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Forschungsartikel
Dieser Artikel stellt einen reproduzierbaren Bioinformatik-Workflow vor, der öffentliche transkriptomische Datensätze, maschinelles Lernen, externe Validierung, quantitative reverse Transkriptions-PCR, die Screening der Connectivity Map und molekulares Docking integriert, um Biomarker für pulmonale Hypertonie und potenzielle therapeutische Substanzen zu identifizieren.
Diese Studie hatte das Ziel, molekulare Biomarker im Zusammenhang mit pulmonaler Hypertonie (PH) sowie vielversprechende kleine Moleküle mithilfe öffentlich zugänglicher transkriptomischer Daten und unabhängiger Validierungsressourcen zu identifizieren. Drei Genexpressions-Omnibus-Datensätze (GSE22356, GSE33463 und GSE48149) wurden nach Normalisierung, Probennachbeschriftung und ComBat-Korrektur für Batch-Effekte integriert. Zur Identifizierung zentraler Merkmalgene wurden Analysen zur differentiellen Expression, gewichtete Gen-Koexpressionsnetzwerkanalysen, funktionelle Anreicherungsanalysen, Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkanalysen sowie drei maschinelle Lernalgorithmen eingesetzt. Die diagnostische Leistungsfähigkeit wurde anhand von Receiver-Operating-Characteristic-Kurven bewertet. Die externe Validierung umfasste eine unabhängige Lungen-Gewebekohorte (GSE117261), einen Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdatensatz der Lungenarterie (GSE210248) und eine quantitative Reverse-Transkriptase-PCR-Validierung in unabhängigen Lungen-Gewebeproben. Mithilfe der Connectivity-Map-basierten Arzneimittelumpositionierung und molekularen Docking-Analysen wurden potenzielle Wirkstoffe identifiziert. Es wurden 78 differentiell exprimierte Gene gefunden, wobei CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 und TLR7 als zentrale Merkmalgene ausgewählt wurden. In der unabhängigen Lungen-Gewebekohorte GSE117261 zeigte JUN die stärkste externe Unterstützung, während die Reproduktion der übrigen Gene variabel war. Die quantitative Reverse-Transkriptase-PCR in 20 biologisch unabhängigen Proben von pulmonaler arterieller Hypertonie und 20 Kontrollproben bestätigte die Hochregulation aller fünf Gene. Sowohl das offensichtliche Fünf-Gen-qRT-PCR-Modell als auch 100 wiederholte stratifizierte Fünf-Fold-Kreuzvalidierungsanalysen ergaben eine AUC von 1,000, obwohl aufgrund der geringen Kohortengröße vorsichtige Interpretation und eine unabhängige prospektive Validierung erforderlich sind. Die Einzelzellanalyse von GSE210248 unterstützte veränderte Kommunikation zwischen Immun- und Strukturrzellen sowie einen phänotypischen Wechsel der glatten Muskelzellen. BRD-K91900765/VX-745 erzielte im Connectivity-Map-Screening die höchste Bewertung. MAPK14/p38α, das etablierte pharmakologische Zielmolekül, wurde als positiver Referenz-Docking-Protein eingeschlossen, während das Docking an die fünf biomarkerassoziierten Proteine als explorativ betrachtet wurde. Diese Ergebnisse stützen die fünf Gene als potenzielle PH-Biomarker und VX-745 als rechnergestützte Hypothese zur Arzneimittelumpositionierung, die experimentell validiert werden muss.
Pulmonale Hypertonie (PH) ist ein progredienter kardiopulmonaler Syndromkomplex, der durch eine anhaltend erhöhte pulmonale arterielle Drucklage, einen erhöhten pulmonalen Gefäßwiderstand und letztlich ein rechtherzliches Versagen gekennzeichnet ist. Die aktuellen hämodynamischen Kriterien definieren die PH als mittleren pulmonal-arteriellen Druck im Ruhezustand von >20 mmHg, gemessen mittels Rechtsherzkatheterisierung1. Unter den verschiedenen klinischen Subtypen ist die pulmonal-arterielle Hypertonie (PAH) eine der schwersten Formen und zeichnet sich durch eine progrediente Remodellierung der pulmonalen Gefäße aus. Zu ihren pathologischen Merkmalen gehören endotheliale Dysfunktion, abnorme Proliferation und Migration von glatten Muskelzellen der pulmonalen Arterien, Aktivierung von adventitiellen Fibroblasten, Ablagerung der extrazellulären Matrix, Infiltration entzündlicher Zellen sowie Verengung oder Obliteration der distalen pulmonalen Arterien2. Diese Veränderungen zeigen, dass die PH/PAH nicht nur eine Erkrankung der Vasokonstriktion, sondern auch eine komplexe Gefäßremodellierungserkrankung ist, die durch koordinierte molekulare, zelluläre und immun-entzündliche Mechanismen verursacht wird.
