Methodenartikel

Ex Vivo-Modell eines Myokardinfarkts im kristalloidperfundierten Mausherzen

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DOI:

10.3791/73840

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27. Oktober 2026

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1Department of Cardiology, The People's Hospital of Danyang, Affiliated Danyang Hospital of Nantong University, 2Institute of Molecular Cardiology, Medical Faculty and University Hospital Düsseldorf, Heinrich Heine University of Düsseldorf, 3Department of Cardiac Surgery, Heinrich Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein ex vivo-Modell eines Myokardinfarkts am isolierten, kristalloid-perfudierten Mausherzen. Dieser Ansatz umgeht systemische Variablen und ermöglicht es den Forschern, die direkten kardialen Effekte ohne störende extrinsische Faktoren, die das Überleben der Kardiomyozyten beeinflussen könnten, zu bewerten und lokal begrenzte pharmazeutische Interventionen zu testen.

Zusammenfassung

Das experimentelle Myokardinfarkt-(MI-)Modell wird häufig an Tieren durch eine vorübergehende Okklusion der Arteria coronaria sinistra (LAD) oder auf zellulärer Ebene durch Hypoxie-Reoxygenierungs-Protokolle dargestellt. Als alternatives Organ-Ebene-Modell der Ischämie hat das Langendorff-perfundierte Herz eine zentrale Methode zur Untersuchung der Auswirkungen physiologischer Störungen und pharmakologischer Interventionen auf die Kardioprotektion beibehalten. Hier stellen wir die grundlegende Methodik und die wesentlichen Regeln vor, die zur Etablierung eines regionalen Myokardischämie/Reperfusion-Modells im isolierten Maus-Herzen erforderlich sind. Kurz gesagt, nach kardioplegischer Arrestierung wurde die LAD nach einem kurzen Spülvorgang mit eiskaltem PBS ligiert. Anschließend wurde das Herz an einer Langendorff-Apparatur montiert und mit einem nährstoffreichen, sauerstoffhaltigen Puffer bei 37 °C und einem konstanten Perfusionsdruck von 110 cmH₂O perfundiert. Die Dauer der Myokardischämie betrug 30, 45, 60, 90 und 120 min, gefolgt von 90 min Reperfusion. Die Vitalität der Kardiomyozyten und die Infarktgröße wurden mittels mikroskopischer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-(TTC-)Färbung bestimmt. Wir konnten zeigen, dass das ex-vivo-MI-Modell zuverlässig reproduzierbare Myokardschäden hervorruft, die sich durch einen progressiven Verlust vitaler Kardiomyozyten im Infarktbereich mit zunehmender Ischämiedauer auszeichnen. Außerdem war eine Reperfusion von mindestens 30 min erforderlich, um eine klare TTC-basierte Abgrenzung des infarzierten Myokards zu ermöglichen. Dieses Vorgehen umgeht systemische Variablen und ermöglicht es Forschern, kardiale Effekte direkt zu bewerten, ohne die Beeinflussung durch extrinsische regulative Faktoren wie zirkulierende humorale Substanzen oder Infiltration von Immunzellen, die den MI-Verlauf verfälschen könnten, sowie lokal begrenzte pharmazeutische Interventionen zu testen. Somit stellt das ex-vivo-MI-Modell eine nützliche Plattform zur Untersuchung kardioprotektiver Mechanismen dar, die direkt auf Kardiomyozyten wirken.

Einleitung

Ein Myokardinfarkt (MI) tritt auf, wenn der koronare Blutfluss stoppt, was zum Absterben von Gewebe und zu schweren Funktionsstörungen führt. Obwohl er typischerweise an ganzen Organismen untersucht wird, kann sich der Begriff auch auf einen regionalen MI beziehen, der auf bestimmte Herzstrukturen beschränkt ist, oder auf ex vivo, isolierte Herz-Labormodelle (z. B. Langendorff-Perfusion), die zur Untersuchung von Infarkten ohne systemische Einflüsse verwendet werden1. Daher dient das am Langendorff-Apparat perfundierte Herz seit mehr als 50 Jahren als robustes und etabliertes experimentelles Modell zur Erforschung myokardialer ischämischer Schäden2.

Das ex vivo-MI-Modell am isolierten Herzen bietet mehrere Vorteile, darunter eine präzise Kontrolle des experimentellen Milieus und die Möglichkeit, die direkten Wirkungen von Interventionen – wie pharmakologische Substanzen – am Myokard unabhängig von systemischen Einflüssen zu bewerten, einschließlich zirkulierender humoraler Faktoren, Blutbestandteile und neurohumoraler Regulation3. Durch die Minimierung dieser störenden Faktoren ermöglicht das ex vivo-Modell einen vorhersagbareren und reproduzierbareren Ansatz im Vergleich zu in vivo-Modellen und erleichtert somit eine gründliche Untersuchung der Krankheitsprozesse und molekularen Signalwege, die an der MI beteiligt sind4.

