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Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Die Elektroakupunktur lindert chronisches Herzversagen und pathologisches kardiales Remodeling, indem sie die neuronale Aktivität im Nucleus tractus solitarii wiederherstellt. Diese therapeutische zentrale Neuromodulation ist mit der Hochregulierung des in Betracht gezogenen biologischen Zieltranskriptionsfaktors YY1 assoziiert.
Chronisches Herzversagen (CHF) ist eine weltweit führende Ursache für kardiovaskuläre Mortalität, verursacht durch autonome Dysregulation und übermäßige sympathische Aktivierung. Obwohl Elektroakupunktur (EA) kardioprotektive Wirkungen über zentrale Neuromodulation entfaltet, bleiben ihre spezifischen molekularen Zielstrukturen im Nucleus tractus solitarius (NTS), einem zentralen Integrationskern des autonomen Nervensystems, unklar. Zur Untersuchung wurde ein CHF-Rattenmodell durch Ligatur der linken absteigenden Koronararterie etabliert. Die Tiere erhielten EA an bilateralen HT7-Akupunkturpunkten über sieben aufeinanderfolgende Tage. Die Herzfunktion und myokardiale Schädigungen wurden mittels Echokardiographie, enzymgekoppelten Immunadsorptionsassays und histologischer Färbungen bewertet. Die neuronale Aktivität im NTS wurde über c-Fos-Immunfluoreszenz und in-vivo-Elektrophysiologie analysiert. Die molekularen Mechanismen wurden mittels quantitativer Proteomik und Bioinformatik untersucht, wobei zentrale Zielstrukturen durch quantitative PCR und Western Blotting validiert wurden. EA verbesserte die linksventrikuläre Ejektionsfraktion, verringerte die myokardiale Fibrose und senkte die serumgebundenen Marker für Herzinsuffizienz. Gleichzeitig normalisierte EA die spontanen Feuerraten der Neurone, die Energie der lokalen Feldpotentiale sowie die c-Fos-Expression im NTS. Die proteomische Profilierung identifizierte 85 zentrale differentiell exprimierte Proteine, die durch EA moduliert wurden. Die funktionelle Einteilung der 58 herunterregulierten und 27 hochregulierten Proteine zeigte deren jeweilige Beteiligung an der Organisation der extrazellulären Matrix und an ATP-abhängiger Chromatin-Remodellierung. Der schrittweise Screening-Ansatz, der topologische Netzwerkanalyse, Pfad-Anreicherung und Gewebe-Expressionsprofilierung kombinierte, identifizierte den Transkriptionsfaktor YY1 als vielversprechendes, hochgradig ansprechbares Zielmolekül. Die in-vivo-Validierung bestätigte, dass EA die Expression von YY1 hochregulierte. Insgesamt milderte EA die pathologische kardiale Remodellierung und normalisierte die neuronale Aktivität im NTS. YY1 wurde als Kandidatenzielstruktur identifiziert, die mit dieser zentralen Neuromodulation assoziiert ist, und liefert somit molekulare Einblicke in die Wirkmechanismen von EA bei CHF.
Chronisches Herzversagen (CHF) gilt weithin als Endstadium unterschiedlicher kardiovaskulärer Pathologien und bleibt weltweit eine der Hauptursachen für kardiovaskuläre Sterblichkeit, wodurch ein erheblicher Druck auf die globalen Gesundheitssysteme ausgeübt wird1. Der pathophysiologische Fortschritt des CHF wird hauptsächlich durch eine Dysregulation des autonomen Nervensystems verursacht, das durch eine anhaltende Überaktivierung des Sympathikus und eine Unterdrückung des Parasympathikus gekennzeichnet ist2. Die Wiederherstellung der autonomen Homöostase wird daher als entscheidende therapeutische Strategie angesehen, um die pathologische kardiale Remodelung einzudämmen und die globale Herzfunktion zu verbessern3.
Die Elektroakupunktur (EA) stellt eine moderne Weiterentwicklung der traditionellen Akupunktur dar und hat breite Anerkennung für ihre klinische Wirksamkeit bei der Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen erlangt4. Umfangreiche Forschungsarbeiten, einschließlich unserer früheren Studien, haben gezeigt, dass diese Therapie vorwiegend durch die Modulation des zentralen autonomen Nervensystems signifikante kardioprotektive Effekte entfaltet. Insbesondere konnten wir nachweisen, dass die EA am Akupunkturpunkt Shenmen (HT7) eine übermäßige sympathische Aktivität wirksam unterdrückt und das sympathovagale Gleichgewicht durch gezielte zentrale neuronale Mechanismen wiederherstellt, wodurch der pathologische Fortschritt einer chronischen Herzinsuffizienz (CHF) gemindert wird5,6,7,8.
