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Die Beziehungen zwischen den verschiedenen Organismen und anorganischen Bestandteilen im Boden sind für das Verständnis von Bodenveränderungen und Umweltbelastungen von entscheidender Bedeutung, können aber ohne direkte Visualisierung nicht aufgeklärt werden.
Der Boden, ein äußerst komplexes System, ist Lebensraum für Millionen unterschiedlicher Organismen. Vor allem der Bereich des Bodens direkt um die Pflanzenwurzeln, die Rhizosphäre, enthält eine einzigartige Reihe von Organismen, die direkt von den Pflanzenwurzeln beeinflusst werden.
Die abiotische oder nicht-biologische Komponente der Rhizosphäre umfasst anorganische Partikel unterschiedlicher Größe und Form, die zur Textur des Bodens beitragen. Der biotische oder biologische Anteil umfasst Pflanzenreste, Wurzeln, organische Substanz und Mikroorganismen.
Dieses Video wird die direkte Visualisierung der biotischen und abiotischen Komponenten des Rhizosphärenbodens demonstrieren, um Faktoren zu verstehen, die Bodenveränderungen beeinflussen, und Umweltbelastungen vorherzusagen.
Mikroskopisch kleine Organismen neigen dazu, sich im Wasser in den Bodenporen zu befinden. Bakterien gehören zu den einfachsten und am häufigsten vorkommenden Organismen im Boden und kommen in vielen Morphologien vor, darunter Kugeln, die als Kokken bezeichnet werden, Stäbchen, die als Bazillen bezeichnet werden, und filamentöse Formen.
Pilzarten wie Hefen und Schimmelpilze sind die zweithäufigsten Organismen im Boden. Sie arbeiten daran, totes organisches Material zu zersetzen und zu recyceln. Mikroskopisch kleine filamentöse Pilze unterscheiden sich optisch von anderen Mikroorganismen, da sie lange und verzweigte Hyphen besitzen, die Sporen freisetzen.
Die direkte Beobachtung der Beziehungen zwischen diesen Organismen ist eine Herausforderung, kann aber mit einem Kontaktobjektträger-Assay erreicht werden. Bei dieser Methode wird ein Objektträger mehrere Tage lang in den Boden getaucht und die Organismen und Bodenpartikel an der Objektträgeroberfläche adsorbiert.
Der Schieber wird dann in einem Winkel entfernt, um ein Verschmieren der Oberfläche zu verhindern. Die Mikroben werden mit Essigsäure fixiert und mit Rose Bengal Färbemittel gefärbt, um eine Visualisierung mittels Lichtmikroskopie zu ermöglichen.
Nachdem Sie nun die Prinzipien hinter der Kontakt-Objektträger-Assay-Technik verstanden haben, werfen wir einen Blick auf den Prozess im Labor.
Sammeln Sie zunächst oberflächliche Gartenerde und überführen Sie die Erde in das Labor. Wiegen Sie 150 g Erde in die 2 separaten Behälter. Ein Behälter sollte als Behandlungsprobe gekennzeichnet sein, der mit Nährstoffen modifiziert wird, um eine schnelle Vermehrung von Organismen zu fördern. Bezeichnen Sie das andere Steuerelement als Steuerelement, das unverändert bleibt.
Berechnen Sie den Wassergehalt im Boden mit der Technik, die im Video Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts im Boden dieser Sammlung gezeigt wird. Bestimmen Sie auf der Grundlage dieser Berechnung die Wassermenge im Boden auf der Basis des Trockengewichts. Berechnen Sie nun die Wassermenge, die hinzugefügt werden muss, um einen Feuchtigkeitsgehalt des Bodens von 15 % zu erhalten. Dadurch wird die Feuchtigkeit auf die Feldkapazität gebracht, optimal für das Wachstum von Mikroorganismen.
Messen Sie die berechnete Menge an destilliertem Wasser mit einem Messzylinder. Gießen Sie das berechnete Wasservolumen in jeden Behälter. Berechnen Sie auf der Grundlage des zuvor ermittelten Trockengewichts des Bodens die Glukosemenge, die erforderlich ist, um eine endgültige Glukosekonzentration des Bodens von 1 Massenprozent zu erreichen, und zwar unter Verwendung der Trockengewichtsbasis. Wiegen Sie diese Menge Glukose und geben Sie sie nur in den Behandlungsbehälter.
Wiegen Sie 200 mg Ammoniumnitrat und geben Sie es dann nur in den Behandlungsbehälter. Das Ammoniumnitrat dient als stickstoffhaltige Nährstoffquelle für die Bodenmikroben. Mische die Mischung aus Erde, Glukose und Ammoniumnitrat in den Behälter.
Beschriften Sie als Nächstes 4 saubere Objektträger: zwei als Behandlung und zwei als Kontrolle. Setzen Sie die beiden Behandlungsschieber in den Behälter für die Behandlungserde ein. Lassen Sie einen Abschnitt jeder Rutsche über der Bodenoberfläche frei, und stellen Sie sicher, dass zwischen den beiden Rutschen ein Spalt vorhanden ist.
Setzen Sie die beiden Steuerschieber auf die gleiche Weise in den Kontrollbodenbehälter ein. Decken Sie die Becher mit Plastikfolie ab und befestigen Sie sie mit einem Gummiband. Durchstechen Sie die Plastikfolie mehrmals, um den Lufttransfer zu ermöglichen, aber dennoch eine übermäßige Verdunstung zu verhindern.
