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Environmental Microbiology

Gramfärbung von Bakterien aus Umweltquellen

Gram Staining of Bacteria from Environmental Sources

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Gram Staining of Bacteria from Environmental Sources

2.2: Aseptic Technique in Environmental Science

2.10: Water Quality Analysis via Indicator Organisms

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09:31 min

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April 30, 2023

Overview

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba – Arizona University
Demonstrierende Autor: Luisa Ikner

Das Spektrum der Forschung in Umweltmikrobiologie ist in Umfang und Anwendungspotenzial breit. Ob die Arbeit Tischwaage mit bekannten bakterielle Isolate oder im Feld mit unbekannten bakterielle Isolate Probenahmen Boden oder Wasser, bleibt die Möglichkeit, schnell und visuell erkennen kultivierbare Populationen von Interesse von großer Tragweite zu ökologischen Mikrobiologen auch heute noch mit der Fülle der molekularen Techniken zur Verfügung. Dieses Video zeigt eine solche Technik, bekannt als Gramfärbung.

Principles

Die Gram-Färbung ist eine klassische und wichtig Färbung Technik, die bleibt von ökologischen Mikrobiologen eingesetzt. Ähnlich wie bei einem einfachen Fleck, ermöglicht es für die Beurteilung der Bakterienzelle Morphologie (z.B., Kokken, Stäbchen, Spore-Spanten), Größe und Anordnung (z.B., Ketten oder Cluster). Darüber hinaus ermöglicht es zur Differenzierung von Bakterien in zwei grundsätzlich verschiedene Gruppen — gramnegative und grampositive – je nach Zusammensetzung der Zellwand und Struktur (Abbildung 1).

Gramfärbung ist ein mehrstufiger Prozess. Vor der Färbung, mit einer Platte, schräge oder Brühe Kultur ein bakterieller Abstrich zubereitet. Die Abstrich Prep wird getrocknet und auf einen sauberen Objektträger fixiert. Ein primäre Fleck von Kristallviolett wird dann auf die fixe Abstrich angewendet. Kristallviolett ist, dass ein grundlegende Fleck bestehend aus positiv gefärbte Ionen (d.h. Chromophore) aufgeladen, die schwache ionische Bindungen mit negativ geladenen funktionellen Gruppen anwesend in der bakteriellen Zellwand zu bilden. Nach dem sanft spülen der Folie mit Wasser, Gram Jod wird angewendet und bildet unlösliche komplexe mit der Kristallviolett in der Zellwand. Kristallviolett-Jod-komplexen weiter binden mit Peptidoglycane, grundsätzlich Bestandteil des bakteriellen Zellwände. Nach einer zweiten Wasserspülung wird ein Aufhellung Agent kurz dem Abstrich angewendet. Für Gram-negativen Bakterien ist der Kristallviolett-Jod-Komplex während der Aufhellung Schritt mit Gram-positiven Bakterien, die Beibehaltung des lila Flecks weggespült. Eine dritte und letzte Wasserspülung folgt eine Gegenfärbung Safranin, die Gram-negativen Bakterien, rosa oder rot färbt.

Abbildung 1. Vergleich der Zellwand grampositive und gramnegative Bakterien.

Procedure

1. die Probenahme

Bodenprobe und Transport in das Labor zur mikrobiellen Analyse zu sammeln.
Wiegen Sie im Labor eine 10 g Probe mit einer Analysenwaage.
Verdünnen der Probe 01:10 in 95 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (10 Teile Boden entspricht 5 Teile wässrige Flüssigkeit), und Vortex mischen (Abbildung 2, Schritt 1).
Führen Sie nachfolgende 01:10 Verdünnungen bis mindestens 10^-5 g Boden pro mL und Ausbreitung-Platte Verdünnungen in Wiederholungen von zwei oder drei auf eine niedrige Nähragar Medium (z. B.R2A) ausgewählt (Abbildung 2, Schritt 2 – 3).
Inkubieren Sie die Platten für eine Woche bei Raumtemperatur (Bild 2, Schritt 4).
Wählen Sie ein oder zwei Kolonien für Isolation und Streifen auf frischen Agarplatten (Abbildung 3, Schritte 1-3).
Inkubieren Sie die Streifen-Platten für zwei bis drei Tage bei Zimmertemperatur (Abbildung 3, Schritt 4).

