Diese Studie identifiziert fünf kupfer- und eisenabhängige Biomarker bei Colitis ulcerosa mittels integrierter maschineller Lernverfahren, Einzelzell-RNA-Sequenzierung und experimenteller Validierung und liefert Erkenntnisse für die klinische Diagnose und eine gezielte Immuntherapie.
Forschungsartikel
Targeting von Ferroptose und Cuproptose bei Colitis ulcerosa: Erkenntnisse aus umfassender Bioinformatik und experimenteller Validierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Colitis ulcerosa (CU) ist eine chronische Darmerkrankung mit noch nicht vollständig geklärter Pathogenese und zunehmender Prävalenz sowie steigenden Krankenhausaufnahmeraten in neu industrialisierten Ländern. Bei der CU führt ein übermäßiger Zelltod der intestinalen Epithelzellen zur Störung der Schleimhautbarriere und löst entzündliche Reaktionen aus. Ferroptose und Cuproptose sind zwei kürzlich beschriebene Formen des regulierten Zelltods. Die meisten Studien zur CU haben diese Prozesse getrennt untersucht; ihre kombinierte Rolle im Fortschreiten der CU ist jedoch bisher unzureichend charakterisiert. Um ihre synergistische Bedeutung für die Pathogenese der CU zu untersuchen, verwendeten wir einen schrittweisen Ansatz, der eine groß angelegte transkriptomische Profilierung zur Identifizierung potenzieller Zielstrukturen umfasste, gefolgt von der Validierung in In-vitro-Modellen. Differenziell exprimierte Gene (DEGs) wurden mit eisenbezogenen Genen (FRGs) und kupferbezogenen Genen (CRGs) geschnitten. Die überlappenden Zielstrukturen wurden mithilfe eines Konsenss aus maschinellen Lernalgorithmen und der gewichteten Gen-koexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA) priorisiert. Fünf Biomarker – LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 und CD274 – waren bei CU signifikant hochreguliert. Eine Einzelzellanalyse charakterisierte ihre Expression in verschiedenen Zelltypen, wobei LCN2 und NOS2 vorwiegend in Epithelzellen angereichert waren. Die mechanistische Relevanz dieser Marker wurde anschließend durch In-vitro-Assays überprüft. Die Behandlung mit Ferroptose- oder Cuproptose-Inhibitoren milderte die CU-assoziierte Entzündung und modulierte die Expression der Biomarker in Caco-2-Zellmodellen. Diese Ergebnisse identifizieren fünf mit dem Fortschreiten der CU assoziierte Biomarker und liefern experimentelle Belege für ihre potenzielle Anwendung in der klinischen Diagnostik und therapeutischen Intervention.
Einleitung
Colitis ulcerosa (CU) ist eine rezidivierende entzündliche Darmerkrankung, die mit einer zunehmenden globalen Belastung und erheblichen langfristigen Behandlungskosten verbunden ist1,2. Obwohl Aminosalicylate, Kortikosteroide, Biologika und Therapien mit kleinen Molekülen die Behandlungsoptionen erweitert haben, bleibt eine dauerhafte Remission für viele Patienten schwer erreichbar3,4. Dieser ungedeckte klinische Bedarf unterstreicht die Bedeutung der Identifizierung reproduzierbarer molekularer Marker und handhabbarer Mechanismen, die eine frühere Diagnose und eine mechanismengesteuerte Therapie unterstützen könnten5.
Ferroptose ist eine eisenabhängige Form des regulierten Zelltods, die durch Lipidperoxidation, Glutathion-Depletion und beeinträchtigte GPX4-Aktivität ausgelöst wird6. Erhöhte Eisen- und Malondialdehydspiegel bei Colitis ulcerosa entsprechen einem ferroptotischen epithelialen Schaden, während die experimentelle Aktivierung der SLC7A11–GSH–GPX4-Achse oder eine direkte Hemmung der Ferroptose die intestinale Barriere schützen können7,8.
Cuproptose, erstmals 2022 beschrieben, wird ausgelöst, wenn Kupfer an lipoylierte mitochondriale Proteine bindet, was zur Proteinstapelung und proteotoxischen Belastung führt9. Da der Darm eine zentrale Rolle im Kupferstoffwechsel spielt, könnte eine Störung dieses Signalwegs die oxidative und entzündliche Schädigung des Epithels bei Colitis ulcerosa verstärken10.
Ferroptose und Cuproptose könnten sich über ein Ungleichgewicht der Metallionen, den mitochondrialen Stoffwechsel, den Glutathionabbau und oxidativen Stress vereinen11. Es ist jedoch unklar, ob diese Wechselwirkung eine reproduzierbare molekulare Signatur bei Colitis ulcerosa hervorruft und ob eine solche Signatur auf eine wegweisspezifische Hemmung anspricht.
Die Studienhypothese war, dass eine dysregulierte Ferroptose–Cuproptose-Kreuzkommunikation bei Colitis ulcerosa (CU) auf eine reproduzierbare Biomarker-Signatur zusammenspielt, die über Bulk- und Einzelzell-Transkriptomdatensätze hinweg priorisiert und in einem Modell für intestinale epitheliale Verletzung durch pathway-spezifische Inhibition abgeschwächt werden kann. Entsprechend wurden multikohortenbasierte Bioinformatik, maschinelles Lernen, Einzelzellanalysen und gezielte Caco-2-Experimente kombiniert, um Kandidaten-Biomarker zu identifizieren und funktionell zu bewerten (Abbildung 1).
Abbildung 1: Studienarbeitsablauf. Integrierter Arbeitsablauf für die transkriptomische Multikohorten-Screeninganalyse, biomarkerbasierte Priorisierung mittels maschinellem Lernen und Netzwerkanalyse, Einzelzelllokalisation sowie inhibitorische Validierung in Caco-2-Zellen. UC: Colitis ulcerosa; GEO: Gene Expression Omnibus; WGCNA: gewichtete Gen-koexprimierungsnetzwerkanalyse; PPI: Protein-Protein-Interaktion; ROC: Empfänger-Operationscharakteristik; GSEA: Gen-Set-Verdünnungsanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Protokoll
Diese Studie verwendete öffentlich zugängliche Datensätze und kommerziell erhältliche humane Zelllinien. Es waren keine menschlichen Probanden, neu gewonnene menschliche Gewebe oder Wirbeltiere beteiligt; daher war keine Genehmigung durch einen institutionellen Ethikausschuss erforderlich. In der Tabelle der Materialien sind die im Protokoll verwendeten Forschungswerkzeuge, Software und Online-Ressourcen aufgelistet.
1. Datenverarbeitung für die differentielle Expressionsanalyse
Um die transkriptomischen Entdeckungs- und Validierungskohorten aufzustellen, wurde die Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank mit dem Begriff „ulcerative colitis“ durchsucht. Vier Datensätze – GSE87466, GSE92415, GSE107499 und GSE75214 – wurden als Trainingsset verwendet, während GSE47908 für die externe Validierung reserviert wurde. Die Trainingsdatensätze wurden mit ComBat in Sangerbox 3.0 normalisiert und auf Batch-Effekte korrigiert, während der Validierungsdatensatz unabhängig verarbeitet wurde.
Insgesamt wurden 583 eisenabhängige Zelltod-assozierte Gene (FRGs) aus FerrDB gewonnen und durch Gene ergänzt, die in der Literatur beschrieben wurden, um eine Einzelquellenverzerrung zu reduzieren12. Ein Satz von 96 kupferabhängige Zelltod-assozierten Genen (CRGs) wurde aus veröffentlichten Studien zusammengestellt12,13,14. Die differentielle Expression wurde mit limma unter Verwendung der Schwellenwerte |log₂-Fold-Change| > 1 und benjamini-hochberg-korrigiertem P < 0,05 analysiert. Diagnostische Plots zur Normalisierung, Batch-Korrektur, differentiellen Expression und Clusterung sind in Abbildung 1, Zusatzmaterial enthalten. Die Probenzusammensetzung, Plattformen und Kohortenzuordnungen sind in Tabelle 1, Zusatzmaterial aufgeführt.