Aktuelle PAH-Therapien zielen hauptsächlich auf die Prostazyklin-, Endothelin-, Stickoxid-lösliche Guanylatcyclase- und Phosphodiesterase-Typ-5-Signalwege ab3˒4. Obwohl diese Behandlungen die Symptome, die Belastungstoleranz und hämodynamische Parameter verbessern, beschränken sich ihre Wirkungen weitgehend auf vasodilatatorische und hämodynamische Effekte. Ihre Fähigkeit, bereits bestehende pulmonale Gefäßumbauvorgänge rückgängig zu machen, ist begrenzt, und viele Patienten zeigen trotz Kombinationstherapie einen fortschreitenden Krankheitsverlauf. Daher besteht ein wichtiger, bisher ungedeckter Bedarf an der Identifizierung neuartiger molekularer Biomarker und therapeutischer Kandidaten, die den Umbauprozess widerspiegeln. Insbesondere die immun-entzündliche Aktivierung, interferonassoziierte Signalwege, Toll-ähnliche Rezeptorwege, chemokinvermittelte Immunzellrekrutierung sowie der phänotypische Wechsel der glatten Muskelzellen haben sich als mögliche Faktoren für das Fortschreiten der PH/PAH herauskristallisiert5˒6.
Durchsatzstarke transkriptomische Datensätze stellen wertvolle Ressourcen für die Identifizierung molekularer Signaturmuster bei PH/PAH dar. Studien, die auf einem einzelnen Datensatz basieren, sind jedoch häufig durch kleine Stichprobengrößen, Batch-Effekte, Plattform-Heterogenität und unzureichende Validierung eingeschränkt. Die differentielle Expressionsanalyse kann Gene mit veränderter Expression identifizieren, erfasst jedoch möglicherweise nicht vollständig krankheitsrelevante Ko-Expressionsmodule oder Interaktionen auf Netzwerkebene. Die gewichtete Gen-Ko-Expressionsnetzwerk-Analyse (WGCNA) kann Genmodule identifizieren, die mit Krankheitseigenschaften assoziiert sind, während die Analyse von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) stark vernetzte Gene innerhalb biologischer Netzwerke aufzeigen kann. Maschinelle Lernverfahren können zudem Gene priorisieren, die diagnostischen oder Klassifizierungswert besitzen. Die alleinige Nutzung eines einzelnen Algorithmus kann jedoch modellspezifische Verzerrungen verursachen. Die Integration der differentiellen Expressionsanalyse, WGCNA, PPI-Netzwerkanalyse und mehrerer maschineller Lernalgorithmen kann daher die Robustheit der Biomarker-Entdeckung verbessern.
Eine weitere große Herausforderung bei transkriptomischen Biomarker-Studien besteht in der biologischen Interpretation. Signale aus Gesamtgewebe können Veränderungen der Genexpression in residenten vaskulären Zellen, eine Infiltration von Immunzellen oder veränderte Anteile mehrerer Zellpopulationen widerspiegeln. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung bietet die Möglichkeit, aus Gesamtgewebe abgeleitete Kandidatengene in einen zellulären Kontext einzubetten. Bei PH/PAH umfasst die pulmonale vaskuläre Remodelung Endothelzellen, glatte Muskelzellen, Fibroblasten, Monozyten/Makrophagen, Lymphozyten sowie andere Immun- oder Strukturzellen. Der Krankheitsverlauf ist ebenfalls mit veränderter Zell-Zell-Kommunikation und einem Phänotypwechsel der glatten Muskelzellen assoziiert. Daher kann die Kombination einer transkriptomischen Screening-Methode an Gesamtgewebe mit einer Validierung auf Einzelzellebene helfen zu bestimmen, ob Kandidaten-Biomarker mit einer Immunaktivierung, einer vaskulären strukturellen Remodelung oder einem Ungleichgewicht in der multizellulären Kommunikation verknüpft sind.
Neben der Biomarker-Entdeckung können transkriptomische Signaturen für die computergestützte Neupositionierung von Arzneimitteln verwendet werden. Die Connectivity Map (CMap) verknüpft krankheitsassoziierte Genexpressionsprofile mit kleinen Molekülen, die diese Signaturen umkehren oder modulieren können7. In Kombination mit der Kuration von Verbindungen und molekularem Docking kann diese Strategie experimentell überprüfbare therapeutische Hypothesen generieren. Obwohl CMap-Vorhersagen und molekulares Docking die Wirksamkeit von Arzneimitteln nicht belegen können, lassen sie sich dazu nutzen, Kandidatenverbindungen für zukünftige Target-Bindungsassays, zellbasierte Experimente und die Validierung im Tiermodell zu priorisieren.
