2.3: Gramfärbung von Bakterien aus Umweltquellen

1. die Probenahme

1. Bodenprobe und Transport in das Labor zur mikrobiellen Analyse zu sammeln.
2. Wiegen Sie im Labor eine 10 g Probe mit einer Analysenwaage.
3. Verdünnen der Probe 01:10 in 95 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (10 Teile Boden entspricht 5 Teile wässrige Flüssigkeit), und Vortex mischen (Abbildung 2, Schritt 1).
4. Führen Sie nachfolgende 01:10 Verdünnungen bis mindestens 10^-5 g Boden pro mL und Ausbreitung-Platte Verdünnungen in Wiederholungen von zwei oder drei auf eine niedrige Nähragar Medium (z. B.R2A) ausgewählt (Abbildung 2, Schritt 2 - 3).
5. Inkubieren Sie die Platten für eine Woche bei Raumtemperatur (Bild 2, Schritt 4).
6. Wählen Sie ein oder zwei Kolonien für Isolation und Streifen auf frischen Agarplatten (Abbildung 3, Schritte 1-3).
7. Inkubieren Sie die Streifen-Platten für zwei bis drei Tage bei Zimmertemperatur (Abbildung 3, Schritt 4).

2. Vorbereitung des bakteriellen Abstrich

1. Beobachten Sie die Streifen-Platten für isolierte Kolonien.
2. Für die Vorbereitung jeder Abstrich Prep, Tauchen eine Impfkeimen Schleife in Ethanol, Flamme-sterilisieren, und legen Sie 1 bis 2 Loopfuls von sterilem destilliertem Wasser in die Mitte des vorgereinigten Objektträger.
3. Sterilisieren Sie die Impfkeimen Schleife wieder wie zuvor beschrieben. Sobald Sie abgekühlt, entfernen Sie eine kleine Menge der Kultur aus einer einzigen isolierten Kolonie und mischen Sie es mit den Wassertropfen auf der Folie (der Abstrich sollte verdünnte Magermilch ähneln). Die Impfkeimen Schleife muss vor der Kolonie isoliert gekühlt werden. Eine Schleife, die zu heiß ist verursacht die Kolonie und/oder Medium, splatter, Aerosolization von Bakterien führen. In der Regel, wenn die Schleife zu heiß für den Einsatz ist, ein "Zischen" ertönt wenn Agar oder Kolonie angewendet. Unsachgemäße Kühlung der Schleife kann auch weniger effiziente Übertragung der Kultur-Folie und Verzerrung der Zellmorphologie führen.
4. Der Abstrich auf die Oberfläche der Folie messen ca. 2,5 cm x 2,5 cm, verteilt und lassen Sie es an der Luft trocknen. Es ist wichtig für die Lufttrocknung unter Laminar-Flow-Bedingungen auftreten. Folien sollten nicht um den Abstrich stören nicht zu trocken geblasen werden. Auch darf Folien Flamme getrocknet, um Zellmorphologie halten.
5. Nach dem Trocknen Hitze fixieren den Abstrich indem man der Folie schnell durch eine Flamme 2-3 X. Die Folie sollte nicht stationär in der Flamme, um Verzerrung Zellmorphologie und Beschädigungen auf den Objektträger zu verhindern gehalten werden.

(3) Gramfärbung

1. Befestigen Sie die Folie an einem Ende mit einem sauberen Wäscheklammer.
2. Decken Sie den Abstrich mit Kristallviolett (Primärfärbung) und halten Sie für 2 bis 3 Minuten.
3. Objektträger mit destilliertem Wasser sorgfältig abspülen. Der Wasserstrahl sollte nicht auf den Abstrich gerichtet werden, zur Vermeidung von Schäden und/oder Loslösung von den Objektträger.
4. Der Abstrich mit Gram Jod zu decken und 2 min. lang halten, dann vorsichtig die Folie mit Wasser spülen.
5. Bleichmittel der Abstrich mit 95 % Ethanol bis Fleck nicht mehr aus der Folie wäscht (Dies dauert in der Regel nicht mehr als 20 s je nach Stärke der Abstrich), dann sofort mit destilliertem Wasser abspülen. Dieser Schritt ist wichtig zur Vermeidung über Entfärbung der Folie, was zu einer falschen Gramm Fleck Bezeichnung (z. B. Gramm-Variable) führen kann.
6. Der Abstrich der Gegenfärbung (Safranin) hinzu und halten Sie für 30 s. Dann sanft die Folie mit destilliertem Wasser abspülen und mit Küchenpapier trocken tupfen.

(4) mikroskopische Beobachtung der Folien

1. Beobachten Sie die Folien mit niedrigen (z.B.4 X oder 10 X), hoch-trocken (z.B.40 X) und Öl-Immersion (100 X) Ziele. Fügen Sie für Ölimmersion das Öl direkt auf den Abstrich.
2. Für repräsentative Ergebnisse der grampositive und gramnegative Bodenbakterien siehe Abbildungen 4 und 5.