2. Identifizierung von CF-DEGs bei UC
Die Pearson-Korrelationsanalyse wurde unter Verwendung von Schwellenwerten von |r| > 0,5 und P < 0,05 durchgeführt, um koexprimierte FRGs und CRGs zu identifizieren. Der resultierende Gen-Satz wurde mit den differentiell exprimierten Genen (DEGs) geschnitten, um kuproptotisch-ferroptotisch koexprimierte differentiell exprimierte Gene (CF-DEGs) zu ermitteln.
3. Anreicherungsanalyse
Genontologie (GO)- und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Anreicherungsanalysen wurden mit clusterProfiler und der Bioinformatics.com.cn-Plattform durchgeführt. Ein nach Benjamini–Hochberg korrigierter P < 0,05 diente als Signifikanzschwelle. Anreicherungsdiagramme sind in Abbildung 2, Zusatzmaterial enthalten.
4. Gewichtete Gen-koexpressions-Netzwerkanalyse (WGCNA)
Die der Genexpressionsprofile zugrunde liegende modulare Struktur wurde mittels gewichteter Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA) analysiert. Anormale Proben wurden durch hierarchisches Clustering in Kombination mit der goodSamplesGenes-Funktion identifiziert und ausgeschlossen. Anschließend wurde eine geeignete Soft-Thresholding-Potenz (β) bestimmt, um das Kriterium der skalenfreien Topologie für die Netzwerkkonstruktion zu erfüllen.
Die aufbereiteten Expressionsdaten wurden verwendet, um eine topologische Überlappungsmatrix (TOM) für die Gen-Koexpressionsanalyse zu erstellen. Mithilfe des dynamischen Baumzerschneidungsansatzes wurden Gene mit stark übereinstimmenden Expressionsmustern in Genmodule gruppiert, wobei jedes Modul mindestens 100 Gene enthielt. Die Assoziationen zwischen Moduleigenengenen (MEs) und Phänotypen wurden analysiert, um Module zu identifizieren, die mit dem Krankheitsprozess assoziiert sind, und die entsprechenden Gensätze zu extrahieren. Die WGCNA-Screening-Diagnosen sind in Abbildung 3 (Zusatzmaterial) dargestellt.
5. Auswahl von Biomarkern
Um Kandidaten für die experimentelle Weiterverfolgung zu priorisieren, wurden drei maschinelle Lernalgorithmen parallel angewandt15. Für die Merkmalsauswahl wurde eine Least-Absolute-Shrinkage-and-Selection-Operator-(LASSO-)Regression verwendet, ein Random-Forest-Modell mit ntree = 500 diente zur Rangfolgebestimmung der Genwichtigkeit und ein Support-Vektor-Maschine–rekursiver Merkmalsausschluss (SVM-RFE) wurde genutzt, um die Merkmalsuntergruppe mit dem geringsten Kreuzvalidierungsfehler zu identifizieren. Die vollständigen Screening-Diagnosen sind in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt.
Die Genwichtigkeit wurde anhand des Beitrags einzelner Gene zur Klassifizierungsgenauigkeit bewertet, und hochrangige Gene wurden gesammelt, um einen vorläufigen Gen-Satz zu generieren¹⁶. Der SVM-RFE-Algorithmus führte eine Merkmalsauswahl und Modelloptimierung durch iterative Merkmalseliminierung durch, wodurch die optimale Teilmenge an Merkmalen für die Klassifizierung identifiziert werden konnte¹⁷. Gene, die von allen drei Algorithmen gemeinsam identifiziert wurden, galten als Kandidaten-Biomarker, die mittels maschinellem Lernen ermittelt wurden.
Die CF-DEGs wurden verwendet, um ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) zu konstruieren, und CytoHubba wurde zur Rangfolgebestimmung der zentralen Knotenpunkte genutzt. Der Durchschnitt der Schlüsselmodule der WGCNA, der drei maschinellen Lernausgaben und des PPI-Kernsets ergab fünf integrierte Kandidaten-Biomarker: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 und CD274. Diese Gene wurden als UC-assoziierte diagnostische Kandidaten klassifiziert. Nachfolgende Inhibitorexperimente klassifizierten LCN2, IDO1, CXCL2 und NOS2 zusätzlich als Marker, die auf Hemmung der Ferroptose ansprechen, und CD274 als Marker, der auf Hemmung der Cuproptose anspricht. Diese Gene wurden nicht als nachgewiesene upstream-Regulatoren beider Signalwege betrachtet.
6. Entwicklung eines Vorhersagemodells und multimethodische Bewertung
Um das klinisch übertragbare Potenzial der identifizierten Gen-Signatur zu bewerten, wurde mithilfe des rms-Pakets ein Nomogramm zur Beurteilung der diagnostischen Leistung erstellt. Die Modellleistung wurde anhand einer Kalibrierungskurve, des Hosmer–Lemeshow-(HL-)Tests und des Harrellschen Konkordanzindexes (C-Index) evaluiert.
Die Modellkalibrierung wurde anhand des HL-Tests und des mittleren absoluten Fehlers (MAE) bewertet. Ein P-Wert > 0,05 und ein MAE < 0,1 wurden als Schwellenwerte für eine akzeptable Modellanpassung bzw. Genauigkeit festgelegt. Es wurden Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurven erstellt, und die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde berechnet, um die Vorhersageleistung des Nomogramms für UC zu bewerten. Ein unabhängiger Datensatz wurde verwendet, um die Generalisierbarkeit und Stabilität des Modells zu überprüfen.
7. Analyse der Gen-Set-Verstärkung (GSEA)
Im Trainingsset wurde eine Spearman-Korrelationsanalyse zwischen jedem Biomarker und allen anderen Genen durchgeführt. Die Korrelationsergebnisse wurden rangiert, um ein geordnetes Gen-Set zu generieren. Eine Gen-Set-Verdünnungsanalyse (GSEA) wurde unter Verwendung des c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols Gen-Sets aus der Molecular Signatures Database (MSigDB) als Referenz durchgeführt. Biologische Signalwege mit P < 0,05 galten als signifikant angereichert.
8. Analyse des Immunlandschaftsprofils
Das CIBERSORT-Tool und die LM22-Signaturmatrix wurden verwendet, um eine Dekonvolutionanalyse der Expressionsdaten durchzuführen und die Anteile von 22 Immunzellsubtypen zu schätzen. Anschließend wurde eine Spearman-Korrelationsanalyse durchgeführt, um die Assoziationen zwischen den fünf Biomarkern und den Immunzellsubtypen zu bewerten.
9. Analyse des regulatorischen Netzwerks
Informationen zur genbezogenen Regulation durch Transkriptionsfaktoren (TF) und Mikro-RNAs (miRNA) wurden über die integrierten Datenbanken ChEA3 und TarBase 9.0 über die Plattform NetworkAnalyst gewonnen. In das regulatorische Netzwerk wurden miRNAs einbezogen, die mit mindestens zwei Knoten assoziiert waren.
10. Einzelzell-RNA-Seq
Die Einzelzell-Datensätze GSE116222, bestehend aus drei gesunden und drei UC-Proben, und GSE214695, bestehend aus sechs gesunden und sechs UC-Proben, wurden integriert. Zellen wurden beibehalten, wenn sie 200–5.000 nachgewiesene Gene, >1.000 eindeutige molekulare Identifikatoren, < 30 % mitochondriale Transkripte, < 3 % Hämoglobin-Transkripte und < 50 % ribosomale Transkripte enthielten. Die NormalizeData-Funktion wurde zur Normalisierung verwendet, und Harmony wurde vor der Clusterung und Annotation für die Batch-Korrektur eingesetzt.
Nach der Filterung wurden die Daten mithilfe der NormalizeData-Funktion normalisiert. Harmony wurde verwendet, um Batch-Effekte zwischen den Proben zu minimieren. Die uniforme Mannigfaltigkeitsapproximation und Projektion (UMAP) sowie die t-verteilte stochastische Nachbarn-Einbettung (t-SNE) dienten der Dimensionsreduktion und Zellclustering, um lokale und globale Strukturen innerhalb der Zellpopulation zu charakterisieren. Insgesamt wurden 31.712 hochwertige Zellen für weitere Analysen beibehalten. Die Zelltypen wurden basierend auf kanonischen Zellmarkergenen annotiert.