Es wurde ein integrierter und reproduzierbarer Arbeitsablauf zur Identifizierung von Biomarkern sowie kandidatenhaft wirksamer therapeutischer Substanzen für PH/PAH entwickelt. Drei öffentliche Transkriptom-Datensätze der Gene Expression Omnibus-Datenbank wurden nach Normalisierung und Korrektur von Batch-Effekten integriert. Mittels Analyse differentieller Expression, WGCNA, funktionaler Anreicherungsanalyse, PPI-Netzwerkanalyse und drei maschinellen Lernalgorithmen erfolgte die Identifizierung robuster Merkmal-Gene. Zur weiteren Evaluierung der ausgewählten Gene wurden die Receiver-Operating-Characteristic-Analyse, eine unabhängige Validierungs-Kohorte aus Lungen-Gewebe, Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten der Lungenarterie sowie die quantitative reverse Transkriptions-PCR an unabhängigen Proben herangezogen. Schließlich wurden eine auf CMap basierende Arzneimittelumpositionierung und molekulares Docking eingesetzt, um in Frage kommende Verbindungen zu identifizieren. Die Neuheit der Studie liegt in ihrem mehrschichtigen Validierungsansatz, der die Entdeckung mittels Bulk-Transkriptomik, Priorisierung durch maschinelles Lernen, unabhängige Validierung, experimentelle Bestätigung mittels quantitativer reverser Transkriptions-PCR, interpretationsfähige Einzelzell-Mechanismusanalyse und computergestützte Substanz-Screening miteinander verknüpft. Die Hypothese der Studie besagte, dass PH/PAH durch ein koordiniertes immun-entzündliches Programm und Gefäßremodeling getrieben wird und dass robuste Gene innerhalb dieses Programms als Kandidaten-Biomarker dienen könnten sowie Ansatzpunkte für die Umpositionierung von Wirkstoffen bieten könnten.
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Die in dieser Studie analysierten öffentlichen Datensätze der Gene Expression Omnibus (GEO) enthielten anonymisierte transkriptomische Daten aus zuvor veröffentlichten Studien und erforderten keine zusätzliche ethische Genehmigung. Der Ethikausschuss der Huaihua University genehmigte die unabhängige Validierungsstudie mittels quantitativer reverser Transkriptions-PCR (qRT-PCR) an menschlichem Lungengewebe (Genehmigungsnummer 2024(A05112)). Von allen Teilnehmern oder deren gesetzlich bevollmächtigten Vertretern wurde vor der Probennahme schriftlich informierte Einwilligung eingeholt. Die Genehmigungs- und Einwilligungsverfahren galten für alle 20 Pulmonalarterienhypertonie-(PAH)- und 20 Kontroll-Lungengewebeproben, die in die qRT-PCR-Validierung eingeschlossen wurden. Die für dieses Protokoll verwendeten Forschungswerkzeuge sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
1. Sammlung und Vorverarbeitung öffentlicher transkriptomischer Datensätze
Mikroarray-Datensätze im Zusammenhang mit pulmonaler Hypertonie (PH), GSE22356, GSE33463 und GSE48149, wurden aus der GEO-Datenbank bezogen. PH/pulmonal-arterielle Hypertonie (PAH)- und Kontrollproben wurden gemäß den ursprünglichen Phänotyp-Beschriftungen extrahiert. Expressionsmatrizen und Plattform-Annotationsdateien wurden mithilfe reproduzierbarer R-Skripte und des GEOquery-Pakets heruntergeladen.
Die Probennotation und Gen-Symbol-Zuordnung wurde einheitlich über alle Datensätze hinweg durchgeführt. Wenn mehrere Proben auf dasselbe Gen abgebildet wurden, wurde der mittlere Expressionswert berechnet. Es wurde eine Quantilnormalisierung durchgeführt, und Gene mit geringer Expression oder geringer Varianz wurden entfernt. Die Datensätze wurden zusammengeführt, und Batch-Effekte wurden mithilfe des ComBat-Algorithmus im sva-Paket8 korrigiert. Die Korrektur wurde anhand von Boxplots und der Hauptkomponentenanalyse evaluiert.