2. Vorbereitung des bakteriellen Abstrich

Beobachten Sie die Streifen-Platten für isolierte Kolonien.
Für die Vorbereitung jeder Abstrich Prep, Tauchen eine Impfkeimen Schleife in Ethanol, Flamme-sterilisieren, und legen Sie 1 bis 2 Loopfuls von sterilem destilliertem Wasser in die Mitte des vorgereinigten Objektträger.
Sterilisieren Sie die Impfkeimen Schleife wieder wie zuvor beschrieben. Sobald Sie abgekühlt, entfernen Sie eine kleine Menge der Kultur aus einer einzigen isolierten Kolonie und mischen Sie es mit den Wassertropfen auf der Folie (der Abstrich sollte verdünnte Magermilch ähneln). Die Impfkeimen Schleife muss vor der Kolonie isoliert gekühlt werden. Eine Schleife, die zu heiß ist verursacht die Kolonie und/oder Medium, splatter, Aerosolization von Bakterien führen. In der Regel, wenn die Schleife zu heiß für den Einsatz ist, ein “Zischen” ertönt wenn Agar oder Kolonie angewendet. Unsachgemäße Kühlung der Schleife kann auch weniger effiziente Übertragung der Kultur-Folie und Verzerrung der Zellmorphologie führen.
Der Abstrich auf die Oberfläche der Folie messen ca. 2,5 cm x 2,5 cm, verteilt und lassen Sie es an der Luft trocknen. Es ist wichtig für die Lufttrocknung unter Laminar-Flow-Bedingungen auftreten. Folien sollten nicht um den Abstrich stören nicht zu trocken geblasen werden. Auch darf Folien Flamme getrocknet, um Zellmorphologie halten.
Nach dem Trocknen Hitze fixieren den Abstrich indem man der Folie schnell durch eine Flamme 2-3 X. Die Folie sollte nicht stationär in der Flamme, um Verzerrung Zellmorphologie und Beschädigungen auf den Objektträger zu verhindern gehalten werden.

(3) Gramfärbung

Befestigen Sie die Folie an einem Ende mit einem sauberen Wäscheklammer.
Decken Sie den Abstrich mit Kristallviolett (Primärfärbung) und halten Sie für 2 bis 3 Minuten.
Objektträger mit destilliertem Wasser sorgfältig abspülen. Der Wasserstrahl sollte nicht auf den Abstrich gerichtet werden, zur Vermeidung von Schäden und/oder Loslösung von den Objektträger.
Der Abstrich mit Gram Jod zu decken und 2 min. lang halten, dann vorsichtig die Folie mit Wasser spülen.
Bleichmittel der Abstrich mit 95 % Ethanol bis Fleck nicht mehr aus der Folie wäscht (Dies dauert in der Regel nicht mehr als 20 s je nach Stärke der Abstrich), dann sofort mit destilliertem Wasser abspülen. Dieser Schritt ist wichtig zur Vermeidung über Entfärbung der Folie, was zu einer falschen Gramm Fleck Bezeichnung (z. B. Gramm-Variable) führen kann.
Der Abstrich der Gegenfärbung (Safranin) hinzu und halten Sie für 30 s. Dann sanft die Folie mit destilliertem Wasser abspülen und mit Küchenpapier trocken tupfen.

(4) mikroskopische Beobachtung der Folien

Beobachten Sie die Folien mit niedrigen (z.B.4 X oder 10 X), hoch-trocken (z.B.40 X) und Öl-Immersion (100 X) Ziele. Fügen Sie für Ölimmersion das Öl direkt auf den Abstrich.
Für repräsentative Ergebnisse der grampositive und gramnegative Bodenbakterien siehe Abbildungen 4 und 5.