Der Nucleus tractus solitarii (NTS), lokalisiert im Medulla oblongata, ist ein entscheidendes Integrationszentrum zur Aufrechterhaltung des zentralen autonomen Gleichgewichts. Er fungiert als primäre Relaisstation für kardiovaskuläre Reflexe und periphere sensorische Eingänge und reguliert so das dynamische Gleichgewicht zwischen sympathischem und vagalem Tonus9. Trotz seiner anatomischen und funktionellen Bedeutung sind die spezifischen molekularen Veränderungen in diesem kritischen Hirnstammzentrum während der EA-Behandlung bei CHF weitgehend unbekannt. Hochmoderne Hochdurchsatz-Proteomik in Kombination mit bioinformatischer Analyse bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die komplexen Proteinnetzwerke und Signaltransduktionskaskaden, die an diesem zentralen neurobiologischen Prozess beteiligt sind, objektiv abzubilden10.
Daher hatte diese Studie zum Ziel, die Wirkungen der Elektroakupunktur am Akupunkturpunkt HT7 auf die Herzfunktion und die neuronale Aktivität im NTS bei chronischer Herzinsuffizienz (CHF) zu untersuchen und die mit der Elektroakupunkturbehandlung assoziierten molekularen Veränderungen im NTS zu charakterisieren. Durch die Integration von In-vivo-Elektrophysiologie mit quantitativer Proteomik, bioinformatischer Analyse und molekularer Validierung suchte diese Studie nach kandidatenmolekularen Zielstrukturen, die mit der zentralen neuromodulierenden Wirkung der Elektroakupunktur bei CHF assoziiert sind.
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Alle Methoden, die Wirbeltiere betreffen, wurden gemäß den Vorschriften des Ausschusses für Tierversuche der Anhui-Universität für Chinesische Medizin unter der Genehmigungsnummer AHUCM-rats-2024145 durchgeführt. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
Vorbereitung und Gruppierung der Tiere
Für alle Experimente wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 8 Wochen mit einem Gewicht von 200 bis 250 g verwendet. Die Tiere wurden in einer kontrollierten Umgebung bei 24 ± 2 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50–60 % unter einem standardmäßigen 12-Stunden-Tag-Nacht-Zyklus gehalten. Allen Ratten standen Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung, und sie durchliefen eine Akklimatisierungsphase von einer Woche, bevor experimentelle Eingriffe vorgenommen wurden.
Für Experiment I, das die funktionelle und zentrale neuronale Aktivität untersuchte, wurden 24 Ratten zufällig in vier Gruppen mit jeweils sechs Tieren eingeteilt: Sham-, CHF-, EA- und Sham-EA-Gruppen (Abbildung 1A). Für Experiment II, das molekulare Zielstrukturen und die Hochdurchsatz-Proteomik bewertete, wurden 36 Ratten zufällig drei Gruppen mit jeweils 12 Tieren zugeordnet: Sham, CHF und EA. Die Stichprobengrößen wurden anhand der Resource-Equation-Methode festgelegt, um den Grundsätzen des Tierschutzes und der Reduktion zu entsprechen und gleichzeitig die statistische Aussagekraft sicherzustellen (E-Wert = 20 für Experiment I; E-Wert = 33 für Experiment II)11. Diese Strategie der Stichprobengröße war konsistent mit Protokollen früherer Studien zur EA bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen8,12. Post-hoc-Power-Analysen zeigten, dass eine statistische Power von über 0,90 die Angemessenheit dieser Aufteilung unterstützte. Die Sham-EA-Gruppe wurde von Experiment II ausgeschlossen, da vorläufige funktionelle Evaluierungen auf einen Mangel an therapeutischer Wirksamkeit hindeuteten.
Herstellung des Modells der chronischen Herzinsuffizienz
Die Ratten wurden 12 h vor der Operation nüchtern gehalten und hatten freien Zugang zu Wasser. Die Anästhesie wurde mit 3 % Isofluran induziert und während des Eingriffs mit 1,5–2 % Isofluran aufrechterhalten. Da Isofluran ein flüchtiges Anästhetikum ist, wurde ein geeignetes Absaugsystem verwendet, und der Eingriff wurde in einem gut belüfteten Bereich durchgeführt, um berufliche Exposition zu vermeiden.