Die Pseudotime-Analyse wurde mit Monocle 2 durchgeführt, um Veränderungen in den Zuständen epithelialer und myeloischer Zellen aus UC-Geweben zu untersuchen. Zelluläre Entwicklungstrajektorien und Gruppenunterschiede wurden evaluiert, und die Expressionsmuster von Biomarkern entlang der Pseudotime-Trajektorie wurden visualisiert.
CellChat wurde verwendet, um die Zell-Zell-Kommunikation zwischen epithelialen und myeloiden Zellsubpopulationen zu bewerten. Subpopulationsspezifische Expressionsmuster wurden integriert, um Interaktionswahrscheinlichkeiten und zentrale Signalwege zwischen epithelialen und myeloiden Zellen abzuleiten und ihre potenziellen zellulären Regulierungsnetzwerke zu charakterisieren.
11. Zellversuche
Humanen Caco-2-Kolonadenokarzinomzellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das 10 % fetalen Kälberserum, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin enthielt, bei 37 °C in 5 % CO₂ kultiviert. Caco-2-Zellen wurden als reproduzierbares epitheliales Einschichtmodell für Darmbarrieren- und Entzündungs-Schädigungs-Assays ausgewählt; jedoch beschränkt ihr maligner Ursprung eine direkte Übertragung auf nichtmalignes kolonales Epithel. Informationen zur Passage waren in den archivierten experimentellen Aufzeichnungen nicht verfügbar.
Ein in vitro-Entzündungs-Schädigungsmodell wurde etabliert, indem Zellen 24 h lang 1 µg/mL Lipopolysaccharid (LPS) ausgesetzt wurden. Die Zellen wurden einer Dimethylsulfoxid-Fahrzeugkontrollgruppe, einer LPS-allein-Gruppe, einer LPS + 4 µM Ferrostatin-1-Gruppe oder einer LPS + 40 µM Tetrathiomolybdat-Gruppe zugeordnet, jeweils mit angepassten endgültigen Lösungsmittelkonzentrationen. Die LPS-allein-Gruppe diente als positive Schädigungs-/Modellkontrolle für die Inhibitor-Rettungsvergleiche.
- Zellviabilität
Die Zellviabilität wurde mithilfe eines Zellviabilitätsassays gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Nach einer Inkubation bei 37 °C für etwa 2 h wurde die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. - Bestimmung der MDA- und Fe²⁺-Konzentrationen
Die intrazellulären Konzentrationen von Malondialdehyd (MDA) und Fe2⁺ wurden mit den entsprechenden Testkits gemäß den Anweisungen der Hersteller bestimmt. Die Gesamtproteinmenge wurde mittels eines Bicinchoninsäure-Assays quantifiziert, und jede Messgröße wurde auf den Proteingehalt der entsprechenden Probe normalisiert. - Fluoreszenzsonden-Assay für Kupferionen
Nach dem Entfernen des Kulturmediums wurde eine Cu2⁺-spezifische fluoreszierende Sonde in einer Endkonzentration von 1 µM hinzugefügt und 30 min bei 37 °C inkubiert. Bilder wurden unmittelbar ohne Waschschritte mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von jeweils 510 und 578 nm aufgenommen. Die Aufnahmeparameter blieben zwischen den Gruppen konstant, und die Maßstabsleiste im Bild wurde auf 50 µm kalibriert. - RT-qPCR
Gesamt-RNA wurde mit einem auf Phenol–Guanidinium basierenden RNA-Extraktionsreagenz isoliert. Komplementäre DNA wurde aus 1 µg RNA unter Verwendung eines Kits zur Synthese des ersten DNA-Strangs hergestellt, und SYBR-Green-basierte Reagenzien wurden für die Echtzeit-PCR verwendet. Jede Reaktion wurde technisch dreifach durchgeführt. Die Primersequenzen sind in Supplementary Table 2 angegeben, und die relative mRNA-Menge wurde nach der 2⁻ΔΔCt-Methode berechnet.
12. Statistische Analyse
Die Normalverteilung und die Varianzhomogenität wurden mithilfe des Shapiro-Wilk-Tests bzw. des medianzentrierten Levene-Tests überprüft. Daten, die beide Annahmen erfüllten, wurden mit einem ungepaarten zweiseitigen t-Test oder einer einfaktoriellen Varianzanalyse, gefolgt vom ehrlichen signifikanten Differenztest nach Tukey, analysiert. Wenn eine der Annahmen nicht erfüllt war, kamen der t-Test nach Welch oder die Varianzanalyse nach Welch, gefolgt von den Vergleichen nach Games-Howell, zum Einsatz.
Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die tatsächlichen Anzahlen biologischer Wiederholungen, exakten zweiseitigen P-Werte und Annahmenprüfungen sind in ergänzender Tabelle 3 aufgeführt. Die archivierte Quelldatei zu Abbildung 13 enthält für die Bereiche A (n = 4), C (n = 4) und F (n = 2) weniger Kontrollwiederholungen, während alle anderen Kombinationen aus Bereich und Gruppe n = 6 aufweisen.
Die computergestützten Analysen wurden mit R sowie den limma-, WGCNA-, clusterProfiler-, glmnet-, randomForest-, e1071-, pROC-, rms-, Seurat-v4-, Harmony-, Monocle-2-, CellChat- und Cytoscape/CytoHubba-Workflows durchgeführt. Zu den verwendeten Online-Ressourcen gehörten FerrDB, GEO, STRING, ChEA3, TarBase 9.0, NetworkAnalyst, CIBERSORT/LM22, MSigDB, Bioinformatics.com.cn und Sangerbox 3.0.
Ergebnisse
Identifizierung und funktionelle Annotation von kuproptotisch-ferroptotisch koexprimierten Genen
Vier Trainingsdatensätze, bestehend aus 421 UC-Proben und 97 gesunden Kontrollen, wurden integriert. Insgesamt wurden 551 differentiell exprimierte Gene identifiziert, darunter 362 hochregulierte und 189 herunterregulierte Gene. Die Korrelationsanalyse ergab 444 Eisenoptose–Kupferoptose-korrelierte Gene, und der Durchschnitt mit den differentiell exprimierten Genen ergab 32 kupferoptose–eisenoptose-koexprimierte differentiell exprimierte Gene (CF-DEGs).
Die 32 CF-DEGs waren angereichert in Antworten auf Verletzungen, Kupferionen, Fettsäuretransport, Lipopolysaccharid, chronisch-entzündliche Darmerkrankung, NF-κB-Signalweg, TNF-Signalweg und Ferroptose (Supplementary Table 4).
Priorisierung zentraler Biomarker durch integriertes maschinelles Lernen und WGCNA
Die gewichtete Gen-ko-Expressionsnetzwerkanalyse (WGCNA) identifizierte MEpurple, MEbrown und MEblack als die Module, die am stärksten mit UC assoziiert sind. Zusammen enthielten die ausgewählten Module 1.426 Gene (Supplementary Table 5).
Die Methode der kleinsten absoluten Schrumpfung und Auswahl (LASSO), die stützende Vektormaschine mit rekursiver Merkmalseliminierung (SVM-RFE) und der Zufallswald wählten jeweils 21, 32 und 19 Merkmale aus. Dreizehn Gene wurden von allen drei Modellen gemeinsam genutzt. Die Integration des maschinellen Lern-Konsenss, des mittels CytoHubba ranggeordneten protein-protein-Interaktionskerns und der ausgewählten WGCNA-Module ergab fünf mit Colitis ulcerosa assoziierte Kandidaten-Biomarker: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 und CD274.
Diagnostische Bewertung und Pfadverknüpfung der Biomarker-Signatur
Alle fünf Kandidaten-Biomarker waren positiv korreliert und in der Trainingskohorte bei Colitis ulcerosa (UC) hochreguliert (Abbildung 2A, B). Jeder Marker erreichte in der Trainingskohorte eine Fläche unter der Receiver-Operating-Characteristic-Kurve von > 0,80 und in der unabhängigen Validierungskohorte GSE47908 von > 0,75 (Abbildung 2C–E).