Bei isolierten Herzen kann eine myokardiale Ischämie entweder global oder regional induziert werden5. Im globalen MI-Modell wird der Perfusatsfluss durch die gesamte Koronarzirkulation vollständig unterbrochen, während im regionalen MI-Modell nur die linke absteigende Koronararterie (LAD) vorübergehend durch Ligatur okkludiert wird, was zu einem ischämischen Schaden führt, der auf das Myokard distal zur Ligaturstelle begrenzt ist. Obwohl das globale MI-Modell technisch einfach durchzuführen ist, weist es mehrere Einschränkungen auf, die seine Anwendung in Studien zur Kardioprotektion begrenzen6. Eine wesentliche Einschränkung besteht darin, dass die Dauer der Ischämie durch die Belastbarkeit des gesamten Herzens begrenzt ist, wodurch eine längere Ischämie schwer zu induzieren ist und die Wahrscheinlichkeit eines transmuralen Infarkts vergleichbar mit in vivo-Situationen ist7. Darüber hinaus variieren diese Protokolle erheblich zwischen verschiedenen Laboren, obwohl ex vivo-Modelle im Allgemeinen eine hervorragende Reproduzierbarkeit bieten, wenn Dauer von Ischämie und Reperfusion sorgfältig kontrolliert werden. Diese Variabilität unterstreicht die Notwendigkeit einer besseren Standardisierung und Charakterisierung des isolierten Mausherzens, zumal viele kritische methodische Details in der Literatur weiterhin unzureichend beschrieben sind8.

Andererseits ist das regionale MI-Modell technisch anspruchsvoller in der Einrichtung. Hier stellen wir mehrere Modifikationen und praktische Strategien vor, um die Induktion eines zuverlässigen ex vivo-MI im isolierten Mausherzen zu optimieren, insbesondere zur Bewertung pharmakologischer Interventionen, die auf Kardioprotektion abzielen9,10. Daher bietet dieses modifizierte ex vivo-MI-Protokoll am Langendorff-perfunden Mausherzen eine effektive Plattform, um das myokardiale Überleben nach therapeutischen Interventionen direkt zu beurteilen.

Protokoll

Das hier beschriebene Modell des isoliert perfundierten Herzens ist ein akutes, nicht überlebensrelevantes Experiment und wurde von den zuständigen Behörden genehmigt (O1019/25, LANUV Nordrhein-Westfalen, Deutschland). Alle Verfahren wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien und der NIH-Richtlinie für die Pflege und den Einsatz von Laborversuchstieren durchgeführt. Die für die Experimente benötigten Geräte und Chemikalien sind in der Tabelle der Materialien aufgelistet.

1. Einrichten eines Langendorff-Rückperfusionssystems für das isolierte Mausherz

HINWEIS: Ein nicht-rezirkulierendes, gravitationsgetriebenes System wurde entwickelt, um dem isolierten Mausherzen bei einem konstanten Druck von 110 cmH2O sauerstoffangereicherte kristalloide Perfusionslösung (Krebs-Henseleit-Puffer, KHB) zuzuführen (Abbildung 1A).

  1. Reinigen Sie die Langendorff-Glasgeräte mit 0,1 M/L HCl, 100 % Ethanol und spülen Sie anschließend mit destilliertem Wasser, bevor Sie das System zusammenbauen.
  2. Wiegen Sie alle Chemikalien ab, die zur Herstellung von 2 L modifiziertem KHB gemäß den folgenden Endkonzentrationen (mM) benötigt werden: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO4·7H2O, 1,21 KH2PO4, 2,52 CaCl2·2H2O, 24,88 NaHCO3, 8,30 D-Glucose, 2,0 Natriumpyruvat.
  3. Lösen Sie alle Chemikalien mit Ausnahme von CaCl₂ in doppelt destilliertem Wasser in einem 2-L-Flask unter kontinuierlichem Begasen mit Carbogen (95 % O₂/5 % CO₂) mindestens 10 Minuten lang auf, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.
  4. Fügen Sie CaCl₂ anschließend hinzu, um eine Fällung zu vermeiden.
  5. Setzen Sie das Begasen der Lösung mit Carbogen weitere 10 Minuten fort.
  6. Filtrieren Sie die KHB-Lösung unter Vakuum durch einen 0,2-µm-Membranfilter, um kleine Partikel zu entfernen, die die koronare Mikrozirkulation verstopfen könnten.
  7. Füllen Sie die filtrierte KHB-Lösung in ein 2-L-Glaskolben, der in ein vorgewärmtes Wasserbad bei 37 °C gestellt wird.
  8. Verbinden Sie den KHB-Kolben mit der Glasdrucksäule, sodass oxygeniertes KHB kontinuierlich durch den Druck des Carbogen-Gases im Kolben in die Säule nachfließt.
  9. Stellen Sie sicher, dass das Ausfluss-Schlauchsystem frei von Luftblasen ist.
  10. Äquilibrieren Sie die KHB-Lösung weitere 30 Minuten mit Carbogen, bevor das Experiment beginnt.

2. Isolation und Kanülierung des Herzens

HINWEIS: In den vorliegenden Experimenten wurden männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 20–25 g verwendet. Alle experimentellen Verfahren müssen gemäß den örtlichen Vorschriften ordnungsgemäß dokumentiert werden, einschließlich der Begründung, des Datums und der Methode der Euthanasie.

