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Methodenartikel

Ein schneller Workflow zur Modellierung von schlafentzuginduzierten Defiziten des Erkennungsgedächtnisses bei Mäusen mittels Novel-Object-Recognition und hippocampaler Biomarker

132 Aufrufe

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DOI:

10.3791/73557

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8. September 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 2Department of Neurology, Hefei Eighth People's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine, Bengbu First People's Hospital, 4Department of Pathogen Biology, School of Basic Medicine, Tongji Medical College and State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Severe Zoonotic Infectious Diseases, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt einen schnellen, reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Modellierung von Erkennungsgedächtnisstörungen durch Schlafentzug bei Mäusen vor, der sanften Schlafentzug, Testung der Erkennung neuer Objekte und Analyse hippocampaler Biomarker in denselben Tieren innerhalb einer 10-tägigen Pipeline kombiniert, ergänzt durch strukturierte Interventionsdokumentation und vordefinierte Qualitätskontrollkriterien.

Zusammenfassung

Unzureichender Schlaf trägt zum kognitiven Abbau bei und kann neurodegenerative Prozesse beschleunigen. Dieser Artikel stellt einen schnellen und reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Modellierung von Erkennungsgedächtnisstörungen durch Schlafentzug bei Mäusen vor, wobei Verhaltensergebnisse mit molekularen Veränderungen im Hippocampus verknüpft werden. Das Protokoll verwendet ein fünf Stunden dauerndes Schlafentzugsparadigma mittels sanfter Behandlung, das unmittelbar nach einer standardisierten 10-minütigen Gewöhnungsphase an ein neues Objekt (Novel Object Recognition, NOR) durchgeführt wird. Die Erkennungsmemory wird mithilfe eines 5-minütigen NOR-Tests nach einem genau definierten 5-Stunden-Retentionsintervall bewertet, gefolgt von der sofortigen Entnahme des Hippocampus derselben Tiere zur Quantifizierung proinflammatorischer Zytokine, einschließlich Interleukin-1-beta (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α), sowie von Markern für oxidativen Stress, darunter Superoxiddismutase (SOD), Glutathionperoxidase (GPx) und Malondialdehyd (MDA). Der wesentliche methodische Fortschritt liegt nicht in den einzelnen verhaltensbezogenen oder biochemischen Techniken, die bereits etabliert sind, sondern in deren operationeller Standardisierung zu einem zusammenhängenden Arbeitsablauf. Das Protokoll erfordert ein strukturiertes, quantifizierbares Protokoll der sanften Handhabungsmaßnahmen, verankert Training und Schlafentzug an einem festen zirkadianen Zeitpunkt, bewahrt die Zuordnung von NOR-Aufzeichnungen zu Gewebeproben auf Ebene des einzelnen Tieres und legt Qualitätskontroll- und Analysekriterien im Voraus fest. Das Verfahren ist so konzipiert, dass es körperliche Fixierung und erzwungene Bewegung minimiert, kann innerhalb eines kurzen experimentellen Zeitfensters abgeschlossen werden und wird als Referenzarbeitsablauf vorgeschlagen, den einzelne Labore nutzen können, um ihre eigene Durchführung der sanften Schlafentzugsmethode zu überprüfen, sobald eine unabhängige Reproduktion erfolgt ist.

Einleitung

Schlaf ist ein grundlegender physiologischer Prozess, der für die Gehirnfunktion, das Lernen und die Gedächtniskonsolidierung unerlässlich ist1. Unzureichender Schlaf ist mit kognitiven Funktionsstörungen, Stimmungsstörungen und dem Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen assoziiert2. Experimentelle Schlafentzug (SD) bei Nagetieren wird häufig verwendet, um die neurobiologischen Folgen eines akuten Schlafentzugs zu untersuchen. Der Hippocampus, ein Gehirnareal, das für deklaratives und räumliches Gedächtnis zentral ist, ist besonders anfällig für Schlafentzug3.