Abbildung 2: Verdünnung und Spread-Plating-Technik. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Kolonie Isolation mit der Streak-Plate-Technik.

Abbildung 4. Grampositiven Bodenbakterium Staphylococcus aureus .

Abbildung 5. Gram-negatives Bodenbakterium Escherichia coli.

Die Gram-Färbung ermöglicht eine schnelle Visualisierung der bakteriellen Morphologie und eine breite zelluläre Unterscheidung aus einer Vielzahl von Umweltproben. Um Bakterien zu färben, wird ein gleichmäßiger Abstrich auf eine Glasseite aufgetragen und trocknen gelassen. Nach dem Fixieren des Abstrichs wird Kristallviolett aufgetragen.

Ein Entfärbungsmittel spült das Kristallviolett von gramnegativen Zellen, nicht aber von grampositiven Zellen weg. Ein zweiter Farbstoff, typischerweise Safranin, wird als Hintergrundfärbung verwendet, um die gramnegativen Zellen sichtbar zu machen. Nach der Färbung können die Zellen auf Zellmorphologie, Größe und Anordnung wie Ketten oder Cluster untersucht werden.

Dieses Video zeigt, wie man eine Umweltprobe vorbereitet, die darin gefundenen Bakterienarten isoliert und eine Gram-Färbung an den isolierten Kolonien durchführt

Die Gramm-Färbung ermöglicht die Kategorisierung der meisten Bakterien in zwei große Strukturklassen: Gram-positiv und Gram-negativ. Beiden Klassen liegt zwar eine Phospholipid-Plasmamembran zugrunde, aber die Struktur der Zellwand ist sehr unterschiedlich. Die grampositive Zellwand besteht hauptsächlich aus einer dicken Schicht aus Peptidoglykan, einem Polymer, das aus Zuckern und Aminosäuren besteht. Gramnegative Zellwände haben eine dünnere Schicht aus Peptidoglykan, die zwischen einer zweiten Lipidmembran eingebettet ist. Diese äußere Membran enthält typischerweise Lipopolysaccharide.

Das positiv geladene Kristallviolett bindet schwach an die negativ geladene Bakterienzellwand. Gram's Jod bildet mit dem kristallvioletten Farbstoff einen unlöslichen Komplex und fixiert ihn dadurch in der Zellwand.

Während des Entfärbungsschritts wird das Peptidoglykan in den grampositiven Zellen dehydriert, wodurch es sich zusammenzieht und die Kristallviolett-Jod-Komplexe einfängt. Bei gramnegativen Zellen beeinträchtigt das Entfärbungsmittel die äußere Membran und erhöht deren Porosität. Dadurch können die Kristallviolett-Jod-Komplexe weggespült werden.

Nachdem Sie nun die Prinzipien hinter der Gram-Färbung von Bodenbakterien verstanden haben, sehen wir uns den Prozess an, der an Bodenbakterien im Labor durchgeführt wird.

Nachdem Sie eine Bodenprobe auf dem Feld entnommen haben, bringen Sie sie zur Analyse ins Labor. Verfeinern Sie die Probe mit einem Sieb und wiegen Sie 10 g des gesiebten Bodens mit einer Analysenwaage.

Verdünnen Sie die Probe in 95 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung und wirbeln Sie sie zum Mischen ein. Führen Sie weitere 1 bis 10 Verdünnungen durch, wobei zwischen jeder Verdünnung ein Vortexen entsteht. Übertragen Sie Aliquote von mindestens 3 aufeinanderfolgenden Verdünnungen auf replizierte Agaroseplatten mit niedrigem Nährstoffgehalt.

Nach der Ethanol-Flammensterilisation und dem Abkühlen eines gebogenen Glasstabes durch Klopfen auf das Medium wird die Probe auf der Oberfläche der Platten verteilt. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur. Nach einer Inkubation von 3 bis 5 Tagen wählen Sie die höchste Verdünnung mit 30 bis 300 diskreten Kolonien. Wählen Sie mit einer sterilen Impfschlaufe die Kolonien aus, die für die Isolierung von Interesse sind.

Streichen Sie die Kolonie auf einen Teil eines frischen Tellers. Sterilisieren Sie die Schlaufe zwischen den Streifen und machen Sie aufeinanderfolgende Streifen in einem Zick-Zack-Muster auf jedem Abschnitt der Platte, um eine anschließende Isolierung diskreter Einzelkolonien zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Platten 1 bis 2 Tage bei Raumtemperatur.