  1. Legen Sie die Maus vorsichtig in eine Induktionskammer mit 5 % Isofluran (v/v) zur Anästhesieinduktion.
  2. Überprüfen Sie die Anästhesietiefe durch das vollständige Fehlen einer Reaktion auf einen kräftigen Zehenquetschtest und überführen Sie die Maus anschließend auf den Operationstisch. Töten Sie die Maus unverzüglich durch Halswirbeldislokation, erkennbar am Aussetzen der Atmung und am Verlust des Muskeltonus im unteren Körperbereich.
  3. Schneiden Sie den Rippenkorb beidseitig bis zum Brustbein, um Herz und aufsteigende Aorta vollständig freizulegen.
  4. Fassen Sie das außerkardiale Gewebe mit einer Pinzette und entfernen Sie das Herz.
  5. Legen Sie das Herz in einen kleinen vorgekühlten Becher mit 50 mL eiskalter KHB-Lösung, um eine kardioplegische Arrestierung herbeizuführen, mindestens 30 s lang.
    ANMERKUNG: Da die Herztätigkeit stark temperaturabhängig ist, wird das Herz durch Eintauchen in eiskalte KHB-Lösung vollständig stillgelegt.
  6. Überführen Sie das Herz auf ein vorab gekühltes, mit KHB-Lösung angefeuchtetes Wattepad, das in einer Metallschale liegt, in der ein Kanülensystem an einen Dreiweghahn angeschlossen wurde. (Abbildung 1B).
    ANMERKUNG: Das Perfusionsystem sollte frei von Luftblasen sein.
  7. Platzieren Sie vorab einen lockeren halben Quadratknoten aus einer 5-0-Seidenlitze am distalen Ende der Kanüle.
  8. Lösen Sie vorsichtig den Thymus, das Bindegewebe und restliches außerkardiales Gewebe (einschließlich Lunge und Speiseröhre), um die Aortenwurzel freizulegen und zurechtzuschneiden.
    ANMERKUNG: Achten Sie auf eine ausreichende Länge der aufsteigenden Aorta für eine erfolgreiche Kanülierung.
  9. Montieren Sie das Herz auf die Kanüle und fixieren Sie es mit der vorplatzierten Naht.
  10. Spülen Sie das Herz mit 5 mL eiskalter PBS, um restliches Blut aus dem Koronarkreislauf auszuspülen.

3 Ex vivo-Myokardischämie und Reperfusion

HINWEIS: Eine globale myokardiale Ischämie wurde durch einfaches Stoppen der Herzperfusion induziert, während eine regionale myokardiale Ischämie durch vorübergehende Ligatur der LAD unter einem Stereomikroskop erzeugt wurde.

  1. Positionieren Sie die A. coronaria sinistra (LAD) mittig im Sichtfeld, indem Sie das Herz durch vorsichtiges Verstellen des darunterliegenden Wattepads leicht drehen. Während der PBS-Perfusion wird die LAD transparent und deutlich vom umgebenden Myokard unterscheidbar.
  2. Führen Sie eine abgerundete Nadel mit einer 8–0-Polypropylennahtrung unterhalb der LAD etwa 1 mm unterhalb des unteren Randes des linken Vorhofs hindurch.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dass sich die LAD genau in der Mitte zwischen den beiden Einstichstellen befindet, um eine vaskuläre Verletzung durch die Ligatur zu vermeiden.
  3. Legen Sie ein weiches Pflasterstück über die LAD.
  4. Ziehen Sie die Naht fest, um die Perfusion distal zur Ligaturstelle zu unterbinden.
  5. Überführen Sie das kanülierte Herz in die Langendorff-Apparatur und beginnen Sie mit der retrograden Perfusion.
  6. Tauchen Sie das Herz in das mit Wasser umspülte Organgefäß ein, um während des gesamten Versuchszeitraums eine konstante Temperatur (37 °C) aufrechtzuerhalten.
  7. Überwachen Sie den maximalen und den stationären koronaren Fluss (Tabelle 1).
  8. Zu den festgelegten Zeitpunkten der myokardialen Ischämie (siehe Ergebnisse) stellen Sie die Perfusion ein und nehmen Sie das kanülierte Herz aus der Perfusionsapparatur.
  9. Tauchen Sie das Herz unverzüglich in eiskaltes KHB (4 °C), um die Herzkontraktion vollständig zu stoppen.
  10. Platzieren Sie das Herz erneut auf dem Wattepad in der vorgekühlten Metallschale und lösen Sie die LAD-Ligatur.
  11. Für pharmakologische Interventionsstudien injizieren Sie an dieser Stelle 5 µL Interleukin-6 (IL-6, 0,1 mg/mL) mithilfe einer 30-G-Insulinspritze in die infarzierte vordere Wand.
  12. Befestigen Sie das kanülierte Herz erneut an der Perfusionsapparatur und setzen Sie die Herzperfusion (Reperfusion) fort.

4. Beurteilung der myokardialen Schädigung und Überlebensrate

HINWEIS: Die Färbung mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) färbt vitales Myokard tiefrot, während infarziertes bzw. nekrotisches Gewebe nach Fixierung mit Zamboni-Lösung beige erscheint.

ACHTUNG: TTC gilt im Allgemeinen als gefährlich und erfordert sorgfältige Handhabung, da es milde Hautreizungen, schwere Augenreizungen verursachen kann und bei Einatmen schädlich ist. Entsorgen Sie Abfälle und Rückstände gemäß den Anforderungen der örtlichen Behörden.

