In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode

1. Verkleistern T75 Kolben unter Verwendung einer 0,1% igen Gelatinelösung und inkubieren Platte in einem 37 ° C, 5% CO ₂ Gewebekultur-Inkubator über Nacht einen Tag vor.
2. Nehmen Sie die MES-Zellen aus inkubieren, absaugen des Mediums, spülen Sie die ES Zellkultur mit PBS, fügen 0,05% Trypsin-Lösung zur Beschichtung der Boden der Schale (2 ml/100mm Platte).
3. Bei 37 ° C für ca. 1 Minute, bis die Zellen Häutung sind von der Platte.
   
4. Vorsichtig verreiben (Pipette nach oben und unten) die trypsiniert Zellen vier Minuten vor sechs Mal die ES-Zellen mit einem eingesteckt Pasteurpipette zu dispergieren,. Übertragen Sie die verstreut ES-Zellen in einer 15-ml konische Zentrifugenröhrchen mit vorgewärmten (37 ° C) mES Medium.
   
5. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Den Überstand aspirieren, 10 ml MES-Medium und Pipette auf und ab zu einer einzigen Zelle Suspension bilden.
   
6. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine T75-Kolben vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine und bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 1 Stunde
   
   * Nach einer Stunde wurden die Fibroblasten auf der Platte befestigt, aber die Stammzellen bleiben in dem Medium. Pipette das Medium, um die Stammzellen zu sammeln.
   
   
7. Spin die Zellen bei 1000 rpm für 5 min und absaugen der MES-Medium. Dann fügen Sie weitere 10 ml MES-Differenzierungsmedium und Zellen durch repetitive Pipettieren, bis es erscheint zu einer feinen Suspension von Zellen sein.
8. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer verwenden Differenzierung Medium, um die Stammzell-Suspension auf eine Konzentration von 400 bis 500 Zellen pro 20 ul (20ul/drop) in einem sterilen Becken zu verdünnen.
9. Deckel abheben, vorsichtig umdrehen und platzieren Sie sie auf der Oberseite der Schale mit 10 ml PBS. Mit einer Mehrkanal-Pipette, um Reihen von 20 ul Tropfen auf dem up-turned innere Oberfläche des Deckels des Gewebes Kulturschale.
10. Vorsichtig die Schale in den Brutschrank für 2 Tage. Nach zwei Tagen, sorgfältig über die Platte abdecken wiederum absaugen 180 ul frisch Differenzierungsmedium und setzte einige Tropfen in die Vertiefung einer 96-well ultratiefen Befestigungsplatte. Dann Pickup der Tropfen mit der Pipette und übertragen Tropfen, one-by-one, die 96-Well-Platte. Legen Sie die Platten in den Inkubator ungestört für 3 Tage.
    
11. Coat jede Vertiefung einer 48-well Zellkultur-Platte mit 300ul von 0,1% Gelatine. Nach Zugabe der Gelatine, inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 ° C einen Tag im Voraus vor der Übertragung der Ebs.
    
12. Am nächsten Tag absaugen die Gelatine aus den 48-Well-Platte. Dann fügen Sie 300 ul der Differenzierung Medium in jede Vertiefung. Übertragen Sie die EBs aus den 96-Well-Platten, die 48 gut Gelatine-beschichteten Platten one-by-one. Ändern Sie das Medium am nächsten Tag und ändern Sie dann das Medium jeden zweiten Tag zu den Zellen aufrecht zu erhalten.
    
13. Spontane cardiaomyocyte Kontraktionen sollte innerhalb von 7 Tagen evident.

The disadvantages of hanging drop method are as follows: the liquid volume of a drop is limited to less than 50ul due to maintaining hanging drops on the lid by surface tension, and it’s impossible to change the medium for hanging drops. Observation of forming EBs in drops directly with microscopy is also very difficult during cultivation. Further more , the hanging drop method consists of two steps, therefore, a series of step of the hanging drop method may be troublesome.