Abbildung 2: Verdünnung und Spread-Plating-Technik. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Kolonie Isolation mit der Streak-Plate-Technik.

Abbildung 4. Grampositiven Bodenbakterium Staphylococcus aureus .

Abbildung 5. Gram-negatives Bodenbakterium Escherichia coli.

Gramfärbung ermöglicht eine schnelle Visualisierung von bakteriellen Morphologie und breiten zellulare Unterscheidung aus einer breiten Palette von Umweltproben. Um Bakterien zu färben, ist ein einheitliche Abstrich auf eine Glasseite und trocknen gelassen. Nach der Hitze-Fixierung der Abstrich, wird Kristallviolett angewendet.

Ein Aufhellung Agent spült weg Kristallviolett von Gram-negativen Zellen, aber nicht Gram-positiven Zellen. Ein zweiten Farbstoff, in der Regel Safranin dient als ein Hintergrund-Fleck, um die Gram-negativen Zellen zu visualisieren. Sobald gebeizt, können die Zellen für Zellmorphologie, Größe und Anordnung, wie Ketten oder Cluster beurteilt werden.

Dieses Video demonstriert, wie eine ökologische Probe isolieren vorbereiten, die der Bakterienarten darin gefunden, die und führen Sie eine Gram-Färbung auf die isolierte Kolonien

Für die Kategorisierung von den meisten Bakterien in zwei große strukturelle Klassen ermöglicht Gramfärbung: grampositive und gramnegative. Während beide Klassen eine zugrunde liegende Plasmamembran Phospholipid haben, unterschiedlich die Struktur der Zellwand. Der Gram-positiven Zellwand besteht in erster Linie aus einer dicken Schicht von Peptidoglycan, ist ein Polymer, das aus Zucker und Aminosäuren besteht. Gramnegativen Zellwände haben eine dünnere Schicht von Peptidoglycan, eingeklemmt zwischen eine zweite Lipidmembran. Diese äußere Membran enthält in der Regel Lipopolysacchariden.

Die positiv geladenen Kristallviolett bindet schwach an negativ geladenen bakteriellen Zellwand. Gram Jod bildet einen unlöslichen Komplex mit Kristallviolett-Farbstoff, damit in der Zellwand Befestigung.

Während der Aufhellung Schritt ist der Peptidoglycane in den Gram-positiven Zellen entwässert, wodurch es bis zum Vertragsabschluss und fangen die Kristallviolett-Jod-komplexen. In Gram-negativen Zellen beeinträchtigt die Aufhellung Agent die äußere Membran Erhöhung seiner Porosität. Dies ermöglicht die Kristallviolett-Jod-komplexen weggespült werden.

Nun, da Sie die Prinzipien hinter Gram Färbung Bodenbakterien zu verstehen, sehen wir den Prozess auf Bodenbakterien im Labor durchgeführt.

Nach dem Sammeln einer Bodenprobe im Feld, bringt es in das Labor zur Analyse. Verfeinern Sie die Probe mit einem Sieb, und wiegen Sie 10 g des gesiebten Bodens mit einer Analysenwaage.

Verdünnen der Probenmaterials in 95 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und Vortex mischen. Führen Sie weitere 1 bis 10 Verdünnungen, Bereich zwischen jeder Verdünnung. Aliquote mindestens 3 aufeinander folgende Verdünnungen auf replizieren niedrigen Nährstoff Agarose Teller zu übertragen.

Anschluss an Ethanol-Flamme Sterilisation und Kühlung von einem gebogenen Glasstab durch Tippen auf die Medien, verbreitet die Probe über die Oberfläche der Platten. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur. Wählen Sie nach Inkubation für 3 bis 5 Tage die höchste Verdünnung mit diskreten Kolonien von 30 bis 300. Wählen Sie mit einer sterilen Impfkeimen Schleife Kolonien von Interesse für die Isolierung.

Streifen der Kolonie auf einem Abschnitt von einem frischen Teller. Sterilisieren die Schleife zwischen Schlieren, aufeinanderfolgenden Streifen machen Sie in einem Zick-Zack-Muster auf jedem Abschnitt der Platte, um nachträgliche Isolierung von diskreten einzelnen Kolonien zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Platten für 1 bis 2 Tage bei Raumtemperatur.