  1. Beenden Sie die Perfusion 90 min nach Reperfusion und tauchen Sie das Herz unverzüglich in eiskaltes KHB, um die Herzkontraktion zu stoppen.
  2. Verbinden Sie die Kanüle mit einer 3-mL-Spritze, die vorab mit TTC-Färbelösung (1 % TTC in PBS gelöst) gefüllt wurde. über ein Dreifach-Hahn
  3. Infundieren Sie 1 mL TTC-Lösung in das Herz, wiederholen Sie die Infusion dreimal und verabreichen Sie insgesamt 3 mL über einen Zeitraum von 15 Minuten.
  4. Decken Sie das Herz mit feuchtem Papiertuch ab, um Austrocknung der Oberfläche zu vermeiden.
  5. Legen Sie das Herz in ein Zentrifugenröhrchen, das 3 mL TTC-Lösung enthält, 4 °C über Nacht
  6. Stellen Sie einen Gewebeklotz mit dem Schnitttemperatur-Optimierungsmittel (OCT) her.
    HINWEIS: Der Gewebeprobeblock kann bei −80 °C mehrere Monate lang, bis zur weiteren Analyse.
  7. Montieren Sie den Gewebeprobeblock mit OCT-Verbindung auf einer Kryostat-Spannvorrichtung.
  8. Cryosektionieren Sie das Herz nacheinander mit einer Dicke von 50 µm und sammeln Sie jeweils alle 10th Abschnitt; pro Herz werden im Allgemeinen etwa 8 Gewebeschnitte erhalten.
  9. Bringen Sie alle 8 Schnitte auf einem Objektträger an und trocknen Sie sie mit einem Fön für 2–3 min.
  10. Tauchen Sie die Schnitte in eine Färbegefäße mit Zamboni-Lösung (ein Fixans mit 2 % Paraformaldehyd und 0,4 % Pikrinsäure, w/v) und lassen Sie sie über Nacht bei 4 °C.
    ACHTUNG: Das Zamboni-Fixans kann allergische Hautreaktionen hervorrufen und wird verdächtigt, genetische Defekte und Karzinogenese zu verursachen. Entsorgen Sie Abfälle und Rückstände gemäß den Vorschriften der örtlichen Behörden.
  11. Die Schnitte dreimal mit PBS waschen und die Schnitte mit Eindeckmedium bedecken.
    HINWEIS: TTC-gefärbte Herzproben können bei Raumtemperatur mehrere Monate lang aufbewahrt werden.
  12. Erwerben Sie Herzbilder mit einem Lichtmikroskop mit 1,25x-Objektiv unter Verwendung der CellSens-Software.
  13. Zur Quantifizierung der Infarktgröße importieren Sie die Bilddateien in die ImageJ-Plattform.
  14. Im ImageJ-Menü auswählen Bild -> Anpassen -> Farbschwellenwert um das Fenster „Farbschwellen“ zu öffnen (Abbildung 2B).
  15. Wählen Sie einen kleinen interessierenden Bereich (ROI) innerhalb des Herzabschnitts aus und verwenden Sie das tiefrote vitale Myokard und das beige farbene infarzierte/nekrotische Gewebe als Farbreferenzen.
  16. Klicken Sie auf Probe in der Farbschwelle Fenstern Sie den Bereich und justieren Sie den Sättigungsbereich so lange, bis der ausgewählte Bereich genau mit dem Ziel-Farbbereich übereinstimmt.
  17. Klicken Sie auf Selektion um den Bereich abzugrenzen, der der ausgewählten Farbe entspricht.
  18. Aus dem ImageJ-Menü auswählen Analysieren -> MessenDie Fläche des ausgewählten Bereichs, angegeben in Pixeln, wird im Ergebnisfenster angezeigt.
  19. Exportieren Sie die Messdaten in eine Excel-Tabelle, um die planimetrische Infarctgröße zu berechnen.
  20. Zur Quantifizierung des vitale Myokard im infarzierten Bereich grenzen Sie den interessierenden Bereich (ROI) hauptsächlich an der infarzierten vorderen Ventrikelseptumwand ab, wo IL-6 injiziert wurde.
  21. Öffnen Sie die ROI-Manager aus dem ImageJ-Menü und klicken Sie auf Hinzufügen um das ausgewählte ROI zur ROI-Liste hinzuzufügen (Abbildung 2C).
  22. Verwenden Sie die Funktionen „Sample“ und „Selection“ wie oben beschrieben, um das vitale Myokard (tiefrot) abzugrenzen.
  23. Fügen Sie den ausgewählten lebensfähigen Bereich der „ROI-Manager“-Liste hinzu und wählen Sie dann aus UND um die Überlappung zwischen der ROI und dem vitalem Myokard zu erhalten.
  24. Messen Sie die Fläche des vitablen Myokards und berechnen Sie die Kardiomyozyten-Überlebensrate innerhalb der ausgewählten ROI.
    HINWEIS: Die methodischen Einzelheiten zur TTC-Färbung und zur Quantifizierung der Infarctgröße wurden bereits früher beschrieben11.

Ergebnisse

In der ex vivo-MI-Plattform wurden zwei ischämische Protokolle am isolierten Mausherzen untersucht. Die globale Ischämie, die in ex vivo-MI-Studien weit verbreitet ist, führte zu einer heterogenen ischämischen Schädigung im gesamten Herzen. Mithilfe eines zuverlässigen und hochauflösenden mikroskopischen, TTC-basierten Nachweisverfahrens12 wurde gezeigt, dass das atriale Myokard und der apikale Bereich relativ ischämieresistent waren und nach 45 Minuten globaler No-Flow-Ischämie vital blieben (Abbildung 2A, oberes Panel). Im Gegensatz dazu verursachte die regionale MI eine lokal begrenzte ischämische Schädigung im Myokard distal zur LAD-Ligationsstelle. Unter diesen Bedingungen blieben Teile des subepikardialen Myokards TTC-positiv, was auf die Erhaltung von vitalem Gewebe hindeutet (Abbildung 2A, unteres Panel). Diese Befunde zeigen unterschiedliche Muster des myokardialen Überlebens zwischen den beiden ischämischen Protokollen auf.