Es stehen mehrere Verfahren zur Induktion von Schlafentzug bei Nagetieren zur Verfügung. Die modifizierte Mehrfachplattform-Methode kann den schnellen Augenbewegungsschlaf effektiv reduzieren, führt jedoch möglicherweise zu erheblichem Stress und körperlicher Erschöpfung4. Im Gegensatz dazu erhält die sanfte Handhabung (GH) das Wachbleiben durch leichte sensorische Reize aufrecht, wie beispielsweise das Antippen des Käfigs, Störung des Einstreus oder das Vorlegen von neuem Nistmaterial, sobald Anzeichen für Schlaf auftreten. Eine kurze GH-Phase, die unmittelbar nach dem Lernen angewendet wird, kann die hippocampusabhängige Gedächtniskonsolidierung stören, gleichzeitig jedoch viele Störfaktoren vermeiden, die mit länger andauernden Deprivationsparadigmen assoziiert sind5. Da die Interventionen in diesem Protokoll durch Körperhaltung und Verhaltensmerkmale der Wachheit ausgelöst werden und nicht durch EEG-bestätigte REM-Erkennung, stellt die hier angewandte GH eine etablierte Methode für totalen Schlafentzug dar und nicht eine REM-spezifische Technik; sie wird bereits seit mehreren Jahrzehnten in dieser Form eingesetzt6.

Der Test zur Erkennung neuartiger Objekte (NOR) ist ein weit verbreiteter Assay für das Erkennungsgedächtnis. Er beruht auf der natürlichen Neigung von Nagetieren, ein neues Objekt stärker zu erkunden als ein vertrautes, ohne dass Belohnung, Bestrafung oder umfangreiches Training erforderlich sind7,8. Akuter Schlafentzug wurde als Ursache für eine beeinträchtigte Unterscheidung zwischen neuen und bekannten Objekten nachgewiesen und liefert somit einen effizienten verhaltensbasierten Hinweis auf eine gestörte Gedächtniskonsolidierung9. Auf molekularer Ebene kann Schlafmangel hippocampale Neuroinflammation und oxidativen Stress hervorrufen, einschließlich erhöhter Spiegel proinflammatorischer Zytokine und Produkte der Lipidperoxidation sowie einer verminderten antioxidativen Kapazität10,11.

Die Herausforderung bei der Anwendung dieses Modells liegt nicht in der Verfügbarkeit der einzelnen Elemente, sondern in der fehlenden operationalen Konsistenz zwischen den Studien. Sanftes Handling wird oft ohne strukturierte Dokumentation der Interventionsintensität berichtet; Verhaltens- und molekulare Endpunkte werden häufig an getrennten Kohorten erhoben; und Qualitätskontrollkriterien für das Erkundungsverhalten sowie die Planung der Stichprobengröße sind nicht immer explizit angegeben. Das übergeordnete Ziel des vorliegenden Artikels besteht darin, einen standardisierten Arbeitsablauf zur Modellierung von Erkennungsgedächtnisstörungen infolge von Schlafentzug bereitzustellen, wobei die verhaltensbezogenen Ergebnisse mit molekularen Messungen im Hippocampus bei denselben Tieren verknüpft werden. Die Methode schließt diese Reproduzierbarkeitslücken, indem sie ein fünf Stunden nach dem Training beginnendes Zeitfenster für sanftes Handling, eine Protokollierung der Interventionsintensität, die Erhebung von Verhaltensdaten und Gewebeproben an derselben Kohorte sowie vordefinierte Analysekriterien in einer einzigen zehntägigen Pipeline kombiniert (Abbildung 1). Auf die fehlende Standardisierung bei der Durchführung des sanften Handlings wurde bereits früher in der Methodenliteratur zur Schlafforschung hingewiesen6.

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Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs. Das Protokoll erstreckt sich über 10 Tage, einschließlich Umgewöhnung und Habituation, gefolgt von einem entscheidenden Testtag, der eine 10-minütige NOR-Vertrautmachungsphase, 5 h Schlafentzug während des GH, eine 5-minütige NOR-Testphase und unmittelbar anschließend die Gewebegewinnung aus dem Hippocampus derselben Tiere zur Biomarkeranalyse umfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von dem Ausschuss für Tierschutz und Ethik der Laboratoriumstiere von AILIMO (Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.) geprüft und genehmigt, beantragt vom Nanjing Drum Tower Hospital (Leitender Wissenschaftler: Yuan Liu), Genehmigungsnummer AP CODE: ALM202605070, genehmigt am 7. Mai 2026 (gültig für 4 Jahre), entsprechend den geltenden institutionellen und nationalen Vorschriften. Verwenden Sie erwachsene männliche C57BL/6J-Mäuse (8–12 Wochen alt) für das unten beschriebene Protokoll.