2. Identifizierung differentiell exprimierter Gene
Das limma-Paket wurde verwendet, um die Expressionsniveaus zwischen PH- und Kontrollproben in der batch-korrigierten Expressionsmatrix zu vergleichen9. Ein lineares Modell wurde angepasst, und empirische Bayes-Statistiken wurden angewendet. Differenziell exprimierte Gene wurden anhand eines adjustierten P-Werts <0,05 und einer absoluten log2-Fold-Change > 0,585 definiert. Die Ergebnisse wurden mithilfe von Volcano-Plots und Heatmaps visualisiert.
3. Konstruktion eines gewichteten genen Koregulationsnetzwerks
Ein gewichtetes Gen-Koexpressionsnetzwerk wurde unter Verwendung des WGCNA-Pakets10 konstruiert. Die Proben wurden mittels Clusteranalyse auf Ausreißer überprüft. Die Soft-Thresholding-Potenz wurde anhand des Fit-Index für die skalenfreie Topologie gewählt. Genmodule wurden mithilfe des dynamischen Baum-Schneide-Algorithmus identifiziert. Die Moduleigenvektoren wurden mit dem PH-Phänotyp korreliert, und das krankheitsassoziierte Modul mit der stärksten Korrelation wurde ausgewählt. Die Gene im Schlüsselmodul wurden mit den differentiell exprimierten Genen geschnitten, um Konsensgene zu erhalten.
4. Funktionsanreicherungsanalyse
Die biologischen Prozesse, zellulären Komponenten und molekularen Funktionen der Genontologie wurden mittels clusterProfiler11 analysiert. Eine Anreicherungsanalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wurde durchgeführt, um Signalwege zu identifizieren12. Als Anreicherungsschwellenwerte dienten ein P-Wert < 0,05 und ein q-Wert < 0,2; die angereicherten Terme wurden mithilfe von Bubble-Plots visualisiert11.
5. Konstruktion des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks und Identifizierung von Hub-Genen
Die konsensierte Genliste wurde in die STRING-Datenbank eingereicht, wobei Homo sapiens als Spezies und eine Interaktionsvertrauensschwelle von > 0,413 ausgewählt wurde. Die Interaktionsdatei wurde in Cytoscape importiert, und das CytoHubba-Plug-in wurde verwendet, um Gene nach Knotengrad zu sortieren. Stark vernetzte Gene wurden als Hub-Gene definiert.
6. Auswahl diagnostischer Merkmal-Gene mithilfe maschinellen Lernens
Es wurden drei unabhängige Algorithmen zur Merkmalsauswahl angewendet. Zunächst wurde eine logistische Regression mit der Methode „Least Absolute Shrinkage and Selection Operator“ unter Verwendung des glmnet-Pakets und einer 10-fachen Kreuzvalidierung durchgeführt, um Gene mit von null verschiedenen Koeffizienten zu identifizieren14. Als Zweites wurde die schrittweise Merkmalseliminierung mittels Support-Vektor-Maschinen angewendet, um redundante Merkmale zu entfernen und diejenige Teilmengen von Merkmalen auszuwählen, die die höchste Genauigkeit in der Kreuzvalidierung erreichte15. Drittens wurde ein Random-Forest-Modell erstellt, und die Merkmale wurden nach dem mittleren Rückgang der Gini-Unreinheit sortiert16. Der Durchschnitt der aus den drei Algorithmen gewonnenen Genmengen wurde verwendet, um die endgültige Menge der zentralen Merkmalsgene festzulegen. Mit dem pROC-Paket wurden Receiver-Operating-Characteristic-Kurven erstellt und die Flächen unter der Kurve berechnet17.
7. Validierung der Kerngene mithilfe unabhängiger Bulk- und Einzelzell-Datensätze
GSE117261 wurde als unabhängige externe Validierungskohorte von Lungengewebe verwendet, die 58 PAH-Proben und 25 Kontrollproben von verstorbenen Spendern umfasst18. Dieser Datensatz wurde nicht für die Entdeckungsanalyse differentieller Expression, den Aufbau des gewichteten Gen-ko-Expressionsnetzwerks oder die Merkmalsauswahl mittels maschinellem Lernen herangezogen. Die Expressionsmatrix wurde normalisiert und annotiert, und die differentielle Expression wurde mit limma v3.68.0 analysiert. Die False-Discovery-Rate-Korrektur nach Benjamini-Hochberg wurde auf das gesamte annotierte Transkriptom angewandt. Einzelne ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) wurden mit pROC v1.19.0.1, DeLong-95%-Konfidenzintervallen und Youden-Index-Schwellenwerten berechnet. Ein exploratives logistisches Regressionsmodell mit fünf Genen wurde innerhalb von GSE117261 angepasst, und seine interne Leistung zusätzlich mittels wiederholter geschachtelter Kreuzvalidierung bewertet.