Das Fünf-Gen-Nomogramm zeigte eine gute Kalibrierung mit einem Hosmer-Lemeshow-P > 0,05 und einem mittleren absoluten Fehler < 0,1 sowie eine gute Diskriminierung in der analysierten Kohorte, mit einer Fläche unter der Kurve und einem Konkordanzindex von 0,945 sowie einem 95-%-Konfidenzintervall für den Konkordanzindex von 0,922–0,968 (Abbildung 3).
Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse verknüpfte die fünf Kandidaten mit der JAK–STAT-, Interferon–RIPK1/3- und Toll-ähnlichen Rezeptor–NF-κB-Signalübertragung (Abbildung 4).
Abbildung 2: Expression der Kandidaten-Biomarker und deren diagnostische Leistungsfähigkeit. (A) Korrelations-Heatmap. (B, C) Expression der Biomarker und Receiver-Operating-Characteristic-Kurven in der Trainingskohorte. (D, E) Expression der Biomarker und Receiver-Operating-Characteristic-Kurven in der Validierungskohorte GSE47908. ROC: Receiver-Operating-Characteristic; AUC: Fläche unter der Kurve; UC: Colitis ulcerosa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Entwicklung und Bewertung des UC-Nomogramms. (A) Fünf-Gen-Nomogramm. (B) Kalibrierungsdiagramm. (C) Kurve der verwendeten Empfänger-Charakteristik. ROC: Empfänger-Charakteristik; UC: Colitis ulcerosa; AUC: Fläche unter der Kurve; C-Index: Konkordanzindex. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4: Gen-Set-Enrichment-Analyse der fünf Kandidaten-Biomarker. (A–E) Ergebnisse der Gen-Set-Enrichment-Analyse für LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 bzw. CD274. GSEA: Gen-Set-Enrichment-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Analysen der Landschaft des immunologischen Mikromilieus und regulatorischer Netzwerke
UC-Proben wiesen erhöhte Anteile an Neutrophilen, aktivierten Gedächtnis-CD4⁺-T-Zellen, M1-Makrophagen und aktivierten Mastzellen auf, begleitet von entsprechenden Abnahmen an M2-Makrophagen, ruhenden Mastzellen und ruhenden dendritischen Zellen. Diese Muster zeigten sich auch in der Validierungskohorte (Abbildung 5A–E).
Die fünf Kandidaten korrelierten positiv mit Neutrophilen, aktivierten Gedächtnis-CD4⁺-T-Zellen und M1-Makrophagen sowie negativ mit ruhenden Mastzellen und M2-Makrophagen (Abbildung 5F–J). Das Gen-miRNA-Netzwerk enthielt 98 Knoten und 146 Kanten. hsa-miR-34a-5p und hsa-miR-16-5p wiesen die höchste Biomarker-Konnektivität auf, während AR und RELA die am stärksten vernetzten Transkriptionsfaktoren waren (Abbildung 6).
Abbildung 5: Analyse der Immuninfiltration. (A) Zusammensetzung der Immunzellen. (B) Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der Anteile der Immunzellen. (C) Heatmap der Korrelationen zwischen Immunzellen. (D, E) Immunzellinfiltration in den Trainings- und Validierungskohorten. (F–J) Korrelationen zwischen Kandidaten-Biomarkern und Populationen von Immunzellen. UC: Colitis ulcerosa. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 6: Vorhergesagte miRNA- und Transkriptionsfaktor-Netzwerke. (A) Gen–miRNA-Netzwerk. Kreise zeigen Kandidaten-Biomarker, Quadrate zeigen miRNAs. (B) Transkriptionsfaktor–Gen-Netzwerk. Rauten zeigen Kandidaten-Biomarker, umgekehrte Dreiecke zeigen Transkriptionsfaktoren. miRNA: microRNA; TF: Transkriptionsfaktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Räumlich-zeitliche Expressionsdynamik mit Einzelzellauflösung
Nach der Qualitätskontrolle bildeten 31.712 Zellen 22 Cluster, die als neun Hauptzellpopulationen annotiert wurden (Abbildung 7A–C). Die Anteile epithelialer Zellen und Plasmazellen waren bei UC höher. LCN2 und NOS2 waren in epithelialen Zellen angereichert, während IDO1, CXCL2 und CD274 in myeloischen Zellen angereichert waren (Abbildung 7D–G).
Die Subclustering-Analyse epithelialer Zellen identifizierte 11 Teilpopulationen, wobei eine Expansion entzündlicher Kolonozyten sowie eine Anreicherung von LCN2 und NOS2 in dieser Teilpopulation beobachtet wurde (Abbildung 8). Die Subclustering-Analyse myeloischer Zellen ergab sieben Teilpopulationen, gekennzeichnet durch eine Zunahme von Monozyten, eine Abnahme von Makrophagen und eine Anreicherung von IDO1, CXCL2 und CD274 in den Monozyten (Abbildung 9).
Entzündliche Kolonozyten reicherten sich spät in der epithelialen Entwicklungslinie an, mit zunehmender Expression von LCN2 und NOS2 (Abbildung 10). Monozyten zeigten eine deutliche, mit Colitis ulcerosa assoziierte Entwicklungslinie mit dynamischer Expression von IDO1, CXCL2 und CD274 (Abbildung 11).
Entzündliche Kolonozyten zeigten die stärkste ausgehende Signalübertragung und eine hervorragende Kommunikation mit Monozyten. APP–CD74 war ein führendes Ligand–Rezeptor-Paar zwischen diesen Subpopulationen (Abbildung 12).
Abbildung 7: Expression von Kandidaten-Biomarkern in verschiedenen Zellpopulationen. (A) Zellcluster. (B) Annotationsmarker. (C) Neun annotierte Zellpopulationen. (D, E) Zellverteilungen und -anteile in gesunden Proben und bei Colitis ulcerosa (UC). (F, G) Visualisierung der Expression von Kandidaten-Biomarkern mittels UMAP und Blasendiagramm. UC: Colitis ulcerosa; UMAP: uniform manifold approximation and projection. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 8: Subclustering epithelialer Zellen und Expression von Kandidatengenen. (A) Erste Cluster epithelialer Zellen. (B) Annotationsmarker. (C) Annotierte Teilpopulationen epithelialer Zellen. (D) Anteile der Teilpopulationen in gesunden Proben und bei Colitis ulcerosa (CU). (E) Expression von LCN2 und NOS2 in den verschiedenen Teilpopulationen epithelialer Zellen. t-SNE: t-verteilte stochastische Nachbarn-Einbettung; CU: Colitis ulcerosa. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 9: Subclustering von myeloischen Zellen und Expression von Kandidatengenen. (A) Erste myeloische Zellcluster. (B) Annotationsmarker. (C) Annotierte Subgruppen myeloischer Zellen. (D) Anteile der Subgruppen in gesunden Proben und bei Colitis ulcerosa (UC). (E) Expression von IDO1, CXCL2 und CD274 in den Subgruppen myeloischer Zellen. t-SNE: t-verteilte stochastische Nachbarn-Einbettung; UC: Colitis ulcerosa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 10: Pseudotime-Analyse epithelialer Zellen. (A) Pseudotime-Trajektorie und Zustandszuweisungen. (B) Verteilung gesunder und UC-epithelialer Zellen entlang der Trajektorie. (C) Expressionsdynamik von LCN2 und NOS2 entlang des Pseudotime. UC: Colitis ulcerosa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 11: Pseudotemporalanalyse myeloischer Zellen. (A) Pseudotemporale Trajektorie und Zustandszuweisungen. (B) Verteilung gesunder und myeloischer Zellen bei Colitis ulcerosa entlang der Trajektorie. (C) Expressionsdynamik von IDO1, CXCL2 und CD274 entlang der Pseudotime. UC: Colitis ulcerosa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 12: Kommunikation zwischen epithelialen und myeloischen Zellen. (A) Anzahl und Stärke der Wechselwirkungen. (B) Ausgehende und eingehende Signalstärken. (C) Wechselwirkungen, an denen inflammatorische Kolonozyten beteiligt sind. (D) Heatmap der Kommunikationsstärke. (E) Ligand-Rezeptor-Paare, an denen inflammatorische Kolonozyten beteiligt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
In-vitro-experimentelle Validierung von Ferroptose- und Cuproptose-Interventionen
Die Exposition gegenüber Lipopolysaccharid (LPS) verringerte die Lebensfähigkeit von Caco-2-Zellen und erhöhte die Expression von IL-6 und IL-1β im Vergleich zur Kontrolle mit Trägersubstanz (Abbildung 13A–C und Ergänzende Abbildung 5).