Standard-Limb-Elektrokardiogramme (EKG) wurden kontinuierlich aufgezeichnet. Es wurde eine linke Thorakotomie durchgeführt, um das Herz freizulegen, und die linke absteigende Koronararterie (LAD) wurde 2 bis 3 mm unterhalb des linken Vorho-Ohrläppchens mit einer nicht resorbierbaren 7-0-Naht dauerhaft ligiert13. Ein erfolgreicher Ischämienachweis erfolgte durch die Identifizierung einer ST-Segment-Elevation von mindestens 0,2 mV im EKG (Abbildung 1B). Zur Infektionsprophylaxe und Schmerzlinderung wurden postoperativ an drei aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneale Injektionen von Penicillin (200.000 U/mL) und subkutane Injektionen von Carprofen (5 mg/kg) verabreicht.
Für die Schein-Kontrollgruppe wurde ein identisches Thorakotomieverfahren durchgeführt, gefolgt von einer oberflächlichen Nadeleinführung an der entsprechenden anatomischen Stelle, ohne Ligatur der A. coronaria sinistra (LAD). Die postoperative Versorgung und Überwachung erfolgte identisch. Vier Wochen nach der Operation wurde eine echokardiographische Beurteilung vorgenommen. Das Modell galt als erfolgreich etabliert, wenn die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) ≤45% betrug8 (Abbildung 1C). Tiere, die diese Kriterien nicht erfüllten, präoperative Grundwerte mit EKG-Auffälligkeiten aufwiesen oder einen vorzeitigen Tod erlitten, wurden systematisch ausgeschlossen. Zusätzliche Ratten wurden denselben chirurgischen Protokollen unterzogen, um ausgeschlossene Tiere unverzüglich zu ersetzen und eine einheitliche Stichprobengröße beizubehalten.
Elektroakupunktur-Intervention
Entsprechend etablierten vergleichend-anatomischen Protokollen14 wurden die bilateralen Akupunkturpunkte HT7 am Hand-Shaoyin-Herz-Meridian an der Handfläche entlang der quer verlaufenden Handgelenkfurche in der Nähe des ulnaren Randes lokalisiert, direkt in der radialen Vertiefung der Sehne des Musculus flexor carpi ulnaris. Die lokale Region wurde routinemäßig desinfiziert. Zwei sterile Einweg-Akupunkturnadeln (0,25 x 25 mm) wurden senkrecht in jede HT7-Akupunkturpunktregion bis zu einer Zieltiefe von 2 bis 3 mm eingeführt und in einem Abstand von etwa 1 mm zueinander positioniert, um streng innerhalb derselben Akupunkturpunktregion zu verbleiben. Zur video-basierten Dokumentation wurde die Einführtiefe visuell überprüft, indem der Nadelschaft vor der Einführung an der 3-mm-Marke vormarkiert wurde.
Eine Nadel wurde an den kathodischen Anschluss des EA-Geräts angeschlossen und die benachbarte Nadel an den anodischen Anschluss, um einen lokal begrenzten elektrischen Stromkreis zu erzeugen (Abbildung 1D). Über sieben aufeinanderfolgende Tage hinweg wurde täglich 30 Minuten lang eine kontinuierliche elektrische Wellenform mit einer konstanten Frequenz von 2 Hz und einer Intensität von 1 mA appliziert, kalibriert, um in den entsprechenden Gliedmaßen sichtbare, aber milde Muskelzuckungen hervorzurufen, unter Isofluran-Anästhesie.
Ein minimales Nadelprotokoll wurde auf die Sham-Interventionskohorte angewendet, um unspezifische somatosensorische Reaktionen15,16 zu berücksichtigen. Sterile Nadeln wurden oberflächlich auf eine Tiefe von 0,5–1 mm an identischen HT7-Stellen eingeführt, ohne elektrische Leitungen anzuschließen oder Strom zuzuführen, wobei die 30-minütige Anästhesiedauer beibehalten wurde. Die Baseline-Sham- und CHF-Kontrollgruppen wurden einer identischen täglichen Isofluranexposition unterzogen (1,5–2 % Isofluran für 30 Minuten täglich an sieben aufeinanderfolgenden Tagen), ohne dass Nadeln eingeführt oder elektrische Reize appliziert wurden. Dieses Vorgehen standardisierte die anästhetische Basislinie über alle experimentellen Kohorten hinweg und kontrollierte mögliche neurosuppressive oder kardioprotektive Artefakte, die durch wiederholte inhalative Anästhesie entstehen könnten.
Echokardiographische Beurteilung und Tiereuthanasie
Nach der Intervention wurden die Ratten mit 3 % Isofluran zur Einleitung und 1 % zur Aufrechterhaltung der Narkose anästhesiert und in Rückenlage auf der Tierhalterung befestigt. Das Brustfell wurde vorsichtig mit einem Enthaarungsmittel entfernt und ein akustisches Koppelgel gleichmäßig auf die freigelegte Haut aufgetragen. Die Herzfunktion wurde mithilfe eines digitalen Ultraschallsystems mit einem 18-MHz-Echowandler untersucht. M-Mode-Echokardiographie-Aufnahmen wurden angefertigt, um die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) und die linksventrikuläre Fractional Shortening (LVFS) zu bestimmen, und der Mittelwert aus 3 technischen Wiederholungen wurde für die endgültige Analyse berechnet.
