergestellt (Abbildung 1A). Die Stängelquerschnitte wurden mit doppelseitigem Klebeband auf Objektträger befestigt (Abbildung 1B) und in eine Pansenflüssigkeits-Inokulationslösung zur Inkubation für Zeiträume von 4 h bis 96 h eingetaucht (Abbildung 1C). Für das in vitro Inkubation, verschlossene Einweg-Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 50 mL wurden als Inkubationsgefäße verwendet und mit 0,2 g eines auf 1 mm zerkleinerten Maisstängel-Substrats versetzt, um die Pansenmikroorganismen während der gesamten Inkubationsdauer zu versorgen. Die Röhrchen wurden in einem Wasserbad inkubiert, das auf einer konstanten Temperatur gehalten wurde 39 °C (Abbildung 1D). Die aktive Fermentation durch Pansenmikroorganismen wurde visuell durch die Bildung von Gasblasen in der Inokulationslösung bestätigt. Die für dieses Protokoll benötigten Materialien sind in der Regel in nasschemischen Laboratorien verfügbar. Doppelseitiges Klebeband verhinderte keinen Gewebeabbau während der Exposition gegenüber Pansensaft, hielt jedoch die nach der Verdauung verbliebenen Stängelanteile fest und ermöglichte anschließende Färbung und mikroskopische Visualisierung.

Stammquerschnitte, die keiner in vitro-Inkubation unterzogen wurden (0 h), ermöglichten die Visualisierung der anfänglichen Zellwandbestandteile in verschiedenen Stammgeweben. Mit Wiesner-Färbung behandelte Querschnitte zeigten Gewebe mit ligninassoziiierter Färbung (Abbildung 2A–E), während mit Rutheniumrot gefärbte Querschnitte Gewebe mit pektinassoziiierter Färbung hervorhoben (Abbildung 3A–E). In mit Wiesner-Färbung behandelten Schnitten zeigten reife primäre Phloemfasern fuchsine Färbung (Abbildung 2B–E). Xylemgefäße und interfazikuläres Xylem zeigten ebenfalls fuchsine Färbung (Abbildung 2B–D). Rutheniumrot-Färbung wurde in der Epidermis, im Kollenchym, im Chlorenchym, im sekundären Phloem (Abbildung 3B–E) und im Mark (Abbildung 3B–D) beobachtet. Einige Bereiche des interfazikulären Xylems und der primären Phloemfasern färbten sich ebenfalls mit Rutheniumrot (Abbildung 3B–E). Vollständige Stammquerschnitte wurden durch Zusammensetzen eines 5 × 5-Rasters von Bildern, die bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurden, visualisiert (Abbildung 2A und Abbildung 3A). Zusätzliche Bilder eines Bereichs des Stammquerschnitts wurden bei 10-facher (Abbildung 2B und Abbildung 3B), 20-facher (Abbildung 2C und Abbildung 3C) und 40-facher Vergrößerung oberhalb (Abbildung 2D und Abbildung 3D) und unterhalb (Abbildung 2E und Abbildung 3E) des vaskulären Kambiums aufgenommen.

Wiesner-gefärbte Gewebe von M. sativa-Stängelquerschnitten waren in allen in vitro-Inkubationen von 0 h bis 96 h sichtbar (Abbildung 4A–F). Bei 0 h wiesen alle Zellen klare Begrenzungen auf (Abbildung 4A). Nach 8 h zeigten sich erste Anzeichen des Gewebeabbaus durch unscharfe Zellränder bei Zellen mit dünnen, nicht lignifizierten (d. h. ungefärbten) Zellwänden (z. B. Kollenchym) sowie durch das Verschwinden einzelner Zellen (z. B. sekundäres Phloem). Nach 24 h trat die spiralförmige dreidimensionale Struktur der Xylemgefäße deutlicher hervor, da die umgebenden Gewebe abgebaut wurden (Abbildung 4D). Nach 24 h degradierten ungefärbte Zellen fortschreitend und verschwanden (Abbildung 4D–F). Mit fortschreitendem Gewebeabbau führte der Verlust anatomischer Stabilität zum seitlichen Kollaps der ungefärbten Epidermis, wodurch bei 24, 48 und 96 h der Eindruck eines Bandes aus dünnen, transparenten Zellen entstand (Abbildung 4D–F).