LPS erhöhte Fe2⁺, Malondialdehyd und die mRNA-Menge von LCN2, IDO1, CXCL2 und NOS2, wohingegen Ferrostatin-1 jede mit LPS assoziierte Veränderung umkehrte (Abbildung 13D–I). Für die Vergleiche von LPS versus LPS + Ferrostatin-1 lagen die exakten zweiseitigen P-Werte nach Mittelung der technischen Replikate innerhalb jedes biologischen Replikats zwischen 9,45 × 10⁻5 und 0,0027.
LPS verringerte die Zellviabilität und erhöhte IL-6, IL-1β, FDX1/DLAT, CD274 sowie kupfersensitive Fluoreszenz, wohingegen Tetrathiomolybdat diese Veränderungen umkehrte (Abbildung 14 A–E). Bei den Vergleichen von LPS allein mit LPS + Tetrathiomolybdat lagen die exakten zweiseitigen P-Werte zwischen < 1 × 10⁻15 und 0,0008.
Insgesamt identifizierten die Analysen fünf mit Colitis ulcerosa assoziierte diagnostische Kandidaten, lokalisierten ihre Expression auf epitheliale und myeloide Populationen und zeigten, dass LCN2, IDO1, CXCL2 und NOS2 auf die Hemmung der Ferroptose reagierten, während CD274 auf die Chelatbildung von Kupfer in Caco-2-Zellen reagierte.
Abbildung 13: Ferrostatin-1 vermindert lps-assoziierte entzündliche und eisenabhängige Zelltod-verwandte Veränderungen in Caco-2-Zellen. (A) Zellviabilität. (B, C) IL-6- und IL-1β-Messenger-RNA-Expression. (D, E) Intrazelluläre Malondialdehyd- und Fe2⁺-Spiegel. (F–I) LCN2-, IDO1-, CXCL2- und NOS2-Messenger-RNA-Expression. Technische Triplicate wurden innerhalb jedes unabhängigen biologischen Replikats gemittelt; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Die verfügbaren Anzahlen biologischer Replikate betrugen Kontrolle n = 4 in A und C, Kontrolle n = 2 in F und n = 6 für alle anderen Kombinationen von Diagrammen/Gruppen. Exakte zweiseitige P-Werte und Prüfungen der Annahmen sind in Ergänzungstabelle 5 angegeben. Fer-1: Ferrostatin-1; LPS: Lipopolysaccharid; MDA: Malondialdehyd. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 14: Tetrathiomolybdat vermindert LPS-assoziierte entzündliche und kuproptosebezogene Veränderungen in Caco-2-Zellen. (A) Zellviabilität. (B, C) IL-6- und IL-1β-Messenger-RNA-Expression. (D) FDX1- und DLAT-Messenger-RNA-Expression. (E) CD274-Messenger-RNA-Expression. (F) Intrazelluläre Cu2⁺-Fluoreszenz; Maßstabsbalken = 50 µm. Technische Triplicate wurden innerhalb jeder der sechs unabhängigen biologischen Wiederholungen pro Gruppe gemittelt; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Exakte zweiseitige P-Werte und Überprüfungen der Annahmen sind in Ergänzungstabelle 5 angegeben. TTM: Tetrathiomolybdat; LPS: Lipopolysaccharid. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Rohdaten und verarbeitete Daten, Analyseskripte sowie Quell-Tabellenkalkulationen für Zellexperimente sind öffentlich verfügbar unter https://doi.org/10.5281/zenodo.21202720.
Erweiterte Abbildung 1: Daten-Vorverarbeitung und Diagnostik der differentiellen Expression. (A–F) Stichprobenverteilungen vor (A–C) und nach (D–F) Batch-Korrektur. (G) Volcano-Plot der differentiell exprimierten Gene. (H) Heatmap der normalisierten Expressionsmuster. DEGs: differentiell exprimierte Gene; GEO: Gene Expression Omnibus.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung 2, Zusatzmaterial: Anreicherungsanalyse der CF-DEGs. (A) Genontologie-Anreicherung. (B) Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG)-Anreicherung. CF-DEGs: kuproptotisch-ferroptotisch koexprimierte differentiell exprimierte Gene; GO: Genontologie; KEGG: Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Erweiterte Abbildung 3: WGCNA-Screening-Diagnostik. (A) Auswahl der Soft-Schwellenwerte. (B) Modul-Eigengen-Clustering. (C) Gen-Modul-Dendrogramm. (D) Assoziationen zwischen Modulen und Merkmalen. (E–G) Beziehungen zwischen Gen-Signifikanz und Modul-Zugehörigkeit für die violetten, braunen und schwarzen Module. WGCNA: gewichtete Gen-koexpressionsnetzwerkanalyse; UC: Colitis ulcerosa.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Erweiterte Abbildung 4: Mehrstufige Biomarker-Screening. (A, B) LASSO-Merkmalsauswahl. (C, D) SVM-RFE-Merkmalsauswahl. (E, F) Rangfolge der Merkmale durch Zufallswald. (G) Übereinstimmung zwischen den drei Modellen. (H, I) PPI-Netzwerk und Kernknoten von CytoHubba. (J) Integration der Ergebnisse aus maschinellem Lernen, WGCNA und PPI. (K) Chromosomale Lokalisation der fünf Kandidaten. LASSO: Least Absolute Shrinkage and Selection Operator; SVM-RFE: Support Vector Machine–Recursive Feature Elimination; RF: Random Forest; PPI: Protein–Protein-Interaktion; WGCNA: gewichtete Gen-koexprimierungsnetzwerkanalyse.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung 5, Zusatzmaterial: Validierung des LPS-Modells in Caco-2-Zellen. (A) Zellviabilität. (B, C) Expression der Boten-RNA für IL-6 und IL-1β. Technische Triplicate wurden innerhalb von sechs unabhängigen biologischen Wiederholungen pro Gruppe gemittelt; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. LPS: Lipopolysaccharid.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Erweiterte Tabelle 1: Für Entdeckung und Validierung verwendete GEO-Datensätze. Zugangsnummern der Datensätze, Plattformen, Zusammensetzung der Proben und Kohortenzuordnungen für die in den Analysen zur Entdeckung und Validierung einbezogenen GEO-Datensätze. GEO: Gene Expression Omnibus.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Erweiterte Tabelle 2: Primersequenzen für die quantitative PCR nach reverser Transkription. Primersequenzen, die für die Analyse der in dieser Studie untersuchten Gene mittels quantitativer PCR nach reverser Transkription verwendet wurden.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 3: Statistische Details zu den Abbildungen 13, 14 und der ergänzenden Abbildung 1. Anzahlen biologischer Wiederholungen, Überprüfung von Annahmen, Methoden der statistischen Analyse und exakte P-Werte für die angegebenen experimentellen Vergleiche.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Erweiterte Tabelle 4: Kupfer-abhängige Apoptose–Eisen-abhängige Apoptose koexprimierte differentiell exprimierte Gene. Liste der CF-DEGs, identifiziert durch den Schnittmenge von Eisen-abhängige Apoptose–Kupfer-abhängige Apoptose-korrelierten Genen mit differentiell exprimierten Genen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatz-Tabelle 5: Gene in den WGCNA-Modulen, die für die Biomarker-Screening ausgewählt wurden. Liste der Gene, die in den für das anschließende Biomarker-Screening ausgewählten WGCNA-Modulen enthalten sind. WGCNA: gewichtete Gen-koexpressionsnetzwerkanalyse.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Diese Studie kombinierte Bulk-Transkriptomik, maschinelles Lernen, Einzelzellanalysen und gezielte Zellexperimente, um die Wechselwirkung zwischen Ferroptose und Cuproptose bei Colitis ulcerosa (UC) zu untersuchen. Fünf mit UC assoziierte diagnostische Kandidaten zeigten sich reproduzierbar in Entdeckungs- und Validierungskohorten, lokalisierten sich hauptsächlich in epithelialen und myeloiden Kompartimenten und wiesen in Caco-2-Zellen eine expressionsmäßige Antwort auf die Hemmung entsprechender Signalwege auf. Diese Ergebnisse stützen einen stufenweisen Arbeitsablauf, bei dem eine computergestützte Priorisierung eine gezielte biologische Validierung leitet, ohne jedoch die stärkere Behauptung aufzustellen, dass die fünf Gene etablierte upstream-Regulatoren der Ferroptose oder Cuproptose seien.