Wiegen Sie schließlich beide Tassen, notieren Sie ihr Gewicht und inkubieren Sie sie sieben Tage lang an einem dafür vorgesehenen Ort bei Raumtemperatur.
Berechnen Sie nach der siebentägigen Inkubation den Feuchtigkeitsgehalt des Bodens, indem Sie die Bodenbecher wiegen. Stellen Sie fest, ob durch Wasserverdunstung Gewicht verloren gegangen ist, und ersetzen Sie das Wasser bei Bedarf.
Entfernen Sie die Plastikfolie aus dem Behälter und entfernen Sie die beiden Objektträger aus der Erde, indem Sie jede Folie in eine geneigte Position drücken und so zurückziehen, dass die Oberseite der Folie ungestört ist.
Klopfen Sie vorsichtig auf die Objektträger, um große Bodenpartikel zu entfernen. Reinigen Sie mit einem feuchten Papiertuch die Unterseite der Objektträger. Lassen Sie sie bei Raumtemperatur in einem Abzug trocknen. Sobald es trocken ist, nehmen Sie einen Objektträger mit einer Pinzette und tauchen Sie ihn 1 bis 3 Minuten lang in Essigsäure.
Spülen Sie die Oberseite des Objektträgers mit einem sanften Strahl destillierten Wassers ab, um überschüssige Säure zu entfernen. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Folien. Lassen Sie die Rutschen an der Luft trocknen.
Stützen Sie den Objektträger auf einem Färbegestell über einen Behälter, um überschüssige Farbe aufzufangen. Bedecken Sie die Oberfläche jedes Objektträgers vorsichtig mit einer Pipette mit phenolischem Rose Bengal-Farbstoff. Lassen Sie die Objektträger 5 bis 10 Minuten lang fleckig und achten Sie darauf, bei Bedarf mehr Farbe hinzuzufügen, um die Objektträger feucht zu halten. Spülen Sie die Objektträger vorsichtig mit Wasser ab, um überschüssige Flecken zu entfernen, und lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur trocknen.
Untersuchen Sie die Objektträger an einem Lichtmikroskop mit einem Ölimmersionsobjektiv. Der behandelte Boden wird mehr Bodenmikroben enthalten.
Die räumlichen Wechselwirkungen zwischen Pilzen und bakteriellen Organismen in typischen Bodenproben können leicht visualisiert werden. Bodenpartikel weisen dunkle, unregelmäßige Formen auf.
Pilzorganismen weisen dicke filamentöse Hyphen auf, während Actinomyceten dünne filamentöse Hyphen aufweisen.
Bakterien kommen in Form von kleinen Kokken oder Stäbchen vor, typischerweise in Klumpen, auf Bodenpartikeln oder in der Auskleidung von Pilzhyphen.
Die direkte Isolierung von Organismen aus dem Boden ist wichtig für das Verständnis der Boden- und Umwelteigenschaften.
Entomopathogene Nematoden sind mikroskopisch kleine Fadenwürmer, die Insekten parasitieren. Obwohl sie im Kontaktobjektträger-Assay nicht sichtbar sind, können sie aus gesammelten Bodenproben isoliert werden, wie in diesem Beispiel gezeigt.
Zunächst wurden die Nematoden mit Insekten in den Boden geködert, die durch visuelle Untersuchungen identifiziert wurden. Nematoden wurden aus den toten Insektenködern isoliert, indem die toten Insekten in einer feuchten und dunklen Umgebung platziert wurden und die Nematoden in das umgebende Wasser wandern konnten. Die Nematoden wurden dann aus dem Wasser gesammelt und analysiert.
Fadenpilze sind aufgrund ihrer Rolle beim Nährstoffrecycling für die Bodengesundheit von entscheidender Bedeutung. In diesem Beispiel wurde die Isolierung und Beobachtung von Fadenpilzen aus dem Boden durchgeführt.
Bodenproben wurden mit Wasser verdünnt und zu sterilen Rosen-Bengal-Streptomycin-Agarplatten gegeben. Das Streptomycin verhinderte das Bakterienwachstum und ermöglichte das Wachstum von Pilzen. Pilzkolonien wurden gezählt und mit Klebeband auf einen Objektträger geklebt. Anschließend wurden die Pilze mit einem Lichtmikroskop abgebildet.
Bodenmikroorganismen bauen auf natürliche Weise Bestandteile des Bodens ab, wie zum Beispiel abgestorbene Pflanzen und Organismen. Untersucht wurde der biologische Abbau und die Besiedlung von biologisch abbaubaren Kunststofffolien, wie in diesem Beispiel gezeigt.
Pilze wurden aus Plastikfolien isoliert, die mehrere Monate lang im Boden vergraben waren. Anschließend wurden die Pilze einzeln auf ihr Wachstum auf Kunststofffolien getestet. Anschließend wurden Kunststofffolien mit dem ausgewählten Pilzstamm ohne Wachstumsmedien inkubiert, um den direkten Abbau des Kunststoffs durch die Pilze zu beobachten.
Sie haben gerade die Einführung von JoVE in den Kontaktobjektträger-Assay für die qualitative Bildgebung von Bodenmikroben gesehen. Sie sollten jetzt verstehen, wie Sie die Kontaktfolie vorbereiten und Bodenmikroben visualisieren. Danke fürs Zuschauen!