Zur Vorbereitung der bakteriellen Abstrich zu beginnen, legen Sie einen Clip auf einem vorgereinigten Objektträger zur leichteren Handhabung. Für jede bakterieller Abstrich reinigen und eine Impfkeimen Schleife Flamme zu sterilisieren. Legen Sie 2 Loopfuls von sterilem destilliertem Wasser auf die Mitte der Folie.

Nach der Sterilisierung der Schleife wieder, eine kleine Menge der Kultur aus einem isolierten Kolonie zu entfernen, und mischen mit dem Wasser auf der Folie. Es ist wichtig, die Schleife abkühlen, bevor Sie die Kultur durch Tippen auf eine nicht inokulierten Teil des Nährbodens mehrmals berühren. Der Abstrich sollte verdünnte Milch ähneln. Lassen Sie die Folie trocken bei Raumtemperatur. Nach dem Trocknen Hitze fixieren den Abstrich indem man es schnell durch eine Flamme.

Nach dem Trocknen, pipette Kristallviolett auf dem Abstrich, und lassen Sie sich für ca. 2-3 min. sorgfältig spülen Sie die Folie mit destilliertem Wasser mit dem Ziel, des direkten Fluss in Richtung zur Oberseite der Folie, so dass das Wasser sanft nach unten zu fließen. Richten Sie den Wasserfluss direkt auf den Abstrich nicht.

Decken Sie die Folie mit Gram Jod. Spülen Sie nach 2 min sanft mit destilliertem Wasser ab. Die Folie mit 95 % igem Ethanol Bleichmittel, bis der Fleck nicht mehr wäscht. Sofort mit destilliertem Wasser abspülen. Dies schränkt über Entfärbung der Abstrich.

Füge Safranin als einen Counter Fleck dem Abstrich für 30 s. Dies färbt alle Gram-negativen Zellen vorhanden. Sanft mit destilliertem Wasser abspülen und mit Küchenpapier trocken tupfen. Die daraus resultierende Folie mit einem Mikroskop zu beobachten. Verwenden Sie ein low-Power-Ziel zuerst grobe Anpassungen und finden eine ideale Portion des Abstrichs bevor ich auf die kleineren Bereich der Ansichten von den höheren Vergrößerungen.

Fügen Sie nach weiteren Bildgebung und Anpassung der Abstrich mit mittlerer Leistung Zielsetzung Immersionsöl direkt den Abstrich hinzu. Das Öl ist für Hochleistungs-Ziele benötigt, die die besten Mikrographen bieten wird. Gram-positiven Bakterien erscheinen blau oder violett in der Farbe, während Gram-negativen Zellen rot werden oder rosa. Neben der Zellwandstruktur sind Form und Anordnung von der daraus resultierenden Mikrographen aufgeklärt.

Die Fähigkeit der Gram Färbung um qualitativ Bakterien zu studieren ist wichtig, den unterschiedlichsten wissenschaftlichen Bereichen.

Boden gehört zu den ökologischen Quellen aus denen Bakterien isoliert und analysiert werden können. Für Trinkwasser muss Probenvorbereitung geändert werden. Proben von Leitungswasser können gezeichnet aus einem Hahn, und vergoldet auf Wachstumsmedien, die das Wachstum von vielfältigen, heterotrophen Bakterienkolonien erleichtert. Bei der Beschichtung auf ein Medium wie R2A ist der Prozess fast identisch mit der Boden-Verfahren.

Die Parameter sind für bestimmte bakterielle Identifizierungstechniken abhängig die Zellwand der Bakterien von Interesse. In diesem Beispiel einen septischen Patienten Blut wurde getestet und erwies sich als Gram-positiven Bakterien beherbergen.

Mit diesen Informationen wurden artspezifische Peptid-Nukleinsäure Sonden gewählt, um die Zellen rRNA binden würde. Diese Sonden wurden an Fluoreszenzfarbstoffen gebunden, die verwendet wurden, um die Artenvielfalt zu identifizieren.