Die CF-DEGs waren angereichert in Antworten auf Lipopolysaccharid, Kupferstoffwechsel, Lipidtransport, NF-κB/TNF-Signalgebung und Ferroptose, was einen kohärenten Zusammenhang zwischen metallabhängiger oxidativer Belastung und Schleimhautentzündung aufzeigt10,19.
Die fünf Kandidaten besetzen komplementäre entzündliche und metallbedingte Stresskontexte. LCN2 verbindet Eisen-Sequestrierung, mikrobielles Dysbiose und die LCN2–ALOX15-Ferroptose-Achse20,21,22,23; IDO1 verknüpft Tryptophan-Stoffwechsel, Schleimhautentzündung und gestörte Eisenverarbeitung24,25,26; und CXCL2 verbindet IL-17/IL-22-Signalgebung, Neutrophilenrekrutierung und Lipidperoxidation27,28,29,30. NOS2 hat kontextabhängige Effekte, kann aber oxidative Schäden und die Anfälligkeit für Ferroptose verstärken, wenn es übermäßig induziert wird31,32,33,34,35,36. CD274 ist ein immunregulatorisches epitheliales Merkmal, dessen Beziehung zu FDX1 und Kupfer-Ionenophor-Empfindlichkeit auf eine Reaktion auf Cuproptose hinweist, nicht jedoch auf eine etablierte Pfadregulation37,38,39. Die Inhibitorexperimente waren konsistent mit diesen Klassifikationen: Ferrostatin-1 verringerte LCN2, IDO1, CXCL2 und NOS2, während Tetrathiomolybdat CD274 reduzierte.
Die Immunanalyse stellte zudem einen Zusammenhang zwischen der Kandidatensignatur und M1-Makrophagen, Neutrophilen, aktivierten Gedächtnis-CD4⁺-T-Zellen sowie aktivierten Mastzellen her, die alle über Zytokine, reaktive Sauerstoffspezies und barrierestörende Signalwege eine Schädigung des Epithels aufrechterhalten können40,41,42,43,44. RELA, hsa-miR-34a-5p und hsa-miR-16-5p erwiesen sich als plausible upstream-Regulatoren, während Hinweise auf eine direkte Rolle des Androgenrezeptors bei Colitis ulcerosa weiterhin begrenzt sind45,46,47,48,49,50. Diese Befunde sollten als hypothesenbasierte Netzwerkzusammenhänge für zukünftige Störungsexperimente verstanden werden, nicht jedoch als Nachweis einer direkten Regulation.
Die Einzelzellanalyse lokalisierte LCN2 und NOS2 in inflammatorische Kolonozyten sowie IDO1, CXCL2 und CD274 in monocytenreiche myeloide Populationen. Inflammatorische Kolonozyten wurden als Kommunikationszentralen vorhergesagt, wobei APP–CD74 zu den führenden epithelial-myeloiden Ligand-Rezeptor-Paaren gehört51,52,53,54,55,56. Diese Auflösung auf Zelltyp-Ebene engt den biologischen Kontext ein, in dem die fünf Kandidaten getestet werden sollten, und unterstützt Ko-Kulturen oder Organoid–Immunzell-Systeme als nächsten experimentellen Schritt.
Mehrere Einschränkungen beeinträchtigen die Interpretation. Caco-2 ist eine Kolonkarzinom-Zelllinie und bildet das nicht maligne koloniale Epithel, die Patienten-Heterogenität, Stroma-Immun-Interaktionen oder die chronische Colitis ulcerosa (UC) nicht vollständig nach; daher sind Validierungen in primären intestinalen Epithelzellen, patientenabgeleiteten Organoiden, Ko-Kultursystemen und in vivo-Kolitis-Modellen erforderlich. Die archivierte Quell-Tabellendatei zu Abbildung 13 enthielt außerdem fehlende Kontrollwiederholungen in den Panels A, C und F, was die Präzision dieser Vergleiche verringert; alle verfügbaren Wiederholungszahlen und exakten P-Werte sind in Ergänzungstabelle 5 angegeben. Schließlich waren Alter, Geschlecht, Behandlungsexposition und andere klinische Kovariaten in den öffentlichen Kohorten nicht einheitlich verfügbar. Um die diagnostische Nützlichkeit und kausalen Rollen zu belegen, sind prospektive multizentrische Kohortenstudien und direkte Störungen der fünf Kandidaten erforderlich. Innerhalb dieser Grenzen liefert die Studie einen transparenten, experimentell fundierten Satz an Hypothesen, die metallabhängigen Zelltod, epitheliale myeloide Kommunikation und UC miteinander verbinden. Vergleichbare Netzwerkpharmakologie-Studien beim Prostatakarzinom verdeutlichen den hypothesengenerierenden Wert der computergestützten Target-Priorisierung, stellen jedoch keine UC-spezifische Validierung dar57. Ebenso spiegelt die aktuelle Diskussion über Ferroptose bei Arthrose und Knochendegeneration ein breiteres therapeutisches Interesse an der Modulation der Ferroptose wider, obwohl krankheitsspezifische Mechanismen nicht direkt auf UC übertragbar sind58. Die Validierung in externen Kohorten und Inhibitorexperimente wurden daher eingesetzt, um die bioinformatischen Assoziationen zu stärken, jedoch nicht zu übertreiben.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch das Projekt „Young Qihuang Scholar“ der Nationalen Verwaltung für Traditionelle Chinesische Medizin gefördert (Förderkennzeichen Nr. 2022256). Wir danken allen Mitgliedern der Forschungsteams der Liaoning-Universität für Traditionelle Chinesische Medizin und des Dritten Angegliederten Krankenhauses der Liaoning-Universität für Traditionelle Chinesische Medizin für die technische Unterstützung sowie für ihren Beitrag zur Datenaufbereitung und bioinformatischen Analyse.