GSE210248 (Tabelle 1) wurde als Einzelzell-Pulmonalarterien-Validierungsdatensatz verwendet, der Proben von drei Patienten mit PAH und drei gesunden Spendern umfasst19. Die Daten wurden mit Seurat v5.5.1 zur Qualitätskontrolle, Normalisierung, Dimensionsreduktion, Clusterung und Zellannotation verarbeitet20. Wichtige Zellpopulationen, darunter Endothelzellen, glatte Muskelzellen, Fibroblasten, Monozyten/Makrophagen sowie T- und natürliche Killerzellen, wurden identifiziert. Die Zell-Zell-Kommunikation wurde mit CellChat v2.1.2 und der Ligand-Rezeptor-Datenbank CellChatDB.human analysiert21. Ein CellChat-Objekt wurde aus der normalisierten Seurat-Expressionsmatrix und den Zelltyp-Metadaten erstellt. Überexprimierte Gene und Ligand-Rezeptor-Interaktionen wurden identifiziert; Kommunikationswahrscheinlichkeiten berechnet; Interaktionen, an denen Zellgruppen mit weniger als 10 Zellen beteiligt waren, entfernt; und auf Pfadwirkungsebene basierende Kommunikationsnetzwerke wurden abgeleitet und aggregiert. Dieser Datensatz wurde ausschließlich zur externen mechanistischen Validierung und nicht zum Modelltraining verwendet.
| Element | Beschreibung |
| Datensatz | GSE210248 |
| Datentyp | 10x Genomics/Tropfen-basierte Einzelzell-RNA-Sequenzierung; hochdurchsatzfähige transkriptomische Profilierung |
| Menschliche Proben | Drei pulmonalarterielle Proben von PAH-Patienten und drei pulmonalarterielle Proben von gesunden Spendern |
| Gewebekomponente | Ex-vivo-Pulmonalarterien-Gewebe, das hauptsächlich die zelluläre Ökologie der pulmonalen Gefäßwand und den Prozess der Gefäßumbildung widerspiegelt |
| Hauptanalytischer Zweck | Zelltyp-Lokalisierung, phänotypischer Übergang von glatten Muskelzellen, Kommunikation zwischen immunen und strukturellen Zellen sowie Validierung der mechanistischen Konsistenz von Kandidatengenen |
Tabelle 1: Grundlegende Informationen zum GSE210248 Einzelzell-Validierungsdatensatz. Die Tabelle fasst die Datensatz-ID, Sequenzierplattform, Gewebeprobe, Probenzusammensetzung und analytische Zielsetzung der Einzelzell-Analyse der Lungenarterie zur Validierung zusammen.
8. Validierung der Genexpression durch qRT-PCR
Die qRT-PCR-Validierung umfasste 20 biologisch unabhängige Lungenproben von Patienten mit PH/PAH und 20 biologisch unabhängige Kontroll-Lungenproben. Die Gesamt-RNA wurde mit dem Total RNA Extraction Kit extrahiert. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wurden mithilfe eines Spektrophotometers bestimmt, und die RNA-Integrität wurde durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Nur RNA-Proben mit A260/280-Werten zwischen 1,8 und 2,1 und ohne sichtbare Degradation wurden einbezogen.
Gleiche Mengen an RNA wurden mit dem Solarbio Universal RT-PCR Kit (AMV; Artikelnummer RP1200) in komplementäre DNA umgeschrieben. Die quantitative PCR für CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 und TLR7 wurde unter Verwendung von SYBR Green PCR Master Mix auf einem Echtzeit-PCR-System durchgeführt. Jede biologische Probe wurde in drei technischen Wiederholungen analysiert, zusammen mit Kontrollen ohne Template und ohne Reverse Transkription. Der mittlere Ct-Wert der drei technischen Wiederholungen wurde für die nachfolgende Analyse verwendet; technische Wiederholungen wurden nicht als unabhängige Beobachtungen betrachtet. Es wurden Primer verwendet, die Exon-Intron-Übergänge überspannen und Amplikone von 80–200 bp erzeugen (Tabelle 2). Die Primer-Spezifität wurde mittels NCBI Primer-BLAST und Schmelzkurvenanalyse überprüft22.