In-vitro-Inkubation von Querschnitten der M. sativa-Stängel, gefolgt von einer Färbung mit Rutheniumrot, ermöglichte die Visualisierung pektinassoziiierter Färbungen in Stängelgeweben nach 0–96 h Exposition gegenüber Pansensaft (Abbildung 5A–F). Zwischen 0 und 4 h deuten scharfe Zellränder darauf hin, dass alle Zellen intakt waren (Abbildung 5A,B). Mit fortschreitender Inkubationszeit bis zu 8 h verloren Gewebe mit dünnen, nicht verholzten Zellwänden in der Rinde, einschließlich Kollenchym, Chlorenchym und sekundärem Phloem, zunehmend ihre strukturelle Integrität, was zur Unschärfe der Zellränder führte (Abbildung 5C). Nach 24, 48 und 96 h fehlte ein Großteil des umgebenden kortikalen Gewebes, während Teile der Epidermis, des interfascikulären Xylems, des Markgewebes und der Gefäßgewebe weiterhin sichtbar blieben (Abbildung 5D–F). Der Verlust der umgebenden anatomischen Struktur ging mit einem seitlichen Kollaps des epidermalen Bereichs einher. Nach 96 h war deutlich weniger rutheniumrotgefärbtes Gewebe vorhanden als zu früheren Inkubationszeitpunkten (Abbildung 5F). Insgesamt ging der fortschreitende Verlust von Stängelgewebe während der Inkubation mit einer Abnahme der Zellen einher, die positiv auf die Rutheniumrot-Färbung reagierten. Der Abbau und das Verschwinden dünner, nicht verholzter und pektinassoziiierter Zellen waren erwartet, da Pektin im Laufe der Zeit leicht abgebaut wird.

Gewebeschnitte am Mikrotom, Objektträgerpräparation, Suspensionkultur, Fermentationsaufbau.
Abbildung 1: in vitro Inkubation von Querschnitten der Alfalfa-Stängel (A) Alfalfa-Stengelabschnitte wurden zwischen zwei Stücken extrudierten Polystyrol-Hartschaum-Isoliermaterials geklemmt und auf einer Schiebemikrotomvorrichtung zur Querschnittsherstellung montiert. (B) Vier Querschnitte, jeweils 100 μm dick, wurden mit doppelseitigem Klebeband auf einem Objektträger befestigt für in vitro Inkubation und histologische Färbung. (CZwei Glasobjektträger wurden rückseitig aneinandergefügt, wobei das doppelseitige Klebeband nach außen zeigte, in ein 50-mL-Reagenzglas mit 30 mL Pansensaft-Puffer-Inokulumlösung und 0,2 g 1-mm-gemahlenem Maisstängel gegeben. Das Gefäß wurde mit CO₂ gespült und verschlossen, um es anschließend zu inkubieren. Gasblasen an der Wand des Reagenzglases wiesen auf eine aktive Fermentation durch Pansenmikroorganismen während der Inkubation hin.D) Gestelle mit den 50-mL-Röhrchen wurden in einem 39 °C Wasserbad während der gesamten Inkubation. Der Wasserstand bedeckte die Inokulationslösung, blieb jedoch unterhalb der Röhrenöffnungen, um ein Eindringen von Wasser in die Röhrchen zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Schnittbild der Pflanzenachse; Xylem, Phloem beschriftet; zelluläre Struktur, Gewebe sichtbar.
Abbildung 2: Wiesner-Färbung von Alfalfa-Achsengeweben zeigt die Verteilung lignifizierter Zellwandbestandteile. (A–E) Ungedüngte Querschnitte der Alfalfa-Achse (Inkubationszeit = 0 h) dienten als Ausgangsreferenz zur Identifizierung von Achsengeweben mit Wiesner-Färbung. Xylemgefäße (XV), interfaskikuläres Xylem (ifX) und reife primäre Phloemfasern (PP) färbten sich fuchsinfarben. Vergrößerungen und Maßstäbe: (A) 5 × 5 Raster zusammengesetzter Bilder mit 10× Vergrößerung, Maßstab = 500 μm; (B) 10×, Maßstab = 500 μm; (C) 20×, Maßstab = 250 μm; (D, E) 40×, Maßstäbe = 150 μm. Abkürzungen: Xy = Xylem; Ct = Kortex; Pi = Mark; Ep = Epidermis; Co = Kollenchym; Ch = Chlorenchym; SP = sekundäres Phloem; XV = Xylemgefäße; ifX = interfaskikuläres Xylem; PP = reife primäre Phloemfasern. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzusehen.