Die minimale Dauer der Ischämie und Reperfusion, die erforderlich ist, um bei der isolierten Maus-Herzpräparation zuverlässig und reproduzierbar einen Myokardinfarkt auszulösen, wurde weiter untersucht. Die myokardiale Schädigung nahm progressiv zu, je länger die Ischämiedauer von 30 min auf 120 min verlängert wurde (Abbildung 3A). Bemerkenswerterweise verdoppelte sich die Infarktgröße zwischen 30 min (n = 3) und 45 min (n = 5) Ischämie und erreichte offenbar ein Plateau, als die Ischämiedauer auf 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) und 120 min (n = 3) verlängert wurde (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Myokardvitalität gegenüber einer Ischämiedauer über 30 min äußerst empfindlich ist. Im Vergleich zum in vivo-MI-Modell (ivMI, n = 5) ergab das ex vivo-MI-Modell (evMI, n = 8) nahezu identische Infarktgrößen bei vergleichbaren Ischämie- und Reperfusionsdauern (36,88 % ± 3,91 % vs. 37,8 % ± 2,17 %, p = 0,27), was darauf hindeutet, dass die myokardiale Schädigung durch die Kristalloidperfusion nicht wesentlich beeinflusst wurde. Dennoch wiesen die evMI-Herzen dickere ventrikuläre Wände und einen verkleinerten ventrikulären Lumen auf, wahrscheinlich bedingt durch ein myokardiales Ödem im Zusammenhang mit der Kristalloidperfusion (Abbildung 3C).

Unter Ausnutzung des relativ kontrollierten Milieus, frei von extrakardialen Einflüssen, wurden die kardioprotektiven Wirkungen einer intramyokardialen IL-6-Applikation untersucht. In Kontrollherzen, die mit PBS behandelt wurden, blieben verstreute, aber messbare lebensfähige Kardiomyozyten (viable CMs; tiefrot) innerhalb des infarzierten/nekrotischen Bereichs (beige) nachweisbar, selbst nach 45 min Ischämie (Abbildung 4; 1,05 % ± 0,44 %, SEM, n = 4). Bemerkenswerterweise erhöhte die intramyokardiale Applikation von IL-6 (i.m.; Pfeile) signifikant die Menge an lebensfähigen CMs, die vorwiegend um die Injektionsstelle innerhalb des interessierenden Bereichs (ROI; 4,08 % ± 0,99 %, SEM, n = 6; p = 0,005, Student’s t-Test) lokalisiert waren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass IL-6 das Überleben von Kardiomyozyten nach ischämischem Schaden fördern könnte.