β-Aktin (ACTB) wurde als internes Referenzgen verwendet, um die Expressionsniveaus der Zielgene zu normalisieren. Die relative Expression wurde mit der 2-ΔΔCt-Methode berechnet23. Für den Vergleich zwischen Gruppen wurden zweiseitige Mann-Whitney-U-Tests in Abhängigkeit von der Datenverteilung verwendet, und eine Falsch-Entdeckungs-Rate-Korrektur nach Benjamini-Hochberg wurde für die fünf Gene angewandt. Einzelne ROC-Kurven pro Gen wurden mit 95 % Konfidenzintervallen nach DeLong erstellt, und die optimalen Cut-offs wurden anhand des Youden-Index ausgewählt. Das logistische Regressionsmodell mit fünf Genen wurde zunächst an denselben 40 biologischen Proben angepasst und bewertet; diese Schätzung wurde daher als scheinbare In-Sample-Performance definiert. Um eine mögliche Überanpassung zu beurteilen, wurden 100 Wiederholungen einer stratifizierten fünffachen Kreuzvalidierung unter Verwendung eines L2-regulären logistischen Regressionsmodells durchgeführt, und die gepoolte ROC-Performance außerhalb der Folds wurde berechnet.
| Gen | RefSeq-Zugangsnummer | Forward-Primer (5′–3′) | Reverse-Primer (5′–3′) | Produktgröße (bp) | Tm (°C) | Exon-überspannend |
| CXCL10 | NM_001565.4 | GTCAAGCCAT AATTGTTC | ATAGTGCCAG GGTAGAGT | 141 | 46.1 | Ja |
| JUN | NM_002228.4 | ACAAGTGGCA GAGTCCCG | CGCCCAAGTT CAACAACC | 152 | 54.5 | Ja |
| IFIH1 | NM_022168 | GCACAGAGCG GTAGACCCT | GCCCTGAAGC ACGAGATG | 182 | 54.7 | Ja |
| MX1 | NM_002462.5 | TTAGCCGTGG TGATTTAGC | CAAGGTGGAG CGATTCTG | 156 | 52.3 | Ja |
| TLR7 | NM_016562.4 | ATTGCCCTCGT TGTTATA | TTCCTGGAGTT TGTTGAT | 179 | 48.1 | Ja |
| ACTB | NM_001101.3 | CTCACCATGGAT GATGATATCGC | AGGAATCCTTCT GACCCATGC | 194 | 56.2 | Ja |
Tabelle 2: Primersequenzen für die quantitative reverse Transkriptions-PCR. Die Tabelle enthält die Zielgene, RefSeq-Zugangsnummern, Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen, Produktgrößen, Schmelztemperaturen und Angaben dazu, ob die Primer auf Exon-Übergängen liegen, die bei der qRT-PCR verwendet wurden.
9. Screening von Wirkstoffkandidaten und molekulares Docking
Die hoch- und herunterregulierten Kern-Gen-Signaturen wurden in die Connectivity-Map-Datenbank eingegeben, um kleine Moleküle zu identifizieren, von denen vorhergesagt wird, dass sie das PH-assozierte Expressionsprofil umkehren7. Die Kandidaten wurden nach Logit-Score und Vorhersagewahrscheinlichkeit geordnet.
Die dreidimensionale Struktur von BRD-K91900765/VX-745 wurde aus PubChem unter CID 303852524 bezogen. Pharmakologische Informationen zum Wirkstoff wurden aus öffentlichen Arzneimitteldatenbanken zusammengestellt, und strukturelle Deskriptoren wurden mithilfe von DrugBank und SwissADME25,26 berechnet. Proteinstrukturen wurden aus der RCSB Protein Data Bank unter Verwendung der folgenden PDB-Identifikatoren bezogen: CXCL10, 1LV9; JUN, 1JUN; IFIH1, 3B6E; MX1, 5GTM; TLR7, 7CYN; sowie MAPK14/p38α, 1OUK27. Die blinde Hohldetektion und molekulare Docking-Analysen wurden mit CB-Dock2 v2.0 unter Verwendung der AutoDock Vina v1.2.0 Scoring-Engine durchgeführt28,29. Protein- und Ligandendateien wurden auf CB-Dock2 hochgeladen, potenzielle Hohlräume automatisch detektiert, und das Docking wurde innerhalb der vom Server generierten hohlraumspezifischen Boxen durchgeführt. Für jedes Protein wurden der Hohlraum-Identifikator, der Vina-Score, das Hohlraumvolumen, der Mittelpunkt der Docking-Box, die Abmessungen der Docking-Box sowie die Datei des Protein-Ligand-Komplexes dokumentiert. Die Pose mit dem niedrigsten (negativsten) Vina-Score wurde als die am höchsten bewertete vorhergesagte Konformation ausgewählt. MAPK14/p38α wurde als etabliertes pharmakologisches Ziel und als positiver Referenz-Docking-Protein für VX-745 einbezogen. Das Docking an CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 und TLR7 diente explorativen Zwecken und wurde nicht als Hinweis auf eine direkte pharmakologische Zielgerichtetheit, Bindung, Hemmung oder Wirksamkeit interpretiert.