Mikroskopische Aufnahmen von pflanzlichen Stängelquerschnitten mit Darstellung der Gefäßbündel, Xylem, Phloem und Markdetails.
Abbildung 3: Die Färbung mit Rutheniumrot zeigt die Verteilung pektischer Polysaccharide in den Zellwänden von Luzernestängeln. (A–E) Querschnitte unverdauter Luzernestämme (Inkubationszeit = 0 h) dienten als Ausgangsreferenz zur Identifizierung der Stängelgewebe, die eine Färbung mit Rutheniumrot aufwiesen. Epidermis (Ep), Kollenchym (Co), Chlorenchym (Ch), sekundäres Phloem (SP) und Mark (Pi) zeigten eine rote Färbung. Auch sekundäres Xylem (SX) und reifes primäres Phloem (PP) wiesen eine Färbung auf, während Xylemgefäße (XV) vergleichsweise ungefärbt blieben. Vergrößerungen und Maßstäbe: (A) 5 × 5 Raster zusammengesetzter Bilder mit 10× Vergrößerung, Maßstab = 500 μm; (B) 10×, Maßstab = 500 μm; (C) 20×, Maßstab = 250 μm; (D, E) 40×, Maßstäbe = 150 μm. Abkürzungen: Xy = Xylem; Ct = Rinde; Pi = Mark; Ep = Epidermis; Co = Kollenchym; Ch = Chlorenchym; SP = sekundäres Phloem; XV = Xylemgefäße; SX = sekundäres Xylem; PP = reifes primäres Phloem. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Mikroskopaufnahmen von Pflanzenquerschnitten zur Analyse des Gefäßgewebes mit Hervorhebung der Xylemzellen.
Abbildung 4: Veränderungen in den Stängelgeweben von Luzerne nach in vitro-Inkubation und Wiesner-Färbung. Querschnitte von Luzernenstängeln derselben Internodien wurden in vitro mit Pansenflüssigkeit über einen Zeitraum von (A) 0 h, (B) 4 h, (C) 8 h, (D) 24 h, (E) 48 h und (F) 96 h inkubiert. Xylemgefäße (XV), interfazikuläres Xylem (ifX) und reife primäre Phloemfasern (PP) behielten während der gesamten Inkubationsdauer die Wiesner-Färbung bei. Eine schwache Färbung des ifX wurde in unreifen Stängelgeweben beobachtet. Mit zunehmender Inkubationsdauer verloren die umgebenden Gewebe schrittweise ihre strukturelle Integrität, wodurch die verbliebenen gefärbten Gefäßstrukturen zunehmend deutlicher sichtbar wurden. Maßstabsbalken = 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.

Mikroskopische Aufnahmen von Querschnitten pflanzlicher Stängel; Gefäßgewebestruktur; biologische Untersuchung.
Abbildung 5: Veränderungen in den Stängelgeweben von Luzerne nach in vitro-Inkubation und Färbung mit Rutheniumrot. Querschnitte von Luzernenstängeln derselben Internodien wurden in vitro mit Pansenflüssigkeit für (A) 0 h, (B) 4 h, (C) 8 h, (D) 24 h, (E) 48 h und (F) 96 h inkubiert. Die Färbung mit Rutheniumrot war in mehreren Stängelgeweben sichtbar, während die Xylemgefäße (XV) vergleichsweise ungefärbt blieben. Mit zunehmender Inkubationsdauer zeigte sich ein fortschreitender Verlust der Gewebestruktur sowie der Färbung mit Rutheniumrot. Teile der Xylemgefäße, des interfascikulären Xylems (ifX) und der Epidermisregion (Ep) blieben zu späteren Zeitpunkten der Inkubation sichtbar. Maßstabsbalken = 250 μm. Klicken Sie bitte hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.

ParameterEinstellung
Schnell (Fokus)2000 × 1328
Qualität (Aufnahme)2000 × 1328
FarbmodusRGB-Farbe
Farbtiefe8 Bit pro Kanal
Effektive Farbtiefe24-Bit-RGB (8-Bit-R + 8-Bit-G + 8-Bit-B)
Verstärkung2
Belichtungszeit bei 10facher Vergrößerung (ms)30
Belichtungszeit bei 20facher Vergrößerung (ms)50
Belichtungszeit bei 150facher Vergrößerung (ms)150

Tabelle 1: Mikroskop- und Kameraeinstellungen für die Bildaufnahme. Mikroskop-, Kamera- und Bildaufnahmeeinstellungen, die für die Hellfeldmikroskopie mit einem aufrechten Mikroskop ausgestattet mit einer digitalen Farbkamera und Bildverarbeitungssoftware verwendet wurden.

Diskussion

Das im vorliegenden Studium verwendete Luzernematerial bestand aus Klonen von fünf Luzernenlinien. Zwei experimentelle Linien wurden nach zwei Zyklen divergenter Selektion hinsichtlich der in vitro-Neutraldetergenzienfaserverdaulichkeit (IVNDFD) aus Mutterpflanzen ausgewählt, die entweder eine niedrige IVNDFD nach 16 h und 96 h oder eine hohe IVNDFD nach 16 h und 96 h aufwiesen12. Drei kommerzielle Linien mit unbekanntem genetischem Hintergrund wurden ebenfalls in die Studie einbezogen, und Mutterpflanzen wurden basierend auf einer Nahinfrarotspektroskopie-Analyse ausgewählt, um Individuen mit (a) dem höchsten Ligningehalt, (b) dem niedrigsten Ligningehalt und (c) dem niedrigsten Gehalt an Neutraldetergenzienfaser und Säuredetergenzienfaser zu identifizieren. Die fünf Luzernenlinien wurden im Mai 2021 aus einem Gewächshaus in wiederholte Feldversuche an zwei Standorten in Minnesota, USA, umgesetzt. Für die erste und zweite Mahd jeder Wachstumssaison wurden jeweils 10 Stängel jeder Luzernenlinie in den Reifestadien vegetativ, frühes Knospenstadium, frühe Blüte, Blüte und grüne Schote geerntet. Das siebte Internodium von der Basis jedes Stängels wurde herausgeschnitten und in ein 50-mL-Gefäß mit einer 50:50-Mischung aus 200-Proof-Ethanol und ultrareinem Wasser zur Lagerung bis zur Querschnittsinkubation gegeben. Diese Methode wurde auf der Grundlage früherer Arbeiten der Laborgruppe aus den 1990er Jahren entwickelt, bei denen das siebte Internodium als Untersuchungseinheit gewählt wurde4,6.