1. Vorbereitung und Gewöhnung der Tiere

  1. Halten Sie Hausmäuse unter standardmäßigen Laborbedingungen bei 22°C ± 1°C und 50–60 % Luftfeuchtigkeit mit einem 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus (Licht an um 07:00, definiert als ZT0). Gewähren Sie ad libitum-Zugang zu Standard-Nagetierfutter und Wasser.
  2. Handhaben Sie jede Maus täglich für 3–5 min über mindestens 7 aufeinanderfolgende Tage vor dem Test.
    ANMERKUNG: Dieses Verfahren minimiert durch Handhabung verursachten Stress, der das Erkundungsverhalten beeinflussen könnte.
  3. Bereiten Sie eine quadratische, undurchsichtige NOR-Arena mit den Maßen 40 cm × 40 cm × 40 cm und nicht reflektierenden Wänden vor. Verwenden Sie eine Arenafarbe, die sich vom Fellfarbton der Tiere abhebt.
  4. Wählen Sie NOR-Objekte, die schwer genug sind, um ein Verschieben zu verhindern, und aus nicht porösem Material bestehen. Verwenden Sie Objekte, die sich in Form und Textur unterscheiden lassen, jedoch in der Gesamtgröße vergleichbar bleiben.
    ANMERKUNG: Abbildung 2 zeigt die Trainings- und Testanordnung.
  5. Am 8. und 9. Tag bringen Sie die Mäuse 1 h vor der Gewöhnung in den Versuchsraum. Stellen Sie jede Maus für 10 min in die leere Arena und kehren Sie sie anschließend in ihren Heimkäfig zurück.
  6. Reinigen Sie die Arena und die Objekte zwischen den Tieren mit 70 %igem Ethanol. Lassen Sie das Ethanol unter normaler Laborbelüftung etwa 3–5 min lang an der Luft trocknen, bevor das nächste Tier eingebracht wird.
    ACHTUNG: Ethanol ist hochentzündlich. Sorgen Sie für ausreichende Belüftung und halten Sie es von Zündquellen fern.

figure-protocol-1
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Apparatur und des experimentellen Designs für die Erkennung neuartiger Objekte. Wählen Sie während der Gewöhnungsphase zwei identische Objekte (A und A′) und platzieren Sie diese in gegenüberliegenden Ecken der Versuchsarena. Ersetzen Sie nach einer Retentionsphase von 5 h eines der bekannten Objekte durch ein neuartiges Objekt (B). Balancieren Sie die Position des neuartigen Objekts zwischen linker und rechter Seite über alle Tiere hinweg aus, sodass ungefähr die Hälfte der Tiere jeder Gruppe das neuartige Objekt in jeder Position erhält, um räumliche Voreingenommenheit zu minimieren. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

2. NOR-Training (Eingewöhnung)

  1. Beginnen Sie am Tag 10 um ZT1 (08:00 Uhr gemäß dem angegebenen Lichtplan) mit dem NOR-Training. Halten Sie diese Startzeit über alle Kohorten hinweg ein, um zirkadiane Schwankungen zu minimieren.
  2. Bringen Sie die Mäuse 1 Stunde vor Beginn der Trainingssitzung in den Versuchsraum. Platzieren Sie zwei identische Objekte (A und A′) in gegenüberliegenden Ecken der Versuchsarena, jeweils etwa 10 cm von den Wänden entfernt.
  3. Befestigen Sie die Objekte bei Bedarf am Boden.
  4. Setzen Sie die Maus in die Mitte der Arena, sodass sie mit der Nase von den Objekten wegzeigt. Lassen Sie die Maus 10 Minuten lang frei erkunden.
  5. Zeichnen Sie das Verhalten mit einem über Kopf montierten Video-Tracking-System auf. Definieren Sie aktive Erkundung als das Zuwenden der Nase in Richtung eines Objekts auf eine Distanz von ≤2 cm, das Beschnüffeln des Objekts oder das Berühren mit der Nase.
    HINWEIS: Das Sitzen auf oder Klettern an einem Objekt ohne aktives Beschnüffeln darf nicht als Objekterkundung gewertet werden.
  6. Nehmen Sie das NOR-Verhalten mit EthoVision XT Version 17.5 und einer über Kopf montierten Basler acA1300-60gm-Kamera auf und werten Sie es aus. Konfigurieren Sie die Tracking-Software mit einer Detektionszone am Nasenpunkt von ≤2 cm Abstand zu jedem Objekt, um aktive Erkundung entsprechend den in Schritt 2.5 definierten Kriterien zu bewerten.
  7. Entfernen Sie die Maus am Ende der 10-minütigen Gewöhnungsphase unmittelbar aus der Arena.
  8. Reinigen Sie die Arena und die Objekte gründlich mit 70 %igem Ethanol, bevor das nächste Tier eingesetzt wird.