10. Statistische Analyse und Reproduzierbarkeitskontrolle
Alle statistischen Analysen wurden in R durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Zweiseitige P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet. Eine Korrektur für Mehrfachvergleiche wurde auf die Analysen zur differentiellen Expression, Anreicherung, externen Validierung und qRT-PCR wie oben beschrieben angewandt. Eine Kreuzvalidierung wurde verwendet, um die Stabilität der Machine-Learning- und kombinierten qRT-PCR-Modelle zu bewerten.
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Vorverarbeitung öffentlicher transkriptomischer Daten und Identifizierung differentiell exprimierter Gene
Die Integration und ComBat-Korrektur von GSE22356, GSE33463 und GSE48149 verringerte systematische Unterschiede zwischen den Datensätzen. Boxplots zeigten, dass die Expressionsverteilungen der Proben nach der Korrektur konsistenter wurden. Die Hauptkomponentenanalyse zeigte, dass sich die Proben vor der Korrektur hauptsächlich entsprechend ihrer Datensatzherkunft gruppiert...
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Es wurde ein integrierter und reproduzierbarer Workflow entwickelt, um molekulare Biomarker und kandidatenwirksame therapeutische Verbindungen im Zusammenhang mit PH/PAH zu identifizieren, indem öffentlich zugängliche Transkriptomik, gewichtete Gen-ko-Expressionsnetzwerkanalyse, funktionelle Anreicherung, Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkanalyse, drei maschinelle Lernalgorithmen, externe Validierung, Interpretation der Einzelzell-Transkriptomik, quantitative reverse Transkriptions-PCR-Bestätigung, Connectivity-Map-Scr...
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Die Autoren geben keine Wettbewerbsinteressen an.
Diese Studie wurde durch das Hunan Innovative Province Construction Project (Nr. 2022JJ30465) unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2× SYBR Green PCR Mastermix | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | Katalog-Nr. SR1110 | Für dye-basierte quantitative Echtzeit-PCR-Amplifikation und Fluoreszenzdetektion |
| AI21.msvmRFE.R und e1071 | Individuelles R-Skript mit dem CRAN-Paket e1071 | AI21.msvmRFE.R; e1071 v1.7-17 | Support-Vektor-Maschinen-Verfahren mit rekursiver Merkmalsauswahl (SVM-RFE) |
| Agarose | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | Katalog-Nr. A8201; CAS 9012-36-6 | Beurteilung der Gesamt-RNA-Integrität mittels Agarose-Gelelektrophorese |
| Apparat für Agarose-Gelelektrophorese | Beijing Liuyi Biotechnologie Co., Ltd. | Modell DYCZ-24DN | Elektrophoretische Beurteilung der RNA-Integrität |
| AutoDock Vina Scoring-Engine | Zentrum für Computerbasierte Strukturbiologie, Scripps Research | v1.2.0; RRID: SCR_011958 | Scoring von Protein-Ligand-Komplexen im CB-Dock2-Workflow |
| CB-Dock2 | Cao-Laborgruppe, CB-Dock2-Webserver | v2.0; Zugriff im Juli 2026 | Blinddetektion von Bindungstaschen und molekulare Docking-Analyse von VX-745 mit ausgewählten Proteinstrukturen |
| CellChat | CellChat R-Paket | v2.1.2 | Rekonstruktion und Visualisierung von Zell-Zell-Kommunikation aus der Einzelzell-Expressionsmatrix |
| CellChatDB.human | Wird zusammen mit dem CellChat R-Paket bereitgestellt | CellChatDB.human; Secreted Signaling-Teilmenge; minimale Zellanzahl-Schwelle = 10 | Menschliche Ligand-Rezeptor-Interaktionsdatenbank für CellChat |
| clusterProfiler | Bioconductor R-Paket | v4.20.0; Bioconductor Release 3.23 | Anreicherungsanalysen für Gene Ontology und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) |
| Connectivity Map (CMap/CLUE) | Broad Institute | L1000/CLUE-Ressource; RRID: SCR_016204; Zugriff im Juli 2026 | Computerbasierte Analyse zur Arzneimittelumwidmung (Drug Repositioning) |
| Individuell synthetisierte Oligonukleotid-Primer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | Individuell synthetisiert; Primersequenzen in Tabelle 2 angegeben | Amplifikation von ACTB, CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 und TLR7 |
