Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.
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Methodenartikel
Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Seit der Entwicklung von Sakmann und Neher 1, 2, hat der Patch-Clamp zu einem etablierten und äußerst nützliche Technik für elektrophysiologische Messung von einzelnen oder mehreren Ionenkanälen in Zellen. Diese Technik kann auf Ionenkanäle sowohl in ihrer natürlichen Umgebung angewendet werden und ausgedrückt in heterologen Zellen, wie Eizellen aus dem Krallenfrosch, Xenopus laevis geerntet. Hier beschreiben wir die gut etablierte Technik der Patch-Clamp-Aufzeichnung von Xenopus Oozyten. Diese Technik wird verwendet, um die Eigenschaften ausgedrückt Ionenkanäle entweder messen in der Bevölkerung (macropatch) oder einzeln (Single-Channel-Aufnahme). Wir konzentrieren uns auf Techniken konzentrieren, die Qualität der Eizelle Vorbereitung und Dichtung Generation zu maximieren. Bei allen Faktoren optimiert, bietet diese Technik eine Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Abdichtung Generation über 90 Prozent. Der Prozess kann unterschiedlich von jedem Forscher auf die Faktoren, er oder sie findet wichtigste Basis optimiert werden, und wir stellen den Ansatz, die zu den größten Erfolg in unseren Händen haben.
Protokoll
Teil 1: Entfernen der Dotterhaut
- Bereiten Sie zwei Sätze von einer Pinzette. Wir bevorzugen Nr. 5 Pinzetten, wo ein Satz wurde leicht hat mit einer Feile geschärft. Auch bereiten ein Glas Transferpipette durch Trimmen und Feuerpolitur ein 7 "Pasteurpipette.
- Empfohlen: Um die Eizellen ein Verrutschen zu verhindern, schnitt einen Kreis von Raster (1 mm Quadrate) und Leim in den Boden einer 60mm-Petrischale. Dieses Gericht kann unbegrenzt wiederverwendet werden, wenn sauber zwischen den Anwendungen.
- Füllen Sie die Petrischale zur Hälfte mit hyperosmotischen Lösung (siehe Rezept) und unter einem Binokular.
- Nehmen Sie 1-3 X....
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Diskussion
Es gibt viele Parameter elektrophysiologische Ableitung hier nicht diskutiert. Rig Setup, sind System-Management-Lärm-, Kanal-Ausdruck, und die Aufnahme Protokolle allem auch entscheidend für die gute experimentelle Ergebnisse.
Nach unserer Erfahrung sind die wichtigsten Parameter für die Bildung zuverlässige Dichtungen: hochwertige Eizellen, die Beseitigung der Dotterhaut schnell (auch bekannt als "Peeling"), verwenden Sie neu gezogen Pipetten vor Staub geschützt, glatte Pipetten, positive Druck beim Betreten des Bades Lö.......
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Danksagungen
Schrumpfende Lösung Rezept stammt aus dem Labor von RW Aldrich. Wir danken folgenden Förderorganisationen und Stiftungen für die Unterstützung: National Institutes of Health, National Science Foundation, der American Heart Association, Gesellschaft für Muskeldystrophie, die Donald B. und Delia E. Baxter-Stiftung, die Klingenstein Fonds und der McKnight Endowment for Neuroscience.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Patch-Clamp-Verstärker & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Oder ein anderes ähnliches Gerät (z. B. HEKA EPC-9 oder Axopatch 200B) |
| Pinzette Nr. 5 (zwei Paare) | Werkzeug | Fine Science Tools | ||
| Lösung zur Oozytenverkleinerung | Reagenz | Zutaten In mM N-Methyl-D-glucamin 220 HEPES 10 MgCl2 1 EGTA 10 Asparaginsäure 220 KCl 2 pH auf 7,4 mit N-Methyl-D-glucamin eingestellt | ||
| Gesponnener Mesh | 800 µm | Spectrum Labs | 146481 |
Referenzen
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
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Nachdrucke und Genehmigungen