3. Schlafentzug durch sanfte Handhabung

  1. Weisen Sie jedem Tier vor der Trainingssitzung am Tag 10 einen eindeutigen Identifikationscode zu. Behalten Sie den Identifikationscode während der Verhaltensaufzeichnung und der Gewebesammlung bei.
  2. Weisen Sie die Tiere mithilfe von computergenerierten Zufallszahlen, die mit der Excel-Funktion ZUFALLSZAHL erstellt wurden, im Verhältnis 1:1 den Gruppen SD und NSD zu.
  3. Unmittelbar nach dem NOR-Training kehren die NSD-Mäuse in ihre Heimkäfige zurück und bleiben dort 5 Stunden lang ungestört. Halten Sie die Tiere der Gruppen SD und NSD unter vergleichbaren Umweltbedingungen und innerhalb desselben zirkadianen Zeitfensters.
  4. Unmittelbar nach dem NOR-Training beginnen Sie die GH-Schlafentzug-Behandlung bei den SD-Mäusen. Erhalten Sie die Wachheit für 5 aufeinanderfolgende Stunden im Heimkäfig aufrecht.
  5. Überwachen Sie die Tiere kontinuierlich. Greifen Sie ein, wenn eine Maus schlafassoziierte Haltungen einnimmt, wie das Zusammenrollen, das Schließen der Augen oder anhaltende Bewegungslosigkeit.
  6. Wenden Sie die Stimulation schrittweise an, beginnend mit vorsichtigem Klopfen auf den Käfig. Falls erforderlich, stören Sie leicht das Einstreu, geben Sie einen sauberen, neuen Gegenstand wie eine Papierröhre hinzu oder berühren Sie das Tier vorsichtig mit einem weichen Pinsel.
  7. Vermeiden Sie körperliche Fixierung, erzwungene Bewegung sowie aversive oder schmerzhafte Reize.
  8. Füllen Sie das Interventionsprotokoll in Tabelle 1 für jeden Käfig während des gesamten 5-stündigen GH-Zeitraums aus. Notieren Sie die ungefähre Anzahl der Interventionen pro Stunde, die vorherrschende Art der Intervention sowie alle Abweichungen vom Protokoll oder Tierwohlbedenken.
  9. Verwenden Sie dieselbe Vorlage für das Interventionsprotokoll über alle Kohorten hinweg.
    ACHTUNG: Verwenden Sie keine körperliche Fixierung, erzwungene Bewegung oder schmerzhafte Reize, da diese unabhängig die Gedächtnisleistung, den Stresslevel und entzündliche Parameter beeinflussen können.
Käfig/Kohorten-IDH1H2H3H4H5Dominante Eingriffsart(en)Abweichung oder Wohlbefindenbeobachtung
Datensatz-IDAnzahl Datensatz H1Anzahl Datensatz H2Anzahl Datensatz H3Anzahl Datensatz H4Anzahl Datensatz H5Antippen / Einstreu / neuartiger Gegenstand / weiche BürsteAufzeichnen, falls vorhanden

Tabelle 1: Vorlage für das Protokoll der sanften Handhabung. Notieren Sie die Käfig- oder Kohorten-ID, die Anzahl der sanften Handhabungsmaßnahmen während jeder Stunde der 5 h dauernden Schlafentzugsphase (H1–H5), die vorherrschenden Arten der Maßnahmen sowie alle Abweichungen vom Protokoll oder Beobachtungen zum Wohlergehen.

4. NOR-Testphase

  1. Beginn der NOR-Testphase genau 5 h nach Abschluss des NOR-Trainings, um ein festes Retentionsintervall von 5 h beizubehalten.
  2. Platzieren Sie ein bekanntes Objekt (A) und ein neues Objekt (B) in der Versuchsarena.
  3. Balancieren Sie die Position des neuen Objekts über die Tiere hinweg aus, indem Sie die Platzierung zwischen linker und rechter Position wechseln, sodass etwa die Hälfte der Tiere jeder Gruppe das neue Objekt links und die andere Hälfte rechts erhält.
  4. Stellen Sie die Maus in die Mitte der Arena. Lassen Sie die Maus 5 min lang frei erkunden.
  5. Nehmen Sie die Sitzung mit dem gleichen überkopf montierten Video-Tracking-System auf, das auch für die Gewöhnungsphase verwendet wurde. Wenden Sie die in Schritt 2.5 festgelegte Definition für das Erkundungsverhalten an.
  6. Reinigen Sie die Arena und die Objekte zwischen den Tieren mit 70%igem Ethanol.