Bakterien haben aufgrund der grundlegenden Unterschiede in gram-positive und negative – Zellstruktur eindeutige Antworten auf andere Verbindungen neben Kristallviolett. Dieses Experiment versucht, Clostridium Difficile, ein grampositives Bakterium aus Stuhlproben zu isolieren. Cycloserin, die das Wachstum von Gram-negativen Zellen hemmt, wurde die Agarplatte hinzugefügt. Die Gram-positiven Zellen, die auf dem Teller wuchs wurden weitere über andere Methoden isoliert.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Gramfärbung für Umweltstudien beobachtet. Sie sollten jetzt die Vorteile des Prozesses und Gewusst wie: führen Sie die Technik und die Ergebnisse zu nutzen verstehen. Danke fürs Zuschauen!

Applications and Summary

Die Gram-Färbung ist in vielen Teilbereichen der Umwelt- und klinische Mikrobiologie verwendet. Wasser Qualität Wissenschaftler können die Gram-Färbung als bestätigende Werkzeug zur Erkennung von fäkalen Bakterien in Wasserproben. Bakterielle Isolate aus Böden sind Gram gefärbt um weitere kultivierbare Erde Gemeinschaften zu charakterisieren. Für ökologische Mikrobiologen Gramm Fleck hilft bei der Kategorisierung der Bakterienpopulationen nach Zellwandstruktur. Dies wiederum liefert Informationen über die allgemeine Fähigkeit einer bestimmten mikrobiellen Gemeinschaft Austrocknung und andere ökologische Belastungen standhalten. Kenntnis der Gramm-Fleck-Bezeichnung ist auch von Bedeutung in der Forschung und Entwicklung von Desinfektions- und anderen Antibiotika, wie Gram-positiven Bakterien sind in der Regel widerstandsfähiger gegen Inaktivierung von bestimmten Chemikalien als Gram-negativen Bakterien.

Für klinische Mikrobiologie Anwendungen wird der Gram-Färbung zur Bestätigung der Identität des bakteriologischen Krankheit-Agenten zusammen mit traditionellen Diagnoseverfahren. Es ist auch sehr hilfreich bei der Kultivierung fehlgeschlagen ist, oder ist keine Option. Gramfärbung von klinischen Proben kann ätiologische Substanzen enthalten, die kann sonst nicht beobachtet worden.

Transcript

Gram staining allows for quick visualization of bacterial morphology and broad cellular distinction from a wide range of environmental samples. To stain bacteria, a uniform smear is applied to a glass side and allowed to dry. After heat-fixing the smear, crystal violet is applied.

A decolorizing agent rinses away the crystal violet from Gram-negative cells, but not Gram-positive cells. A second dye, typically safranin, is used as a background stain to visualize the Gram-negative cells. Once stained, the cells can be assessed for cell morphology, size, and arrangement, such as chains or clusters.

This video will demonstrate how to prepare an environmental sample, isolate the bacterial species found therein, and perform a Gram stain on the isolated colonies

Gram staining allows for the categorization of most bacteria into two broad structural classes: Gram-positive and Gram-negative. While both classes have an underlying phospholipid plasma membrane, the structure of the cellular wall varies greatly. The Gram-positive cell wall is primarily composed of a thick layer of peptidoglycan, which is a polymer that consists of sugars and amino acids. Gram-negative cell walls have a thinner layer of peptidoglycan, sandwiched between a second lipid membrane. This outer membrane typically contains lipopolysaccharides.

The positively-charged crystal violet binds weakly to the negatively-charged bacterial cell wall. Gram’s iodine forms an insoluble complex with the crystal violet dye, thereby fixing it in the cell wall.

During the decolorizing step, the peptidoglycan in the Gram-positive cells is dehydrated, causing it to contract and trap the crystal violet-iodine complexes. In Gram-negative cells, the decolorizing agent compromises the outer membrane, increasing its porosity. This allows the crystal violet-iodine complexes to be washed away.