Das Blut wurde aus der Bauchaorta entnommen, während die Tiere weiterhin unter Anästhesie standen, um nachfolgenden Blutverlust und Gerinnung zu verhindern und die Probenqualität für den enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sicherzustellen. Die Ratten wurden unverzüglich durch kontinuierliche Einleitung von 5 % Isofluran bis zum Erliegen von Herzschlag und Atmung euthanasiert.
Gewebeproben wurden anschließend gemäß dem experimentellen Design verteilt. Für Experiment I wurden jeweils 3 Ratten pro Gruppe verwendet, um das Herz zur Hämatoxylin- und Eosin-(HE)/Masson-Färbung und das Gehirn zur c-Fos-Immunfluoreszenz zu gewinnen. Die verbleibenden drei Ratten wurden für die in-vivo-Elektrophysiologie verwendet. Für Experiment II wurden bilaterale NTS-Gewebeproben von jeweils sechs Ratten pro Gruppe für die Proteomik entnommen. Gewebe der verbleibenden sechs Ratten wurde für die molekulare Verifizierung gesammelt: drei davon wurden für Western Blotting und qPCR verwendet, drei ausschließlich für qPCR.
Enzymgebundener Immunosorbens-Assay
Die gesammelten Blutproben wurden zur natürlichen Gerinnung bei 4 °C für 10–20 min belassen. Die Proben wurden bei 4 °C 15 min lang bei 1.000 x g zentrifugiert, um das Serum zu gewinnen, und die Überstände wurden gesammelt. Falls die Analyse nicht unmittelbar durchgeführt wurde, wurden die Serumproben bei −80 °C aufbewahrt, bis sie benötigt wurden. Die Konzentrationen von N-terminalem pro-Brain-Natriuretischem Peptid (NT-proBNP) und kardialem Troponin T (cTnT) im Serum wurden mithilfe spezifischer ELISA-Kits gemäß den Standardanleitungen quantifiziert. Die Absorptionswerte wurden gemessen, und die Biomarkerkonzentrationen wurden anhand von Standardkurven berechnet.
Die histologische und immunfluoreszenzchemische Färbung
Die gewonnenen Herzgewebe wurden in vorgekühlter 0,9%iger Natriumchloridlösung gespült, 5 mm oberhalb der Herzspitze abgeschnitten und in Paraffin eingebettet. Die Gewebeschnitte wurden entparaffiniert und rehydriert. Die HE-Färbung erfolgte durch 10-minütige Anwendung von Hämalumin, gefolgt von einer Gegengefärbung mit Eosin für 2,5 Minuten. Die Masson-Färbung wurde durch 60 Sekunden lange Anwendung von Hämalumin und anschließende 30–60 Sekunden lange Anwendung von Massons Trichrom durchgeführt. Die Schnitte wurden in 6–8%iger Phosphorsäure differenziert und für 5 Minuten mit Hellgrün gegengefärbt. Der Kollagen-Volumenanteil (CVF) wurde quantifiziert, um die myokardiale Fibrose zu bewerten.
Die gewonnenen Hirngewebe wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert, in aufsteigenden Saccharoslösungen entwässert und in einer Dicke von 30 µm geschnitten. Da Paraformaldehyd toxisch und ein vermuteter Karzinogen ist, wurde es unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung in einer chemischen Abzugshaube gehandhabt. Die Schnitte wurden mit einem Puffer, der 0,5% Triton X-100 und 3% Rinderserumalbumin enthielt, blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit einem primären Antikörper gegen c-Fos inkubiert. Danach wurden die Schnitte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und für 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln mit entsprechenden sekundären Antikörpern inkubiert. Die Schnitte wurden mit einer Fluoreszenzlöschungslösung, die 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthielt, auf Objektträger aufgebracht, und die c-Fos-positiven Neuronen wurden abgebildet.
In-vivo-Elektrophysiologie
Die Ratten wurden mit 3 % Isofluran zur Einleitung und 1 % zur Aufrechterhaltung der Narkose versetzt und in einer stereotaktischen Gehirnapparatur fixiert. Der Kopf wurde rasiert und desinfiziert. Ein medianer Schnitt wurde durchgeführt, um die Bregma freizulegen, und die Dura mater wurde entfernt. Über der NTS-Region wurde präzise ein Schädelbohrloch angelegt, basierend auf folgenden stereotaktischen Koordinaten relativ zur Bregma: anteroposterior (AP) ±12,6 mm, mediolateral (ML) ±0,9–2,1 mm und dorsoventral (DV) ±7,6–8,1 mm.