Schließlich weist das derzeitige ex vivo-MI-Modell mehrere mögliche Fallstricke auf, die die Reproduzierbarkeit der experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen können. Wie in Abbildung 5 gezeigt, kann ein Abrutschen der Ligatur zu einer unzureichenden LAD-Okklusion und umfangreichem myokardialem Überleben (4/168) führen; gleichzeitig kann eine unvollständige Reperfusion auftreten, wenn Zweige der LAD beschädigt sind (12/168). Außerdem kann eine Luftembolie während der Aortenkatheterisierung ebenfalls myokardiale Schäden verursachen (Pfeile, 7/168), wodurch eine Unterscheidung zwischen ischämischer und embolischer Schädigung für die Quantifizierung erschwert wird. Schließlich kann eine unzureichende TTC-Färbung auftreten, wenn das Herz übermäßig perfundiert wird (11/168), was die Abgrenzung des Infarktgebiets erheblich erschwert.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus. Das nicht-rezirkulierende, gravitationsgetriebene Langendorff-System mit konstantem Druck wurde entwickelt, um nährstoffreiches, mit Sauerstoff angereichertes Krebs-Henseleit-Pufferlösung (KHB) bei einem konstanten hydrostatischen Druck von 110 cmH₂O bereitzustellen.₂O. KHB wurde zunächst vorgewärmt auf 37 °C in einem Reservoir gesammelt und einer wassergekühlten Drucksäule zugeführt, in der ein konstanter hydrostatischer Druck von 110 cmH₂O aufrechterhalten wird2O wurde beibehalten über ein Druckregler. Das perfundierte Herz wurde in ein höhenverstellbares, wassergeheiztes Organglasbad eingetaucht, um eine konstante Temperatur von 37 °C während des gesamten Versuchszeitraums (A). Der Myokardinfarkt wurde durch eine vorübergehende Ligatur der linken absteigenden Koronararterie (LAD) nach kardioplegischem Stillstand auf dem Wattepad in einer vorab gekühlten Metallschale induziert (B). Das Verfahren wurde unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Regionales versus globales Myokardinfarkt (MI) und Bestimmung der Infarktgröße. Ein globaler MI verursacht ischämisches Gewebeleiden im gesamten Herzen, wie durch die gelbe Färbung in mikroskopischen TTC-Bildern angezeigt. Das Vorhofmyokard und der apikale Bereich erwiesen sich als resistenter gegenüber Ischämie und blieben nach 45 min globaler No-Flow-Ischämie lebensfähig (oberes Feld in A). Ein regionaler MI verursacht ischämisches Gewebeleiden im Myokard distal zur LAD-Ligationsstelle. In diesem Fall erscheinen Teile des subepikardialen Myokards rot gefärbt, was auf Erhalt lebensfähigen Gewebes hindeutet (unteres Feld in A). Die Infarktgröße wurde mittels ImageJ quantifiziert, wobei die infarzierte/nekrotische Fläche und das vitale Myokard anhand ihrer unterschiedlichen Färbungen abgegrenzt wurden (B). Das Überleben der Kardiomyozyten innerhalb des interessierenden Bereichs (ROI) wurde berechnet, indem der Prozentsatz der tiefroten Färbung im ausgewählten ROI ermittelt wurde (C). Maßstabsbalken: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Auswirkung der Ischämiedauer auf die Infarctgröße. Die myokardiale Schädigung verschlimmerte sich progressiv, je länger die Ischämiedauer von 30 min auf 120 min verlängert wurde (A). Die Infarctgröße mehr als verdoppelte sich zwischen 30 min (n = 3) und 45 min (n = 5) Ischämie und erreichte offenbar ein Plateau, als die Ischämiedauer auf 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) und 120 min (n = 3) verlängert wurde (B). Im Vergleich zum in vivo-MI-Modell (ivMI, n = 5) ergaben die ex vivo-MI-Herzen (evMI, n = 8) nahezu identische Infarctgrößen bei vergleichbaren Ischämiedauern (36,88 % ± 3,91 % vs. 37,8 % ± 2,17 %, p = 0,27, Student’s t-Test). Die evMI-Herzen wiesen eine dickere ventrikuläre Wand und einen verkleinerten ventrikulären Lumen auf, wahrscheinlich bedingt durch ein myokardiales Ödem im Zusammenhang mit kristalloider Perfusion (C). Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung des Mittelwerts (SDM). Maßstabsbalken: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: IL-6 verbesserte das Überleben von Kardiomyozyten nach ischämischem Schaden. Die intramyokardiale (i.m.) Applikation von IL-6 im evMI-Modell führte zu einer messbaren Anzahl lebensfähiger Kardiomyozyten (viable CMs; tiefrot) innerhalb des infarzierten/nekrotischen Bereichs (beige), die hauptsächlich um die IL-6-Injektionsstelle lokalisiert waren (Pfeile, linkes Panel). Die Quantifizierung lebensfähiger CMs innerhalb des interessierenden Bereichs (ROI, durch gestrichelte Linien gekennzeichnet) zeigte, dass die Injektion von PBS nur einen geringen Anteil an lebensfähigem Myokard ergab (1,05 % ± 0,44 %, SEM, n = 4), während die Injektion von IL-6 den Anteil lebensfähiger CMs im ROI signifikant erhöhte (4,08 % ± 0,99 %, SEM, n = 6; p = 0,005, Student’s t-Test). Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung des Mittelwerts (SDM). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Unzufriedenstellende oder erfolglose Ergebnisse aufgrund technischer Fehler. Wie durch die repräsentative Myokardverletzung im ex vivo-MI-Modell (links) veranschaulicht, können vitales und nekrotisches Myokard im typischen TTC-Färbungsbild im Allgemeinen deutlich voneinander unterschieden werden. Mehrere technische Fehler können jedoch zu unzufriedenstellenden oder nicht interpretierbaren Ergebnissen führen. Eine unzureichende LAD-Ligatur infolge Abschlupfens der Naht kann zu umfangreichem Myokardüberleben trotz prolongierter Ischämie führen. Eine unvollständige Reperfusion kann auftreten, wenn Äste der LAD während der Ligatur beschädigt und anschließend schlecht durchblutet werden, wodurch ein Muster entsteht, das dem klinisch beobachteten „No-Reflow“-Phänomen ähnelt. Solche Bereiche können eine rosa Färbung aufweisen (Pfeile). Eine mikrovaskuläre Embolisierung durch Luftblasen, die während des Kanülierungsverfahrens in den Koronarstrom eindringen, kann ebenfalls eine Myokardverletzung verursachen (Pfeile), wodurch es schwierig wird, ischämische von embolischen Läsionen zur Quantifizierung zu unterscheiden. Schließlich kann eine unzureichende TTC-Färbung auftreten, wenn das Herz übermäßig perfundiert wird, was eine Myokardverletzung unabhängig von Ischämie hervorrufen kann. Maßstabsbalken: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

F-Spitze (n = 19)F-Dauerzustand (n = 19)RF-Spitze (n = 19)RF-Dauerzustand (n = 19)
Mittelwerte (mL/min)2.540.7820.99
SD0.590.290.560.53

Tabelle 1: Koronarfluss auf maximalem (F-peak) und stationärem (F-steady) Niveau während Ischämie und Reperfusion (RF-peak und RF-steady).

Diskussion

Das derzeitige ex vivo-MI-Modell basiert hauptsächlich auf anspruchsvollen Langendorff-perfudierten Herzsystermen2. Eine häufige Fehlerquelle während der Vorbereitung ist das Eindringen von Luftblasen in den koronaren Kreislauf, was zu embolischen Schäden führen und die Beurteilung der ischämischen Schädigung erschweren kann. Um dieses Problem zu vermeiden, ist eine sorgfältige Überprüfung des Perfusionsystems unmittelbar vor jedem Experiment unerlässlich. Falls sich kleine Luftblasen im Schlauchsystem festsetzen, kann eine retrograde Spülung mit KHB, um die Blasen zurück in die Drucksäule zu verdrängen, zur Behebung des Problems beitragen.