In-vitro-Inkubation mit Pansenflüssigkeit und histologische Färbung von Luzernestämmen wurden verwendet, um Einblicke in die Muster der Ablagerung von Zellwandbestandteilen in abgebauten Stängelgeweben zu erhalten. Die in-vitro-Inkubationen simulierten das Ausmaß des Abbaus, dem ein Luzernestängel im Pansen unterliegt, und anschließende histologische Färbungen machten Lignin und Pektin in Zellen sichtbar, in denen diese Zellwandbestandteile nach einer zeitlich begrenzten mikrobiellen Verdauung noch nachweisbar blieben. Der Einsatz eines Gleitschneidmikrotoms gewährleistete eine standardisierte Dicke der Querschnitte, um Schnittartefakte zu minimieren, die die Ergebnisse beeinträchtigen könnten13. Obwohl im vorliegenden Protokoll nur Lignin und Pektin untersucht wurden, können alternative Färbeverfahren wie Toluidinblau, Astra-Blau und Direct Red 23 ebenfalls zur histologischen Färbung dieser und anderer Zellwandbestandteile verwendet werden14,15,16. Zusätzlich kann polarisiertes Licht zur Detektion von Cellulose in Zellwänden eingesetzt werden, und fluoreszierende Reagenzien wie Safranin O können Lignin17 sowie Zellwandpolysaccharide sichtbar machen. Darüber hinaus können Antikörper zur Markierung spezifischer Pektine verwendet werden18. Über Luzerne hinaus könnte dieses Protokoll auf andere Arten angewendet werden. Die Färbereaktionen können jedoch je nach Art, Genotyp, Entwicklungsstadium und Umweltbedingungen variieren19.

Die Verwendung von kostengünstigem doppelseitigem Klebeband, um Stängelquerschnitte auf Objektträgern zu befestigen, wurde bereits früher beschrieben6,20. Bevor dieses in vitro-Inkubationsprotokoll begonnen wurde, musste ein doppelseitiges Klebeband identifiziert werden, das mehrere Tage lang der Eintauchung in Flüssigkeit standhielt und leicht erhältlich war. Verschiedene Klebebandtypen, die sich in ihrem vorgesehenen industriellen Einsatz und ihrer Dicke unterschieden, wurden geprüft. Kurz gesagt, wurden 2,5 cm lange Stücke doppelseitigen Klebebands und Stängelquerschnitte auf Objektträger aufgebracht und über einen Zeitraum von einer Woche für unterschiedliche Dauer in Wasser eingetaucht, um zu überprüfen, ob sie weiterhin am Objektträger hafteten. Einige doppelseitige Klebebänder lösten sich von den Objektträgern, während andere nach längerer Flüssigkeitsbelastung undurchsichtig wurden. Der Verlust der Transparenz des Klebebands störte die Mikroskopie und verhinderte die Aufnahme hochwertiger Bilder der Stängelquerschnitte. Ein Vinyl-Doppelseitklebeband zeigte unter den getesteten Klebstoffen die beste Leistung. Das im ursprünglichen Experiment verwendete Klebeband war in den 1990er Jahren gekauft worden und blieb wirksam; für nachfolgende Experimente konnte dasselbe Produkt jedoch nicht mehr beschafft werden. Daher sollte das ausgewählte Klebeband vor der Anwendung getestet werden, um sicherzustellen, dass sowohl das Klebeband als auch die Querschnitte während des gesamten Inkubationszeitraums fest haften bleiben. Das Klebeband sollte außerdem transparent bleiben, um die Aufnahme hochwertiger Bilder zu ermöglichen.

Der in vitro-Inkubationsabschnitt des Protokolls umfasste mehrere zeitaufwändige Schritte, die sorgfältige Planung und Abstimmung erforderten. Die Gesamtdauer des in vitro-Inkubationsverfahrens kann je nach Umfang des Experiments variieren. Um beispielsweise einen aussagekräftigen Datensatz von Stängelquerschnitten zu erhalten, wurden pro Probe × in vitro-Inkubationsintervall × Färbekombination jeweils vier eindeutige Alfalfa-Stängel pro Objektträger montiert. Bei 16 Proben, sechs Inkubationsintervallen und zwei Färbeverfahren waren für jeden in vitro-Inkubationsdurchlauf insgesamt 768 Stängelquerschnitte erforderlich. Für die Herstellung der 768 Querschnitte wurden etwa 8 h benötigt; danach konnten diese über Nacht in Petrischalen mit ultrareinem Wasser aufbewahrt und am folgenden Tag montiert werden. Vor dem Montieren mussten 192 Objektträger und 96 Zentrifugenröhrchen (50 mL) beschriftet werden. Das Montieren der Querschnitte erforderte weitere 8 h, da die Schnitte über alle Inkubationsintervalle und Färbungen hinweg einheitlich ausgerichtet wurden, um den Vergleich der Stängelgewebe zu erleichtern. Dieser Ansatz beanspruchte mehr Zeit als eine zufällige Anordnung der Querschnitte. Die präparierten Objektträger wurden über Nacht in ultrareinem Wasser gelagert, bevor am nächsten Tag die in vitro-Inkubation begann. Während die Querschnitte der Alfalfa-Stängel hergestellt und montiert wurden, musste gleichzeitig McDougall-Puffer vorbereitet werden. Der Puffer konnte höchstens zwei Tage vor Beginn der in vitro-Inkubation hergestellt werden und musste vor der Inokulation der montierten Querschnitte auf 39 °C erwärmt werden. Daher waren sorgfältige Planung und Vorbereitung für die erfolgreiche Durchführung des Protokolls unerlässlich.