Nach Abschluss der elektrophysiologischen Ableitungen wurde die exakte stereotaktische Lokalisation der Elektrodenspitze überprüft. Zur Erzeugung einer kleinen elektrolytischen Läsion wurde kurzzeitig ein Gleichstrom von 1 mA für 10 s an die Ableitelektrode angelegt. Nach dem Experiment wurde das Hirnstammgewebe geschnitten, und der Läsionsverlauf wurde histologisch bestätigt, wobei sich zeigte, dass er anatomisch innerhalb des NTS lokalisiert war.
Ein achtkanaliges (2 x 4) Mikroelektrodenarray wurde implantiert und mithilfe eines motorisierten Mikromanipulators schrittweise mit einer Geschwindigkeit von 5 µm/s in die Zielregion des Gehirns vorgeschoben. Sobald sich eine stabile neuronale Aktivität etabliert hatte, wurden Aufzeichnungen kontinuierlich über einen Zeitraum von 400 s durchgeführt. Mit einem Multikanal-Aufzeichnungssystem wurden neuronale Aktionspotentiale (gefiltert bei 150–8.000 Hz, Abtastrate 40 kHz) und lokale Feldpotentiale (LFP; gefiltert bei 0,7–400 Hz, Abtastrate 1 kHz) erfasst.
Zur Eliminierung typischer Interferenzsignale mit hoher Amplitude und Artefakte mittels Wellenform-Kreuzkorrelation wurde eine Spike-Sortierungssoftware verwendet. Die anschließende Analyse der neuronalen Signale erfolgte mit einer Software zur Neuralanalyse. Neuronen wurden nur dann als aktiv klassifiziert, wenn sie eine spontane mittlere Feuerrate von >2 Hz aufwiesen und ein stabiles Signal-Rausch-Verhältnis von >3:1 beibehielten. Die Schwelle von 2 Hz wurde basierend auf den etablierten physiologischen Eigenschaften von autonomiebezogenen Neuronen im NTS gewählt; sie schloss effektiv vorwiegend stille Zellen und niederfrequente, atemrhythmische Burstaktivitäten aus, wodurch sichergestellt wurde, dass die Analyse auf tonisch aktive Neuronen fokussiert blieb, die an der basalen kardiovaskulären Regulation beteiligt sind17,18,19,20. Basierend auf diesen Kriterien wurden die mittlere neuronale Feuerrate sowie Rasterplots der Aktionspotential-Auslöschung erstellt. Energiespektrogramme der 2D-LFP und 3D-Leistungsspektraldichte-(PSD-)Topographien wurden konstruiert, um die oszillatorischen Energieeigenschaften der neuronalen Aktivität zu bewerten.
Nach der Aufzeichnung wurde der Einschnitt genäht, und die Ratten wurden überwacht, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hatten. Penicillin wurde mittels intraperitonealer Injektion verabreicht, und Carprofen (5 mg/kg, s.c.) wurde drei aufeinanderfolgende Tage lang täglich verabreicht.
Quantitative Proteomik-Analyse mittels datenunabhängiger Akquisition
Das Gesamtprotein wurde mit einem Lysepuffer extrahiert und mittels der Bicinchoninsäure-Methode quantifiziert. Die Proteine wurden denaturiert, einer reduktiven Alkylierung unterzogen und mit Trypsin bei 37 °C für 2 h verdaut. Die resultierenden Peptide wurden mittels einer C18-Säule entzogen, bei 45 °C konzentriert und für die anschließende Massenspektrometrie-Analyse resuspendiert.
Peptide wurden auf eine Trap-Säule (5 µm C18, 300 µm x 5 mm) aufgegeben, die mit 96 % Puffer A (0,1 % Ameisensäure in Wasser) vorgelegt war. Die Trennung der Peptide erfolgte an einer Hochdurchsatz-Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Analysensäule mithilfe eines streng optimierten Gradienten aus Puffer A und Puffer B (0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril).