Der entscheidende Schritt in diesem Protokoll ist die Ligatur der A. coronaria anterior (LAD). Daher ist zunächst eine genaue visuelle Identifizierung der LAD von entscheidender Bedeutung. In den meisten Fällen werden die koronaren Gefäße nach Spülung des Herzens mit eiskalter PBS-Lösung durchscheinend, wodurch die LAD deutlich vom umgebenden Myokard unterscheidbar ist. Außerdem ist eine korrekte und geschickte Ligaturtechnik ebenso wichtig, da eine zu starke Zugbelastung der 8-0-Polypropylennahtrung die LAD durchtrennen und eine anschließende Reperfusion unmöglich machen kann. Um dieses Risiko zu minimieren, sollte zwischen Nahtmaterial und Gefäß ein passend dimensionierter weicher Pledget platziert werden, um die Ligaturkraft zu verteilen und die Koronararterie vor mechanischer Schädigung zu schützen. Dennoch ist eine geringfügige, durch die Ligatur verursachte Myokardschädigung unvermeidlich, beeinträchtigt jedoch in der Regel weder die koronare Perfusion noch das Ergebnis des Experiments. Schließlich ist die Myokardschädigung äußerst temperatursensitiv13, weshalb eine konstante Temperatur während des gesamten Experiments von entscheidender Bedeutung ist. Insbesondere bei Perfusionsbedingungen mit konstantem Druck kann zwischen Perfusionskolonne und Herz ein Wärmeverlust auftreten, der dynamisch von der koronaren Flussrate abhängt14. Solche Schwankungen können somit zu Temperaturschwankungen im Myokard führen. Unter diesen Bedingungen ist ein wassergekühltes Organglas zur Aufrechterhaltung stabiler thermischer Bedingungen äußerst empfehlenswert (Abbildung 1A).

Sobald diese technischen Herausforderungen überwunden sind, bietet das ex vivo-MI-Modell eine zuverlässige und reproduzierbare Plattform zur Induktion einer myokardialen Verletzung im isolierten Mausherzen (Abbildung 3A). Es stellt daher ein wertvolles experimentelles System dar, um das Überleben des Myokards nach einem MI zu untersuchen, lokal applizierte therapeutische Maßnahmen zu evaluieren und hochauflösende Bildgebungsverfahren durchzuführen, ohne durch Atem- oder Herzbewegungen gestört zu werden. Obwohl das globale MI-Protokoll technisch unkompliziert ist und in früheren Studien bereits weit verbreitet wurde4, besteht seine wesentliche Einschränkung darin, dass die Dauer der globalen Ischämie im Allgemeinen auf weniger als 45 min begrenzt ist3. Folglich führt es im Gegensatz zum regionalen MI-Modell selten zu einer transmuralen Infarktbildung (Abbildung 2).

Ein einzigartiges Merkmal des ex vivo-MI-Modells ist das Fehlen systemischer Einflüsse, einschließlich der neuronalen Regulation und zirkulierender Blutbestandteile, wodurch Forscher die direkten lokalen Wirkungen therapeutischer Interventionen am Myokard bewerten können8. Dies ist insbesondere für Zytokine wie IL-6 und die nachgeschaltete PI3K/AKT-Signalübertragung relevant, die in isolierten Kardiomyozyten als kardioprotektiv nachgewiesen wurden15. In vivo hingegen sind die kardialen Wirkungen von IL-6 oft inkonsistent oder sogar widersprüchlich, da IL-6 gleichzeitig Immunzellen aktiviert und entzündliche Reaktionen fördert, die seine direkten kardioprotektiven Wirkungen aufheben können16. In Übereinstimmung mit diesem Konzept zeigte unser ex vivo-Modell überzeugend, dass die lokale intramyokardiale Applikation von IL-6 die Myokardviabilität nach ischämischer Schädigung signifikant erhält17,18 und damit einen direkten kardioprotektiven Effekt von IL-6 an Kardiomyozyten unterstützt (Abbildung 4).

Wir erkennen mehrere Limitationen des vorliegenden ex vivo-MI-Modells an. In der vorliegenden Versuchsanordnung wurde die kardiale Kontraktionsfunktion im gegenwärtigen Protokoll nicht evaluiert.3Dies lag daran, dass das primäre Ziel darin bestand, das Überleben des Myokards in einem regionalen MI-Modell zu charakterisieren, und daran, dass eine kontraktile Dysfunktion die funktionelle Beeinträchtigung nach ischämischem Schaden widerspiegelt, jedoch nicht zwangsläufig auf den Tod von Kardiomyozyten hinweist.8. Darüber hinaus die ex vivo Das MI-Modell schließt von sich aus zirkulierende Blutbestandteile, Immunzellen und neurohumorale Einflüsse aus, die wesentlich zum Fortschreiten des Myokardinfarkts und zur kardialen Remodelung beitragen können. in vivo. Obwohl diese Verringerung der systemischen Komplexität ein großer Vorteil des ex vivo MI-Modell, schränkt jedoch seine breite Anwendung bei der Nachbildung der entzündlichen, vaskulären, neuronalen und endokrinen Reaktionen, die auftreten können, ein in vivoSchließlich wurde festgestellt, dass die Kristalloid-Perfusion mit myokardialem Ödem assoziiert ist, wie durch eine erhöhte Ventrikelseptumdicke und eine verminderte Ventrikellichtung im Vergleich zu in vivo MI-Herzen. Das häufig auftretende Ödem kann die myokardiale Architektur, die Gewebediffusion und möglicherweise die zelluläre Vitalität verändern. Daher sollte das vorliegende Modell als kontrollierte Plattform zur Untersuchung myokardialer Schädigungen und kardiomyozytenspezifischer Mechanismen betrachtet werden.