OpenAI Codex (OpenAI) wurde während der Überarbeitung ausschließlich zur Unterstützung bei der englischsprachigen Bearbeitung, der Dokumentformatierung und der Überprüfung der Abbildungsqualität verwendet. Alle wissenschaftlichen Inhalte, Analysen, Zitate und die endgültige Darstellung wurden von den Autoren geprüft und verifiziert, die die volle Verantwortung für den Manuskriptinhalt übernehmen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BCA-Protein-Assay-Kit | Beyotime Institute of Biotechnology | P0010 | Proteinquantifizierung zur Normalisierung. |
| Bioinformatics.com.cn | Bioinformatics.com.cn | Online-Plattform; Zugriff 2026 | GO/KEGG-Visualisierungs- und Analyseplattform. |
| Caco-2-Zelllinie | ATCC | HTB-37 | Menschliche kolorektale Adenokarzinom-Zelllinie, verwendet für das epitheliale Verletzungsmodell. |
| Cell Counting Kit-8 | GLPBio | GK10001 | Zellviabilitäts-Assay, gemessen bei 450 nm. |
| CIBERSORT mit LM22-Signatur | CIBERSORT-Entwickler | LM22 | Entflechtung von 22 Immunzellfraktionen. |
| ChEA3 | Ma'ayan Laboratory | Online-Plattform; Zugriff 2026 | Transkriptionsfaktor-Anreicherung und Vorhersage regulatorischer Netzwerke. |
| CO2 inkubator | Nicht dokumentiert | N/V | Befeuchteter Inkubator zur Kultur bei 37 °C und 5 % CO2. |
| Cu2+ fluoreszenzsonde | BIOFOUNT | CAS 98907-26-7 | Intrazelluläre Fluoreszenzdetektion von Cu2+ . |
| Cytoscape mit CytoHubba | Cytoscape-Konsortium | Version nicht dokumentiert | PPI-Visualisierung und Rangfolge der Kernknoten. |
| Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium | Gibco | 11965092 | Kulturmedium für Caco-2-Zellen. |
| Dimethylsulfoxid | Nicht dokumentiert | N/V | Fahrzeugkontrolle. |
| Fötales Rinderserum | Nicht dokumentiert | N/V | Mediumzusatz in 10 %iger Konzentration. |
| Fe2+ -Assay-Kit | Abcam | ab83366 | Bestimmung des intrazellulären Fe2+-Spiegels. |
| FerrDB | FerrDB-Entwickler | Online-Datenbank; Zugriff 2026 | Quelle für ferroptosebezogene Gene. |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583 | Ferroptose-Inhibitor; Endkonzentration 4 µM. |
| Harmony | Broad Institute/Gemeinschaft | Version nicht dokumentiert | Korrektur von Batch-Effekten in Einzelzell-Daten. |
| Invertiertes Fluoreszenzmikroskop | Olympus | IX71 | Fluoreszenzbildgebung von Cu2+ bei 510/578 nm Anregung/Emission. |
| Lipopolysaccharid | Nicht dokumentiert | N/V | Entzündlicher Verletzungsreiz bei 1 µg/mL für 24 h. |
| Malondialdehyd-Assay-Kit | Beyotime Institute of Biotechnology | S0131S | Bestimmung der Lipidperoxidation. |
| Mikroplattenreader | Nicht dokumentiert | N/V | Absorptionsmessung bei 450 nm. |
| Monocle | Bioconductor/Gemeinschaft | Version 2 | Pseudotime-Analyse auf Einzelzellebene. |
| Molecular Signatures Database | Broad Institute | c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs | Referenz-Gen-Satz für GSEA. |
| NetworkAnalyst | NetworkAnalyst-Entwickler | Online-Plattform; Zugriff 2026 | Integration von Transkriptionsfaktor- und miRNA-Netzwerken. |
| Penicillin–Streptomycin | Nicht dokumentiert | N/V | 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin. |
| R | R Foundation for Statistical Computing | Version nicht dokumentiert | Bioinformatik-Analyseumgebung. |
| R-Paket-Sammlung | CRAN/Bioconductor | Paketversionen nicht dokumentiert | limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC und rms Workflows. |
| Echtzeit-PCR-System | Nicht dokumentiert | N/V | SYBR-Green-RT-qPCR-Gerät. |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1622 | Synthese der ersten cDNA-Stranges aus 1 µg RNA. |
| Sangerbox | Sangerbox-Entwickler | 3.0 | Normalisierung und ComBat-Batch-Korrektur. |
| Seurat | Satija-Labor/Gemeinschaft | Version 4 | Qualitätskontrolle, Normalisierung, Clusterung und Visualisierung von Einzelzell-Daten. |
| Statistische Analyse-Software | Nicht dokumentiert | N/V | Statistische Analyse der ursprünglichen Zellversuche. |
| STRING | STRING-Konsortium | Online-Datenbank; Zugriff 2026 | Konstruktion von Protein–Protein-Interaktionsnetzwerken. |
| SYBR-Green-Echtzeit-PCR-Reagenzien | Takara | RR820A | Quantitative Echtzeit-PCR. |
| TarBase | DIANA Tools | 9.0 | Experimentell bestätigte miRNA–Gen-Interaktionen. |
| Tetrathiomolybdat | Sigma-Aldrich | 323446 | Kupferchelator; Endkonzentration 40 µM. |
| TRIzol-Reagenz | Takara | 9108 | Extraktion der Gesamt-RNA. |
Referenzen
- Fu M, Wang QW, Liu YR, Chen SJ. The role of the three major intestinal barriers in ulcerative colitis in the elderly. Ageing Res Rev. 2025;108:102752. https://doi.org/10.1016/j.arr.2025.102752.
- Le Berre C, Honap S, Peyrin-Biroulet L. Ulcerative colitis. Lancet. 2023;402:571–584.
- Wangchuk P, Yeshi K, Loukas A. Ulcerative colitis: Clinical biomarkers, therapeutic targets, and emerging treatments. Trends Pharmacol Sci. 2024;45:892–903.
- Kobayashi T, et al. Ulcerative colitis (primer). Nat Rev Dis Primers. 2020;6:74. https://doi.org/10.1038/s41572-020-0205-x.
- Huang J, et al. Comprehensive analysis of cuproptosis-related genes in immune infiltration and diagnosis in ulcerative colitis. Front Immunol. 2022;13:1008146. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1008146.
- Liu Y, et al. Development and experimental validation of machine learning-based disulfidptosis-related ferroptosis biomarkers in inflammatory bowel disease. Genes. 2025;16:496. https://doi.org/10.3390/genes16050496.
- Hu W, et al. HIF-1α alleviates ferroptosis in ulcerative colitis by regulation of GPX4. Cell Death Dis. 2025;16:542. https://doi.org/10.1038/s41419-025-07883-8.
- Zhao C, et al. FXR acts as a therapeutic target for ulcerative colitis via suppressing ferroptosis. Mol Med. 2025;31:258. https://doi.org/10.1186/s10020-025-01305-3.
- Tsvetkov P, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022;375:1254–1261.
- Liu J, et al. Unveiling the cuproptosis in colitis and colitis-related carcinogenesis: A multifaceted player and immune moderator. Research (Wash D C). 2025;8:0698. https://doi.org/10.34133/research.0698.
- Liu N, Chen M. Crosstalk between ferroptosis and cuproptosis: From mechanism to potential clinical application. Biomed Pharmacother. 2024;171:116115. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2023.116115.
- Hao S, et al. Development of prognostic model incorporating a ferroptosis/cuproptosis-related signature and mutational landscape analysis in muscle-invasive bladder cancer. BMC Cancer. 2024;24:958. https://doi.org/10.1186/s12885-024-12716-1.
- Wang Z, et al. Exosomes secreted by macrophages upon copper ion stimulation can promote angiogenesis. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2021;123:111981. https://doi.org/10.1016/j.msec.2021.111981.
- Zou M, Zhang W, Zhu Y, Xu Y. Identification of 6 cuproptosis-related genes for active ulcerative colitis with both diagnostic and therapeutic values. Medicine (Baltimore). 2023;102:e35503. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000035503.
- Chen W, Miao J, Chen J, Chen J. Development of machine learning models for diagnostic biomarker identification and immune cell infiltration analysis in PCOS. J Ovarian Res. 2025;18:1. https://doi.org/10.1186/s13048-024-01582-8.
- Lv JH, et al. WGCNA combined with machine learning to find potential biomarkers of liver cancer. Medicine (Baltimore). 2023;102:e36536. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000036536.
- Wu Q, Yang C, Huang C, Lin Z. Screening key genes for intracranial aneurysm rupture using LASSO regression and the SVM-RFE algorithm. Front Med. 2025;11:1487224. https://doi.org/10.3389/fmed.2024.1487224.
- Tang D, Pu B, Liu S, Li H. Identification of cuproptosis-associated subtypes and signature genes for diagnosis and risk prediction of ulcerative colitis based on machine learning. Front Immunol. 2023;14:1142215. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1142215.
- Yang C, et al. Identification of cuproptosis hub genes contributing to the immune microenvironment in ulcerative colitis using bioinformatic analysis and experimental verification. Front Immunol. 2023;14:1113385. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1113385.
- Yadav SK, et al. Fecal Lcn-2 level is a sensitive biological indicator for gut dysbiosis and intestinal inflammation in multiple sclerosis. Front Immunol. 2022;13:1015372. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1015372.
- Luo Q, et al. Bioinformatics analysis reveals potential crosstalk genes and molecular mechanisms between ulcerative colitis and psoriasis. Arch Dermatol Res. 2024;317:118. https://doi.org/10.1007/s00403-024-02856-1.