5. Gewebesammlung und Hippocampus-Dissektion derselben Kohorte

  1. Identifizieren Sie unmittelbar nach dem NOR-Test dasselbe verhaltensmäßig untersuchte Tier für die Gewinnung von Gewebeproben.
  2. Töten Sie das Tier durch Enthauptung ohne Anästhesie gemäß dem genehmigten Tierversuchsprotokoll, um mögliche störende Einflüsse anästhetischer Substanzen auf inflammatorische und phosphorylierungsabhängige Biomarker zu vermeiden. Sammeln Sie das Gehirngewebe unmittelbar nach der Tötung.
  3. Behalten Sie die eindeutige Verhaltens-Test-ID des Tieres auf allen Probenröhrchen und Unterlagen bei, um sicherzustellen, dass jede molekulare Probe direkt mit dem NOR-Ergebnis dieses Tieres verknüpft bleibt.
  4. Entnehmen Sie das Gehirn rasch und legen Sie es auf eine sterile, eiskalte Schneidefläche.
  5. Trennen Sie die Hemisphären durch einen mittig sagittalen Schnitt. Präparieren Sie den Hippocampus aus jeder Hemisphäre mithilfe gekühlter Mikrospatel.
  6. Schockfrieren Sie die präparierten Hippocampi in flüssigem Stickstoff ein. Lagern Sie die Proben bei −80°C bis zur Analyse.
    ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff kann schwere Kälteverletzungen verursachen. Tragen Sie geeignete kryogene Schutzausrüstung.

6. Quantifizierung von Hippocampus-Biomarkern

  1. Fügen Sie der eiskalten RIPA-Lysepufferlösung eine kombinierte Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail-Lösung in einer 1× Arbeitskonzentration hinzu (10 µL pro mL Lysepuffer aus einer 100× Stammlösung).
  2. Homogenisieren Sie das Hippocampusgewebe im Verhältnis 1:10 Gewebe zu Puffer (w/v) in dem ergänzten eiskalten RIPA-Lysepuffer (10 µL Lysepuffer pro mg Gewebe). Für eine typische Hippocampusgewebemasse von etwa 25–30 mg pro Hemisphäre verwenden Sie etwa 250–300 µL Lysepuffer pro Hemisphäre oder etwa 500–600 µL für etwa 50–60 mg bilaterales Hippocampusgewebe.
  3. Zentrifugieren Sie das RIPA-Homogenat 15 min bei 14.000 × g bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand. Verwenden Sie den Überstand für die Gesamtproteinkonzentrationsbestimmung und die drei Zytokin-ELISAs.
    ANMERKUNG: Verwenden Sie die jeweils kitspezifischen Homogenisierungspuffer für die SOD-, GPx- und MDA-Assays gemäß den Herstellerempfehlungen zur Erhaltung der enzymatischen Aktivität.
  4. Stellen Sie ein separates 10 %iges (w/v) Hippocampus-Homogenat für die SOD-, GPx- und MDA-Messungen im Verhältnis 1:9 Gewebe zu Puffer her, wobei Sie den jeweils kitspezifischen Homogenisierungspuffer anstelle des RIPA-Lysepuffers verwenden.
  5. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration mithilfe eines BCA-Proteinassays.
  6. Quantifizieren Sie IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD, GPx und MDA unter Verwendung der zielgerichteten ELISA- oder biochemischen Assaysysteme, die in der Tabelle der Materialien aufgeführt sind. Befolgen Sie die jeweiligen Herstelleranweisungen für jeden Assay.