Dennoch stellt das hier beschriebene ex vivo-MI-Modell eine einfache und kostengünstige Plattform zur Beurteilung des myokardialen Überlebens in Abwesenheit extrinsischer regulatorischer Einflüsse dar. Angesichts der zunehmenden Nutzung genetisch modifizierter Mausmodelle könnte dieser Ansatz besonders wertvoll sein, um kardioprotektive Mechanismen mittels fortschrittlicher Bildgebung, elektrophysiologischer Ableitungen und molekularer Analysen zu untersuchen. Darüber hinaus ließe sich das Modell anpassen, um lokal begrenzte pharmakologische oder genbasierte Interventionen systematisch zu testen und kardiomyozytenspezifische Mechanismen ohne systemische störende Faktoren zu untersuchen. Somit bietet das ex vivo-MI-Modell eine ergänzende experimentelle Plattform, die die Identifizierung und mechanistische Erforschung kardioprotektiver Signalwege erleichtert.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben. Die Autoren erklären, dass bei der Ausarbeitung, Datenanalyse, Erstellung der Abbildungen oder Validierung dieser Arbeit keine KI-Tools (künstliche Intelligenz) oder generative, KI-gestützte Technologien verwendet wurden.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Generalprojekt der Jiangsu Geriatrics Society (JGS2026MS019 an WO), die Stiftung für soziale Entwicklung des Wissenschafts- und Technologiedepartments der Stadt Zhenjiang (Förderkennzeichen SH2023023 an H.Z. und SH2023057 an X.L.), das FoKo-Programm (Förderkennzeichen 23/2013 an ZD) und das Herz-Kreislauf-Forschungsinstitut Düsseldorf (CARID).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2,3,5-TriphenyltetrazoliumchloridMilipore1.08380.0100Chemikalien
AortenkanüleBD305895 (20 G)Retroperfusion
AquamountBDH362262HKryoschnitt
WaageOhaus-Wiegen von Chemikalien
Große PinzetteAESCULAP-Chirurgische Instrumente
BlutgasanalysatorRadiometerABL90 FLEX PLUSGasanalysator
Calciumchlorid-DihydratFluka21097Chemikalien
CarbogenLinde4040152Langendorff-Apparatur
CellSensOlympusVersion 3.1.1Bildgebungssoftware
BaumwolltupferBEESanaPZN-1330900Chirurgische Instrumente
DeckgläserEprediaBB02400500A113MN20Kryoschnitt
KryostatLeicaM850Kryoschnitt
D(+)-Glucose, wasserfreiMerck8337.1000Chemikalien
Doppelt destilliertes WasserMilipore-Lösen von Chemikalien
Äthanol (100 %)Merck64-17-5Reinigung von Schläuchen
Äthanol (70 %)VWRUN1170Reinigung von Schläuchen
Filtersmembran (0,2 µm)Thermo Scientific8-000-230511Langendorff-Apparatur
DurchflussmesserTransonicT4S410Langendorff-Apparatur
GlasobjektträgerEngelbrecht11102Kryoschnitt
Glaswassersäulehausgemacht-Langendorff-Apparatur
SalzsäureRothP074.1Chemikalien
ImageJNIHVersion 1.54gSoftware
Interleukin-6Biolegend570804Chemikalien
IsofluranPiramal14150097146754Chemikalien
LeichtmikroskopOlympusBX61Bildgebung
Magnesiumsulfat-HeptahydratMerck5886.1000Chemikalien
Medizinischer DurchflussfühlerTransonic3PXNLangendorff-Apparatur
Metallschalehausgemacht-Chirurgische Instrumente
Micro-Fine-SpritzeBD30G / 0,3 mLLangendorff-Apparatur
MausJanvierC57BL/6JTiere
Objektiv (x 1,25)OlympusPlanApo 1,25X/0,04Bildgebung
OCT-VerbindungSakura4583Chemikalien
Petri-SchaleThermo Scientific172931Langendorff-Apparatur
Phosphatgepufferte KochsalzlösungRoth9143.1Chemikalien
KaliumchloridMerck4936.1000Chemikalien
MonopotassiumphosphatMerck4873.1000Chemikalien
SeidennahtF.S.T18020-60Chirurgische Instrumente
NatriumchloridSigmaaldrichSZBD0810VChemikalien
NatriumhydrogencarbonatRoth6885.2Chemikalien
NatriumpyruvatSigmaaldrich113-24-6Chemikalien
Weicher TupferDeknatelL-705Chirurgische Instrumente
Edelstahlpinzette (8 mm)F.S.T11052-10Chirurgische Instrumente
EdelstahlschereAESCULAPBC702RChirurgische Instrumente
EdelstahlschereAESCULAPBC257RChirurgische Instrumente
StereomikroskopLeicaMZ6Chirurgische Instrumente
Naht (8-0)EthiconTG-108Chirurgische Instrumente
Spritze (3 mL)B. Braun4617100VRetroperfusion
DreiwegehahnB. Braun16494CRetroperfusion
SchlauchTygonT3304-23Langendorff-Apparatur
WasserbadHAAKEDC1/B3Langendorff-Apparatur
Zamboni-LösungMorphisto12773.0050Chemikalien

Referenzen

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