| cytoHubba | Cytoscape App Store | v0.1 | Gradbasierte Rangfolge von Hub-Genen im Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk |
| Cytoscape | Cytoscape-Konsortium | v3.10.4; RRID: SCR_003032 | Visualisierung und Analyse von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken |
| DrugBank | DrugBank-Wissensdatenbank | v6.0; RRID: SCR_002700 | Erfassung von Verbindungskennungen und pharmakologischen Informationen |
| Gel-Dokumentationssystem | Beijing Liuyi Biotechnologie Co., Ltd. | Modell WO-9413B | Sichtbarmachung und Aufzeichnung der Ergebnisse zur RNA-Integrität im Agarosegel |
| Gene Expression Omnibus (GEO) | Nationales Zentrum für Biotechnologieinformationen (National Center for Biotechnology Information) | GSE22356, GSE33463, GSE48149, GSE117261 und GSE210248; RRID: SCR_005012 | Bezug von Bulk- und Einzelzell-Transkriptomdatensätzen |
| GEOquery | Bioconductor R-Paket | v2.80.0; Bioconductor Release 3.23 | Programmgestützter Download und Import von GEO-Expressions- und Phänotypdaten |
| glmnet | CRAN R-Paket | v5.0 | Logistische Regression mit Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO) und regularisierte logistische Modellierung |
| limma | Bioconductor R-Paket | v3.68.0; Bioconductor Release 3.23; RRID: SCR_010943 | Differenzielle Expressionsanalyse und empirische Bayes-Statistik |
| NanoDrop-Spektrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop ND-1000; Software v3.8 | Bestimmung der RNA-Konzentration sowie der Reinheitsverhältnisse A260/280 und A260/230 |
| NCBI Primer-BLAST | Nationales Zentrum für Biotechnologieinformationen (National Center for Biotechnology Information) | Web-Tool; RRID: SCR_003095; Zugriff im Juli 2026 | Überprüfung der Primer-Spezifität |
| pROC | CRAN R-Paket | v1.19.0.1; RRID: SCR_024286 | Receiver-Operating-Characteristic-Analyse (ROC), DeLong-Konfidenzintervalle und Youden-Index-basierte Cutoffs |
| Protein Data Bank (PDB) | RCSB Protein Data Bank | CXCL10: 1LV9; JUN: 1JUN; IFIH1: 3B6E; MX1: 5GTM; TLR7: 7CYN; MAPK14/p38α: 1OUK; RRID: SCR_012820 | Bezug experimentell bestimmter Proteinstrukturen für molekulares Docking |
| PubChem | Nationales Zentrum für Biotechnologieinformationen (National Center for Biotechnology Information) | PubChem CID 3038525; RRID: SCR_004284 | Bezug der dreidimensionalen Struktur und chemischen Kennungen von BRD-K91900765/VX-745 |
| R | R Foundation for Statistical Computing | v4.6.1; RRID: SCR_001905 | Statistische Datenverarbeitung, maschinelles Lernen und Visualisierung |
| randomForest | CRAN R-Paket | v4.7-1.2 | Feature-Auswahl mittels Random Forest und Rangfolge der Variablenwichtigkeit |
| Echtzeit-PCR-System | Stratagene, jetzt Agilent Technologies | Mx3000P Echtzeit-PCR-System | qRT-PCR-Amplifikation, Fluoreszenzdetektion, Schmelzkurvenanalyse und Ct-Werte-Export |
| Seurat | CRAN R-Paket; Satija-Laborgruppe | v5.5.1; RRID: SCR_016341 | Qualitätskontrolle, Normalisierung, Dimensionsreduktion, Clusterung und Annotation von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten |
| STRING | STRING-Konsortium | v12.0; RRID: SCR_005223 | Erstellung von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken |
| sva (ComBat) | Bioconductor R-Paket | v3.60.0; Bioconductor Release 3.23 | Korrektur von Batch-Effekten zwischen Datensätzen |
| SwissADME | Schweizerisches Institut für Bioinformatik (Swiss Institute of Bioinformatics) | Webserver; Zugriff im Juli 2026 | Vorab-Screening hinsichtlich Arzneimittelähnlichkeit, physikochemischer Eigenschaften und ADME |
| Gesamt-RNA-Extraktionskit | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | Katalog-Nr. R1200 | Extraktion und Reinigung der Gesamt-RNA aus Lungenproben |
| Universal RT-PCR-Kit (AMV) | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | Katalog-Nr. RP1200 | Reverse Transkription der Gesamt-RNA in komplementäre DNA (cDNA) |
| WGCNA | CRAN R-Paket | v1.74 | Erstellung gewichteter Gen-Coe-Expressionsnetzwerke und Analyse von Modul-Merkmal-Beziehungen |
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