  7. Stellen Sie die Standardlösungen im entsprechenden Assaypuffer her. Verdünnen Sie die Proben so, dass die Werte der optischen Dichte im linearen Bereich der Standardkurve liegen.
  8. Verdünnen Sie die Hippocampusproben für die Zytokin-ELISAs etwa im Verhältnis 1:5 mit dem entsprechenden Assayverdünnungspuffer. Passen Sie die Verdünnung im Bereich von 1:2 bis 1:10 an, um optische Dichtewerte im linearen Bereich der Standardkurve zu erhalten.
  9. Verwenden Sie die Überstände der 10 %igen (w/v) Hippocampus-Homogenate, die in Schritt 6.4 beschrieben sind, direkt für die SOD-, GPx- und MDA-Assays. Wenden Sie das in Schritt 6.8 beschriebene Verdünnungsschema für die Zytokin-ELISAs nicht auf diese drei Assays an.
  10. Für die IL-1β-, IL-6- und TNF-α-ELISAs geben Sie 100 µL Standard oder angemessen verdünnte Hippocampusprobe pro Vertiefung in Duplikaten hinein und inkubieren 90 min bei 37 °C. Fügen Sie 100 µL biotinyliertes Detektionsantikörper hinzu und inkubieren weitere 60 min bei 37 °C.
  11. Geben Sie 100 µL HRP-Konjugat in jede Zytokin-ELISA-Vertiefung und inkubieren 30 min bei 37 °C. Entwickeln Sie mit TMB-Substrat 15 min bei 37 °C im Dunkeln.
  12. Für den SOD-Assay mischen Sie 20 µL Überstand des Hippocampus-Homogenats mit 20 µL Enzym-Arbeitslösung und 200 µL Substratlösung. Inkubieren Sie 20 min bei 37 °C und messen Sie die Extinktion bei 450 nm.
  13. Für den GPx-Assay geben Sie 200 µL Überstand des Hippocampus-Homogenats zur GSH-haltigen Reaktionsmischung hinzu und inkubieren 5 min bei 37 °C. Stoppen Sie die Reaktion und zentrifugieren Sie die Mischung 10 min bei 3500 × g bei 4 °C. Führen Sie die Farbentwicklung des Überstands etwa 15 min durch und messen Sie die Extinktion bei 412 nm unter Verwendung von 200 µL des Reaktionsüberstands.
  14. Für den MDA-Assay mischen Sie 100 µL Überstand des Hippocampus-Homogenats mit 1,0 mL MDA-Arbeitsreagenz und inkubieren 40 min im 95 °C heißen Wasserbad. Kühlen Sie ab und zentrifugieren Sie die Mischung. Überführen Sie etwa 250 µL des Überstands in eine Mikrotiterplatte und messen Sie die Extinktion bei 532 nm.
  15. Lesen Sie für die Zytokin-ELISAs die Extinktion bei der vom Kit vorgegebenen Wellenlänge, typischerweise 450 nm, unter Verwendung einer Referenzwellenlängenkorrektur, falls verfügbar.
  16. Erstellen Sie eine Standardkurve unter Verwendung eines geeigneten Modells, beispielsweise einer Vier-Parameter-Logistischen-Regression. Normalisieren Sie jede Biomarker-Messung auf den Gesamtproteingehalt.
  17. Geben Sie die Zytokinkonzentrationen in pg/mg Protein, die Aktivitäten der antioxidativen Enzyme in U/mg Protein und MDA in nmol/mg Protein an, sofern dies mit dem gewählten Kit kompatibel ist.