Die Massenspektrometrie wurde im positiven Ionenmodus mit datenunabhängiger Akquisition (DIA) und einer Elektrospray-Spannung von 1,9 kV durchgeführt. Vollständige Massenspektrometer-Scans wurden über einen Massenbereich von 380 bis 980 m/z mit einer Auflösung von 240.000 erfasst, wobei eine automatische Verstärkungssteuerung (AGC) mit einem Zielwert von 500 % und eine maximale Injektionszeit von 3 ms verwendet wurden. MS/MS-Spektren wurden mit einer Auflösung von 80.000 (AGC-Ziel: 500 %; maximale Injektionszeit: 3 ms; RF-Linsenamplitude: 40 %) aufgenommen. Vorläuferionen wurden mittels hochenergetischer kollisionsinduzierter Dissoziation fragmentiert, wobei ein Isolationsfenster von 2 Th und eine normalisierte Kollisionsenergie von 25 % bei einer definierten Zykluszeit von 0,6 s angewendet wurden.
Rohe Massenspektrometriedaten wurden mit der DIA-NN-Software verarbeitet. Mithilfe des internen Deep-Learning-Algorithmus wurde eine Spektralbibliothek erstellt, und die Match-between-runs-Funktion wurde zur Quantifizierung gegenüber der Referenzproteomdatenbank von Rattus norvegicus angewandt, unter Berücksichtigung von Trypsinverdauung und bis zu 2 ausgelassenen Spaltungen. Die endgültige quantitative Proteinmatrix wurde anhand einer strengen Grenze von 1 % falscher Entdeckungsrate auf Ebene der Vorläuferionen und der Proteine gefiltert.
Bioinformatische Analyse und Hub-Gen-Screening
Bioinformatische Analysen und Datenvisualisierungen wurden hauptsächlich mithilfe der R-Programmierumgebung in Kombination mit spezialisierter Software zur Netzwerkvisualisierung durchgeführt. Um methodische Transparenz und Reproduzierbarkeit sicherzustellen, wurden alle benutzerdefinierten R-Skripte, die in diesen Analyseprozessen verwendet wurden, als Zusätzliche Datei 1 bereitgestellt. Die erste Qualitätskontrolle der Daten sowie die Bewertung der Gesamtverteilung erfolgten mit dem ropls-Paket. Es wurden Übersichtsstatistiken zur Proteinidentifizierung/-quantifizierung zusammengestellt; eine partielle kleinste-Quadrate-Diskriminanzanalyse (PLS-DA) wurde für die drei Gruppen durchgeführt; eine orthogonale partielle kleinste-Quadrate-Diskriminanzanalyse (OPLS-DA) wurde für paarweise Vergleiche angewandt; und Korrelations-Heatmaps der Proben wurden mit dem pheatmap-Paket erstellt.
Kernproteine mit differenzieller Expression wurden anhand von Schwellenwerten ausgewählt, die einen p-Wert <0,05, eine Fold-Change >1,2 und einen Variable-Importance-in-Projection-Score >1,0 umfassen. Doppelte Volcano-Plots wurden mit dem ggplot2-Paket erstellt, Schnittmengen mit dem ggVennDiagram-Paket identifiziert und hierarchische Cluster-Heatmaps mit dem pheatmap-Paket zur Visualisierung der gemeinsamen Proteine dargestellt. Die Anreicherungsanalysen für Gene Ontology (GO) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wurden getrennt für die hoch- und herunterregulierten Proteine mithilfe des enrichR-Pakets basierend auf der Enrichr-Datenbank durchgeführt.
Alle differentiell exprimierten Proteine wurden mit einem Konfidenzschwellenwert von 0,4 der STRING-Datenbank zugeordnet, um das Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk aufzubauen. Die Interaktionsdaten wurden in eine Netzwerk-Visualisierungssoftware importiert. Mithilfe des cytoHubba-Plugins wurden topologische Werte berechnet, und die 18 Gene mit den höchsten Werten wurden anhand der Knoten-Farbintensität extrahiert. Die 18 Hub-Kandidaten wurden einer Pfad-Enrichment-Analyse unterzogen, und die 10 auffälligsten Proteine wurden ausgewählt, um ihre Expressionsniveaus in menschlichen Geweben anhand der Genotype-Tissue Expression (GTEx)-Datenbank zu bewerten. Das wichtigste Hub-Gen wurde basierend auf den Expressionsniveaus im menschlichen Gehirn und den topologischen Netzwerkparametern identifiziert. Mithilfe des Cistrome Data Browser wurden downstream liegende Transkriptionsfaktoren und mit dem spezifischen Hub-Gen assoziierte Histonmodifikationen vorhergesagt.
Westernblot und quantitative Polymerasekettenreaktion
Gesamtprotein wurde aus NTS-Geweben mit einem Lysepuffergemisch, das Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und Phosphataseinhibitoren enthielt, extrahiert. Die Proben wurden mittels eines Ultraschall-Disaggregators homogenisiert und bei 4 °C 20 min bei 13.800 × g zentrifugiert, um die Überstände zu gewinnen. Die Protein-Konzentrationen wurden mit einem Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit bestimmt. Jeweils 20 µg Protein aus jeder Probe wurden mittels 10%iger Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und anschließend auf Polyvinylidenfluorid-Membranen übertragen.
Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Salzlösung mit Tween (TBST) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit spezifischen primären Antikörpern gegen Yin Yang 1 (YY1) sowie β-Aktin als Housekeeping-Protein inkubiert. Die Membranen wurden dreimal je 5 min mit TBST gewaschen und danach 1,5 h bei Raumtemperatur mit einem mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörper versetzt. Die Zielbanden wurden mithilfe eines verbesserten Chemilumineszenz-Kits sichtbar gemacht, mit einem Bildgebungssystem aufgenommen und relativ zu β-Aktin quantifiziert.
Gesamt-RNA wurde aus NTS-Geweben unter Verwendung eines RNA-Extraktionsreagenz gewonnen. Die RNA-Konzentration und -reinheit wurden mithilfe eines Spektrophotometers gemessen, und die erste cDNA-Strangsynthese erfolgte unter Verwendung eines Reverse-Transkriptions-Kits. Die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung eines SYBR-Green-PCR-Kits auf einem Echtzeit-PCR-System durchgeführt. Die spezifischen Primersequenzen, die für die Amplifikation verwendet wurden, zusammen mit ihren jeweiligen NCBI-Referenzsequenz-Zugangsnummern, lauteten wie folgt: YY1 (NM_001002271.1), vorwärts 5'-AGCGTTCGTTGAGAGCTCAA-3' und rückwärts 5'-AGCCTTCGAATGTGCACTGA-3'; DPF2 (NM_001014264.1), vorwärts 5'-TGTGATGACTGTGACCGTGG-3' und rückwärts 5'-TCCAAACACAGGTGGCAACT-3'; DMAP1 (NM_001007705.1), vorwärts 5'-GGTGTGACATTACGGAGCCA-3' und rückwärts 5'-TCCAGCAGCATCTGTTCCAG-3'; sowie Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (NM_017008.4), vorwärts 5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3' und rückwärts 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'. Die relativen mRNA-Expressionsmengen wurden nach der 2-ΔΔCt-Methode berechnet und gegenüber dem internen Referenzgen GAPDH normalisiert.
Statistische Analyse
Alle experimentellen Daten wurden mithilfe statistischer Software analysiert und als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die Normalverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test überprüft, und die Varianzhomogenität wurde mittels des Brown-Forsythe-Tests bewertet.
Für den Vergleich zwischen zwei unabhängigen Gruppen wurde der Student-t-Test oder der gepaarte t-Test für Daten verwendet, die die Normalitätskriterien erfüllten. Daten, die die Annahmen der Normalverteilung nicht erfüllten, wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test oder dem Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test analysiert. Für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse, gefolgt vom post-hoc-Test nach Holm-Sidak, verwendet, wenn die Annahmen der Normalität und Varianzhomogenität erfüllt waren. Der Kruskal-Wallis-H-Test, gefolgt vom post-hoc-Test nach Dunn, wurde angewendet, wenn diese Annahmen nicht erfüllt waren.
Die Korrelationen wurden mithilfe des Pearson-Korrelationskoeffizienten bewertet, der mit dem Hmisc-Paket in R berechnet wurde. Die entsprechenden p-Werte wurden mit der Benjamini-Hochberg-Methode zur Kontrolle der falschen Entdeckungsrate (FDR) mittels des stats-Pakets angepasst, um den aufgrund multipler Tests erhöhten Typ-I-Fehler zu berücksichtigen. Die allgemeine statistische Signifikanz wurde bei p <0,05 festgelegt.
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Die Elektroakupunktur verbessert die Herzfunktion und verringert myokardiale Schäden bei Ratten mit chronischer Herzinsuffizienz
Um die Wirkungen von EA auf CHF zu bewerten, wurde das Rattenmodell durch Ligatur der LAD-Koronararterie etabliert, gefolgt von spezifischen EA- oder Sham-EA-Interventionen. Systematische Bewertungen, einschließlich Echokardiographie, biochemischer Assays und histologischer Färbungen, wurden durchgeführt (Abbildung 2A). ...
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The present study investigated the central mechanisms of EA at the HT7 acupoint in the rat model of CHF. Physiological and histological data indicated that EA improved LVEF and attenuated myocardial fibrosis. In parallel with these peripheral changes, in vivo electrophysiological recordings and neural mapping supported that EA restored neuronal firing rates within the NTS. Through mass spectrometry-based proteomics, the molecular landscape of the NTS was mapped, and 85 differentially expressed proteins whose abnormal exp...