Die Wiesner-Färbung wird häufig verwendet, um ligninassoziierte Strukturen in Pflanzengeweben sichtbar zu machen. Obwohl diese Färbemethode relativ einfach21 und hinreichend spezifisch22 ist, färbt sie Cinnamaldehyd-Endgruppen, die mit Guaiacyl-(G)-Lignineinheiten assoziiert sind13. Bei dikotylen Angiospermen wie Luzerne sind G- und Syringyl-(S)-Einheiten die Hauptbestandteile des Ligninpolymeren, obwohl auch H-ringförmige Untereinheiten vorhanden sind. Die Wiesner-Färbung könnte daher den Gesamtligningehalt im Stängel unterschätzen, da sie nicht mit S-Lignin reagiert. Sowohl G- als auch S-Einheiten können in interfazischem Xylem und primären Phloemfasern (d. h. Sklerenchymgeweben) vorkommen; daher kann, obwohl S-Einheiten nicht mit der Wiesner-Reaktion ansprechen, die Anfärbung der G-Einheiten dennoch das Vorhandensein ligninassoziiierter Strukturen in diesen Geweben anzeigen. Die Mäule-Färbung könnte verwendet werden, um S-Einheiten sichtbar zu machen und eine vollständigere Darstellung der Lignineinheiten im Stängel zu liefern13. Unterschiede in der Intensität der Rutheniumrot-Färbung von Pektin können ebenfalls auftreten, abhängig vom Veresterungs- oder Deesterifizierungszustand der Pektinsäure23. Die Färbung kann von einem gelb-orangenen Ton bis zu einem leuchtend roten Farbton reichen. Da Rutheniumrot mit mehreren Kohlenhydraten interagieren kann, könnte die Verwendung dieser Färbung zu einer Überschätzung des Pektins in Geweben führen11. Da der Ligninanteil mit zunehmender Reife des Luzernestängels ansteigt, könnte Lignin auch die Pektinfärbung in älteren Stängeln stören. Unterschiede zwischen Farbnuancen einer bestimmten Färbung können visuell schwer zu unterscheiden sein; hier könnten jedoch Bildanalysetechnologien helfen, diese Einschränkung zu überwinden.

Nach der in vitro-Inkubation mit Pansenflüssigkeit und histologischen Färbung können Querschnitte von Stämmen unter dem Mikroskop sichtbar gemacht und Bilder für die anschließende Analyse aufgenommen werden. Da die Wiesner-Färbung innerhalb von 24 Stunden verblassen kann9, sollte die Hellfeld-Mikroskopie von Stämmen, die auf Lignin gefärbt wurden, am selben Tag wie die Färbung durchgeführt werden, idealerweise innerhalb von 6–8 Stunden, um eine konsistente Färbung über alle Bilder hinweg sicherzustellen. Die Färbung mit Rutheniumrot behält ihre Intensität im Laufe der Zeit bei; daher ist die Bildaufnahme am selben Tag weniger kritisch. Dennoch wurden auch die mit Rutheniumrot gefärbten Bilder aus Gründen der Konsistenz innerhalb von 6–8 Stunden aufgenommen. Die Bilder wurden mit einer hochauflösenden digitalen Farbmikroskopkamera mit großformatigem CMOS-Bildsensor aufgenommen. Dieselben Einstellungen für Belichtungszeit, analoge Verstärkung, Farbtiefe, Bildqualität und Fokus wurden verwendet, um die Vergleichbarkeit der Bilder sicherzustellen und Variationen, die durch unterschiedliche Aufnahmeeinstellungen entstehen könnten, zu minimieren. Die Belichtungszeit wurde je nach Vergrößerung (10×, 20× und 40×) angepasst, um Über- oder Unterbelichtung zu vermeiden und qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen. Daher sollten Vergleiche nur zwischen Bildern derselben Vergrößerung angestellt werden, um Variationen aufgrund unterschiedlicher Belichtungseinstellungen zu minimieren. Die Aufnahmeeinstellungen müssen möglicherweise je nach verwendeter Mikroskop- und Kameraausrüstung angepasst werden (Tabelle 1). Andere Mikroskopietechniken, einschließlich Rasterelektronenmikroskopie6,20 und Fluoreszenzmikroskopie14,15,17, wurden ebenfalls zur Visualisierung von Zellwandbestandteilen verwendet, obwohl im vorliegenden Protokoll die Hellfeldmikroskopie angewandt wurde.