7. Datenanalyse und Qualitätskontrolle

  1. Extrahieren Sie die Untersuchungszeit für das bekannte Objekt (Tfamiliar) und das neue Objekt (Tnovel) während der NOR-Testphase.
  2. Berechnen Sie den Diskriminationsindex (DI) wie folgt:
    figure-protocol-2.
    HINWEIS: Ein DI über 0,5 weist auf eine Präferenz für das neue Objekt hin.
  3. Schließen Sie ein Tier von der NOR-Analyse aus, wenn die gesamte Objektuntersuchungszeit (Tnovel + Tfamiliar) weniger als 10 s beträgt. Wenden Sie dieses Kriterium vor der Analyse auf Gruppenebene an und dokumentieren Sie alle Ausschlüsse.
  4. Prüfen Sie die Normalverteilung jeder Gruppe mit dem Shapiro-Wilk-Test und die Varianzhomogenität mit dem Levene-Test. Bewerten Sie für jede Gruppe den DI im Vergleich zum Zufallswert von 0,5 mithilfe eines zweiseitigen einstichproben-t-Tests; falls die Annahme der Normalverteilung nicht erfüllt ist, verwenden Sie stattdessen einen einstichproben-Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test gegenüber 0,5.
  5. Legen Sie Alpha für alle statistischen Tests auf 0,05 fest, sofern nicht anders angegeben.
  6. Vergleichen Sie den DI zwischen unabhängigen NSD- und SD-Gruppen mithilfe eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests, wenn die Annahmen der Normalverteilung und Varianzhomogenität erfüllt sind. Verwenden Sie andernfalls einen Mann-Whitney-U-Test.
  7. Analysieren Sie die Untersuchungszeit für bekanntes versus neues Objekt mittels einer zweifaktoriellen Varianzanalyse mit Messwiederholung mit den Faktoren Gruppe und Objekttyp. Führen Sie paarweise post-hoc-Vergleiche mit Sidak-Korrektur durch und berichten Sie 95 % Konfidenzintervalle zusammen mit allen Gruppenvergleichsschätzungen.
  8. Vergleichen Sie jeden hippokampalen Biomarker zwischen unabhängigen NSD- und SD-Gruppen mithilfe eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests, wenn die Annahmen der Normalverteilung und Varianzhomogenität erfüllt sind. Verwenden Sie andernfalls einen Mann-Whitney-U-Test.
  9. Wenn mehrere Biomarker derselben Kohorte ausgewertet werden, kontrollieren Sie die Fehlentdeckungsrate (FDR) über das gesamte Biomarkerpanel mithilfe des Verfahrens nach Benjamini-Hochberg. Berichten Sie sowohl nominelle als auch FDR-korrigierte p-Werte.
  10. Führen Sie die a-priori-Power-Analyse mit G*Power Version 3.1 für einen zweiseitigen Vergleich unabhängiger Stichproben durch, wobei der NOR-Diskriminationsindex als primärer Endpunkt dient. Begründen Sie die erwartete Effektgröße anhand zuvor veröffentlichter Studien, die eine deutliche Beeinträchtigung der Präferenz für das neue Objekt nach Schlafentzug nach dem Lernen zeigen.
  11. Führen Sie die a-priori-Power-Analyse mit einer standardisierten Effektgröße nach Cohen’s d = 1,35, einem zweiseitigen Alpha von 0,05, einer Power von 80 % und einem Allokationsverhältnis von 1:1 durch. Diese Parameter ergeben eine berechnete Mindeststichprobengröße von 10 Tieren pro Gruppe.
    HINWEIS: Die Effektgröße wurde anhand zuvor veröffentlichter Daten zur Objekterkennung geschätzt9. Palchykova et al. berichteten über einen signifikanten Gruppeneffekt bezüglich der Untersuchungsdauer des neuen Objekts während der Testphase (F(1,16) = 8,26, p < 0,007) bei Mäusen, die unmittelbar nach dem Training schlafentzogen wurden, im Vergleich zu zeitlich abgestimmten Kontrollen (n = 9 pro Gruppe), was einer Effektgröße nach Cohen’s d ≈ 1,36 entspricht. Daher wurde für die a-priori-Power-Analyse eine standardisierte Effektgröße von d = 1,35 zugrunde gelegt.
  12. Erhöhen Sie die geplante Stichprobengröße um 20 % auf 12 Tiere pro Gruppe (insgesamt 24 Tiere), um vorgegebene Verhaltens- oder technische Ausschlüsse zu berücksichtigen. Legen Sie als Ausschlusskriterien fest: Gesamtuntersuchungszeit der Objekte <10 s während des NOR-Tests, ausschließungsbedingte Tierschutzgründe, nicht verwendbare Videoaufnahmen und technische Ausfälle bei Gewebe- oder Probentests.
  13. Schließen Sie Tiere nicht basierend auf der Richtung oder Stärke des beobachteten Behandlungseffekts aus.
  14. Führen Sie die statistischen Analysen mit Python Version 3.12, SciPy Version 1.17 für Hypothesentests und Effektgrößenberechnungen sowie statsmodels Version 0.14 für die Falschentdeckungsrate-Korrektur nach Benjamini-Hochberg durch.
  15. Wenn Sie mit diesem Protokoll einen formalen Datensatz erstellen, berichten Sie Effektgrößen (z. B. Cohens d für Gruppenvergleiche) zusammen mit den p-Werten für alle in den Schritten 7.4–7.9 angegebenen statistischen Tests.

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Ergebnisse

Eine erfolgreiche Durchführung dieses Protokolls sollte ein kohärentes Verhaltens-Molekular-Muster ergeben, ohne dass die isolierte Interpretation einzelner Messwerte erforderlich ist. Die vollständige experimentelle Abfolge ist in Abbildung 1 dargestellt, und die NOR-Apparatur sowie der experimentelle Aufbau sind in Abbildung 2 gezeigt. In der NSD-Gruppe sollten die Mäuse eine klare Präferenz für das neue Objekt zeigen, was sich in einem Diskriminierungsindex (...

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Diskussion

Dieser Artikel bietet einen schnellen, reproduzierbaren Rahmen zur Untersuchung von Erkennungsgedächtnisstörungen und hippocampalen molekularen Veränderungen, die durch akuten Schlafentzug verursacht werden. Durch Anwendung von 5 h sanfter Behandlung unmittelbar nach einer standardisierten Lernphase von 10 min zielt das Verfahren auf ein definiertes Konsolidierungsfenster nach dem Lernen ab und ist darauf ausgelegt, die körperliche Belastung im Vergleich zu ausgedehnten Deprivationsmodellen oder Verfahren, die auf erzwun...

