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protokolle für orale infektion von schmetterlingslarven mit baculovirus

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviren sind weit verbreitet sowohl als Protein-Expressionsvektoren und Schädlingsbekämpfung Mittel verwendet. Dieses Video zeigt, wie Schmetterlingslarven mit Polyeder kann durch Tröpfcheninfektion Fütterung und Ernährung Plug-basierte Bioassays infiziert werden. Diese begleitende Springer Protocols Abschnitt gibt einen Überblick über das Baculovirus-Lebenszyklus und die Verwendung von Baculoviren als insektizide Wirkstoffe, einschließlich einer Diskussion über das Für und Wider für den Einsatz von Baculoviren als Insektizide, und die Fortschritte in der genetischen Verbesserung von Baculoviren für eine bessere insektizide Wirksamkeit aus.

In diesem Video zeigen wir, orale Infektion Techniken der Schmetterlingslarven mit Baculovirus um insektizide Wirksamkeit zu bestimmen.

Protokolle für orale Infektion von Schmetterlingslarven mit Baculovirus

Baculoviren werden sowohl als Proteinexpressionsvektoren als auch als Mittel zur biologischen Schädlingsbekämpfung von Insekten weit verbreitet eingesetzt. In diesem Video wird gezeigt, wie Lepidoptera-Larven ...