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Alle Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen. Die Autoren erklären außerdem, dass im gesamten Manuskripterstellungsprozess keine KI-Tools verwendet wurden.
Wir möchten allen Forschern, die zu dieser Studie beigetragen haben, unseren aufrichtigen Dank aussprechen und respektvoll das Opfer der Versuchstiere anerkennen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Nationale Schlüssel-Forschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas (Förderkennzeichen Nr. 2022YFC3500500 und 2022YFC3500502) sowie durch das universitätsweite Talentförderprogramm Xu Nenggui (Förderkennzeichen Nr. DT2400000222). Die Fördergeber hatten keinerlei Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerhebung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Vorbereitung des Manuskripts.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Adulte männliche Sprague-Dawley-Ratten | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. | No. SCXK (LIAO) 2025-0001 | RGD_70508 |
| Akupturnadeln | Suzhou Tianxie Akupunktur-Instrument Co., Ltd. | — | — |
| Antifade-Einbettmedium mit DAPI | Aibixin Biotechnologie Co., Ltd. | abs9235-25ml | — |
| Primärantikörper gegen YY1 | Proteintech Group, Inc | 66281-1-Ig | AB_2881664 |
| Primärantikörper gegen Beta-Aktin | 66009-1-Ig | AB_2687938 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma Odellie Trading Co., Ltd. | V900933 | — |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Shanghai Biyuntian Biotechnologie Co., Ltd. | P0012S | — |
| c-Fos (9F6) Kaninchen-mAb | Sai Xin Tong Biologische Reagenzien Co., Ltd. | 2250S | AB_2247211 |
| Cytoscape | The Cytoscape Consortium | Version 3.2.1 | SCR_003032 |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme Biotech Co., Ltd. | Q711-02 | — |
| Elektroakupunkturgerät | Nanjing Jisheng Medical Technology Co., Ltd. | HANS-200A | — |
| Miniatur-Mikroelektrodenarray mit acht Kanälen (2 × 4) | Kewa Suzhou Medical Technology Co., Ltd. | - | — |
| ELISA-Kit (NT-proBNP) | Wuhan Enzyme Immuno-Biotechnologie Co., Ltd. | MM-0329R1 | — |
| ELISA-Kit (cTnT) | MM-0795R2 | — | |
| Kit für verbesserte Chemilumineszenz | Proteintech Group, Inc | PK10001 | — |
| Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG | Aimee Technology Co., Ltd. | 111-545-003 | AB_2338046 |
| HRP-konjugiertes sekundäres Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper | BeiJing Cowin Biotech Co.,Ltd. | CW0102 | N/A |
| HiScript III RT SuperMix | Vazyme Biotech Co., Ltd. | R323-01 | — |
| ImageJ-Software | National Institutes of Health | Version 4.0 | SCR_003070 |
| Abbildungs-System | Bio-Rad Laboratories, Inc | ChemiDoc MP | |
| Mehrkanalige Kleintier-Narkosemaschine | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22-10 | — |
| Mikroskop | Olympus Optical Co., Ltd. | DP72 | — |
| NeuroExplorer-Software | Beijing Plexon Technology Co., Ltd. | Version 5.0 | SCR_001818 |
| Offline Sorter-Software | Beijing Plexon Technology Co., Ltd. | Version 4.7.2 | SCR_000012 |
| Orbitrap Astral | Thermo Fisher Scientific | — | — |
| Powerlab Standard-Limb-II-Ableitung -System | AD Instruments International Trading Co., Ltd. | ML118 | — |
| PepMap Neo Trap-Säule | Thermo Fisher Scientific | — | — |
| Phosphatase-Inhibitoren | Shanghai Biyuntian Biotechnologie Co., Ltd. | P1081 | — |
| R-Software | — | Version 4.5.2 | SCR_001905 |
| RIPA-Lysepuffer | Yeasen Biotechnologie Co., Ltd. | 20115ES60 | — |
| RNAiso Plus | TaKaRa Biotechnologie Co., Ltd. | 9108 | — |
| Kleintier-Digital-Ultraschallsystem | Feiyino Technology Co., Ltd. | VINNO6 Lab | — |
| Statistiksoftware | GraphPad Software | Version 8.0 | SCR_002798 |
| Das OmniPlex Multikanal-Erfassungs -System | Beijing Plexon Technology Co., Ltd. | Version 1.20.0 | — |
| Triton X-100 | Beijing Solab Technology Co., Ltd. | 22298142 | — |
| Vanquish Neo UHPLC-System | Thermo Fisher Scientific | — | — |
| µPAC Neo Hochdurchsatz-Säule | Thermo Fisher Scientific | — | — |
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