Um mit der Vorbereitung von Bakterienabstrichen zu beginnen, befestigen Sie einen Clip an einem vorgereinigten Objektträger, um die Handhabung zu erleichtern. Für jeden Bakterienabstrich eine Impfschlaufe reinigen und flammensterilisieren. Legen Sie 2 Schlaufen steriles destilliertes Wasser in die Mitte des Objektträgers.

Nachdem Sie die Schlaufe erneut sterilisiert haben, entnehmen Sie eine kleine Menge Kultur aus einer isolierten Kolonie und mischen Sie sie mit dem Wasser auf dem Objektträger. Es ist wichtig, die Schleife abzukühlen, bevor man die Kultur berührt, indem man mehrmals auf eine nicht geimpfte Portion Agar klopft. Der Abstrich sollte verdünnter Milch ähneln. Lassen Sie die Folie bei Raumtemperatur trocknen. Nach dem Trocknen den Abstrich mit Hitze fixieren, indem Sie ihn schnell durch eine Flamme führen.

Nach dem Trocknen Kristallviolett auf den Abstrich pipettieren und 2 - 3 Minuten ziehen lassen. Spülen Sie die Rutsche vorsichtig mit destilliertem Wasser ab, indem Sie den direkten Strom auf den oberen Teil der Rutsche richten, sodass das Wasser sanft nach unten fließen kann. Richten Sie den Wasserstrahl nicht direkt auf den Abstrich.

Bedecken Sie den Objektträger mit Gram's Jod. Nach 2 Minuten vorsichtig mit destilliertem Wasser abspülen. Entfärben Sie den Objektträger mit 95 % Ethanol, bis der Fleck nicht mehr weggespült wird. Sofort mit destilliertem Wasser abspülen. Dadurch wird eine übermäßige Entfärbung des Abstrichs begrenzt.

Safranin als Gegenfleck zum Abstrich für 30 s geben. Dadurch werden alle vorhandenen gramnegativen Zellen gefärbt. Vorsichtig mit destilliertem Wasser abspülen und mit saugfähigem Papier trocken tupfen. Betrachten Sie den entstandenen Objektträger mit einem Mikroskop. Verwenden Sie zuerst ein Objektiv mit geringer Vergrößerung, um grobe Anpassungen vorzunehmen und einen idealen Teil des Abstrichs zu finden, bevor Sie mit dem kleineren Sichtfeld der höheren Vergrößerungen fortfahren.

Nach weiterer Bildgebung und Anpassung des Abstrichs mit einem Objektiv mittlerer Leistung fügen Sie dem Abstrich direkt Immersionsöl hinzu. Das Öl wird für Hochleistungsobjektive benötigt, die die besten Mikroskopaufnahmen liefern. Grampositive Bakterien erscheinen blau oder violett, während gramnegative Zellen rot oder rosa sind. Neben der Zellwandstruktur werden aus den resultierenden Schliffbildern auch Form und Anordnung aufgeklärt.

Die Fähigkeit der Gram-Färbung, Bakterien qualitativ zu untersuchen, ist für eine Vielzahl von wissenschaftlichen Bereichen wichtig.

Der Boden ist nur eine der Umweltquellen, aus denen Bakterien isoliert und analysiert werden können. Bei Trinkwasser muss die Probenvorbereitung geändert werden. Proben des Leitungswassers können aus einem Wasserhahn entnommen und auf Wachstumsmedien aufgetragen werden, die das Wachstum verschiedener, heterotropher Bakterienkolonien erleichtern. Bei der Beschichtung auf einem Medium wie R2A ist der Prozess nahezu identisch mit dem Bodenverfahren.

Bei bestimmten Techniken zur Identifizierung von Bakterien hängen die Parameter vom Zellwandtyp der interessierenden Bakterien ab. In diesem Beispiel wurde das Blut eines septischen Patienten getestet und es wurde festgestellt, dass es grampositive Bakterien enthielt.

Mit diesen Informationen wurden speziesspezifische Peptid-Nukleinsäuresonden ausgewählt, die an die rRNA der Zellen binden würden. Diese Sonden waren an Fluoreszenzfarbstoffe gebunden, die zur Identifizierung der vorhandenen Spezies verwendet wurden.

Aufgrund der grundlegenden Unterschiede in der grampositiven und -negativen Zellstruktur reagieren Bakterien neben Kristallviolett auf andere Verbindungen. In diesem Experiment wurde versucht, Clostridium difficile, ein grampositives Bakterium, aus Stuhlproben zu isolieren. Cycloserin, das das Wachstum gramnegativer Zellen hemmt, wurde der Agarplatte zugesetzt. Die grampositiven Zellen, die auf der Platte wuchsen, wurden mit anderen Methoden weiter isoliert.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Gram-Färbung für Umweltstudien gesehen. Sie sollten nun die Vorteile des Prozesses verstehen und wissen, wie Sie die Technik durchführen und die Ergebnisse nutzen können. Danke fürs Zuschauen!