Now that you understand the principles behind Gram staining soil bacteria, let’s see the process performed on soil bacteria in the laboratory.

After collecting a soil sample in the field, bring it into the laboratory for analysis. Refine the sample with a sieve, and weigh 10 g of the sieved soil using an analytical balance.

Dilute the sample into 95 mL of phosphate-buffered saline and vortex to mix. Perform additional 1 to 10 dilutions, vortexing between each dilution. Transfer aliquots of at least 3 successive dilutions, onto replicate low nutrient agarose plates.

Following ethanol-flame sterilization and cooling of a bent glass rod by tapping onto the media, spread the sample over the surface of the plates. Incubate the plates at room temperature. After incubating for 3 to 5 days, select the highest dilution with 30 to 300 discrete colonies. With a sterile inoculating loop, select colonies of interest for isolation.

Streak the colony onto one section of a fresh plate. Sterilizing the loop between streaks, make successive streaks in a zig-zag pattern onto each section of the plate to allow for subsequent isolation of discrete single colonies. Incubate the plates for 1 to 2 days at room temperature.

To begin preparation of bacterial smears, attach a clip to a pre-cleaned glass slide for ease of handling. For each bacterial smear, clean and flame-sterilize an inoculating loop. Place 2 loopfuls of sterile distilled water onto the center of the slide.

After sterilizing the loop again, remove a small amount of culture from an isolated colony, and mix with the water on the slide. It’s important to cool the loop before touching the culture by tapping an uninoculated portion of agar several times. The smear should resemble diluted milk. Allow the slide to dry at room temperature. After drying, heat fix the smear by quickly passing it through a flame.

Once dry, pipette crystal violet onto the smear, and let sit for 2 – 3 min. Carefully rinse the slide with distilled water by aiming the direct flow towards the top of the slide, allowing the water to gently flow down. Do not aim the water flow directly at the smear.

Cover the slide with Gram’s iodine. After 2 min, gently rinse with distilled water. Decolorize the slide with 95% ethanol until stain no longer washes away. Immediately rinse with distilled water. This will limit over-decolorizing the smear.

Add safranin as a counter-stain to the smear for 30 s. This will stain any Gram-negative cells present. Gently rinse with distilled water and blot dry with absorbent paper. Observe the resulting slide with a microscope. Use a low power objective first to make coarse adjustments and find an ideal portion of the smear before moving on to the smaller field-of-views of the higher magnifications.

After further imaging and adjusting the smear with a medium power objective, add immersion oil directly to the smear. The oil is needed for high power objectives that will provide the best micrographs. Gram-positive bacteria will appear blue or purple in color, while Gram-negative cells will be red or pink. In addition to cell wall structure, shape and arrangement are elucidated from the resulting micrographs.

The ability of Gram staining to qualitatively study bacteria is important to a wide range of scientific fields.

Soil is just one of the environmental sources from which bacteria can be isolated and analyzed. For drinking water, sample preparation must be modified. Samples of tap water can be drawn from a faucet, and plated onto growth media that facilitates the growth of diverse, heterotrophic bacterial colonies. Upon plating onto a medium such as R2A, the process is nearly identical to the soil procedure.

For certain bacterial identification techniques, the parameters are dependent on the cell wall type of the bacteria of interest. In this example, a septic patient’s blood was tested and was found to be harboring Gram-positive bacteria.

With this information, species-specific peptide nucleic acid probes were chosen that would bind to the cells’ rRNA. These probes were bound to fluorescent dyes that were used to identify the species present.

Because of the fundamental differences in Gram-positive and -negative cellular structure, bacteria have unique responses to other compounds besides crystal violet. This experiment sought to isolate Clostridium difficile, a Gram-positive bacterium, from fecal samples. Cycloserine, which inhibits the growth of Gram-negative cells, was added to the agar plate. The Gram-positive cells that grew on the plate were further isolated via other methods.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Gram staining for environmental studies. You should now understand the benefits of the process and how to perform the technique and utilize the results. Thanks for watching!

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