Dieses Protokoll erzeugte einen umfangreichen Datensatz an Querschnittsbildern von Stämmen (>15.000), der genutzt werden könnte, um die in diesem Protokoll mithilfe histologischer Färbungen gewonnenen qualitativen Informationen durch quantitative Analysen unter Verwendung von Technologien des maschinellen Lernens zu erweitern. Effiziente Bildanalyse-Pipelines können die Extraktion quantitativer Daten aus Bildern automatisieren und beschleunigen. Eine Zusammenarbeit mit Informatikern kann die Entwicklung von Werkzeugen zur Vorverarbeitung der Bilder, zur Entfernung störender Artefakte und zur Extraktion relevanter Merkmale zur Prüfung mehrerer Hypothesen erleichtern. Ansätze des maschinellen Lernens erfordern geeignete Trainings- und Testdatensätze ausreichender Größe, um eine robuste Modellleistung sicherzustellen. Kleinere Datensätze können mit einfacheren Bildanalyseverfahren ausgewertet werden, beispielsweise durch manuelle Messung interessierender Merkmale mit Bildanalyse-Software wie ImageJ24 oder mit der Bildanalyse-Software des Mikroskops25. Daher kann die Berücksichtigung der geplanten nachgelagerten Nutzung der Bilder die Effizienz bei der Entscheidung über Art und Anzahl der aufzunehmenden Bilder sowie über den anschließenden analytischen Ansatz verbessern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als möglicher Interessenkonflikt aufgefasst werden könnten. Der Hinweis auf Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium (USDA). Das USDA ist ein Arbeitgeber und Anbieter, der Chancengleichheit gewährleistet. Alle Experimente wurden im Einklang mit den geltenden Gesetzen der Vereinigten Staaten, dem Land, in dem sie durchgeführt wurden, durchgeführt.