- Nielsen OH, et al. Rectal dialysate and fecal concentrations of neutrophil gelatinase-associated lipocalin, interleukin-8, and tumor necrosis factor-alpha in ulcerative colitis. Am J Gastroenterol. 1999;94:2923–2928.
- Sun Y, et al. Natural polyphenol rutin inhibits ferroptosis in ulcerative colitis by regulating lipid metabolism via blocking the LCN2-ALOX15 axis. Food Funct. 2025;16:7169–7186.
- Sofia MA, et al. Tryptophan metabolism through the kynurenine pathway is associated with endoscopic inflammation in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 2018;24:1471–1480.
- Shon WJ, et al. Severity of DSS-induced colitis is reduced in Ido1-deficient mice with down-regulation of TLR-MyD88-NF-kB transcriptional networks. Sci Rep. 2015;5:17305. https://doi.org/10.1038/srep17305.
- Zeng T, et al. Indoleamine 2, 3-dioxygenase 1 enhances hepatocytes ferroptosis in acute immune hepatitis associated with excess nitrative stress. Free Radic Biol Med. 2020;152:668–679.
- Pavlidis P, et al. Interleukin-22 regulates neutrophil recruitment in ulcerative colitis and is associated with resistance to ustekinumab therapy. Nat Commun. 2022;13:5820. https://doi.org/10.1038/s41467-022-33333-3.
- Urzua U, et al. The ovarian transcriptome of reproductively aged multiparous mice: Candidate genes for ovarian cancer protection. Biomolecules. 2020;10:113. https://doi.org/10.3390/biom10010113.
- Zahn A, et al. Transcript levels of different cytokines and chemokines correlate with clinical and endoscopic activity in ulcerative colitis. BMC Gastroenterol. 2009;9:13. https://doi.org/10.1186/1471-230X-9-13.
- Yi Q, et al. Application of genomic selection and experimental techniques to predict cell death and immunotherapeutic efficacy of ferroptosis-related CXCL2 in hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 2022;12:998736. https://doi.org/10.3389/fonc.2022.998736.
- Kolios G, Valatas V, Ward SG. Nitric oxide in inflammatory bowel disease: A universal messenger in an unsolved puzzle. Immunology. 2004;113:427–437.
- Cheng F, et al. Identification of differential intestinal mucosa transcriptomic biomarkers for ulcerative colitis by bioinformatics analysis. Dis Markers. 2020;2020:8876565. https://doi.org/10.1155/2020/8876565.
- Tratensek A, et al. Oxidative stress-related biomarkers as promising indicators of inflammatory bowel disease activity: A systematic review and meta-analysis. Redox Biol. 2024;77:103380. https://doi.org/10.1016/j.redox.2024.103380.
- Zhang JL, et al. Jatrorrhizine alleviates ulcerative colitis via regulating gut microbiota and NOS2 expression. Gut Pathog. 2022;14:41. https://doi.org/10.1186/s13099-022-00516-7.
- Li H, et al. Development of a prognostic model based on ferroptosis-related genes for colorectal cancer patients and exploration of the biological functions of NOS2 in vivo and in vitro. Front Oncol. 2023;13:1133946. https://doi.org/10.3389/fonc.2023.1133946.
- Seibt TM, Proneth B, Conrad M. Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication. Free Radic Biol Med. 2019;133:144–152.
- Holland T, Mattner J. Intestinal eosinophils: Characterization of elusive granulocytes as anti-bacterial and immunomodulatory effector cells in colitis. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:321. https://doi.org/10.1038/s41392-023-01588-4.
- Nguyen J, et al. Overexpression of programmed death ligand 1 in refractory inflammatory bowel disease. Hum Pathol. 2022;126:19–27.
- Shen Z, et al. Exploration of a screening model for intrahepatic cholangiocarcinoma patients prone to cuproptosis and mechanisms of the susceptibility of CD274-knockdown intrahepatic cholangiocarcinoma cells to cuproptosis. Cancer Gene Ther. 2023;30:1663–1678.
- Niu Y, et al. Platelet activation stimulates macrophages to enhance ulcerative colitis through PF4/CXCR3 signaling. Int J Mol Med. 2025;55:78. https://doi.org/10.3892/ijmm.2025.5499.
- Qu F, et al. The role of macrophage polarization in ulcerative colitis and its treatment. Microb Pathog. 2025;199:107227. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2025.107227.
- Danne C, Skerniskyte J, Marteyn B, Sokol H. Neutrophils: From IBD to the gut microbiota. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2024;21:184–197.
- Zhao Q, et al. CD4+ T cell activation and concomitant mTOR metabolic inhibition can ablate microbiota-specific memory cells and prevent colitis. Sci Immunol. 2020;5:eabc6373. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abc6373.
- Chen E, et al. Inflamed ulcerative colitis regions associated with MRGPRX2-mediated mast cell degranulation and cell activation modules, defining a new therapeutic target. Gastroenterology. 2021;160:1709–1724.
- Xu H, Wu C, Wang D, Wang H. Alleviating effect of Nexrutine on mucosal inflammation in mice with ulcerative colitis: Involvement of the RELA suppression. Immun Inflamm Dis. 2024;12:e1147. https://doi.org/10.1002/iid3.1147.
- Luo Y, et al. Rab27A promotes cellular apoptosis and ROS production by regulating the miRNA-124-3p/STAT3/RelA signalling pathway in ulcerative colitis. J Cell Mol Med. 2020;24:11330–11342.
- Pace F, Watnick PI. The interplay of sex steroids, the immune response, and the intestinal microbiota. Trends Microbiol. 2021;29:849–859.
- Rodriguez J, Olivares M, Delzenne NM. Implication of the gut microbiota in metabolic inflammation associated with nutritional disorders and obesity. Mol Nutr Food Res. 2021;65:e1900481. https://doi.org/10.1002/mnfr.201900481.
- Ojha R, et al. Emerging role of circulating microRNA in the diagnosis of human infectious diseases. J Cell Physiol. 2019;234:1030–1043.
- Tian Y, et al. LncRNA CDKN2B-AS1 relieved inflammation of ulcerative colitis via sponging miR-16 and miR-195. Int Immunopharmacol. 2020;88:106970. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2020.106970.
- Kulkarni N, Pathak M, Lal G. Role of chemokine receptors and intestinal epithelial cells in the mucosal inflammation and tolerance. J Leukoc Biol. 2017;101:377–394.
- Stadnyk AW. Intestinal epithelial cells as a source of inflammatory cytokines and chemokines. Can J Gastroenterol. 2002;16:241–246.
- Xu Y, Chen N. DUOX2-mediated innate immune hyperactivation drives macrophage M1 polarization via the APP-CD74 axis in inflammatory bowel disease. Presented at: 19th Congress of the European Crohn’s and Colitis Organisation (ECCO 2026); Stockholm, Sweden; 2026. https://academic.oup.com/ecco-jcc/article/20/Supplement_1/jjaf231.232/8432779.
- Shi CL, et al. Single-nucleus transcriptome unveils the role of ferroptosis in ischemic stroke. Heliyon. 2024;10:e32727. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e32727.
- Tu H, et al. Integrated single-cell analysis with experimental validation reveals ANXA2 as a therapeutic target for ferroptosis in inflammatory bowel disease. Am J Transl Res. 2026;18:91–111.
- Yan C, et al. Exploring the anti-ferroptosis mechanism of Kai-Xin-San against Alzheimer's disease through integrating network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation strategy in vivo and in vitro. J Ethnopharmacol. 2024;326:117915. https://doi.org/10.1016/j.jep.2024.117915.
- Shaik JP, Ahmad A. Pharmacological mechanism of cinnamic acid in the treatment of prostate cancer by network pharmacology. Archives of Medical Reports. 2024;1(2):1–6. https://doi.org/10.26524/amr.2024.2.1.
- Nimmagadda S, Patel S, MR Vishwathika. Targeting ferroptosis: A novel therapeutic avenue in osteoarthritis and bone degeneration. Archives of Medical Reports. 2025;2(5):6–9. https://doi.org/10.26524/amr.2025.5.2.