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Offenlegungen

Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Nachwuchsförderprogramm des Nanjing Drum Tower Hospitals, die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (Förderkennzeichen Nr. 82502706) und das Grundlagenforschungsprogramm von Jiangsu (Förderkennzeichen Nr. BK20250258). KI-gestützte Werkzeuge wurden während der Erstellung und Überarbeitung des Manuskripts eingesetzt, unter anderem zum Verfassen und Überarbeiten von Texten sowie zum Erstellen und Verbessern von schematischen Abbildungen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
70 % EthanolJeder LieferantN/VReinigung der NOR-Arena und Objekte
Adulte männliche C57BL/6J-Mäuse (8–12 Wochen)Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.N/VExperimentelle Tiere
BCA-ProteinbestimmungskitThermo Fisher Scientific (Pierce)23225Bestimmung und Normalisierung der Gesamtproteinkonzentration
Verhaltensanalyse-SoftwareNoldus Information Technology B.V.EthoVision XT Version 17.5Auswertung und Analyse der NOR-Exploration
Zentrifuge, geeignet für 14.000 × g bei 4 °CEppendorfZentrifuge 5424 R; Kat.-Nr. 5404000610Klären von Hippocampus-Homogenaten
Saubere PapierrohreJeder LieferantN/VSanfte Handhabungsintervention
Kryogene persönliche SchutzausrüstungJeder LieferantN/VSichere Handhabung von flüssigem Stickstoff
Glutathionperoxidase-BestimmungskitAbcamab102530GPx-Quantifizierung
Hippocampus-GewebehomogenisatorIKA-Werke GmbH & Co. KGT 10 basic ULTRA-TURRAX; Kat.-Nr. 0003737000Homogenisierung von Hippocampus-Gewebe in Lysepuffer
Flüssiger StickstoffJeder LieferantN/VSofortiges Einfrieren der präparierten Hippocampi
MDA-BestimmungskitSigma-AldrichMAK085MDA-Quantifizierung
MikroplattenreaderAgilent Technologies / BioTekBioTek Epoch 2 Mikroplatten-SpektrophotometerMessung der Absorption bei den vom Kit vorgegebenen Wellenlängen
MikrospatelJeder LieferantN/VHippocampus-Präparation; gekühlt verwendet
Maus-IL-1β-ELISA-KitR&D SystemsMLB00CIL-1β-Quantifizierung
Maus-IL-6-ELISA-KitR&D SystemsM6000BIL-6-Quantifizierung
Maus-TNF-α-ELISA-KitR&D SystemsMTA00BTNF-α-Quantifizierung
Objekt-Sets A/A′ und BJeder LieferantN/VFamiliarisierungs- und Testphasen im NOR
Undurchsichtige NOR-Arena (40 cm × 40 cm × 40 cm)Jeder LieferantN/VVerhaltensuntersuchung
Überkopf-VideokamerasystemBasler AGacA1300-60gmVideodokumentation der NOR-Familiarisierungs- und Testdurchgänge
Protease-/Phosphatase-Hemmer-CocktailThermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)78440Zum Lysepuffer in 1× Arbeitskonzentration hinzugefügt (10 µL/mL aus einer 100×-Stammlösung)
RIPA-LysepufferThermo Fisher Scientific89900Homogenisierung von Hippocampus-Gewebe
Probenröhrchen, geeignet für kryogene LagerungThermo Fisher Scientific (Nunc)Nunc CryoTube, 1,8 mL; Kat.-Nr. 375418Gewährleistung individueller Probenkennungen und Lagerung des präparierten Hippocampus-Gewebes
Weiche BürsteJeder LieferantN/VSanfte Handhabungsintervention
SOD-BestimmungskitSigma-Aldrich19160SOD-Quantifizierung
Statistische und Power-Analyse-SoftwareG*Power; Python Software FoundationG*Power Version 3.1; Python Version 3.12 (SciPy 1.17; statsmodels 0.14)A-priori-Power-Analyse und statistische Analysen gemäß Protokollabschnitt 7
Standard-NagetierfutterJiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.Bestrahltes Ratten-/Maus-Maintenance-Futter; XTI01WC-010Ad-libitum-Fütterung der Tiere
−80 °C-GefrierschrankHaier BiomedicalDW-86L626Langzeitlagerung der schockgefrorenen Hippocampus-Proben

Referenzen

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