Danksagungen

Die Autoren danken R. Ted Jeo für seine Einblicke in frühere verwandte Arbeiten. Vielen Dank gilt dem University Imaging Center der University of Minnesota – Twin Cities für den Zugang zu Mikroskopie-Bildaufnahme- und Analyse-Software zur Vorbereitung der Bilder für die Veröffentlichung. Diese Arbeit wurde vom United States Department of Agriculture – Agricultural Research Service [062-21500-001-000D] und der nicht fördernden Kooperationsvereinbarung (Nr. 58-5062-2-016) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AlufolieBoardwalk7106BW18 in × 1.000 ft; zum Schutz lichtempfindlicher Färbemittel vor Licht
Calciumchlorid-Dihydrat, min. 99 %Sigma Life ScienceC7902-500GCAS-Nr. 10035-04-8; Reagenz für McDougall’s Puffer
Kamera-SoftwareNikonNIS-Elements AR 5.42.0464-Bit-Bildgebungssoftware zur Bildaufnahme und -analyse
Kohlenstoffdioxid-GasMathesonUN1013Technische Qualität; zur Aufrechterhaltung anoxischer Bedingungen während der Vorbereitung und Inkubation
Umwälz-WasserbadPrecision—Temperaturgesteuertes Umwälz-Wasserbad zur Aufrechterhaltung der Proben bei 39 °C
Getreidestängel-StandardUniversity of MinnesotaNAIm Herbst 2023 in St. Paul, Minnesota, USA, geerntet; auf 1 mm zerkleinert und als mikrobielles Substrat verwendet
DeckgläserThermo Scientific341924 mm × 30 mm, Dicke Nr. 1,5, 1 oz
Digital Sight 10 Farbmikroskopkamera mit FX Großformat-CMOS-BildsensorNikonMQA20000Digitale Farbkamera zur Aufnahme von Hellfeld-Mikroskopiebildern
PräparationsmikroskopNikonSMZ18Stereo-Mikroskop zur Ausrichtung und Positionierung von Stängelquerschnitten
Doppelseitiges KlebebandSelloTape Office Vinyl Doppelseitiges Klebeband42702 mm × 53 m; zum Befestigen von Stängelquerschnitten auf Objektträgern
Elektronische WaageANDGH-202Analytische Waage mit vier Dezimalstellen Genauigkeit
Erlenmeyerkolben (125 mL)Kimax25600125-mL-Kolben; kompatibel mit Stopfen Nr. 5
Erlenmeyerkolben (25 mL)Pyrex498025-mL-Kolben; kompatibel mit Stopfen Nr. 0
Äthanol (200 Proof)Fisher Scientific04-355-720Absolute Ethanol zur Herstellung von Färbemitteln und Vorbehandlungs-Spüllösungen
Extrudierter Polystyrol-Hartschaum-DämmstoffOwens Corning14077881 in × 2 ft × 2 ft, R-5, 15 PSI-Schaumplatte; zur Unterstützung von Stängelabschnitten während der Schnittvorbereitung
PinzettenFisher Scientific10-316ALaborpinzetten zum Handhaben von Stängelabschnitten, Objektträgern und montierten Schnitten
GlasobjektträgerFisherBrand12550325 mm × 75 mm × 1 mm; zur Montage von Stängelquerschnitten
Rundkolben (6 L)PyrexCLS43205L-4EA6-L-Glaskolben zur Herstellung oder Handhabung größerer Lösungsmengen
Glycerin, laborrein, flüssigFisher Science Education525342CCAS-Nr. 56-81-5; Glycerol in Montage- und Lagerlösungen
Doppellagiges Tüllgewebe der Klasse 50JINIOHEE ShopB0FL27KXRN100 % Baumwolle, gebleicht weiß; zur Filtration von Pansenmaterial und Pansenflüssigkeit
Messzylinder (10 mL)Pyrex70002410-mL-Messzylinder zur Volumenmessung von Flüssigkeiten
SalzsäureFisherA1445-500CAS-Nr. 7647-01-0; zur Herstellung der Wiesner-Färbung mit Phloroglucinol
Industriemarker, extra permanentSharpie13601Feinspitze; zur wasserfesten Kennzeichnung von Inkubationsröhrchen
L-Cystein-Hydrochlorid-HydratSigma-AldrichC121800-10GCAS-Nr. 345909-32-2; Reduktionsmittel zur Herstellung der Inkubationslösung
Flusenfreies ReinigungstuchKimberly-Clark341554,5 in × 8,5 in; zum Abtupfen überschüssiger Flüssigkeit von Objektträgern ohne Faserrückstände
Niedrigprofil-MikrotomklingeLeica 81963065-LPErsatzklinge mit niedrigem Profil zur Herstellung gleichmäßiger Stängelquerschnitte
Magnesiumsulfat-HeptahydratFisher ChemicalM80-500CAS-Nr. 10034-99-8; Reagenz für McDougall’s Puffer
Magnetisches RührfischFisher Scientific03-411-78376 mm × 12 mm; zum Mischen von Puffer- und Inokulationslösungen
AdressaufkleberAvery51671/2 in × 1 3/4 in; zur Kennzeichnung von Proben und Objektträgern
PinselLoew-Cornell—Serie 7000, Rundpinsel Nr. 3; feiner Pinsel zum Transfer und zur Handhabung von Stängelquerschnitten
Petri-Schalen mit DeckelBecton Dickinson Labware8173111960 mm × 15 mm; zur vorübergehenden Lagerung von Stängelquerschnitten in ultrareinem Wasser
Phloroglucinol, 1,3,5-TrihydroxybenzolSigma-AldrichP3502-25GCAS-Nr. 108-73-6; Reagenz zur Herstellung der Wiesner-Färbung
Pipette (100 μL)GilsonP 1000; 767547MVerstellbare Pipette zur Dosierung von Färbemitteln
Kunststoff-TrichterNalgene10-437-23E150 mm; zum Transfer und zur Filtration von Reagenzien
PP-Becher (4 L)Nalgene1201-40004-L-chemikalienbeständiger Becher zur Herstellung und Mischung von Inokulationslösungen
KaliumchloridFisher ChemicalP217-500CAS-Nr. 7447-40-7; Reagenz für McDougall’s Puffer
RasierklingenPersonna66-00890,009 in dick; zum manuellen Beschneiden von Stängelmaterial
Rutheniumrot, ammoniertes RutheniumoxychloridSigmaR-2751CAS-Nr. 11103-72-3; histologisches Färbemittel zur Visualisierung von pektischen Substanzen
SchereFiskars1063071Allzweckschere zum Schneiden von Klebeband, Schaumstoff und anderen Verbrauchsmaterialien
Schraubverschluss-Kegelröhrchen (50 mL)Corning430828aus Polypropylen, nicht pyrogen; zur Probenlagerung, Inkubation, Spülen und Aufbewahrung
SchlittenmikrotomLeica2000RSchlittenmikrotom zur Herstellung von 100 μm-dicken Stängelquerschnitten
Natriumbikarbonat, ACS-ReinheitFisher ChemicalS233-3CAS-Nr. 144-55-8; Reagenz für McDougall’s Puffer
NatriumchloridFisher Chemical—CAS-Nr. 7647-14-5; Reagenz für McDougall’s Puffer
NatriumhydroxidFisher ChemicalS318-500CAS-Nr. 1310-73-2; zur Herstellung der Reduktionslösung
Natriumphosphat-dibasisch, wasserfrei (Na2HPO4)Sigma AldrichS-9763CAS 7558-79-4
Natriumsulfid, wasserfrei, ACS, min. 98,0 %Oakwood Chemicals245960CAS-Nr. 1313-84-4; Reduktionsmittel zur Herstellung der Inkubationslösung
Laborlöffel (Spoonula)Fisher Scientific14-375-10Labor-Spatel zum Überführen pulverförmiger Reagenzien
RührplatteThermolyne by Sybron7200Magnetische Rührplatte zum Mischen von Puffer- und Inokulationslösungen
Spritze (60 mL) mit breiter NadelMonoject93540102860-mL-Spritze mit Kanüle großem Durchmesser zur Dosierung der Inokulationslösung
ReagenzglasständerThermo Scientific14-809-44Ständer zur Organisation und Befestigung von 50-mL-Inkubationsröhrchen
ThermometerFisherBrand13201663Labor-Thermometer zur Überprüfung der Lösungs- und Wasserbadtemperatur
Aufrechtes MikroskopNikonEclipse NiAufrechtes Hellfeld-Mikroskop zur Visualisierung und Bildgebung gefärbter Stängelquerschnitte
UmwälzpumpeLittle Giant Pump Co.502203Modell 2E-38N; 115 VAC, 60 Hz, 1,7 A; zum Umwälzen von Wasser und zur Aufrechterhaltung gleichmäßiger Badtemperatur
WiegepapierVWR Scientific Products12578-165Einweg-Wiegepapier zum Wiegen und Überführen fester Reagenzien und des Getreidestängel-Substrats