Das Vao-Virus wird häufig als DNA-Vektor in Kombination mit Insektenzelllinien zur Proteingewinnung verwendet. Die Tatsache, dass dieses Virus Insekten effizient infiziert und tödliche Folgen hat, macht es jedoch auch zu einem wirksamen insektiziden Wirkstoff. In Brasilien wird beispielsweise das Wildtyp-Balo-Virus jährlich auf mehr als 1 Million Hektar Sojabohnenfeldern zur Bekämpfung der Samtvorhangraupe eingesetzt. Um ihre insektizide Wirksamkeit zu erhöhen, wurden Balo-Viren genetisch so verändert, dass sie Gene für insektenspezifische Toxine enthalten, die im Hämolymphe des Insekts aktiv sind.In diesem Video demonstrieren wir Methoden zur oralen Infektion von Lepidopteren-Larven mit Baculovirus, um die insektizide Wirksamkeit zu analysieren. Hallo, ich komme vom Blind-Boning-Labor im Fachbereich Augenheilkunde der Iowa State University, und ich bin Wendy Sparks, ebenfalls vom Boning-Labor. Heute zeigen wir Ihnen zwei Verfahren zur VA-Virus-Infektion von Lter- und Larven.Zuerst wird Harran Ihnen zeigen, wie man neugeborene Larven mithilfe eines Tröpfchenfütterungs-Bioassays infiziert. Danach zeige ich Ihnen, wie man Larven im mittleren bis späten Entwicklungsstadium mithilfe eines Futter-Blut-Bioassays infiziert. Beginnen wir also.Tropfenfütterungs-Bioassays können zur Bestimmung der letalen Dosis von Abacavir und der Überlebenszeit von mit Balo-Virus infizierten Larven verwendet werden. Für diesen Assay werden in der Regel Larven früher Entwicklungsstadien oder neugeschlüpfte Larven verwendet.Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass Sie Futtertöpfchen mit der geeigneten Nahrung bereitstehen haben. Bereiten Sie außerdem die entsprechenden Virusverdünnungen vor, die grüne Lebensmittelfarbe in einer Konzentration von 4 % (Volumenanteil) enthalten. Um die letale Viruskonzentration zu bestimmen, sollte die Verdünnung einen Sterblichkeitsbereich zwischen ein und 99 % ergeben. Vorläufige Bioassays können erforderlich sein, um einen geeigneten Bereich der Viruskonzentrationen zu ermitteln. Nach dem Wirbeln des Reaktionsgefäßes, um ein Absinken der Polyeder zu verhindern, bringen Sie zwei konzentrische Kreise aus kleinen Tröpfchen der Viruslösung in einer 60-Millimeter-Petri-Schale auf.Denken Sie daran, für jede verwendete Virus-Konzentration zusätzlich eine negative Kontrolle mit einer Scheininfektion anzulegen. Danach überführen Sie 25 bis 30 neugeborene Larven mit einem sterilen Pinsel in die Mitte der konzentrischen Kreise. Setzen Sie den Deckel auf die Schale und versiegeln Sie ihn mit Parafilm, um ein Entweichen der Larven zu verhindern.Verwenden Sie idealerweise verschiedene Pinsel für die Übertragung auf jeden Virustyp, um Kontaminationen zwischen den Behandlungen zu vermeiden. Lassen Sie die Petrischale 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen, wobei die Larven fressen. Die Lösung, die von gefütterten Larven aufgenommen wurde, kann an der grünen Färbung des vorderen Darmabschnitts erkannt werden, die durch den grünen Lebensmittelfarbstoff verursacht wird. Übertragen Sie nur die Larven, die gefressen haben, in Einweg-Plastikbecher mit einer Kapazität von einer Unze, die Nahrung enthalten, und geben Sie jeweils eine Larve pro Becher.Nach dem Übertragen der Larven die Becher mit Deckeln verschließen und 24 Stunden nach der Infektion bei 28 Grad Celsius inkubieren. Becher mit toten Larven entsorgen. Diese frühen Todesfälle sind wahrscheinlich auf Verletzungen durch die Handhabung zurückzuführen.Bei Verwendung dieses Bioassays zur Bestimmung der letalen Dosis sollten die Larven alle zwei bis drei Tage überprüft werden, bis die mock-infizierten Larven sowie alle überlebenden, virusbehandelten Larven entweder verpuppt haben oder mit dem Graben begonnen haben, um sich zu verpuppen. Virusinfizierte Larven verbleiben auf der Oberfläche der Nahrung und sterben nach einigen Tagen ab. Tote Larven schrumpfen manchmal ein und verfärben sich schwarz. Larven, die an der Infektion sterben, werden im Wesentlichen zu Säcken voller Polyeder, die sich vollständig auflösen. Wenn zu diesem Zeitpunkt eine mechanische Störung erfolgt, erfassen Sie die Larvenmortalität in jeder Behandlungsgruppe.Lethale Konzentrations-Bioassays sollten an getrennten Tagen drei- oder viermal wiederholt werden. Verwenden Sie 30 Individuen pro Dosis für jede Virus- oder Kontrollbehandlung. Nutzen Sie ein geeignetes Probit-Analyse-Programm wie Polo oder SAS, um LC50-Werte, 95 %-Konfidenzintervalle und die entsprechenden statistischen Kenngrößen zu berechnen.Mithilfe dieses Tröpfchen-Fütterungsassays können auch ST50-Überlebenszeitwerte bestimmt werden. In diesem Fall wird die Larvenmortalität alle vier bis acht Stunden unter häufigeren Beobachtungen erfasst. Wenn die Mortalitätsrate hoch ist, werden Überlebenszeit-Bioassays mit einer LC99-Dosis des Virus durchgeführt; die medianen Überlebenszeiten und die 95-%-Konfidenzintervalle werden mithilfe des Kaplan-Meier-Schätzers unter Verwendung eines S-Plus- oder SAS-Programms berechnet.Nun, da Harang Ihnen den Tröpfchenfütterungs-Bioassay gezeigt hat, werde ich Ihnen den Diät-Plug-Bioassay vorstellen. Bei dem Diät-Plug-Bioassay werden Larven im mittleren bis späten Larvenstadium mit einem Nahrungsplug gefüttert, der mit einer bekannten Virusdosis behandelt wurde, um die letale Dosis oder LD 50 zu bestimmen. Am Tag vor Durchführung dieses Assays entfernen Sie die Nahrung aus dem Becher, um die Larven über Nacht hungern zu lassen.Dieser Schritt erhöht die Geschwindigkeit, mit der die Larven das Virus aufnehmen. Inokulieren Sie am nächsten Tag den Nährboden, indem Sie ihn in kleine Würfel von etwa zwei Kubikmillimetern schneiden. Wenn die Nährbodenwürfel zu klein sind, trocknen sie aus.Wenn die Nahrungswürfel zu groß sind, können die Larven den gesamten Nahrungswürfel über Nacht nicht verzehren. Geben Sie nun ein bis zwei Mikroliter der Polyeder-Suspension zu jedem Nahrungswürfel hinzu. Die Suspension enthält 4 % vol. Lebensmittelfarbstoff.Lassen Sie die Suspension fünf bis 15 Minuten lang in die Nahrung einweichen. Bereiten Sie außerdem einen mit Placebo-Virus behandelten Nahrungswürfel als negativen Kontrollansatz vor. Danach überführen Sie einen Nahrungswürfel in jede vierte Larvenstufe in jedem Becher.Am nächsten Tag die Becher über Nacht bei 28 Grad Celsius in den Inkubator stellen. Verwerfen Sie anschließend alle Larven, die den Nährstoffwürfel nicht vollständig gefressen haben. Geben Sie dann jedem Becher ein großes Stück Nährstoffmedium für die verbleibenden Larven hinzu. Halten Sie die Larven bei 28 Grad Celsius und fügen Sie nach Bedarf zusätzliches Nährstoffmedium hinzu, bis die simuliert infizierten Larven gefressen haben oder mit der Verpuppung begonnen haben, ebenso wie die überlebenden, virusinfizierten Larven.Zu diesem Zeitpunkt die Anzahl der toten und überlebenden Insekten erfassen. Wir zeigen Ihnen lediglich zwei Methoden, um Insekten mit dem Back-Virus zu infizieren: Blutentnahme und Biopsie über die Futterplatte. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Kadaver von Virus-getöteten Larven in der Regel zerbrechlich sind und leicht platzen können, wodurch das Virus freigesetzt wird.Sterilisieren Sie daher Arbeitsflächen und entsorgen Sie kontaminierte Handschuhe und Einwegmaterialien angemessen, um Kontaminationen zu vermeiden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Iowa State University.  In diesem Video zeigen wir, orale Infektion Techniken der Schmetterlingslarven mit Baculovirus um insektizide Wirksamkeit zu bestimmen.

Protokolle für orale Infektion von Schmetterlingslarven mit Baculovirus

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Zusammenfassung

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Offenlegungen

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