Referenzen

  1. Cosgrove DJ. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005;6(11):850-861.
  2. Moore KJ, Jung H-JG. Lignin and fiber digestion. Journal of Range Management. 2001;54(4):420-430.
  3. Barros J, Serk H, Granlund I, Pesquet E. The cell biology of lignification in higher plants. Annals of Botany. 2015;115(7):1053-1074.
  4. Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: cell wall deposition, composition, and degradability. Crop Science. 2002;42(2):524-534.
  5. Jung HG, Lamb JFS. Stem morphological and cell wall traits associated with divergent in vitro neutral detergent fiber digestibility in alfalfa clones. Crop Science. 2006;46(5):2054-2061.
  6. Engels FM, Jung HG. Alfalfa stem tissues: cell-wall development and lignification. Annals of Botany. 1998;82(5):561-568.
  7. Akin DE. Section to slide technique for study of forage anatomy and digestion. Crop Science. 1982;22(2):444-446.
  8. Jung HG, Deetz DA. Cell wall lignification and degradability. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:315-346.
  9. Blaschek L, et al. Cellular and genetic regulation of coniferaldehyde incorporation in lignin of herbaceous and woody plants by quantitative Wiesner staining. Frontiers in Plant Science. 2020;11:109.
  10. Blaschek L, et al. Different combinations of laccase paralogs nonredundantly control the amount and composition of lignin in specific cell types and cell wall layers in Arabidopsis. The Plant Cell. 2023;35(2):889-909.
  11. Nevins DJ. Analysis of forage cell wall polysaccharides. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:105-132.
  12. Xu Z, Heuschele DJ, Lamb JFS, Jung H-JG, Samac DA. Improved forage quality in alfalfa (Medicago sativa L.) via selection for increased stem fiber digestibility. Agronomy. 2023;13(3):770.
  13. Pradhan Mitra P, Loqué D. Histochemical staining of Arabidopsis thaliana secondary cell wall elements. Journal of Visualized Experiments. 2014;(87):51381.
  14. De Micco V, Aronne G. Combined histochemistry and autofluorescence for identifying lignin distribution in cell walls. Biotechnic & Histochemistry. 2007;82(4–5):209-216.
  15. Kraus JE, et al. Astra Blue and Basic Fuchsin double staining of plant materials. Biotechnic & Histochemistry. 1998;73(5):235-243.
  16. Ursache R, Andersen TG, Marhavý P, Geldner N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 2018;93(2):399-412.
  17. Baldacci-Cresp F, et al. A rapid and quantitative safranin-based fluorescent microscopy method to evaluate cell wall lignification. The Plant Journal. 2020;102(5):1074-1089.
  18. Casero PJ, Knox JP. The monoclonal antibody JIM5 indicates patterns of pectin deposition in relation to pit fields at the plasma-membrane-face of tomato pericarp cell walls. Protoplasma. 1995;188(1-2):133-137.
  19. Pesquet E, Cesarino I, Kajita S, Pawlowski K. Physiological roles of lignins – tuning cell wall hygroscopy and biomechanics. New Phytologist. 2025;248(6):2674-2706.
  20. Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: rate and extent of cell-wall thinning during ruminal degradation. NJAS: Wageningen Journal of Life Sciences. 2001;49(1):3-13.
  21. Yeung EC. A beginner’s guide to the study of plant structure. Tested Studies for Laboratory Teaching. 1998;19:125-142.
  22. Jensen, W.A. Botanical Histochemistry: Principles and Practice. Freeman W.H. & Co. San Francisco, CA. (1962).
  23. Ruzin, SE. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University Press; New York, NY; 1999.
  24. Gronwald JW, Bucciarelli B. Comparison of stem morphology and anatomy of two alfalfa clonal lines exhibiting divergent cell wall composition. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2013;93(11):2858-2863.
  25. Dai R, et al. Overexpression MsJAR1 gene increased lateral branches and plant height in alfalfa (Medicago sativa L.). Scientific Reports. 2025;15(1):16956.

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